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一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法及其应用
申请号	CN201610251264.3	申请日	2016-04-21	公开(公告)号	CN105713886A	公开(公告)日	2016-06-29
申请人	山东省林木种质资源中心;			发明人	解孝满; 程仕伟; 吴府胜; 韩彪; 李文清; 张萍;
摘要	本发明涉及一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法及其应用，属于生物技术领域，该壳聚糖酶是由保藏号为CGMCC No.10026的菌株发酵获得的，离心过滤去菌体后经硫酸铵沉淀后再经Sephadex G-100柱层析纯化后制备精纯酶。本发明纯化后的淡紫拟青霉壳聚糖酶能高效酶解壳聚糖，且产物壳寡糖的得率高、生理活性强，适合工业化生产。
权利要求	1.一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于它包括如下步骤： (1)粗酶制备：淡紫拟青霉YT08 发酵液经10000r/min离心5min，去除菌体后收集保留上清液，然后再经微孔过滤膜过滤除淡紫拟青霉YT08菌体，即为粗酶液； (2)淡紫拟青霉壳聚糖酶纯化：在步骤(1)获得的粗酶液中加入固体硫酸铵至30％的饱和度，4℃冰箱冷藏静置5～10h后，离心去除杂蛋白，并收集上清液；离心去杂蛋白后的上清液上再加入固体硫酸铵至80％的饱和度，4℃冰箱冷藏静置过夜，离心，收集沉淀；用pH5.0的0.2mol/L HAc-NaAc缓冲液溶解沉淀，在透析袋中透析除盐，透析后的酶液经PEG4000浓缩后经Sephadex G-100柱层析纯化，用0.2mol/L pH5.0HAc-NaAc缓冲液洗脱，流速在0.5～ 1mL/min；检测每管酶液的酶活力和蛋白含量，合并酶峰部分的酶液，最后经PEG4000浓缩，即得纯化后的淡紫拟青霉壳聚糖酶，冷冻干燥后制得固态淡紫拟青霉壳聚糖酶。 2.根据权利要求1所述的一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于淡紫拟青霉壳聚糖酶粗酶液的制备方法： (1)菌种活化：取保存淡紫拟青霉YT08菌种接种于活化培养基中，在28℃、200rpm下培养至菌体浑浊，制得活化种子液； (2)发酵生产壳聚糖酶：按照0.2～0.8％(v/v)的接种量在灭菌后的发酵培养基中接入步骤(1)活化种子液，在180rpm的旋转摇床中培养，控制温度为30～34℃，发酵3-5d后培养完毕，发酵液经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用；或者在发酵罐中以70％的体积比例装入发酵培养基，经118℃蒸汽灭菌20min后，按照0.2～0.8％(v/v)的比例接入活化的菌种，控制发酵过程中的pH始终维持在pH 5～6.5，调节培养温度在30～34℃，溶解氧维持在10％(mg/ml)以上，经发酵2-4d后发酵完毕，经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用。 3.一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的活化培养基(g/L)：蛋白胨 5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH 7.0，121℃灭菌20min备用。 4.一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，其特征在于所述的发酵培养基(g/L)：甘油10～20，大豆蛋白胨20～35，MnSO4 0.5～2.5，脱乙酰度85％以上的粉末壳聚糖12～20，NaCl 2.5～4，CaCl2 0.5～1.5，MgSO4 1.5～3.5，FeSO4 0.5～2，pH 5～6.5。
