一种提高重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶产量的方法 |
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| 申请号 | CN201510409410.6 | 申请日 | 2015-07-14 | 公开(公告)号 | CN105087534A | 公开(公告)日 | 2015-11-25 |
| 申请人 | 北京嘉万生物技术有限公司; | 发明人 | 李小红; 孔毅荣; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种提高重组N-乙酰神经 氨 酸 醛 缩酶产量的方法。本发明所提供的N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因为SEQ ID NO.1，本发明将大肠杆菌N-乙酰神经氨酸醛缩酶基因Neu5Ac克隆到原核表达载体pET28a上，获得高效表达N-乙酰神经氨酸醛缩酶的重组菌。通过优化 发酵 罐的溶 氧 、PH、搅拌速率以及补料条件，使酶的产量可以达到4.5g/L，酶活可以达到600-800U/mg。本发明提供的提高N-乙酰神经氨酸醛缩酶产量的方法，其操作简单，产量较高，纯度达到98％以上，具有较高的应用前景及开发价值。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种如SEQ ID NO.1所述的蛋白质。 |
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| 说明书全文 | 一种提高重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶产量的方法技术领域背景技术[0002] 唾液酸是一个含9个碳原子并具有吡喃糖结构的酸性氨基糖，可以看成是丙酮酸和α氨基己糖的缩合物，广泛存在于许多生物体内，属于在自然界中并不存在未经修饰的神经氨酸。根据5位碳上连接基团的不同，唾液酸可分为三类：N-乙酰神经氨酸、N-羟乙酰神经氨酸、2-酮-3-脱氧-D-甘油-半乳-壬酸。虽然哺乳动物体内N-乙酰神经氨酸的量占绝大多数，但同时兼有N-羟乙酰神经氨酸。目前已证明肿瘤的转化和恶性进程伴随着细胞表面唾液酸量、连接方式和类型的显著变化。研究发现在恶性肿瘤中唾液酸及多聚唾液酸含量高于正常细胞。 [0003] Neu5Ac醛缩酶(Aldolase)既可催N-乙酰神经氨酸分解成丙酮酸和N-乙酰甘露糖胺，在一定条件下又能催化N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸成为N-乙酰神经氨酸的缩合反应。N-乙酰神经氨酸醛缩酶可与乳酸脱氢酶或者丙酮酸氧化酶耦联，以测定样品中N-乙酰神经氨酸的含量以N-乙酰甘露糖胺和丙酮酸为底物进行Neu5Ac酶法合成，这一生物催化技术具有底物立体特异性强，反应条件温和，无污染等多种优点，具有良好的应用前景，我们利用微生物发酵法高效生产N-乙酰神经氨酸醛缩酶，为唾液酸的检测提供大量原料。 发明内容[0004] 本发明的目的在于提供一种提高N-乙酰神经氨酸醛缩酶产量的方法。 [0005] 本发明所采取的技术方案为： [0006] 一种重组N-乙酰神经氨酸的氨基酸序列如SEQ ID NO：1。 [0007] 重组N-乙酰神经氨酸的表达方法包括如下步骤： [0008] 1.将目的基因的5′端加入Nco I酶切位点，3′加入Xho I酶切位点酶切位点，设计引物，PCR扩增获得Neu5A序列； [0009] 2.将合成的序列从puc57载体切下，插入到原核表达载体的多克隆位点，构建重组表达质粒，将重组表达质粒转化到表达宿主菌大肠杆菌，筛选出阳性克隆菌，获得工程菌； [0010] 3.原核表达载体为pET28a(+)，表达宿主为E.coli BL21(DE3)。 [0011] 重组N-乙酰神经氨酸发酵罐放大生产，步骤如下： [0012] 1.本发明采取以下的技术措施来实现放大生产。 [0013] 2.具体地，利用单因子实验确定最佳IPTG、溶氧、pH以及温度。 [0014] 3.前述的方法，通过设计单因子实验确定发酵温度及IPTG的浓度，结果表明(如图1)，300ml培养基。当IPTG的浓度为0.1mol/L，诱导温度为28℃时，酶产量最高。 [0015] 4.前述的培养基LB+10％glucose。 [0016] 5.具体地可以采用以下方法验证实际发酵过程中IPTG、溶氧、pH和转速。 [0017] 6.为减少IPTG对细胞的毒性，通过改变发酵培养基和补料策略提高酶产量。 [0018] 7.前述的培养基配方为Tryptone 5g/L，Yeast extract 0.25g/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO4 7g/L，一水柠檬酸0.9g/L，MgSO4·7H2O 0.7g/L，葡萄糖15g/L，微量元素母液：3mL。 [0019] 8.前述微量元素的组成为HCl 10g/L，FeSO4·H2O 2.25g/L，ZnSO41.0g/L，CuSO4·5H2O 2g/L，CaCl2·2H2O 0.5g/L以水配制。 [0020] 9.前述的方法，补料培养基分为两种，补料1：MgSO4.7H2O 5g/L，Yeast extract240g/L，Tryptone 100g/L，甘油90g/L，乳糖60g/L；补料2：甘油500g/L，乳糖150g/L。 [0021] 10.前述方法，其中所述的发酵温度为30-38℃，pH6.5-7.5，溶氧为0-100％，当OD600达到18时加入补料1，当诱导后DO上升时加入补料2。发酵25-30h。 [0022] 11.通过补料批式发酵酶的产量可以达到4.5g/L(如图3)，OD600可以达到60，成本低廉，适于大规模生产，因而具有较好的产业价值。 [0023] 12.检测酶活，取0.5ml菌液4000r/min离心10min，生理盐水洗1～2次。菌体经-20℃过夜处理后，加入50mmol/L磷酸钠缓冲液0.5ml(pH7.5)，悬浮后取0.25ml预热10min，加入0.25ml预热的Neu5Ac溶液37℃反应10min。用10％三氯乙酸0.3ml终止反应，加入0.2ml水，加入0.2％ 2,4二硝基苯肼0.4ml摇匀，静置10min。加入3mol/L的氢氧化钠1.5ml摇匀，静置15min，12000r/min离心5min，取上清液在550nm比色测定光吸收值。 附图说明 [0024] 图1为制备N-乙酰神经氨酸醛缩酶的流程示意图 [0025] 图2为重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶表达产物的SDS-PAGE分析，其中1：破碎菌体上清；2：包涵体；M：Marker。 [0026] 图3为发酵罐中N-乙酰神经氨酸醛缩酶可溶性表达量，其中1：发酵罐诱导诱导上清；2：80mm咪唑洗脱；3：200mm咪唑洗脱。 [0027] 图4为发酵罐中菌种的生长曲线具体实施方案 [0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 [0029] 实施例1 [0030] 重组N-乙酰神经氨酸的表达方法 [0031] 1)提取大肠杆菌DH5α基因组 [0032] 2)将目的基因的5′端加入Nco I酶切位点(CCATGG)，3′加入Xho I酶切位点(CTCGAG)；通过PCR扩增获得目的序列。 [0033] 引物设计如下： [0034] F1：CATGCCATGGCAACGAATTTACGTGGCGTAATG [0035] R1：CCGCTCGAGCCCGCGCTCTTGCATCAACTG [0036] 3)将获得序列用Nco I和Xho I进行双酶切，纯化得到目的基因，原核表达载体pET28a，经相同的酶切处理，纯化大片段基因，并与双酶切后得到的目的基因连接，转入感受态细胞DH5a，用通用引物T7/T7T进行菌落PCR验证，测序确定成功，抽提质粒，得重组表达质粒NAL-pET28a。 [0037] 4)将重组表达质粒NAL-pET28a；转入感受态表达宿主菌E.coli BL21(DE3)中，涂布于LB固体培养基(含50μg/ml硫酸卡那霉素)上，37℃培养16h，筛选出阳性克隆菌为工程菌。 [0038] 5)将工程菌接种至LB培养液(含50μg/ml硫酸卡那霉素)中，37℃培养，待菌液OD600nm在0.5，加入 终浓度为0.5mmol/l的IPTG，37℃培养4h，4℃，12000rpm离心10min分离达到诱导表达上清液和菌体。 [0039] 6)将菌体用Binding Buffer洗涤1次后，冰上超声破菌，离心，收集上清液，12％SDS-GAGE检测蛋白的表达量。 [0040] 7)将超声破菌，离心，收集上清液，将上清液加入镍层析柱，一次加入Binding Buffer，Wash Buffer，最后Elute Buffer进行目的蛋白洗脱，收集Elute Buffer洗脱蛋白，获得重组N-乙酰神经氨酸醛缩酶，采用12％SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯度。 [0041] 实施例2 100L发酵罐提高N-乙酰神经氨酸醛缩酶产量的方法 [0042] 在100L的发酵罐中，初始培养基定容为60L，接种量为2％，在发酵过程中，用氨水3 控制pH值，培养温度维持在37℃，发酵液pH维持在6.9。初始的无菌空气通气量为2m/h，初始的搅拌转速为250rpm，初始的溶氧设置为100％，随着发酵的进行，溶氧开始下降，当溶氧下降到20％左右时，需要不断调整通气量和转速，使溶氧维持在20％以上，培养7-8h，当OD600达到20左右时加入补料1，同时温度降到28℃，后期加入补料2，诱导20h，酶的产量达到4.5g/L。 |
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