谷类是日常饮食的重要组分。然而小麦面粉谷蛋白，并且特别是麦醇 溶蛋白级分，造成人的不耐性。乳糜泻，又名Celiac Sprue(CS)或谷蛋白敏 感性肠病，是广泛的食物不耐性之一，在欧洲和美国人群的每130至300 人中发生1例。在南美、北非和亚洲，一般是低估的(Fasano和 Catassi；2001，Gastroenterology，120：636-651)。CS的流行病学分布是通过由 Logan在1992年提出的冰山模型(Logan；1992，Dyn.Nutr.Res.2：14-24)有效 概念化的，在那里所述疾病的流行受所述人群中诱病基因型的频率影响。 完全终身避免谷蛋白摄取仍然是CS治疗的基础。国际食品权威 (International Food Authority)目前已经将术语不含谷蛋白重新定义为对于 谷蛋白的零耐受性，而Codex Alimentarius准许每一食物的谷蛋白浓度为 200ppm。减少人对于谷类不耐性的努力具有巨大的医疗、营养和经济利 益。在当前上下文中是特别真实的，在那里焙烤工业利用非常快的工艺过 程，其也许在CS的扩大的流行病学中具有影响。
因此，真实感受到更易消化和耐受的面包和焙烤产品的需要。
CS是遗传上易感个体中小肠粘膜的自身免疫性疾病。在谷蛋白摄取 时，这些患者遭受自保持的粘膜炎症，其特征在于进行性的吸收绒毛损失 和隐窝增生(Silano和De Vincenzi，1999；Nahrung，43：175-184)。在内腔蛋白 水解消化期间，例如小麦的麦醇溶蛋白释放一族Pro-和Glu-富集的寡肽， 造成T-细胞介导的免疫应答和/或，更一般地，造成表征CS最初阶段的炎 性状态(Silano和De Vincenzi；1999)。所述文献报道了下列寡肽的鉴定：A- 麦醇溶蛋白的片段31-43(Silano和De Vincenzi；1999)，α2-麦醇溶蛋白的片 段62-75(Auricchio，S.，等；1996，Scand.J.Gastroenterol，31：247-253；Picarelli，A. 等；1999，Scand.J.Gastroenterol，34：1099-1102)，表位33-聚物(33-mer)，其对 应于α2-麦醇溶蛋白的片段57-89(Shan，L.，等；2002.Science，297：2275-2279)， γ-麦醇溶蛋白的片段134-153(Aleanzi，M.等；2001，Clin.Chem.，47：2023-2028) 和α9-麦醇溶蛋白的片段57-68(Arentz-Hansen等；2000，J.Exp. Med.，191：603-612)。不受CS患者耐受的面粉包括小麦、黑麦、大麦、kamut、 黑小麦和斯佩耳特小麦。对于燕麦仍有一些争论。
在数个领域进行了多学科研究努力以处理CS。它们涉及不含谷蛋白- 谷物的工程技术(Fasano，A.等；2003，Arch.Intem.Med.163：286-292)，涉及在 人中CS基因的寻找(Fasano，A.等；2003)，一些保护物质诸如甘露聚糖和N- 乙酰葡糖胺(N-acetylglucosammine)的低聚物的应用和来自脑膜脓毒性金 黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)的细菌脯氨酰内肽酶的应用作为 口服补充治疗(Shan等；2002)。
最近，两篇论文显示通过选择的酸酵种(sourdough)乳杆菌诸如消化乳 杆菌(Lactobacillus alimentarius)15M、短乳杆菌14G、L.sanfranciscensis 7A 和希尔乳杆菌51B(Di Cagno，等；2002，Appl Environ.Microbiol，68：623-33) 的麦醇溶蛋白级分的广泛水解并且，特别是，17名CS患者对于含有2g 谷蛋白的面包的耐受性，如基于肠渗透性通过急性体内刺激所测定(Di Cagno，等；2004，Appl.Environ.Microbiol.，70：1088-1096)。这些结果，虽然 至少关于症状学是鼓舞人心的，但是没有证明组织病理学损害的消退。
Wei等(Wei，J.和Hemmings，G.P.；Medical Hypotheses，(2005)，64， 547-552)在乳糜泻和精神分裂症之间建立了基因关系，并且报道在用不含 谷蛋白饮食治疗的乳糜泻患者中精神分裂症症状消退的有益效果(De Santis，A.，等；J.Intern.Med.1997；242：421-3)。
某些乳酸细菌在焙烤食品制造中的用途已经是已知的。
授予Kline的US 4,140,800公开了制造冷冻干燥的酸酵种焙烤发酵剂 组合物的方法，其使用旧金山乳杆菌，旨在提供在法国面包制备中有用的 产品。理想地，所述面粉是高谷蛋白的。
由Di Cagno等提供的利用酸酵种乳酸细菌的解决方案仍留下一些未 解决的实际问题。特别是，(i)选择的菌株是旷日持久的研究结果，所述研 究显示以上种类的酸酵种乳酸细菌之内菌株水平上的显著区别；(ii)在焙烤 工厂中明显不可再现相同的结果；并且，尤其是(iii)选择的菌株不是商售 的。
其它参考文献公开了乳酸细菌和双歧杆菌在食物制造中的应用。
EP 0 856 259涉及食品用途的组合物，所述组合物含有冻干的活细菌 的混合物，所述活细菌包含至少两种选白双歧杆菌的细菌和至少两种选白 嗜酸乳杆菌(Latobacillus acidophilus)，嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)，干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)，植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和屎链球菌 (Streptococcus faecium)的细菌和一种或多种寡糖。将所述组合物加入到液 体的、乳脂状或糊状食品，所述食品是奶、基于奶或源自奶的产品，或者 基于或源自于蔬菜产品的产品，所述补充是在食品使用时进行的。不将所 述产品用于焙烤中。
WO 03/071883涉及用于人和/或动物用途的饮食的和/或药物的组合 物，和一般的食品，基于由相对于人类和动物是土著的和外来的种类组成 的微生物培养物，选自乳细菌、丙酸细菌、酵母和/或霉菌的种类。它们具 有宿主人类或动物的肠菌类平衡作用，而且对于宿主生物具有多种有益/ 益生作用。不存在乳糜泻中可能应用的迹象。
US 2004/265291提供用于对受试者提供或重建有益细菌的组合物、试 剂盒、和方法。所述组合物和试剂盒任选包括促进受试者中细菌生长和增 殖的食物或养分或者减少受试者中不符合要求的或病原微生物的存在的 抗微生物剂。
WO 02/065842涉及适合于所有类型谷类的发酵剂制剂，以及所述发 酵剂制剂基于发酵或利用发酵用于生产面包和焙烤产品的用途，特别是用 于生产用于患有乳糜泻的人的不含谷蛋白的焙烤产品。没有公开乳酸细菌 和双歧杆菌的特定混合物。
US 5,185,165公开了用于在包含酸性浓缩物的焙烤生面团产品中使用 的前体碱、至少一种糖、酵母、至少一种面粉、非脂肪的奶粉和至少一种 产生乳酸的细菌并且公开了用于产生所述前体碱的方法。所述前体碱在产 生前体料浆(或活性酶浓缩物)的方法中是有用的，所述前体料浆在制造用 于焙烤生面团产品的制备的酶原生面团混合物中使用。另外，公开了用于 制备前体料浆和酶原生面团混合物的方法以及产生所述酶原生面团混合 物的装置。对于乳酸细菌的引用全部是属。
