一种环境来源外切几丁质酶及其编码基因与应用

申请号 CN201510511301.5 申请日 2015-08-19 公开(公告)号 CN105062993A 公开(公告)日 2015-11-18
申请人 中国农业大学; 发明人 杨绍青; 刘玉春; 江正强; 闫巧娟;
摘要 本 发明 公开了一种环境来源外切几丁质酶及其编码基因与应用。本发明的几丁质酶是如下a)或b)或c)的 蛋白质 :a) 氨 基酸序列是 序列表 中序列2所示的蛋白质;b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过实验证明:该几丁质酶在模拟胃肠道环境中保持很高的 稳定性 和酶活 力 。
权利要求

1.蛋白质,是如下a)或b)或c)的蛋白质:
a)基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;
b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;
c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料,为下述B1)-B4)中的任一种:
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体;
B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料,其特征在于:B1)所述核酸分子为如下1)或
2)或3)的DNA分子:
1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子;
2)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有
99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子;
3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质在作为几丁质酶中的应用。
5.权利要求2或3所述的相关生物材料在制备几丁质酶中的应用。
6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在解胶体几丁质和/或几丁三糖和/或几丁四糖中的应用;
或权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在制备水解胶体几丁质和/或几丁三糖和/或几丁四糖的产品中的应用;
或权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在制备几丁二糖中的应用。
7.一种重组菌,是将几丁质酶的编码基因导入宿主菌中得到的;所述几丁质酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
8.根据权利要求7所述的重组菌,其特征在于:所述几丁质酶的编码基因是通过重组载体导入宿主菌的;
所述重组载体是将编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子插入表达载体,得到表达权利要求1所述蛋白质的载体;
所述几丁质酶的编码基因的序列如序列表中序列1所示。
9.根据权利要求7或8所述的重组菌,其特征在于:所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115。
10.一种制备几丁质酶方法,包括如下步骤:发酵培养权利要求7-9中任一所述的重组菌,得到几丁质酶。

说明书全文

一种环境来源外切几丁质酶及其编码基因与应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域,具体涉及一种环境来源外切几丁质酶及其编码基因与应用。

背景技术

[0002] 几丁质是由N-乙酰-D-葡萄糖以β-1,4-糖苷键连接而成的高分子聚合物,广泛存在于自然界,是仅次于纤维素的第二大可再生资源。几丁质的降解产物几丁寡糖和N-乙酰氨基葡萄糖具有抗菌、抗肿瘤等活性,在食品、农业、医学、环保、生物工程等领域具有广泛的应用前景(Synowiecki J,Al-Khateeb NA.Production,properties,and some new applications of chitin and its derivatives.Crit Rev Food Sci 2010;43:145-71)。几丁质酶广泛分布于自然界中,几乎从微生物到高等动植物所有的生物类群中都有分布。
