[0001] 序列表的参考文献

[0002] 本申请包括一个序列表，在此引入作为参考。

[0003] 发明背景

[0004] 发明领域

[0005] 本发明涉及一种硝化细菌的聚生体及其应用，尤其在水产养殖方面。 [0006] 相关技术的描述

[0007] 在水产养殖体系中，高浓度氨和亚硝酸盐的积累对水生生物是有毒的，这一般通过硝化微生物(包括氨氧化细菌(Ammonia oxidizing bacteria)(AOB)和亚硝酸盐氧化细菌(nitrite oxidizing bacteria)(NOB))的有效清除来预防。通常认为鱼池中负责氧化氨和亚硝酸盐的细菌是欧洲亚硝化单孢菌(Nitrosomonas europaea)和维氏硝化杆菌(Nitrobacter winogradskyi)。在新建的水族池中，在形成足够生物量的AOB和NOB前，氨和亚硝酸盐会达到对鱼、甲壳类和其他水生无脊椎动物有害的浓度。为减少NOB形成的时间，现在已经出现了这些生物的商品化制备方法，它们可用于水产养殖中环境中的接种，包括自养AOB和NOB生物的混合培养物。

[0008] 专利公开号为2004/0101944的美国专利申请涉及一种微生物培养物及其应用，尤其是用于去除有害物质，如氮化合物；该微生物可以从硝化微生物中选择，例如Nitrosomonas eutropha和维氏硝化杆菌。

[0009] 专利号为6,207,440的美国专利描述了分离的能够将亚硝酸盐氧化为硝酸盐的菌株，及应用其来预防或减轻含水培养基中亚硝酸盐积累的方法。

[0010] 本发明的目的之一是提供一种改进的硝化细菌的聚生体。

[0011] 发明概述

[0012] 本发明的发明人发现了一种Nitrosomonas eutropha和维氏硝化杆菌的聚生体，该聚生体比常用的欧洲亚硝化单孢菌(Nitrosomonas europaea)和维氏硝化杆菌的聚生体能够更有效的去除氨和亚硝酸盐，尤其在水产养殖方面，例如养虾。在水产 养殖如虾池中添加该聚生物可以增加总产量，增大虾的大小，降低食物转化率(获得每公斤虾需要更少的食物)，从而增加所有单位池塘的收益。

[0013] 因此，本发明提供这样一种硝化细菌的聚生体及其在水产养殖中的应用，尤其在虾池中。

[0014] 发明的详细描述

[0015] 微生物保藏

[0016] 一种有代表性的细菌聚生体是1994年以前从采集的天然来源的样本中分离的。该聚生体因专利目的根据布达佩斯条约保藏于ATCC(美国典型培养物保藏中心)，10801 University Blvd.Manassas，VA 20108 USA。Novozymes Biologicals Inc.在2004年9月
23日进行了保藏，相应的保藏号为PTA-6232。

[0017] 保藏的聚生体包括氨氧化菌和亚硝酸盐氧化菌。为分类学目的，测定了这两种生物的16S rDNA序列，分别参见SEQ ID NO：1和2。经过与GenBank提供的所有其它已公开的序列(Nucleic Acids Research 2004 Jan 1；32(1)：23-6)比对，将氨氧化菌分类为Nitrosomonas eutropha(Koops et a1.，J.Gen.Microbiol.1991，137，1689-1699)，亚硝酸盐氧化菌分类为维氏硝化杆菌。

[0018] 硝化聚生体

[0019] 硝化聚生体包括氨氧化菌(AOB)和亚硝酸盐氧化菌(NOB)。

[0020] AOB可能属于Nitrosomonas eutropha，和/或其具有的16S rDNA序列与SEQ ID NO：1的不相似度小于2％(同一性大于98％)，尤其不相似度小于1％(同一性大于99％)。优选的，AOB具有SEQ ID NO：1所示的16S rDNA序列或其是包含在ATCC PTA-6232中的Nitrosomonas eutropha菌株。

[0021] NOB可能属于维氏硝化杆菌，和/或其具有下述的16S rDNA序列，该16SrDNA序列与SEQ ID NO：2的不相似度小于10％(同一性大于90％)，尤其不相似度小于6％或小于3％(同一性大于94％或97％)。优选的，NOB含有与SEQ ID NO：2所示的或其是包含于ATCC PTA-6232的维氏硝化杆菌菌株。