US 2004/110270描述了具有免疫调节性质的细菌组合物，所述细菌组 合物包含至少一种选自由下列细菌组成的组的菌株：嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)PTA-4797、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) PTA-4799、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)PTA-4800、类干酪乳杆菌 (Lactobacillus paracasei)PTA-4798、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum) PTA-4801和乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)PTA-4802。
EP 1258 526公开了通过用包含乳杆菌和酵母的接种物部分发酵水和 磨碎小麦产品的混合物，用于制造小麦预生面团和小麦酸酵种的发酵剂的 生产，所述生产包含利用包含适应的混合菌群的接种物，所述菌群包含至 少一种酵母菌株、至少一种同型发酵的乳杆菌菌株和至少一种异型发酵的 乳杆菌菌株。提供的菌株有：酵母菌属DSM 14265、桥乳杆菌DSM 14269、 桥乳杆菌DSM 14272、桥乳杆菌DSM 14273、桥乳杆菌DSM 14274、卷 曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)DSM 14271、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DSM 14268和Lactobacillus sanfranciscensis DSM 14270；包含 酵母菌属DSM 14265和桥乳杆菌DSM 14269、桥乳杆菌DSM 14272、 桥乳杆菌DSM 14273、桥乳杆菌DSM 14274、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)DSM 14271、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)DSM 14268和 Lactobacillus sanfranciscensis DSM 14270至少三种的适应性混合菌群。该 参考文献属于焙烤食品的一般技术领域，没有特殊的医疗指示。
WO 99/09839涉及糊状组合物，其适用于像这样使用并且作为多种食 品的填料、涂料或其它组分，并且其含有大量的益生元。所述食品优选是 焙烤食品，特别是含有黑麦的面包、面包干、饼干等。该参考文献涉及益 生元用途的通常已知的方面。
适合于受乳糜泻影响的受试者的焙烤产品的需要，所述焙烤产品可以 用容易的、可重现的制造方法并且用可靠的、安全的和市场上可买到的材 料获得，仍然认为在本领域中。
本发明通过为受乳糜泻影响的受试者提供焙烤产品符合这些需要。然 而，在人类饮食中发现所述焙烤产品的一般有用性，由于它的更高的可消 化性。
发明概述
目前已经发现，人类和乳来源的乳酸细菌和双歧杆菌的某些特定混合 物具有能水解造成乳糜泻的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白级分的令人惊讶的性 质。
这些特定混合物在酸酵种制造中是非常有用的，并且提供充分限定的 细菌种类。
因此，本发明的一个目的是乳酸细菌和双歧杆菌的特定混合物用于酸 酵种制造的应用。
本发明的另一个目的是提供基于谷类的食品，特别是一般更易消化的 并且特别是可以由CS患者耐受的面包食品。
本发明的另一个目的是用于制造基于谷类食品的方法，所述基于谷类 食品特别是适合于受乳糜泻影响的受试者并且适合于防止不含谷蛋白产 品中的谷蛋白污染的焙烤食品。
本发明的另外目的是，当在常规用于焙烤工业的微生物蛋白酶的特定 条件之下实施乳酸细菌和双歧杆菌的特定混合物的利用时，提供不含谷蛋 白的基于谷类的食品，特别是由小麦面粉制成的焙烤食品。
本发明的另一个目的是用于受乳糜泻影响的受试者的食品，所述食品 含有在这里公开的乳酸细菌和双歧杆菌的特定混合物。
本发明再另一个目的是上述乳酸细菌和双歧杆菌混合物的应用，用于 制备对减少血小板活化因子(PAF)及其它炎性细胞因子有用的产品。
现在本发明的这些及其它目的将详细公开在上述中，也借助于实施例 和图，其中：
图1显示由小麦面粉制成的不同生面团的麦醇溶蛋白蛋白质级分的 2DE分析。(A)化学酸化的生面团(对照)。由编号的红色椭圆形指示谷醇溶 蛋白(prolamin)多肽。(B)在37℃用下面实施例的混合物1温育24h的生 面团。由编号的红色椭圆形指示谷醇溶蛋白多肽。蓝色数字指的是降解超 过80％的多肽。Mr，分子量。
图2显示通过混合物1(109cfu/ml)的33-聚肽的水解。在37℃的24h 温育而没有微生物接种物之后(A)和用混合物1在37℃水解24h之后(B)， 在UV214nm的RP-FPLC检测200μM的33-聚物。
发明详述
根据本发明，至少6种，优选至少7种，更优选至少8种选自由下列 组成的组的乳酸细菌和/或双歧杆菌适于实施本发明：嗜酸乳杆菌 (Lactobacillus acidophilus)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、干酪乳杆 菌(Lactobacillus casei)、链状乳杆菌(Lactobacillus catenaforme)、纤维二糖 乳杆菌(Lactobacillus cellobiosus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、弯 曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、 德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)、德氏 乳杆菌乳亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.lactis)、瑞士乳杆菌 (Lactobacillus helveticus)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)、Lactobacillus leichmannii、小乳杆菌(Lactobacillus minutus)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、罗氏乳杆菌(Lactobacillus rogosae)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、角双歧杆菌 (Bifidobacterium angulatum)、双歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双 歧杆菌(Bifidobacterium breve)、链状双歧杆菌(Bifidobacterium catenulatum)、齿双歧杆菌(Bifidobacterium dentium)、埃氏双歧杆菌 (Bifidobacterium eriksonii)、婴儿双歧杆菌(Bifidoabcterium infanitis)、乳双 歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、植物 双歧杆菌(Bifidobacterium plantarum)、假小链双歧杆菌(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、乳链 球菌(Streptococcus lactis)、棉子糖乳链球菌(Streptococcus raffinolactis)、发 酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermenta)、发酵噬纤维菌(Cytophaga fermentans)、发酵红育菌(Rhodoferax fermentans)、发酵纤维单胞菌 (Cellulomonas fermentans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、嗜热链 球菌(Streptococcus thermophilus)。