国内外对于几丁质酶的筛选大多采用单菌落纯培养的方式从自然界中筛选产酶活性较高的微生物菌株。然而,土壤中不可培养的微生物占据微生物总数的99%以上,传统的分离培养单菌落只能分离土壤里不到1%的微生物,这己成为微生物资源开发利用的一个限制性因素。宏基因组学是以某一特定环境中的所有微生物基因组DNA为基础,应用分子生物学技术寻找和发现新的功能基因及活性代谢产物的一种方法。它避开了微生物分离培养的过程,极大地扩展了微生物资源的利用空间。
[0003] 近几年来,海产品养殖加工业尤其是贝类养殖加工业迅猛发展,而几丁质是产品加工中产生的大量虾、蟹壳等废弃物主要成分之一,因此新型几丁质酶对于开发利用这一类资源具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的一个目的是提供一种蛋白质
[0005] 本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质:
[0006] a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质;
[0007] b)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质;
[0008] c)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
[0009] 本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料
[0010] 本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述B1)-B4)中的任一种:
[0011] B1)编码上述蛋白质的核酸分子;
[0012] B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
[0013] B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体或含有B2)所述表达盒的重组载体;
[0014] B4)含有B1)所述核酸分子的重组菌或含有B2)所述表达盒的重组菌或含有B3)所述重组载体的重组菌。
[0015] 上述相关生物材料中,B1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)的DNA分子:
[0016] 1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子;
[0017] 2)与1)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子;
[0018] 3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。
[0019] 上述蛋白质在作为几丁质酶中的应用也属于本发明的一个目的。
[0020] 上述相关生物材料在制备几丁质酶中的应用也属于本发明的一个目的。
[0021] 本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
[0022] 本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在水解胶体几丁质和/或几丁三糖和/或几丁四糖中的应用。
[0023] 本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在制备水解胶体几丁质和/或几丁三糖和/或几丁四糖的产品中的应用。
[0024] 本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在制备几丁二糖中的应用。
[0025] 本发明还有一个目的是提供一种重组菌。
[0026] 本发明提供的重组菌是将几丁质酶的编码基因导入宿主菌中得到的;所述几丁质酶的氨基酸序列如序列表中序列2所示。
[0027] 上述重组菌中,所述几丁质酶的编码基因是通过重组载体导入宿主菌的;
[0028] 所述重组载体是将编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子插入表达载体,得到表达权利要求1所述蛋白质的载体;
[0029] 所述几丁质酶的编码基因的序列如序列表中序列1所示。
[0030] 上述重组菌中,所述宿主菌为巴斯德毕赤酵母GS115。
[0031] 本发明的最后一个目的是提供一种制备几丁质酶方法。
[0032] 本发明提供的制备几丁质酶方法包括如下步骤:发酵培养上述重组菌,得到几丁质酶。