[0022] 给定的序列可以与SEQ ID NO：1或2进行比对，然后使用BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool，参见www.ebi.ac.uk/blast/index.html)计算它们的不相似度或同一性，其中期望值(expectation value)设为10，核苷 酸错配罚值设为-3，配对奖励值(the reward for match)设为+1，空位设值罚值(gap opening penalty)设为-5，空位延伸罚值(gap extension penalty)设为-2。可采用来自PHYLIP Phylogenitic Inference Package(Felsenstein，J.1989.PHYLIP--Phylogeny Inference Package(Version 3.2).Cladistics 5：164-166)的CLUSTALW程序产生序列比对结果。也可以采用基于IUB/BESTFIT weightmatrix的Accurate Method，空位罚值和延伸罚值分别设为-15和-6.66。然后将得到的比对结果利用PHYLIP的根据Jukes-Cantor模型建立的DNADIST程序计算％不相似度(和％同一性)。

[0023] AOB和NOB可以与其他细菌一起使用，例如芽孢杆菌属(Bacillus)的(如商品化的Prawn Bac PB-628(Novozymes Biologicals的产品))，肠杆菌属(Enterobacter)和假单胞菌属(Pseudomonas)。

[0024] 硝化聚生体可制成液体，冻干粉或生物膜(例如在麸(bran)或谷蛋白(corn gluten)上)。通常接种氨氧化菌使氨氧化率达到约50-5000mgNH3-N/L/hr(通常约800)，接种亚硝酸盐氧化菌使亚硝酸盐氧化率达到约10-2000mg NO2-N/L/hr(通常约275)。 [0025] 氨和亚硝酸盐氧化率

[0026] 以NH4Cl作为底物在30℃和pH8.0条件下孵育测定氨氧化率。以NaNO2作为底物在30℃和pH7.5-7.8条件下孵育测定亚硝酸盐氧化率。

[0027] 培养

[0028] 聚生体可采用本领域已知的方法进行大量培养。参见，如H Koops，UPurkhold，A Pommerening-Roser，G Timmermann，and M Wagner， ″ TheLithoautotrophic Amnmonia-Oxidizing Bacteria， ″ in M.Dworkin et al.，eds.，TheProkaryotes：An Evolving Electronic Resource for the MicrobiologicalCommunity，3rd edition，release 3.13，2004，Springer-Verlag，New York。

[0029] 硝化聚生体可制成液体，冻干粉或生物膜(例如在麸或谷蛋白)上)。通常配制为使氨氧化率约50-5000mg NH3-N/L/hr(通常约800)，使亚硝酸盐氧化率约10-2000mg NO2-N/L/hr(通常约275)。

[0030] 聚生体的应用

[0031] 聚生体可用于硝化含氨或亚硝酸盐的液体。因此，它可用来喂养水生生物如鱼(淡水或咸水鱼)或甲壳类(如虾)，尤其用于生产水产养殖的食物源(food stock)，保持水产养殖容器中氨和亚硝酸盐水平在有害浓度以 下。水生生物可能在容器(例如水产养殖容器，桶，水族箱，池塘，室外商品化或观赏性的鱼或虾池，或育种池)的液体(淡水或咸水)中培养。因此，在用于海虾养殖的虾池中添加该微生物可将有毒的有机和无机废物降到一个对环境安全的水平。

[0032] 通常在水产养殖容器中每500,000升加入0.5～300升硝化聚生体处理，例如，每500,000升中加入1-300升处理，优选的处理方法是在10周处理期间每周每500,000升水中加入约2升硝化聚生体处理。通常接种氨氧化菌使NH3氧化率达到0.01-10mg NH3-N/L/hr，例如0.03-3或0.1-10mg NH3-N/L/hr，尤其是0.3-3mg NH3-N/L/hr。通常接种亚硝酸盐氧化菌使NO2氧化率达到约0.003-3mg NO2-N/L/hr，例如0.03-3mg NO2-N/L/hr，尤其是
0.01-1或0.1-1mgNO2-N/L/hr。