说明书全文	一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法及其应用技术领域 [0001] 本发明涉及一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，以及其在壳寡糖生产中的应用，属于生物技术领域。背景技术 [0002] 壳聚糖是由D-氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接的一类阳离子型氨基多糖，是几丁质部分或完全脱乙酰基的衍生物，在过去的几十年里壳聚糖作为潜在的生物活性物质被广泛研究，但是壳聚糖的应用仍存在一些缺陷，如在生理条件下的低溶解性和高粘度导致其有效应用受到阻碍。壳寡糖是壳聚糖经水解后产生的一类聚合度在2-20且可溶于水的氨基糖类化合物，具有独特的生理活性和优越的功能性质，在食品、农业、医药和化工领域具有重要应用，如可以作为功能性食品添加剂和防腐剂，在农业上作为植物调节剂和生物防治剂，在医药上可以作为抗癌和免疫系统的药物等。 [0003] 壳寡糖的制备方法有酶法、氧化法和酸降解法，其中酶法制备壳寡糖具有反应条件温和、可人为控制降解速率和产物相对分子质量、不产生二次污染等优点。在酶法制备壳寡糖中，具有突出应用前景的是专一性酶(壳聚糖酶)转化法制备，其相对于非专一性酶(如纤维素酶、蛋白酶、脂肪酶、溶菌酶和果胶酶等)来说，具有催化效率高、产物聚合度适中且具有高生理生化活性等突出优点。壳聚糖酶(Chitosanase，EC 3.2.1.132)作为一类催化氨基葡萄糖间的β-1,4-糖苷键断裂，专一性降解壳聚糖的糖苷水解酶，是在催化壳聚糖底物水解转化制备壳寡糖的产业化领域具有重要应用前景的酶类，尤其是在低分子量且高生理活性的壳寡糖制备方面的应用引人注目。发明内容 [0004] 本发明要解决的技术问题在于提供一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法及其应用，本发明是在筛选获得一株用于番茄和葡萄根结线虫害防治的淡紫拟青霉(发明专利CN 104818216 A)的基础上，研究表明该菌株高产壳聚糖酶，以此优化其培养工艺，并确立了简单易行的壳聚糖酶制备及纯化方法，所述纯化方法采用成本较低且操作简单的一次柱纯化工艺制备精纯壳聚糖酶，有别于以往的二次层析制备工艺，所述纯化后的壳聚糖酶可通过高效水解壳聚糖来生产高生理活性的壳寡糖。 [0005] 本发明是通过如下技术方案来实现的： [0006] 淡紫拟青霉YT08菌株，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2014年11月26日，保藏号为CGMCC No.10026，分类命名：淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)。 [0007] 一种淡紫拟青霉壳聚糖酶的制备方法，包括如下步骤：1)粗酶制备：淡紫拟青霉YT08 发酵液经10000r/min离心5min，去除菌体后收集保留上清液，然后再经微孔过滤膜过滤除淡紫拟青霉YT08菌体，即为粗酶液； [0008] (2)淡紫拟青霉壳聚糖酶纯化：在步骤(1)获得的粗酶液中加入固体硫酸铵至30％的饱和度，4℃冰箱冷藏静置5～10h后，离心去除杂蛋白，并收集上清液；离心去杂蛋白后的上清液上再加入固体硫酸铵至80％的饱和度，4℃冰箱冷藏静置过夜，离心，收集沉淀；用pH5.0的0.2mol/L HAc-NaAc缓冲液溶解沉淀，在透析袋中透析除盐，透析后的酶液经PEG4000浓缩后经Sephadex G-100柱层析纯化，用0.2mol/L pH5.0HAc-NaAc缓冲液洗脱，流速在0.5～1mL/min；检测每管酶液的酶活力和蛋白含量，合并酶峰部分的酶液，最后经PEG4000浓缩，即得纯化后的淡紫拟青霉壳聚糖酶，冷冻干燥后制得固态淡紫拟青霉壳聚糖酶。 [0009] 进一步，淡紫拟青霉壳聚糖酶粗酶液的制备方法为(1)菌种活化：取保存淡紫拟青霉YT08菌种接种于活化培养基中，在28℃、200rpm下培养至菌体浑浊，制得活化种子液； [0010] (2)发酵生产壳聚糖酶：按照0.2～0.8％(v/v)的接种量在灭菌后的发酵培养基中接入步骤(1)活化种子液，在180rpm的旋转摇床中培养，控制温度为30～34℃，发酵3-5d后培养完毕，发酵液经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用；或者在发酵罐中以70％的体积比例装入发酵培养基，经118℃蒸汽灭菌20min后，按照0.2～0.8％(v/v)的比例接入活化的菌种，控制发酵过程中的pH始终维持在pH 5～6.5，调节培养温度在30～34℃，溶解氧维持在10％(mg/ml)以上，经发酵2-4d后发酵完毕，经离心过滤除菌后直接作为壳聚糖酶液使用。 [0011] 进一步，所述的活化培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5，pH 7.0，121℃灭菌20min备用。 [0012] 进一步，所述得发酵培养基(g/L)：甘油10～20，大豆蛋白胨20～35，MnSO4 0.5～2.5，粉末壳聚糖(85％以上的脱乙酰度)12～20，NaCl 2.5～4，CaCl2 0.5～1.5，MgSO4 1.5～3.5，FeSO4 0.5～2，pH 5～6.5。 [0013] 本发明还提供一种利用上述纯化后的淡紫拟青霉壳聚糖酶生产壳寡糖的方法：取90％以上脱乙酰度的壳聚糖，按照壳聚糖与水的质量比为1：10比例加水混合，逐渐滴加乙酸使壳聚糖完全溶解，然后滴加乙酸钠溶液调溶液pH至5.5～6.0，按照壳聚糖：溶液实际体积＝1：25～1：40比例加水定容，并于35℃～50℃保温10～15min；向保温的壳聚糖底物溶液中按照50～80U/g的比例加入纯化后的淡紫拟青霉壳聚糖酶，混合均匀后进行酶解反应，整个反应过程中控制酶解反应温度为35℃～50℃；当酶解反应进行8～15h，壳寡糖含量不再增加时终止反应；酶解产物溶液经过截留分子量10kDa的超滤膜过滤，收集膜透过液组分，浓缩后冷冻干燥制备壳聚糖。 [0014] 本发明与现有技术相比的有益效果： [0015] (1)壳聚糖酶的活力高，制备方法简单。 [0016] 本发明中的发酵酶液，经简单的离心过滤除菌后，即可直接作为酶催化剂使用，用于制备壳寡糖。 [0017] (2)精纯酶的制备步骤简单高效。 [0018] 本发明内容中精纯酶的制备，仅涉及硫酸铵沉淀后再经一步Sephadex G-100柱层析纯化后即可获得电泳纯的壳聚糖酶，相比以往文献报道的，需要2步甚至是3步以上的柱层析纯化工序来说，本发明中的精纯酶制备方法简单高效，生产成本低。 [0019] (3)酶解高效，产物壳寡糖得率高。本发明涉及的是淡紫拟青霉来源壳聚糖酶，目前尚未见淡紫拟青霉来源壳聚糖酶的产业化报道，是一新型壳聚糖酶，酶解高效，适合工厂化生产。附图说明 [0020] 图1为实施例1中淡紫拟青霉壳聚糖酶活力测定的标准曲线。 [0021] 图2为实施例2中淡紫拟青霉壳聚糖酶的纯度鉴定。 [0022] 图3为实施例2中SDS-PAGE确定淡紫拟青霉壳聚糖酶的分子量。