可以使用其它种类，例如在现有技术中公开的并一般在保藏中心诸如 ECACC、ASTM；DSM中可提供的那些。
优选的根据本发明的混合物如下：
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、
婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、
短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、
乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、
短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。
众所周知种类的这些混合物可以容易地由本领域普通技术人员制备。
方便地，这些混合物是以冻干形式商售的。
这些制剂适合于作为酸酵种制备中的发酵剂使用。
基于谷类的食品，特别是根据本发明获得的焙烤食品一般是更易消化 的，因此更是由一般消费者，或者特别是由希望或需要更易消化食品的人 所接受的。
在本发明的特定实施方案中，所述基于谷类的食品、特别是焙烤食品 可以用于受乳糜泻影响的人的饮食整合(integration)，因为将谷蛋白浓度减 少到低值并且存留在所述生面团中的谷蛋白量是显著水解的，特别是对于 造成CS的肽序列。
当以上微生物混合物的一种与足够量的微生物蛋白酶例如200ppm的 微生物蛋白酶(典型来自曲霉菌属)在本发明优化的条件下整合时，发酵的 酸酵种具有低于200ppm的谷蛋白浓度，如通过利用单克隆抗体R5所确 定。如Codex Alimentarius所规定，将这样类型的产品限定为不含谷蛋白 的并且因此适合于乳糜泻患者。
微生物蛋白酶在焙烤中具有通用的用途，例如见WO 88/03365、EP 0588426、US 6,465,209、GB 1,196,946。这些蛋白酶是普遍市售的，例如 见美国的Enzyme Development Corporation，并且用市场上可得到的并在焙 烤中通用的任何产品可以进行本发明。
在本发明的优选实施方案中，所述微生物蛋白酶是来自米曲霉 (Aspergillus oryzae)的真菌蛋白酶；活性为500,000 HUT/g；最适pH约为 3.0并且在pH3.0至6.0的范围内有活性；最适温度约为50℃并且在 25-60℃范围内有活性；或者另一个蛋白酶是来自黑曲霉(Aspergillus niger) 的酸稳定的蛋白酶；活性为3,000 SAPU/g；最适pH2.0-3.0并且在pH2,0 至6,0的范围内有活性；最适温度50-60℃并且在30-60℃范围内有活性。 这些酶是从Bio-Cat Inc.，Troy，Virginia，美国和许多其它供应商获得的。
本发明可以用更高百分比的小麦面粉制造焙烤食品，得到具有更适宜 风味并被受乳糜泻影响的人更好接受的产品。本发明也可以获得针对包括 健康人在内的一般消费者的产品，其被赋予了更好的消化性。
在更宽的方面中，本发明也涉及包含乳酸细菌混合物的淀粉产品，任 选提供有以上公开的酶制剂。
在最宽的方面中，本发明提供乳酸细菌和双歧杆菌的混合物，任选添 加有微生物来源的蛋白酶，对于用于改善谷蛋白和谷蛋白相关物质消化的 口服用产品的制备是有用的。
包含本发明特定混合物的酸酵种是本发明的至关重要的方面。
所述酸酵种在制备焙烤产品特别是面包的方法中是有用的，但是这应 用于全部发酵的和非发酵的产品，例如饼干、面粉糕饼、蛋糕、馅饼、比 萨饼、薄脆饼干、面包棒、小吃以及本领域已知的全部其他产品。
根据本发明的酸酵种也适合于用于制造以及家制基于谷类食品特别 是焙烤食品的制备。在该情况下，除特定产品的通常组分以外，焙烤食品 的包装将包含发酵制剂，所述发酵制剂包含本发明特定混合物。
根据本发明的发酵制剂可以是乳酸细菌和双歧杆菌特定混合物的组 合，或者可以单独地在包装中提供乳酸细菌和双歧杆菌混合物，并且将在 随后使用时与这个混合，例如在水中以形成发酵悬浮液。可以将乳酸细菌 的混合物单独包装在单一容器中或者包装在具有以上公开的蛋白水解酶 (蛋白酶)的混合物。
淀粉产品在本领域中同样在消费者和家制烹饪中通常是众所周知的， 并且属于常识。特别是，将本发明应用于基于谷类的产品。
淀粉产品的实例是各种意大利面食，面条诸如油炸方便面和湿面条， 小吃产品，玉米粉圆饼，玉米片，压制的谷类和切碎的谷类。
制造意大利面食的方法在本领域是众所周知的，并且仅例如对由R.C. Kill和K.Tumbull所编的Pasta and Semolina Technology，Blackwell Science， 2001和Barilla拥有的专利进行参考。制造亚洲淀粉产品的方法也是众所 周知的，并且仅例举性参考由Catharina Y.W.Ang，KeShun Liu and Yao- Wen Huang所编的Asian Food，Science and Technology，Technomic Publishing Company，Inc.，1999和授予Kao Corporation的US 20020160093 和授予Societéde Pro-duits NestléS.A.的WO 99/65331。
今天，大多数意大利面食是在螺旋挤出原理上通过连续的、大容量挤 出机制造的，其中在一道工序中进行捏和和挤出。意大利面食的制造包括 干通心面、面条、和意大利面条生产。
通过混合磨碎的小麦、水、蛋(用于蛋面条或蛋意大利面条)，以及有 时可选的组分而生产意大利面食产品。将这些组分典型加入到连续的、大 容量螺旋挤出机，其可以安装有确定意大利面食形状的多种模具。然后干 燥所述意大利面食并包装用于销售。
意大利面食产品含有磨碎的小麦、水，并且有时含有蛋和/或可选组分。 意大利面食制造商在意大利面食生产中典型使用磨碎的硬粒小麦(粗小麦 面粉、硬质小麦粒、和硬质小麦面粉)，即使有时使用来自普通小麦的谷粉 和面粉。大多数意大利面食制造商优选由均一尺寸的细粒组成并产生最高 品质意大利面食产品的粗小麦面粉。在意大利面食生产中使用的水应该是 纯的，无臭气的，并适合饮用。同样，因为在巴氏消毒法温度下生产意大 利面食，所以应当使用低细菌数的水。将蛋(鲜蛋、冻蛋、干蛋、蛋黄、或 干蛋固体)加入到意大利面食以制造蛋面条或蛋意大利面条并且以改善意 大利面食的营养质量和丰度。少量的可选组分，诸如盐、芹菜、大蒜和月 桂树叶，也可以加入到意大利面食以增强风味。磷酸二钠可以用于缩短烹 饪时间。也可以加入其它组分，诸如谷蛋白胶、单硬脂酸甘油酯、和蛋清。 全部可选组分应当清楚地标记在包装上。
利用辊式研磨机将硬质小麦磨碎成粗粒小麦面粉、硬质小麦粒或硬质 小麦面粉。粗粒小麦面粉是独特的，因为目的是在最少面粉生产的情况下 制备粒状中级品。在小麦研磨后，将其与水、蛋、和任何其它可选组分混 合。
在混合操作中，在混合槽中将水加入到磨碎的小麦以产生水分含量大 约为百分之31的生面团。也可以加入蛋和任何可选组分。大多数现代化 的意大利面食压榨机安装有真空室以在挤出之前除去来自意大利面食的 气泡。如果不在挤出之前除去空气，则小气泡将在意大利面食中形成，其 削弱机械强度并使成品产生白色的白垩外观。