[0033] 本发明应用基因组步移技术从猪粪便宏基因组中克隆了一种新型外切几丁质酶基因并进行了异源表达、重组酶纯化及其性质研究。通过实验证明:该几丁质酶在模拟胃肠道环境中保持很高的稳定性和酶活附图说明
[0034] 图1为几丁质酶基因Echi47的电泳图。
[0035] 图2为几丁质酶Echi47的纯化电泳图。
[0036] 图3为几丁质酶Echi47的最适pH及pH稳定性。图3A为几丁质酶Echi47的最适pH;图3B为几丁质酶Echi47的pH稳定性。
[0037] 图4为几丁质酶Echi47的最适温度及温度稳定性。图4A为几丁质酶Echi47的最适温度;图4B为几丁质酶Echi47的温度稳定性。
[0038] 图5为几丁质酶Echi47水解胶体几丁质产物的薄层层析分析结果、HPLC分析结果以及几丁寡糖水解薄层层析分析结果。图5A为几丁质酶Echi47水解胶体几丁质产物薄层层析分析结果;图5B为几丁质酶Echi47水解胶体几丁质产物的HPLC分析结果;图5C为几丁质酶Echi47水解胶体几丁质产物中的几丁寡糖水解薄层层析分析结果。
[0039] 图6为人工模拟胃肠液对几丁质酶Echi47稳定性及活性影响。
[0040] 图7为Echi47在胃肠道环境下的相对酶活性及其对胶体几丁质降解的实验结果。图7A为Echi47在胃肠道环境下的相对酶活性;图7B为Echi47在胃肠道环境下对胶体几丁质降解的实验结果。

具体实施方式

[0041] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0042] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0043] 实施例1、几丁质酶基因Echi47的获得
[0044] 一、几丁质酶基因组保守区片断的PCR扩增
[0045] 1、引物的设计
[0046] 利用在线引物设计软件CODEHOP(http://blocks.fhcrc.org/codehop.html)设计简并引物CHIF(正向引物):5'-GGNRTNGAYHTNGAYTGGGARTAYCC-3';CHIR(反向引物):5'-CCAATGNCCRTTDATRTCRTA-3'。
[0047] 2、PCR扩增
[0048] 以猪粪便微生物的基因组DNA为模板,采用步骤1设计的CHIF和CHIR为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。
[0049] PCR反应条件:94℃ 5min;94℃ 30s,48℃-52℃(每个循环降低0.5℃)30s,72℃30s,共8个循环;94℃ 30s,56℃ 30s,72℃ 30s,共25个循环;72℃,5min。
[0050] 3、电泳
[0051] PCR扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示在280bp附近有特异条带,将该条带回收,并连接pMD18-T载体,得到重组质粒,将重组质粒热激转化E.coli DH5α,经菌落PCR鉴定重组子后进行测序,测序结果经NCBI BLAST搜索比对,表明PCR扩增得到的目的基因片段与其它微生物来源的几丁质酶基因有较高同源性。
[0052] 二、几丁质酶基因Echi47的获得
[0053] 1、引物的设计
[0054] 根据克隆得到的DNA片段的序列分析结果,分别设计扩增上游序列的引物rsp1、rsp2、rsp3和下游序列的引物fsp1、fsp2、fsp3。引物序列如下:
[0055] rsp1:5'-GCAAACTCGGAAACATCCTTCA-3';
[0056] rsp2:5'-GCTCCTTCTTGCCACCTTTCT-3';
[0057] rsp3:5'-GCTTGTTGCTCGGGACTGG-3';
[0058] fsp1:5'-TATCCTGCCAGTCCCGAGCAA-3';
[0059] fsp2:5'-TCAATGAAGCCGAGGATACCA-3';
[0060] fsp3:5'-ATGAAGGATGTTTCCGAGTTTGC-3'。
[0061] 2、TAIL-PCR
[0062] TAIL-PCR参照文献“Liu YG,Chen Y.High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR for amplification of unknown flanking sequences.Biotechniques2007,43:649-650”中的方法。第一轮的模板为猪粪便基因组DNA;第二轮和第三轮的模板分别为第一轮和第二轮PCR产物(稀释50倍)。TAIL-PCR扩增得到TAIL-PCR产物。