[0033] 池或水族箱(aquarium)中液体的盐度范围可以在0-36ppt(parts perthousand，千分之一)之间，优选的盐度范围是4-22ppt。温度可以在约18-38℃，典型的是在约30℃。pH可以在约6.8-8.5。水产养殖容器可用传统装置如桨轮或喷射泵通气充氧，典型的是达到40-100％氧气饱和度，或溶氧3.5-7.5mg/L。水产养殖容器也可用非机械、自然的方法放气。

[0034] 可加入抗生素(如环己酰亚胺(cycloheximide))以阻止原生生物(如阿米巴虫(amoebas))生长。

[0035] 在其中氨和/或亚硝酸盐已达到有害水平(例如在不同的工业废水处理设施，城市废物处理，或观赏性池塘中)情况下，在常规基础上添加相似量的硝化聚生物可能有利于其他的环境装置，这依赖于水力停留时间(hydraulic retention time)及初始氨和亚硝酸盐的浓度。实施例

[0036] 实施例1：瓶中氨的氧化

[0037] 在仔细维持的条件下(包括仔细维持温度下，4ppt的盐水培养基(pH8)，充氧到目标DO(溶氧；4-5mg/L O2)水平，30℃培育，并提供特定水平的标准食物颗粒(每天每池中添加虾重的5-10％))，虾在养殖槽中活跃地生长4天，然后从活跃地虾的养殖槽中取水作为起始底物溶液，用于在瓶中进行研究。4天后，氨积累到大约1.4-2.0ppm NH3，这个浓度水平开始不利于虾的进一步生长。该培养基经过滤除去背景微生物(异养生物)，分装到摇瓶 中进行下一步研究。瓶中接种下列菌株到指定的氧化率：

[0038]

[0039] 在从第0天到第8天的硝化过程中测定了下列三个关键因素：氨(NH4+)，亚硝酸盐(NO2)和硝酸盐(NO3)。

[0040] 1.氨(ppm NH4+)变化：

[0041]天数 对照 现有技术 参比 本发明
0 9 9 9 9
1 9.0 6.2 4.9 4.1
2 8.9 4.3 0.6 0.6
3 8.7 3.4 0.6 0.6
6 8.7 0.6 0.4 0.3
7 8.4 0.3 0.4 0
8 8.2 0.2 0.3 0

[0042] 2.亚硝酸盐(ppm NO2)变化：

[0043]

[0044]

[0045] 3.硝酸盐(ppm NO3)变化：

[0046]天数 对照 现有技术 参比 本发明
0 0 0 0 0
1 0 4.4 0 4.8
2 0 10.5 0 12.3
3 0 12.5 0 13.7
6 0 18.7 0 19.4
7 0 19.4 0 19.9
8 0 19.5 0 20.4

[0047] 结果清楚显示Nitrosomonas eutropha和维氏硝化杆菌的聚生体能够更有效的将氨氧化为硝酸盐。只含氨氧化菌Nitrosomonas eutropha的参比(reference)能够将氨氧化为亚硝酸盐，但不能将亚硝酸盐氧化为硝酸盐。现有技术的聚生体能够将氨氧化为亚硝酸盐，但去除氨的效率不高。

[0048] 实施例2：虾养殖槽中氨的氧化

[0049] 为在虾养殖槽中进行研究，虾养在如实施例1所述的养殖槽中，只在研究的第一th天接种一次。槽中研究使用的接种率是实施例1比率(rate)的1/10 。典型的，在5加仑养殖用盐水中加入2.5ml硝化菌株浓缩物，其氨氧化率为800mg NH3-N/L/hr，亚硝酸盐氧化率(在适用之处)至少为270mgNO2-N/L/hr。最终氨氧化率为0.1mg NH3-N/L/hr，亚硝酸盐氧化率(在适用之处)至少为0.03mg NO2-N/L/hr。槽中氨，亚硝酸盐和硝酸盐的积累用实施例1中相同的菌株处理。水中也存在异养细菌(天然存在于食物和虾本身，和渔场池塘(farm ponds)一样)，它们可能附着于絮状硝化聚生体并抑制氨或亚硝酸盐的有效利用。 [0050] 1.氨(ppm NH4+)变化：

[0051]天数 对照 现有技术 参比 本发明
0 0 0 0 0
1 0.9 0.8 0.7 0.9

[0052]2 1.6 1.5 1.5 1.3
3 1.8 1.6 1.4 1.2
6 2.1 2.2 1.1 0.7
7 2.3 2 0.6 0.1
8 2.6 2.5 0.6 0.0