在混合生面团之后，将其传递到挤出机。挤出螺旋不仅强制生面团通 过模具，而且它也将生面团揉成均匀团，控制生产率，并且影响成品的总 品质。即使由设备制造商改变挤出钻的结构和尺寸，但是大多数现代化压 榨机具有锐缘钻，所述锐缘钻在它们的整个长度上具有均匀螺距。将所述 钻配合到凹槽的挤出筒中，其帮助生面团前进并减少所述钻和筒内部之间 的摩擦。挤出筒安装有水冷套以分散在挤压过程期间产生的热量。所述冷 却套也帮助保持恒定的挤出温度，其应该大约51℃(124°F)。如果生面团 太热(74℃[165°F]以上)，则将损坏意大利面食。
生面团通过挤出机的均匀流速也是重要的。生面团通过所述模具的流 速的差异引起意大利面食以不同速率挤出。必须排除或再处理不均匀尺寸 的产品，其增加产品的单位成本。所述模具的内表面也影响产品外观。直 到最近，大多数模具才由相对柔软的并需要修复或周期性替换的青铜制 成。最近，已经通过用Teflon_插入物装配所述模具的挤出表面而改进了 模具以延长模具寿命并改善意大利面食的品质。
干燥是意大利面食生产过程中要控制的最困难的和关键的步骤。干燥 的目的是将意大利面食的水分含量从大约百分之31降低至百分之12至 13，以便成品将是硬的，维持它的形状，并无损保存。
大多数意大利面食干燥操作在挤出之后立即使用预备的干燥机以防 止意大利面食粘在一起。预干燥硬化意大利面食的外表面，而保持内部柔 软并可塑。然后将最后的干燥机用于从产品除去大部分水分。
干燥温度和相对湿度增量是干燥中的重要因素。因为意大利面食的外 表面比内部更快速干燥，所以水分梯度穿过意大利面食表面至内部而形 成。如果干燥太快，则意大利面食将破裂，使产品产生不良外观和极低的 机械强度。在干燥过程或在产品离开干燥机后长达几个星期期间可以发生 破裂。如果意大利面食干燥太缓慢，它在干燥过程期间趋于损坏或变发霉。 因此，必要的是，干燥周期适合于满足各自产品类型的需要。如果干燥周 期已经成功，则意大利面食将是坚实的，而且是足够柔韧的，以致它可以 在破裂之前弯曲相当大的程度。
包装保持产品无污染，防止意大利面食在运输和储存期间损坏，并有 利地展示产品。面条用的主要包装材料是玻璃纸袋，其为产品提供防潮保 护并且容易在自动包装机械上使用，但是难以在食品货架上堆叠。许多制 造商利用盒子代替包装意大利面食的袋，因为盒子容易堆叠，为易碎的意 大利面食产品提供良好保护，并且提供机会印刷比袋更容易阅读的广告。
空气排放可以起因于意大利面食制造的多种来源。颗粒物质(PM)排 放主要由固体处理和混合产生。为了意大利面食制造，当粗组分混合时， PM排放发生在小麦磨碎过程期间，并且可能在包装期间。与小麦磨碎有 关的排放源包括颗粒接收、预清洗/处理、清洗间、磨碎、和批量装载。其 它信息提供在D.E.Walsh和K.A.Gilles，″Pasta Technology″，Elements Of Food Technology，N.W.Desrosier，Editor，AVI Publishing Company，Inc.， 1977中。
本发明适用于意大利面食的工业制造和家庭制备，在后者情况中，在 蛋意大利面食制备中有利。
根据本发明，在制造生面团过程中，使用在这里公开的乳酸细菌混合 物。
在本发明另一个实施方案中，提供典型的亚洲的基于谷类的食品。优 选实施例是一种在朝鲜中称为Ramyun、在中国称为Ramien和在日本称为 Ramen的面条。
当在本发明的一般实施中，通过添加乳酸细菌的混合物并让预发酵讲 行足够时间而制备生面团。
根据本发明的乳酸细菌和双歧杆菌的混合物，任选添加有以上微生物 蛋白酶混合物，还可以用于食品特别是不含谷蛋白等级的食品的制造，用 于受乳糜泻影响的受试者消费。这种食品的实例是意大利面食、谷类、墨 西哥煎玉米卷、玉米粉圆饼、爆米花。对于参考，见Practical Gastroenterology-April 2004,86-104页和在其中引用的文献。
本发明的另一个目的是制造焙烤食品的方法，所述方法包含添加以上 酸酵种制剂。
在本发明优选实施方案中，所述方法包含下列步骤：
a)将20-50重量％的小麦面粉(全部混合物，20％-50％的面粉和 80％-50％的水，生面团产率约300，每g生面团含本发明的109混合物细 胞)在大约37℃液体预发酵至少约24h，优选地在约24和约31小时之间；
b)发酵后，将所述生面团与一种或多种耐受面粉诸如小米面粉混合， 以具有最终生面团产率约为150(固体生面团)并且以约1重量％的浓度添 加商业的面包酵母；
c)在大约37℃将所述生面团温育约2小时直到发酵完成；
d)在大约250℃焙烤约20分钟。
在本发明第二个实施方案中，所述方法可以修改如下：
A)在另外添加真菌蛋白酶(200ppm)的情况下将20％小麦面粉在37℃ 液体发酵24-31小时；
B)发酵后，干燥以除去水以便得到不含谷蛋白的小麦面粉(＜200ppm 的谷蛋白)；
C)将不含谷蛋白小麦面粉用作制造基于谷类的食品，特别是焙烤食 品。
在该情况中的术语“约”指的是包含在本发明正常实施中所指示的那 些的周围的那些值，并且可以取决于在所述指示值周围的测量装置的仪器 误差或由本领域技术人员产生的偏差，但是其不影响由本发明获得的结 果。
以上范围也意欲作为大约比下限更高并且大约比上限更低。因此，步 骤a)的液体预发酵包含不低于约20重量％并且不高于50重量％的小麦面 粉的量，发酵不少于约24小时并且不多于约31小时的时间。
耐受面粉的例举性列表包含豆粉、荞麦粉、亚麻、玉米(corn(玉米 (maize))、豆荚粉(鹰嘴豆/鹰嘴豆、小扁豆、豌豆)、小米、印度稻草(Indian Rice Grass)、坚果粉(杏仁、榛子、美洲山核桃)、奎奴亚藜(quinoa)、马铃 薯粉、甘薯粉、西谷米、种子粉(芝麻)、高粱、大豆、木薯淀粉、埃塞俄 比亚画眉草。小米是一种优选的耐受面粉。
本发明的非常有利的实施方案是在所述焙烤食品中包括益生元，无论 是否含有耐受面粉。
益生元是非易消化纤维状物质，其实例是短链和长链寡糖，诸如果- 寡糖(fructo-oligosaccharides)、大豆-寡糖、木-寡糖和异-麦芽-寡糖。
本发明的更有利实施方案是将这里公开的焙烤食品结合在诸如EP 1 010 372中公开的一种的焙烤食品中。在该实施方案中，所述焙烤食品包 含非焙烤的、基本无水的、基于脂肪含有活的冻干乳酸细菌的组合物。这 个包含活的冻干乳酸细菌的基于脂肪的组合物当然可以与本发明的全部 焙烤产品组合在一起。
基于谷类的食品特别是焙烤食品，以及制造基于谷类食品特别是根据 本发明的焙烤食品的包装，适合于施用至遭受乳糜泻的受试者。
如上所述，本发明也包含在淀粉食品特别是基于谷类食品的一般名称 下已知的一般食品。
乳酸细菌的混合物，任选添加有微生物蛋白酶，如上所述，用于淀粉 食品特别是基于谷类食品的制造，以获得以上描述的焙烤食品实施方案的 相同结果和优势。如此说来，根据本发明获得的食品适于遭受乳糜泻的受 试者或者也是健康的希望更易消化食品的一般消费者。例如儿童和老年人 可能希望更易消化的食品。
因此，本发明的另外目的是治疗遭受乳糜泻的受试者的方法，所述方 法包含将所述受试者的饮食与如上公开的焙烤食品和/或淀粉食品的整合。 在上述中，根据本发明的焙烤食品和淀粉食品将包含在术语“基于谷类的 食品”中。
在本发明另一个实施方案中，基于谷类的食品特别是焙烤食品还可以 用于保持谷蛋白耐受性或用于诱导谷蛋白耐受性或用于减少由于小麦面 粉清蛋白和球蛋白导致的变态反应的风险。
在本发明另一个实施方案中，因为低浓度的谷蛋白(＜200ppm)，所以 基于谷类的食品特别是焙烤食品可以对于乳糜泻患者使用是安全的。
根据本发明的治疗方法还可以用于与其它用于乳糜泻的医学疗法的 组合。