[0063] 第一轮PCR扩增条件为:94℃预变性5min,5个循环(94℃ 30s,60℃ 30s,72℃3min),15个循环(94℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 3min,94℃ 30s,60℃ 20s,72℃ 3min,94℃
30s,44℃ 30s,72℃ 3min),延伸72℃ 10min。
[0064] 第二轮和第三轮PCR扩增条件为:94℃预变性5min,15个循环(94℃ 30s,65℃30s,72℃ 3min,94℃ 30s,65℃ 30s,72℃ 3min,94℃ 30s,44℃ 30s,72℃ 3min),过度延伸72℃ 10min。
[0065] 3、几丁质酶基因Echi47的获得
[0066] (1)TAIL-PCR产物分析、测序及序列拼接
[0067] 琼脂糖凝胶电泳分别对每个基因的TAIL第二轮产物和第三轮产物进行电泳分析,并将目标条带回收,连接pMD18-T载体,得到重组质粒并进行测序。将获得的上下游序列和已知的片段序列都输入序列分析软件DNAman,并通过序列拼接程序,将每个基因的三条序列拼接成一条完整的序列。
[0068] (2)几丁质酶基因Echi47的获得
[0069] 序列拼接得到一个大小为1164bp的完整开放阅读框(ORF),其核苷酸序列如序列表中序列1所示,将其命名为Echi47,该基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示,将该蛋白命名为Echi47。
[0070] 实施例2、几丁质酶的获得及其活性检测
[0071] 一、几丁质酶的获得
[0072] 1、Echi47基因的获得
[0073] 以猪粪便的基因组DNA为模板,以Echi47F和Echi47R为引物进行PCR扩增,得到PCR扩增产物,即Echi47基因。Echi47F和Echi47R引物序列如下:
[0074] Echi47F:5’-CATGCCATGGGCAAAGTCATCGTTGGATACTTC-3’;下划线所示的序列为Nco I酶切识别位点;
[0075] Echi47R:5’-CCGCTCGAGTGATCTTATTTTGTAGACCTCATT-3’;下划线所示的序列为Xho I酶切识别位点。
[0076] PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1min,共35个循环;72℃总延伸5min。
[0077] 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果如图1所示:其中,M为DNA marker,1为PCR扩增产物,可以看出PCR扩增得到大小为1164bp的Echi47基因片段。
[0078] 2、重组质粒的获得
[0079] 用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1获得的PCR扩增产物;用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切pET-28a(+)(购自Merck Millipore公司,产品目录号69864-3CN),得到载体大片段;将步骤1获得的Echi47基因片段与载体大片段连接,得到重组质粒,将其命名为pET-Echi47。
[0080] 对重组质粒进行测序验证,测序结果表明:重组质粒pET-Echi47为将序列表中序列1所示的Echi47基因片段插入pET-28a(+)载体的NcoI和XhoI酶切位点间,且保持pET-28a(+)载体的其他序列不变得到的载体。重组质粒pET-Echi47表达氨基酸序列为序列表中序列2所示的Echi47蛋白。
[0081] 3、几丁质酶的诱导表达
[0082] 将重组质粒pET-Echi47转化E.coli BL21(DE3)(购自博迈德,货号CC0602),在含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板上筛选阳性转化子,并将阳性转化子于500mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基中扩大培养。
[0083] 37℃振荡培养至OD600达到0.6-0.8时,加入IPTG至终浓度1mmol/L,20℃诱导培养过夜,7000×g离心收集细胞。重悬后超声破碎,14000×g离心10min,收集上清液即为几丁质酶的粗酶液。
[0084] 4、几丁质酶的纯化