[0053] 2.亚硝酸盐(ppm NO2)变化：

[0054]天数 对照 现有技术 参比 本发明
0 0 0 0 0
1 0.03 0.01 0.06 0.037
2 0.06 0.06 0.29 0.35
3 0.06 0.07 1.74 1.32
6 0.06 0.07 7.04 5.12
7 0.06 0.06 13.92 10.24
8 0.04 0.04 19.20 13.80

[0055] 3.硝酸盐(ppm NO3)变化：

[0056]天数 对照 现有技术 参比 本发明
0 0 0 0 0
1 0.2 0.2 0.3 0.2
2 0.3 0.4 0.8 0.6
3 0.8 0.7 1.2 3
6 0.4 0.5 1.3 9.2
7 0.4 0.5 2.2 24
8 0.3 0.4 2.5 33

[0057] 出乎意料的是，Nitrosomonas eutropha和维氏硝化杆菌的聚生体在自然环境中也能进行有效的氨氧化，但现有技术中的欧洲亚硝化单孢菌和维氏硝化杆菌的聚生体的效率要低得多。尽管现有技术中的聚生体在实施例1的瓶中与本发明聚生体针对氨的效率几乎相同，但本实施例中现有技术中的聚生体效率要低得多。值得注意的是本发明中亚硝酸盐(NO2)的水平高于参比(因为前者较高的氨氧化活性)，并且由于本发明的亚硝酸盐氧化-活性将形成的亚硝酸盐转化为硝酸盐，所以本发明的硝酸盐水平(NO3) 也较高。 [0058] 实施例3：田间实验(field trial)

[0059] 田间实验采用预选的Litopenaeus vannamei幼虾，购自商业化的虾苗孵育场，投苗(stock)密度为每平方米110个幼虾。两个独立的虾池(每个0.8公顷)用硝化微生物产品的标准方案处理，在投苗后第4周每池加入4加仑浓缩的硝化聚生体，然后在第5和6周分别加入2加仑，第13周加入1加仑。在研究过程中，所有接种的AOB细菌的量相当于0.01mg NH3-N/L/hr，所有接种的NOB细菌的量相当于0.003mg NO2-N/L/hr。另外5个大小和投苗(sized and stocked)相似的池塘作为未处理的对照，与接受处理的池塘加入相同数量的食物。所有的池塘都通过机械供氧，白天氧气水平达到至少4.5mg/L O2。 [0060] 池塘中的水温和盐度随典型地季节波动，平均温度在27-32℃之间，盐度在
22-24ppt之间。每天均对池塘进行投食，在邻近收获时每天达到投食四次。 [0061] 五个未处理对照池中的四个在第六周出现由于氨应激性和病毒病导致的虾的死亡。剩余的对照池养殖到第82天收获，此时氨的水平已造成饲喂应激性(stress)和疾病敏感性。而经过处理的池塘在超过100天后仍保持健康状态。

[0062] 经处理的池塘的虾产量(kg/ha)；食物转化率(Feed Conversion Ratio，FCR)；和单个虾重量(wt/pcs)等所有这些关键指标均远远好于未处理的对照池。 [0063] 氨氮(NH3-N)和亚硝酸氮(NO2-N)是本实验最重要的物理参数。在前8周的检测中，与所有对照池中氨和亚硝酸盐水平稳定上升相比，所有接受处理的池中氨和亚硝酸盐的水平保持非常低的水平。很明显，这些NH3和NO2的增加结果非常严重，导致四个对照池中的虾由于死亡而提前结束生长。随着生长的进行，在存活的对照池中观察到显著的氨和硝酸盐水平的增加，而接受处理的池中其水平非常低，接近于零。

[0064] 在第8周从接受处理的池中取出的虾比取自对照池中的虾个头略大，更有活力(跳跃)。这可能是因为相对于接受处理的池中较低的氨和亚硝酸盐水平，对照池中二者浓度较高造成的。与存活的对照池中5.2kg/ha的产量相比，接受处理的池中最终平均产量是19.5kg/ha。

[0065] 这个数据表明生物前期处理可产生显著的、可重复的效果，尤其考虑到氨和亚硝酸盐的水质以及虾生长和产量参数的增加。此外，与以往收获时观察到的和未处理的对照池的底部相比，接受处理的虾池底部的残留淤泥显著减少。