如上报道，在乳糜泻患者中注意到精神分裂症症状并且精神分裂症患 者显示对于谷蛋白的敏感行为。根据本发明的混合物对于制备不含谷蛋白 饮食品是有用的。
因此，本发明的另外目的是以上公开的混合物在良好用于精神分裂症 症状治疗的不含谷蛋白饮食品制备中的用途。特别是，所述症状影响乳糜 泻患者或非乳糜泻患者。
本领域的另一个问题是脯氨酸在肠饮食(enteric diet)制备中的应用。在 某些受试者中，脯氨酸不是水解的并且制造肠饮食溶液的化合物是不消化 的。由于脯氨酸也可以发生变态反应。在本发明公开的乳酸细菌和双歧杆 菌的混合物对于水解脯氨酸或富含脯氨酸的肽是有用的，由此使肠饮食制 备是有效的并且是非变应原的。
由于它们的性质，在本发明中公开的乳酸细菌和双歧杆菌的混合物也 可用于使富含麦醇溶蛋白的谷氨酰胺溶液是低变应原的。
在本发明另一个实施方案中，已经发现，在这里公开的混合物可用于 制造降低血小板活化因子(PAF)及其它炎性细胞因子水平用的产品，用于 治疗胃肠疾病。
PAF涉及一系列胃肠疾病，特别是炎性病症。本发明人可以提及缺血 性肠坏死(Hsueh W.，Gonzalez-Crussi F.；Methods Achiev.Exp.Pathol； 1988：13；208-39)、胃溃疡(Esplugues JV.，Whittle B.J.，Methods Find.；1989： Suppl.1，61-6)、出血性直肠结肠炎(Chaussade S.，Denizot Y，Ann. Gastroenterol.Hepatol.(Paris)；1991，May 27(3)：117-21)、坏死性小肠结肠炎 (Ewer AK.，Acta Pediatr.Suppl.；2002，91(437)：2-5；neonatal：Caplan MS.，et al.，Semin.Pediatr.Surg.；2005，Aug 14(3)：154-51)、炎性肠病(NassifA.，et al. Dis.Colon Rectum；1996，Feb.；39(2)：217-23)、囊炎(Rothenberg DA.，et al. Ann.Chir.；1993；47(10)：1043-6)。
鉴于以上解释，根据本发明的产品还可以补充到受试者，特别是可以 受一系列炎性疾病影响的具有PAF-水解酶缺陷的日本人。(Karasawa K；et al.；Prog.Lipid.Res.；2003 Mar.，42(2)：93-114)。
所述产品可以采取食品的形式，如上所公开，或者采取营养补剂、营 养药、药物的形式。
营养补剂和营养药在本领域中是众所周知的术语(Arvanitoyannis IS， 等；Crit.Rev.Food ScL Nutr.；2005，45(5)：385-404和Kalra EK，AAPS PharmSci.；2003，5(3)；E25)并且不需要进一步的定义。
下列实施例进一步说明本发明。
实施例1
酸酵种发酵和电泳分析
使用的小麦面粉的特征如下：水分，12.8％；蛋白质(N×5.70)，10.7％的 干物质(d.m.)；脂肪，d.m.的1.8％；灰分，d.m.的0.6％；和总可溶性糖类，d.m. 的1.5％。将八十克小麦面粉和190ml自来水(含有细胞制剂的细胞浓度约 为109cfu/g生面团)用于产生270g生面团(生面团产率，220)。通过使用下 列乳酸和双歧杆菌的混合物制造四个生面团。
根据本发明的混合物1：
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、
婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、
长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、
短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、
植物乳杆菌(Lactobacillus plantrum)
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)。
根据本发明的混合物2：
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、
乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、
短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、
干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)。
混合物3
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、
嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、
婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)。
混合物4
短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、
唾液乳杆菌水杨苷亚种(Lactobacillus salivarius spp.salicinius)
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)
发酵在37℃进行24h。将不含细菌接种物的生面团用乳酸和乙酸的 混合物(摩尔比4∶1)化学酸化至pH4.0用作对照。在温育后，按照由Osborne (Osboerne，T.B.；1970，The proteins of the wheat kernel.Carnegie Institute of Washington publication 84.Judd and Detweiler，Washington，D.C.)最先描述 并且由Weiss等(Weiss，等；1993，Electrophoresis，14：805-816)进一步修改的 方法从生面团提取麦醇溶蛋白。
将10-20μl的等分部分(约10μg麦醇溶蛋白)用样品缓冲液1∶1稀释， 在100℃处理5min并用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 根据Laemmli程序(Laemmli；1970，Nature，227：680-685)分析；所述凝胶含 有12％丙烯酰胺并且用B10 Bio-Safe Coomassie blue(Bio-Rad Laboratories， Hercules，CA)染色。如Cagno等(Di Cagno；et al.，2004)所描述进行二维凝 胶电泳(2DE)。分析三种凝胶，并且如Bini等(Bini，等；1997，Electrophoresis， 18：2832-2841)所报道将化学酸化的生面团(siCAD)和酸酵种(加入混合物1) (siSD)的斑点强度标准化。单独蛋白质的水解因子表示为 [(siCAD-siSD)/siCAD]×100。基于三个凝胶的斑点强度的平均值计算全部 水解因子，并且计算标准偏差。仅报道了具有其中P值＜0.05的统计显著 性的水解因子。
合成底物、富Pro多肽的水解和RP-FPLC分析