[0085] 使用琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化重组几丁质酶。具体步骤为:用缓冲液A平衡Ni-IDA柱5-10个柱体积,将步骤3得到的粗酶液以0.5mL/min流速上样,分别用缓冲液A和缓冲液B以1mL/min流速洗涤至洗脱液OD280﹤0.05,最后以缓冲液C洗涤并收集目的蛋白,得到纯化产物。其中,缓冲液A:含有NaCl(500mmol/L)和咪唑(20mmol/L)的Tris-HCl缓冲液(pH为8.0);洗脱液B:为含有NaCl(500mmol/L)和咪唑(50mmol/L)的Tris-HCl缓冲液(pH为8.0);洗脱液C:为含有NaCl(500mmol/L)和咪唑(150mmol/L)的Tris-HCl缓冲液(pH为8.0)。
[0086] 用SDS-PAGE法(SDS-PAGE法具体步骤参见文献“Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.Nature1970,227:680-685”)检测纯化产物的蛋白纯度。
[0087] 蛋白浓度的检测结果如图2所示:其中,M为低分子量标准蛋白质;1为粗酶液;2为纯化产物。从图中可以看出,琼脂糖Ni-IDA亲和柱纯化后得到明显的单一条带,分子量大小为47kDa的Echi47蛋白,即为几丁质酶(Echi47)。
[0088] 将pET-28a(+)载体按照上述方法转化E.coli BL21(DE3),并进行步骤3和步骤4,结果没有目的条带产生。
[0089] 二、几丁质酶(Echi47)的性质
[0090] 1、几丁质酶(Echi47)的酶活力检测
[0091] (1)底物胶体几丁质的制备
[0092] 在4℃下,取2g几丁质(购自sigma公司;产品目录号C9213)放入烧杯中,缓缓加入冷浓HCl 40mL,搅拌使几丁质呈糊状,4℃放置24h;将其缓缓加入到盛有400ml 50%乙醇水溶液的烧杯中(边加边剧烈搅拌),静置,待胶态几丁质析出后去除上清液,用蒸馏水冲洗胶态几丁质至pH 7.0,10000×g离心,收集上清液,以蒸馏水定容至200ml,即为1%(质量分数)的胶体几丁质溶液,4℃保存备用。
[0093] (2)标准曲线的绘制
[0094] 用50mmol/L柠檬酸缓冲液将1mg/mL的N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)溶液(溶剂为50mmol/L柠檬酸缓冲液)进行梯度稀释,然后将不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖溶液分别加入到400μL DNS溶液中,沸水浴10min显色,冷却至室温后测定OD540,绘制标准曲线。
[0095] 根据标准曲线确定每分钟还原糖产量计算公式:N-乙酰氨基葡萄糖(mg/ml)=[(0.621A+0.037)/0.1/t]×n;其中,A:OD540nm处测吸光值;t:反应时间(单位为min,数值为30),n为待测溶液的稀释倍数。实验设3次重复,结果取平均值。
[0096] (3)采用DNS法测定还原糖含量
[0097] 取50μL步骤(1)制备的1%的胶体几丁质溶液(底物),加入250μL柠檬酸缓冲液混合;再加入100μL酶液混合后于40℃水浴30min;加入400μL DNS溶液,沸水浴10min;10000×g离心,取上清液,在540nm下测定其吸光值。酶活力单位定义:在40℃条件下,每分钟分解胶体几丁质释放出1μmol GlcNAc所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
[0098] 测定步骤一中的4得到的纯化产物(几丁质酶Echi47)以及步骤一中的3得到的粗酶液的总蛋白量、总酶活力以及比酶活力,并以粗酶液的量为100%,计算几丁质酶(Echi47)的回收率;以粗酶液的纯化倍数为1,计算几丁质酶的纯化倍数,结果如表1所示。其中总蛋白量的测定参照文献“Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,Randall RJ.Protein measurement with the folin phenol reagent.J Biol Chem1951,193:265-275”中的方法,以血清白蛋白作为标准蛋白。
[0099] 表1、几丁质酶和粗酶液的酶活测定结果
[0100]
[0101] 2、几丁质酶(Echi47)的最适pH及pH稳定性
[0102] (1)最适pH的测定
[0103] 将步骤一制备的几丁质酶(Echi47)作为待测酶液,将其分别溶于如下体积相同、浓度相同(浓度均为50mmol/L)、pH值不同的6种缓冲液体系中,分别得到如下6种缓冲液体系:
[0104] 1)柠檬酸盐缓冲液(pH 3.0-6.0);
[0105] 2)醋酸盐缓冲液(pH 4.0-6.0);