具体实施方式 [0023] 以下结合具体实施例对本发明做进一步详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的保护范围。 [0024] 实施例1：淡紫拟青霉壳聚糖酶的粗酶制备 [0025] 从试管斜面保存菌种中挑取1环接种于活化培养基中，在28℃、200rpm下培养36h至菌体浑浊，制得活化种子液。活化培养基(g/L)：蛋白胨5，葡萄糖10，磷酸二氢钾1，硫酸镁0.5,pH 7.0，500ml三角烧瓶中分装50ml活化培养基，121℃灭菌20min。采用如下发酵培养基(g/L)：甘油15，大豆蛋白胨25，MnSO4 1，粉末壳聚糖15，NaCl 3，CaCl2 1，MgSO4 1，FeSO4 0.5。10L发酵罐中培养基的装液量为7L，经118℃蒸汽灭菌20min后，按照0.8％(v/v)的比例接入活化的菌种，控制发酵过程中的pH始终维持在pH6.5，调节培养温度在32℃，溶解氧参数始终维持在10％以上，在发酵70h时发酵完毕并放罐收集发酵液。 [0026] 发酵液经10000r/min离心5min，去除菌体后收集保留上清液，然后再经0.22um的微孔过滤膜过滤除菌，即为淡紫拟青霉YT08来源壳聚糖酶的液体粗酶，经DNS显色法测定其壳聚糖酶活力为135.20U/mL。 [0027] 在壳聚糖酶的液体粗酶中添加硫酸铵至80％的饱和度，在4℃下盐析沉淀24h，然后再经10000r/min冷冻离心(5℃)10min，收集沉淀的酶蛋白。浓缩沉淀的酶蛋白经透析脱盐处理，并浓缩后进行冷冻干燥，即可获得淡紫拟青霉壳聚糖酶固态制剂，经DNS显色法测定其壳聚糖酶活力为1543.12U/g。 [0028] 所述壳聚糖酶酶活的测定方法：发酵液经5000rpm离心10min得发酵上清液。取0.2mL发酵上清液加水至1ml，在加入1ml的底物溶液水浴(40℃)保温20min，加DNS 试剂3mL，沸水浴5min，定容至25ml后取4ml反应样液在5000rpm下离心10min。取离心后上清液以对照组作为空白在520nm处测定OD值，根据DNS标准曲线，计算其酶活力。空白对照组：0.2mL发酵上清液加水至1ml，沸水浴5min灭活，再加入相同体积的壳聚糖溶液和DNS，处理方法同样品组。酶活计算：以单位体积(ml)单位时间(min)水解产生的氨基葡萄糖的umol数为酶活力的定义单位。 [0029] 所用标准曲线的制作：精确称取100℃干燥至恒重的氨基葡萄糖盐酸盐0.13g，加蒸馏水溶解并定容至100ml，配成.6umol/mL浓度的溶液。按不同浓度梯度在各25mL比色管中加入底物溶液和3mL的DNS显色液，沸水浴反应5min，定容至25ml后于520mn下测OD值，并绘制标准曲线，见图1。 [0030] 所用壳聚糖底物溶液的配置：称取1克90％脱乙酰度的壳聚糖，加水50ml，逐渐滴加乙酸使其完全溶解，在滴加4mol/L的乙酸钠溶液调pH至6.0，定容至100ml后备用。 [0031] 所用DNS试剂的配置：91g酒石酸钾钠加入500mL热水中，在45℃水浴中搅拌溶解后依次加入20g NaOH和3.15g 3，5-二硝基水杨酸(DNS)，然后再加入2.5g结晶酚和2.5g无水亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却，用蒸馏水定容至1000mL，贮存在棕色瓶中放置暗处一周后使用。 [0032] 实施例2：淡紫拟青霉壳聚糖酶的纯化方法 [0033] 种子活化方法同实施例1，采用如下发酵培养基(g/L)：甘油12，大豆蛋白胨29，MnSO4 1，粉末壳聚糖18，NaCl 3，CaCl2 1，MgSO4 2，FeSO4 1，pH，每500mL三角烧瓶中装100mL，发酵48h后收集发酵酶液。 [0034] 收集的淡紫拟青霉来源的壳聚糖酶发酵液，在高速冷冻离心机(4℃)下8000r/min离心10min，去除菌体并收集上清酶液。上清液在缓慢搅拌的同时加入固体硫酸铵至30％的饱和度，4℃冰箱冷藏静置5h后，经8000r/min离心20min去除杂蛋白，并再次收集上清液。离心去杂蛋白后的上清液上再加入固体硫酸铵至80％的饱和度，4℃冰箱冷藏静置过夜，然后8000r/min离心20min，收集沉淀。 [0035] 用pH5.0的0.2mol/L HAc-NaAc缓冲液溶解沉淀，在透析袋中透析除盐8h，期间每隔2h更换一次透析液。透析后的酶液经PEG4000浓缩，浓缩后酶液经Sephadex G-100柱(2.5cm×80cm)层析纯化，用0.2mol/L pH5.0HAc-NaAc缓冲液洗脱，流速在0.5ml/min，每管收集5ml，检测每管酶液的酶活力和蛋白含量，合并酶峰部分的酶液，最后再经PEG4000浓缩，即得淡紫拟青霉壳聚糖酶精纯液体酶。 [0036] 用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，分离胶浓度为7％，浓缩胶浓度为3％，检测结果见图2，显示为单一条带，表明纯化后组分均为淡紫拟青霉壳聚糖酶。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法(分离胶浓度为12％，浓缩胶浓度为3％)测定其相对分子量，其结果见图2，呈现单一酶带，其相对迁移率均为3.0，由低分子量蛋白质标准曲线可知，该组分的相对分子质量为12.7kd。淡紫拟青霉壳聚糖酶的精纯液体酶经冷冻干燥机在-75℃条件下冷冻干燥后制得精纯固态酶。 [0037] 实施例3：淡紫拟青霉壳聚糖酶生产壳寡糖的的方法 [0038] 试验例1淡紫拟青霉壳聚糖酶粗酶的酶解生产壳寡糖 [0039] 称取20克90％脱乙酰度的壳聚糖，加水200ml，逐渐滴加乙酸使其完全溶解，在滴加4mol/L的乙酸钠溶液调pH至6.0，定容至500ml并于40℃水浴保温10min。向保温的壳聚糖底物溶液中加入实施例1中的淡紫拟青霉壳聚糖酶液体粗酶液10mL，混合均匀后进行酶解反应，整个反应过程中控制酶解反应温度为40℃，每个30min取样一次，DNS法测定壳寡糖的含量，当酶解反应进行11h时产物壳寡糖含量不再增加时终止反应。酶解产物溶液经过截留分子量10kDa的超滤膜过滤，收集膜透过液组分，浓缩后冷冻干燥制备壳聚糖12.7g，壳寡糖产品的实际得率为63.5％。 [0040] 试验例2淡紫拟青霉壳聚糖酶精纯酶的酶解生产壳寡糖 [0041] 称取20克90％脱乙酰度的壳聚糖，加水200ml，逐渐滴加乙酸使其完全溶解，在滴加4mol/L的乙酸钠溶液调pH至6.0，定容至500ml并于40℃水浴保温10min。向保温的壳聚糖底物溶液中加入实施例2中的淡紫拟青霉壳聚糖酶精纯酶粉0.2g，混合均匀后进行酶解反应，整个反应过程中控制酶解反应温度为40℃，每个30min取样一次，DNS法测定壳寡糖的含量，当酶解反应进行9h物壳寡糖含量不再增加时终止反应。酶解产物溶液经过截留分子量10kDa的超滤膜过滤，收集膜透过液组分，浓缩后冷冻干燥制备壳聚糖13.64g，壳寡糖产品的实际得率为68.2％。 [0042] 由试验例1和试验例2的结果可以看出，采用相同的酶解工艺，精纯酶的添加量仅为粗酶液的1/50，但是其最终壳寡糖产品得率增加，且反应时间缩短2h。此外，精纯酶的使用可以有效保证壳寡糖产品的安全性和品质，但是其生产成本比粗酶催化工艺会有所增加，因此在壳寡糖酶法生产中要根据产品需求对象灵活选择这两种工艺路线。

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