预先，通过使用合成底物诸如Pro-p-NA、Leu-p-NA、Ala-p-NA、 Leu-Leu、Val-Leu、Pro-Gly、Gly-Pro-Ala、Leu-Leu-Leu、Z-Gly-Pro-p-NA 和NCBZ-Gly-Gly-Leu-p-NA(Sigma Chemical Co，St.Louis，Mo)表征混合 物1的脯氨酸特异性肽酶活性。测定混合物含有500μl的200mM磷酸盐 缓冲液，pH7.5，150μl的底物(0.2-3mM，终浓度)，8μl的NaN3(0.05％终浓 度)和50μl混合物1制剂(5×109cfu/ml，终浓度)。A-麦醇溶蛋白的片段 62-75(P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-S-F-P)(Silano and De Vincenzi；1999)和表 位33-聚物(L-Q-L-Q-P-F-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-L-P-Y-P-Q-P-Q-L-P-YP -Q-P-Q-P-F)(Shan等，2002)由Neosystem Laboratoire(斯特拉斯堡，法国) 化学合成。用于片段62-75的测定混合物含有320μl的20mM磷酸盐缓冲 液，pH7.0，150μl底物(450μM，终浓度)，8μl of NaN3(0.05％终浓度)和50 μl的混合物1制剂(5×109cfu/ml，终浓度)。表位33-聚物的测定混合物含有 500μl的200mM磷酸盐缓冲液，pH7.5，150μl底物(200μM，终浓度)，8μl 的NaN3(0.05％终浓度)和50μl混合物1制剂(5×109cfu/ml，终浓度)。将两 种混合物在37℃在搅拌条件(150rpm)下温育。通过利用Lineweaver-Burk 曲线(Lineweaver和Burk；1934，J.American Chem.Soc，56：658-666)计算33- 聚物水解的酶动力学。
通过添加0.05体积％(终浓度)三氟乙酸终止酶反应。通过RP-FPLC利 用Resource II RPC 3ml柱和装备有在214nm操作的UV检测器的 FPLC(Amersham Bioscences，Upssala，瑞典)从混合物分离肽。以1ml/min 的流速用0.05％三氟乙酸中的乙腈梯度(5至100％)洗脱。CH3CN的浓度从 16和62min之间的5至46％和62和72min之间的46％至100％线性增加。
将相同程序用于确定发酵生面团的70％的乙醇可溶提取物中包含的 寡肽。
与乳酸细菌和双歧杆菌有关的真菌蛋白酶的应用
为了产生不含谷蛋白的酸酵种(＜200ppm)，将混合物1用于与常规用 于焙烤食品的200ppm的真菌蛋白酶联合。在发酵期间，来自细菌和真菌 来源的蛋白水解活性的补充活性特别是对于麦醇溶蛋白和麦谷蛋白级分 给出了明显的下降。发酵的酸酵种的乙醇可溶提取物显示谷蛋白浓度低于 200ppm，如通过利用单克隆抗体R5确定。
用R5单克隆抗体和RAPDPCR分析的蛋白质印迹
用混合物1(约109cfu/g生面团)发酵的生面团(37℃，24h)与非蛋白质 组分和耐受面粉(例如，小米)混合以产生意大利饼干并且在250℃进行焙 烤15min。在不用混合物1发酵的情况下，将意大利饼干用作对照。通过 蛋白质印迹R5单克隆抗体和RAPD PCR在Centro National de Biotecnologia，Gluten Unit，CNB(28049马德里西班牙)分析饼干。R5单克 隆抗体识别潜在的毒性乳糜泻肽：QQPFP和33-聚物。基于与潜在的毒性 肽有关的特定DNA序列进行RAPD PCR。
小麦面粉盐溶蛋白质(清蛋白和球蛋白)的水解
通过Weiss的方法(1993)从小麦面粉萃取清蛋白和球蛋白。测定混合 物，在50mM Tris-HCl中含有0.8ml的清蛋白/球蛋白(约3mg/ml)，pH7.0， 5×109cfu/ml的混合物1和NaN30.05％。温育在搅拌条件下在37℃进行 24h。将没有微生物细胞的对照包括在测试中。在温育以后，通过离心回 收上清液并用于电泳。通过免疫印迹(Curioni，A.等，1999，Clin.Exp.Allergy， 29：407-413)分析来自水/盐溶级分的蛋白质(清蛋白和球蛋白)以检测来自 特异反应性患者的混合血清的IgE结合，所述患者先前鉴定为遭受与小麦 摄食相关的胃肠症状。通过利用半干印迹，将由SDS-PAGE分开的蛋白质 条带用Trans-blot Cell(Bio-Rad Laboratories，米兰，意大利)用含有48mM Tris，pH9.2，39mM甘氨酸，20％甲醇和0.1％SDS的转移缓冲液转移到硝 化纤维片上，在50V的电压转移5h。通过在丽春红S(在3％三氯乙酸中 0.1％)中将膜浸渍几分钟而显现印迹条带并且将其用铅笔标记，之后用水 脱色。用含有0.05％吐温20(TBS-T)的TBS和5％脱脂奶粉(M-TBS-T)将膜 封闭2h，并且用来自患者的混合血清温育过夜，在TBS-T中1∶20稀释。 在用M-TBS-T洗涤五次以后，将印迹用单克隆抗人IgE过氧化物酶-缀合 抗体(Sigma Chemical Co)温育1h，在M-TBS-T(Curioni等；1999)中1∶5000 稀释。在M-TBS-T中四次洗涤和在TBS中一次洗涤以后，通过利用 Supersignal Detection试剂盒(Pierce Biotechnology Inc.，Rockford，IL)根据由 该厂商提供的指导书的化学发光显现。所述程序在室温下进行。
与对照相比，从用四种细胞制剂发酵的生面团萃取的麦醇溶蛋白级分 的SDS-PAGE图显示并非全部细胞制剂具有相同的降解麦醇溶蛋白的能 力。对于本发明混合物1的水解是很高的，对于混合物2仅仅是轻微的， 而其它细胞制剂(混合物3和4)不引起可察觉到的降解。
通过70％乙醇可溶蛋白质级分的RP-FPLC分析证实四种细胞制剂之 中的差异，其给出了具有低于通过电泳可检测出的那些的表观分子量的寡 肽的全图。
以上结果给出了混合物1的最高性能的重大证据，其看起来具有蛋白 水解活性，更具体而言应用于麦醇溶蛋白的蛋白水解活性。
当构成混合物1的细菌种类以约109细胞/g生面团的相同浓度单独使 用时，8个种类没有给出如所述混合物所示的显著水解。这是以充分限定 的比例用于混合物1的至少6个菌株的种之间的互补蛋白水解活性的第一 证据。
麦醇溶蛋白和相关寡肽特征在于它们序列之内大比例的脯氨酸残基 (Wieser，1996，Acta Pe-diatr.Suppl.412：3-9)。在20种氨基酸中脯氨酸是独特 的，由于它的环状结构。该特定构象赋予关于肽和蛋白质结构方面的许多限 制，使它们非常耐水解。为了充分处理这样的肽，一组特定肽酶对于水解 全部肽键是必需的，其中脯氨酸残基在不同的位置作为潜在底物存在 (Cunningham和Connor；1997，Bio-chim.Biophys.Acta，1343：160-186)。预 先地，通过利用合成的底物表征混合物1的脯氨酸特异性肽酶活性，所述 合成的底物诸如Pro-p-NA，Leu-p-NA，Ala-p-NA，Leu-Leu，Val-Leu，Pro-Gly， Gly-Pro-Ala，Leu-Leu-Leu，Z-Gly-Pro-p-NA和NCBZ-Gly-Gly-Leu-p-NA， 其对于脯氨酸亚氨基肽酶、氨肽酶、二肽酶、脯氨酰氨基酸二肽酶、氨酰 基脯氨酸酶、二肽基肽酶、三肽酶、脯氨酰内肽酶和内肽酶酶类分别是相 对特异性的(表1)。
表1
混合物1的酶活性
底物 酶的类型 底物浓度(mM) 活性单位(U) Pro-p-NA Leu-p-NA Ala-p-Na Leu-Leu Val-Leu Pro-Gly Val-Pro Gly-Pro-Ala   Leu-Leu-Leu Z-Gly-Pro-p-NA NCBZ Gly-Gly-Leu-p-NA 脯氨酸亚氨基肽酶 氨肽酶 氨肽酶 二肽酶 二肽酶 脯氨酰氨基酸二肽酶 脯氨酰氨基酸二肽酶 二肽基肽酶IV/羧肽 酶P 三肽酶 脯氨酰内肽酶 内肽酶  2  2  2  2  2  3  2  2    2  2  2  3.2±0.02  8.4±0.04  12.3±0.05  15.51±0.03  17.22±0.07  8.0±0.02  3.03±0.02  2.73±0.01    10.63±0.41  1.3±0.01  1.9±0.02