[0106] 3)磷酸盐缓冲液(pH 5.0-7.0);
[0107] 4)MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)缓冲液(pH 6.5-7.5);
[0108] 5)Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)缓冲液(pH 7.0-9.0);
[0109] 6)CHES(2-环己胺基乙磺酸)缓冲液(pH8.0-10.0)。
[0110] 上述各缓冲液中的几丁质酶的浓度均为1.25μg/mL。在40℃条件下,以酶活力最高点作为100%,计算每种缓冲液体系的相对酶活力。
[0111] 结果如图3A所示:带有“□”的曲线为Echi47在柠檬酸盐缓冲液中的相对酶活;带有“●”的曲线为Echi47在醋酸盐缓冲液中的相对酶活;带有“△”的曲线为Echi47在磷酸盐缓冲液中的相对酶活;带有“■”的曲线为Echi47在MES缓冲液中的相对酶活;带有“▲”的曲线为Echi47在Tris-HCl缓冲液中的相对酶活;带有“○”的曲线为Echi47在CHES缓冲液中的相对酶活。从图中可以看出,几丁质酶(Echi47)的最适反应pH为5.0。
[0112] (2)几丁质酶(Echi47)pH稳定性的测定
[0113] 将上述6种缓冲液体系置于30℃水浴锅中分别处理30min,再将其迅速置于水中冷却30min,然后测定残余几丁质酶液的酶活力,以未经处理的相同量的几丁质酶液作为对照,最后计算残余几丁质酶活力占对照酶活力的百分比,得到相对酶活。
[0114] 结果如图3B所示:从图中可以看出:几丁质酶(Echi47)在pH 4.0-9.0的范围内仍保持80%以上的酶活力,且在酸性pH范围内具有较高的稳定性。
[0115] 3、几丁质酶(Echi47)的最适温度及温度稳定性
[0116] (1)几丁质酶(Echi47)的最适温度的测定
[0117] 将步骤一制备的几丁质酶(Echi47)稀释于50mmol/L pH5.0的柠檬酸盐缓冲液中,得到几丁质酶溶液(浓度为1.25μg/mL),然后将几丁质酶溶液分别在不同温度下(20、25、30、35、40、45、50、55、60、65和70℃)处理30min,测定几丁质酶的酶活力,以酶活力最高点为100%,以未经处理的相同量的几丁质酶液的酶活力作为对照,最后计算几丁质酶的酶活力占对照酶活力的百分比,得到相对酶活。
[0118] 结果如图4A所示:从图中可以看出,几丁质酶(Echi47)的最适反应温度为40℃。
[0119] (2)几丁质酶的温度稳定性测定
[0120] 将步骤一制备的几丁质酶(Echi47)稀释于50mmol/L pH5.0的柠檬酸盐缓冲液中,得到几丁质酶溶液(浓度为1.25μg/mL),分别在不同的温度下处理30min,然后置于冰水浴中冷却30min,测定几丁质酶的酶活力,以未经处理的相同量的几丁质酶液的酶活力作为对照,计算几丁质酶的酶活力占对照酶活力的百分比,得到相对酶活。
[0121] 结果如图4B所示:几丁质酶(Echi47)在50℃下比较稳定,相对酶活力能够保持80%以上,具有较强的低温适应性。
[0122] 4、几丁质酶(Echi47)的底物特异性
[0123] 按照步骤1的几丁质的酶活力测定的方法,分别以胶体几丁质、壳寡糖、乙二醇几丁质为反应底物测定几丁质酶的底物特异性,得到几丁质酶在三种条件下的酶活力,并以胶体几丁质为底物时的酶活力为100%,计算得到其他底物条件下的相对酶活。
[0124] 酶活力测定体系:将50μL 2%底物、250μL柠檬酸缓冲液和100μL几丁质酶液(浓度为1.25μg/mL)混匀,40℃水浴反应30min;加入400μL DNS溶液,沸水浴10min;10000×g离心,取上清液,在540nm下测定其吸光值。
[0125] 结果如表2所示:从表中可以看出,胶体几丁质的比酶活和相对酶活明显高于壳寡糖和乙二醇几丁质。
[0126] 表2、几丁质酶的底物特异性底物比酶活(U/mg)和相对酶活(%)
[0127]底物 比酶活(U/mg) 相对酶活(%)
胶体几丁质 6.84 100
壳寡糖 0.89 13
[0128]乙二醇几丁质 3.38 49
[0129] 5、几丁质酶(Echi47)的水解特性
[0130] (1)水解胶体几丁质
[0131] 将1%的胶体几丁质和0.5U的步骤一制备的几丁质酶(Echi47)混匀,在40℃条件下分别水解5min,15min,30min,60min,120min,应用TLC层析检测水解产物生成情况。并对水解产物进行HPLC分析,HPLC操作条件:色谱柱为shodex sugar KS-802;柱温65℃;流动相为超纯水,流速1mL/min,