每个值是三个酶测定的平均值，并计算标准偏差。关于p-NA底物的酶活性单位(U)规 定为在410产生0.01/min的吸光度增加的酶量。关于多肽的单位是释放1微摩尔底物 /min的酶量。
全部以上酶活性大量分布在混合物1制剂中。因为独特的微生物菌株 可以拥有全部上述酶活性(Cunningham和O′Connor；1997；Kunjii 等；1996，Antoine Van Leeuwenhoek 70：187-221；Di Cagno等；2004)是非常稀 有的，所以只有选择细菌诸如混合物1中含有的那些的集合可以具有水解 富含Pro的寡肽所需的完全肽酶模式。
在生面团发酵期间用混合物1制剂水解麦醇溶蛋白寡肽进一步用2DE 分析表征。在用作对照的化学酸化的生面团中鉴定了八十四个蛋白质斑点 (图1A)。与对照相比，84个麦醇溶蛋白寡肽斑点中的七十九个是在用混 合物1的生面团发酵以后显著降解的(图1B)。表2指的是通过2DE鉴定 的斑点水解因子。大部分降解的寡肽(79个中的65个)具有高于80％的水 解因子并且仅有8个显示低于40％的水解因子。
表2
在37℃将生面团温育24h以后用混合物1水解的醇可溶多肽的性质a。
斑点标号b   推测的pI   推测的分子量(kDa)     水解因子     1     2     3     4     5     6     7     8     9     10     11     12     13     14     15     16     17     18     19     20     21     22     23     24     25     26     27     28     29     30     31     32     33     34     35     6.84     7.15     6.55     6.38     7.52     9.40     7.64     7.98     8.05     9.52     9.15     9.87     9.70     6.83     9.10     9.69     9.25     7.08     8.70     6.54     6.63     7.10     6.70     8.04     6.35     6.04     6.49     6.40     6.78     7.00     7.58     8.55     8.45     8.25     8.00     51.0     49.8     49.5     49.0     48.9     48.7     48.5     48.4     48.3     48.1     48.0     47.9     47.8     47.7     47.6     47.0     46.3     46.0     44.5     44.0     43.2     43.0     42.9     42.6     42.5     41.8     41.7     41.6     41.4     41.3     41.2     41.1     41.0     40.9     40.8     54.0     90.5     85.0     92.0     95.4     87.0     90.6     85.0     90.8     96.2     91.5     90.0     97.7     85.0     92.5     90.8     90.8     52.5     93.2     95.6     0.0     10.0     91.4     67.0     0.0     0.0     87.7     16.0     95.0     47.5     93.2     90.1     85.4     86.2     20.5
    36     37     38     39     40     41     42     43     44     45     46     47     48     49     50     51     52     53     54     55     56     57     58     59     60     61     62     63     64     65     66     67     68     69     70     71     72     73     74     75     76     77     78     79     80     81     82     83     84     8.68     8.85     8.90     9.18     6.37     6.56     7.20     6.05     6.26     6.48     6.57     6.81     9.55     7.57     7.95     7.80     8.05     9.20     6.62     6.26     7.12     9.64     8.08     6.60     6.26     6.40     7.10     8.06     9.20     6.61     6.85     8.75     6.15     9.65     9.00     8.20     8.48     8.60     8.98     9.14     9.37     9.60     9.51     8.90     7.15     9.45     9.46     9.47     9.48     40.7     40.65     40.6     40.55     40.5     40.4     40.0     39.9     39.8     39.7     39.6     39.5     39.3     39.0     38.9     38.7     38.6     38.5     38.3     38.2     38.1     38.0     37.9     37.8     37.5     37.3     37.1     36.7     36.5     36.3     36.0     35.8     35.7     35.6     35.5     35.2     34.9     34.7     34.5     34.3     34.1     33.9     33.6     33.0     32.2     30.3     29.3     28.0     26.6     93.1     88.6     84.8     81.5     45.6     82.0     93.0     95.2     24.8     95.0     44.5     93.5     91.7     92.4     87.9     92.0     58.2     90.8     0.0     90.7     94.8     93.1     94.5     85.7     91.5     90.4     94.8     91.2     90.0     95.7     90.0     95.2     24.8     95.0     44.5     93.5     91.7     95.0     87.9     82.0     85.0     90.8     0.0     90.7     94.8     90.5     88.5     94.7     96.5