[0132] 结果见图5A和图5B所示:几丁质酶(Echi47)降解胶体几丁质的主要产物为几丁二糖,仅有极少量几丁三糖,因此该几丁质酶(Echi47)为外切型几丁质酶。HPLC分析显示几丁质酶(Echi47)水解胶体几丁质产物中几丁二糖含量为87%。
[0133] (2)水解几丁二糖、几丁三糖和几丁四糖
[0134] 分别以100μL质量分数为0.5%的几丁二糖、几丁三糖、几丁四糖为底物,再分别加入15mU的步骤一制备的几丁质酶(Echi47),在40℃下水解反应40min。应用TLC层析检测水解产物生成情况。TLC层析展层剂为正丁醇/甲醇/16%氨水(5:4:3,v/v/v),显色剂为浓硫酸/甲醇(95:5,v/v),烘烤l5min。
[0135] TLC层析检测结果如图5C所示:从图中可以看出,几丁质酶(Echi47)不能水解几丁二糖、但能够将几丁三糖水解为几丁二糖和N-乙酰氨基葡萄糖、能够将几丁四糖水解为几丁二糖。
[0136] 6、几丁质酶(Echi47)的蛋白酶抗性
[0137] 用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 2.0)将胃蛋白酶配制成1mg/mL的溶液;用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.0)将胰蛋白酶配制成1mg/mL的溶液;用0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)将味蛋白酶和蛋白酶K配制成1mg/mL的溶液。
[0138] 将步骤一制备的几丁质酶(Echi47)分别与胃蛋白酶溶液、胰蛋白酶溶液、风味蛋白酶溶液和蛋白酶K溶液按质量比为10:1混合,分别得到胃蛋白酶缓冲液、胰蛋白酶缓冲液、风味蛋白酶缓冲液和蛋白酶K缓冲液,分别将胃蛋白酶缓冲液、胰蛋白酶缓冲液、风味蛋白酶缓冲液和蛋白酶K缓冲液处理5min、10min、20min、30min和60min后检测剩余酶活。
[0139] 结果如图6所示:带有“◆”的曲线为几丁质酶(Echi47)经胃蛋白酶处理后的相对酶活;带有“×”的曲线为几丁质酶(Echi47)经胰蛋白酶处理后的相对酶活;带有“▲”的曲线为几丁质酶(Echi47)经蛋白酶K处理后的相对酶活;带有“●”的曲线为几丁质酶(Echi47)经风味蛋白酶处理后的相对酶活。从图中可以看出,几丁质酶(Echi47)用不同的蛋白酶处理60min后剩余酶活性分别为67.8%(胃蛋白酶),94.8%(胰蛋白酶),90.1%(蛋白酶K),98.3%(风味蛋白酶)。说明几丁质酶(Echi47)在胰蛋白酶、风味蛋白酶和蛋白酶K中很稳定,处理60min后剩余90%以上的相对活性,但对胃蛋白酶的抗性相对较低。
[0140] 7、几丁质酶(Echi47)在模拟肠胃液中的稳定性及活性
[0141] (1)胃模拟液和肠道模拟液的制备
[0142] 1)胃模拟液(simulated gastric fluid):200mmol/L Gly-HCl、200mmol/L乙酸-乙酸钠缓冲液、2.0mg/mL NaCl和2.0mg/mL胃蛋白酶,用HCl或者乙酸钠依次调整pH为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和6.8。
[0143] 2)肠道模拟液(simulated intestinal fluid):6.8mg/mL KH2PO4、0.2mmol/L NaOH和10mg/mL胰蛋白酶,调pH到6.8。
[0144] (2)几丁质酶(Echi47)在模拟胃肠环境中的稳定性试验
[0145] 几丁质酶(Echi47)在模拟胃肠环境中的稳定性试验参考文献“Huang H,Luo H,Wang Y,et al.A novel phytase from Yersinia rohdei with high phytate hydrolysis activity under low pH and strong pepsin conditions.Appl Microbiol Biotechnol 2008,80:417-426.”中的方法,具体步骤为:取步骤一制备的几丁质酶液(2.0U)在37℃条件下的胃模拟液和肠道模拟液中处理20min。将处理后的酶液在标准条件下测定剩余酶活。
[0146] 结果显示:在pH 2.0-6.8的整个胃肠道环境中,几丁质酶(Echi47)始终保持大于35%的相对活性。
[0147] (3)几丁质酶(Echi47)在模拟胃肠环境中的活性
[0148] 将80mg的1%的胶体几丁质溶液加入40mL的模拟环境的体系中,调整体系pH到2.0后将其置于冰上,添加500μg步骤一制备的几丁质酶(Echi47),反应20min;调整体系pH到3.0,然后37℃恒温水浴反应20min;调整体系pH到4.0,然后37℃恒温水浴反应