a用Image Master软件(Pharmacia)进行分析。分析独立重复实验的四个凝胶。对于 斑点定量和水解因子计算，见材料和方法。基于四个凝胶的每一个的斑点强度计算全 部水解因子，并且计算标准偏差。b斑点标号对应与图1A和1B中凝胶的那些。
以上结果显示混合物1具有对于几乎全部水解的麦醇溶蛋白寡肽的能 力。
在体外对于文献中报道的主要担负CS的一些寡肽进一步表征混合物 1的活性：A-麦醇溶蛋白片段62-75(Silano和De Vincenzi；1999)和表位33- 聚物(Shan等；2002)。如RP-FPLC分析所示，在450μM的浓度，A-麦醇 溶蛋白的片段62-75在用5×109cfu/ml的混合物1细胞温育6h后是完全水 解的。在200μM的浓度，在用相同细胞浓度的混合物1温育24h以后， 表位33-聚物完全水解(图2)。用显示Vmax为0.26μmol/毫升/min和Km为 216μM的Lineweaver-Burk图确定33-聚物的水解动力学。如先前文献中 报道，应当注意所述表位33-聚物具有下列性质：(i)尽管延长暴露于胃和 胰腺蛋白酶，但是它保持完好；(ii)用小刷状缘膜酶类温育超过20h，它显 示小于20％的水解；和(iii)它在小肠中长时间(约24h)保持完好并且甚至作 为潜在的T-细胞增殖抗原在低浓度也起作用(Shan等2002)。以上结果显 示，混合物1包含完全水解33-聚物所需的酶活性的复杂集合体，而且这 些活性比位于胃肠水平的那些显著更高。
与欧洲的麦醇溶蛋白参考相比，意大利饼干的用R5单克隆抗体的蛋 白质印迹具有完好麦醇溶蛋白的典型分布。R5单克隆抗体的主要优点是 它识别对应于多个免疫反应性表位重复的共有氨基酸序列QXPW/FP (Osman，等；2001，Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.，13：1189-1193)的能力，其存 在于α-，γ-和ω-麦醇溶蛋白中以及不同小麦品种中(Shewry，等；1992， Cereal′s proteins and celiac disease.In：Celiac disease，Marsh M.fed]，Oxford， Blackwell Scientific Publications pp.305-348)。最大反应性与QQPFP氨基酸 序列有关，但是同源重复诸如LQPFP，QLPYP，QLPTF，QQSFP，QQTFP， PQPPP，QQPYP和PQPFP也被认为对于R5抗体具有更弱的反应性(Osman 等；2001)。有趣的是注意到，这些表位的三种(LQPFP，QLPYP和PQPFP) 位于乳糜泻患者的肠来源的人T-细胞系的有效诱导物的序列中，A-麦醇溶 蛋白33-聚肽的序列中(Shan等；2002)。用混合物1发酵的意大利饼干的蛋 白质印迹显示，α-，β-和γ-麦醇溶蛋白的大部分降解是由R5单克隆抗体识 别的。
用RAPD PCR分析证实了相同结果。
鉴定小麦清蛋白和球蛋白的变应原级分的预备试验指示，针对清蛋白 和球蛋白级分的血清试验的100％是阳性的。对于具有从15至70KDa范 围内表观分子量的蛋白质组分发现响应，对于15至45KDa左右的一些血 清强烈染色。如通过一维SDS-PAGE所确定，将未处理的清蛋白和球蛋白 与用混合物1制剂水解的比较，突出了数个潜在的变应原多肽的水解。
实施例2
将根据实施例1制备的酸酵种用于焙烤产品的制造。
制备如美国专利6,884,443的实施例中公开的焙烤产品，利用根据本 发明的生面团组合物代替所述专利的生面团组合物。在37℃将发酵进行 24小时，如以上实施例1中所公开，并使用混合物1。
所述产品导致更易消化的并且适合于受乳糜泻影响的受试者。
实施例3
将根据实施例1用混合物2制备的酸酵种用于意大利面食的制造。
意大利面食产生更易消化的，并且可以由受乳糜泻影响的受试者采 用。
实施例4
根据US 2002/0160093的教导将根据实施例1的混合物1用于面条制 造。
重复US 2002/0160093的实施例1-4，不同之处在于将含有根据本发 明的混合物1的包装加入到kansui和面粉混合物。在捏和以后，将所述混 合物在37℃进行放置24小时。然后如参考文献中公开制备面条。
所述产品导致更易消化并且适合于受乳糜泻影响的受试者。
实施例5
根据WO99/65331的教导将根据实施例1的混合物2用于面条制造。
重复WO99/65331的实施例1-2，不同之处在于将含有根据本发明混 合物2的包装添加到生面团用的组分中。在混合以后，将所述生面团在 37℃进行放置24小时。然后如参考文献中所公开而制备面条。
所述产品导致更易消化并且适合于受乳糜泻影响的受试者。
实施例6
根据EP 0 614 609的教导，将根据实施例1的混合物1用于面包衍生 物的制造。
重复EP 0 614 609的实施例1-5，不同之处在于将含有根据本发明混 合物1的包装添加到生面团制剂。在捏和以后，将所述生面团在37℃进 行放置24小时。然后如参考文献中所公开而制备产品。
所述产品导致更易消化并且适合于受乳糜泻影响的受试者。
实施例7
根据EP 1 338 209的教导，将根据实施例1的混合物2用于意大利式 细面条的制造。
重复EP 1 338 209的实施例，不同之处在于将含有根据本发明混合物 2的包装添加到用于生面团的组分。在混合以后，将所述生面团在37℃ 进行放置24小时。然后如参考文献中所公开而制备面条。
所述产品导致更易消化并且适合于受乳糜泻影响的受试者。
实施例8
Ramyun
组成：
1.面条
面粉：83-85％
精炼油：15-18％
盐：1％
其它：0.6-1％
2.干汤底(dry soup base)
干牛肉片、酱油、谷氨酸单钠、谷氨酸二钠、调味添加剂、葡萄糖、 大蒜、洋葱、青葱、红辣椒粉末、用于调味的其它成分
Ramyun的制造方法
根据制造商的建议混合面粉(有时可以以不同比例使用淀粉、米粉、大 麦粉)和水。将混合物1添加到所述生面团并且留在37℃放置24小时。
用压辊滚动混合的生面团，然后使生面团通过机器以制造单独条的面 条。可以将面条的形状和厚度通过调节切面条机的槽尺寸以及传送所述面 条的输送带的速度而修改成希望的厚度和形状。
面条经过其中温度超过100℃的蒸汽箱以诱导预胶凝淀粉(-淀粉)以使 消化更容易。
在蒸汽方法以后，用模型箱将面条成型为特定形状。
油炸过程：取决于Ramyun的类型，通过油炸方法产生脱水。面条在 150℃经历油炸过程。一些Ramyun不经历该油炸过程。
在油炸过程以后，Ramyun经历冷却过程。
根据本发明，乳酸细菌和双歧杆菌的特定混合物适合于制造基于谷类 的食品，特别是焙烤食品，其可以是由CS患者更耐受的。特别是，提供 下列优势：
(i)在生面团发酵期间降解麦醇溶蛋白寡肽的显著能力；
(ii)由2DE分析鉴定，84个麦醇溶蛋白寡肽的79个水解；
(iii)对于在不同的位置包括脯氨酸的合成肽的互补的和大的酶活性；
(iv)完全水解造成CS的寡肽(A-麦醇溶蛋白的片段62-75和表位33-聚 物)的能力；
(v)显著减少与R5单克隆抗体起反应的α-、β-和γ-麦醇溶蛋白的能力；
(vi)水解数个变应原多肽的能力。
(vii)当用真菌蛋白酶补充以上细菌的活性并在液体发酵下针对20％小 麦面粉使用时，它强烈增加产生不含谷蛋白的小麦面粉。