20min;调整体系pH到5.0,然后37℃恒温水浴反应20min;调整体系pH到6.0,然后37℃恒温水浴反应20min;最后将反应体系添加10mg/mL胰蛋白酶,并调整体系pH到6.8,37℃恒温水浴反应20min。每次反应后取100μL样品进行产物测定。胶体几丁质在胃肠道环境中酶活的测定参照文献“Minekus M,Marteau P,Havenaar R,et ql.A multicompartmental dynamic computer-controlled model simulating the stomach and small-intestine.Altern.Lab.Anim 1995,23:197–209”中的方法。
[0149] 结果如图7所示:从图7A中可以看出,几丁质酶(Echi47)在pH 3.0-6.8的整个胃肠道环境中始终保持大于85%的相对活性,而且其对蛋白酶的抗性良好,说明随着消化时间的延长,还原糖的含量在不断地积累;从图7B中可以看出,几丁质酶(Echi47)在肠道模拟液中,能够高效降解胶体几丁质底物,最后从80mg的胶体几丁质中水解释放21.1mg的几丁寡糖产物。
[0150] 实施例3、几丁质酶(Echi47)在制备几丁二糖中的应用
[0151] 1、在1L烧杯中用10mmol/L pH 5.0的柠檬酸缓冲液配制500ml质量分数为1%的胶体几丁质;
[0152] 2、向步骤1制备的胶体几丁质中加入15U的实施例2的步骤一中制备的几丁质酶(Echi47);40℃水浴48h,10000×g离心2min,取上清液;
[0153] 3、应用HPLC检测上清液中几丁二糖含量。其中,色谱条件:色谱柱为shodex KS-802(300mm×8mm;waters,US);柱温65℃;流动相为纯水,流速为1mL/min,VWD检测器,检测波长205nm。
[0154] 检测结果表明:上清液中几丁二糖含量为2.15g,N-乙酰氨基葡萄糖含量为0.19g。该几丁质酶水解胶体几丁质底物制备几丁二糖的转化率为43%。
[0155] 实施例4、毕赤酵母高密度发酵表达几丁质酶
[0156] 一、重组菌的获得
[0157] 1、以实施例1获得的Echi47基因为模板,采用PEchi47F和PEchi47R引物对进行PCR扩增,得到PCR扩增产物。引物序列如下:
[0158] PEchi47F:5’-CCGGAATTCCATAAAGTCATCGTTGGATACTTC-3’;下划线所示的序列为EcoR I酶切识别位点;
[0159] PEchi47R:5’-ATAGTTTAGCGGCCGCTGATCTTATTTTGTAGACCTCATT-3’;下划线所示的序列为Not I酶切识别位点。
[0160] 2、用限制性内切酶EcoR I和Not I对步骤1得到的PCR扩增产物进行双酶切,回收得到大小为1161bp的DNA片段;用限制性内切酶EcoR I和Not I对pPIC9K载体(购自Life Technologies公司,产品目录号V175-20)进行双酶切,回收得到大小为5343bp的骨架载体;将大小为1161bp的DNA片段和骨架载体连接,得到重组质粒pPIC9K-Echi47。
[0161] 对重组质粒pPIC9K-Echi47进行测序验证,结果表明:重组质粒pPIC9K-Echi47为将pPIC9K载体的EcoR I和NotI酶切位点之间插入了序列表中序列1所示的DNA分子,该DNA分子编码的氨基酸序列如序列表中序列2所示,重组质粒pPIC9K-Echi47表达Echi47蛋白。
[0162] 3、将重组质粒pPIC9K-Echi47转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(购自Life Technologies公司,产品目录号C181-00)得到含有重组质粒pPIC9K-Echi47的重组菌,将其命名为重组菌pPIC9K-Echi47/GS115。
[0163] 将pPIC9K载体代替重组质粒pPIC9K-Echi47转化巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,得到重组菌pPIC9K/GS115。
[0164] 二、重组菌的发酵
[0165] 1、发酵方法及材料
[0166] 发酵的方法参照文献“Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B,053002,Invitrogen”中的方法。发酵采用5L的发酵罐(BIOTECH,上海保兴生物设备工程有限公司)。种子培养基(BMGY)、发酵基本培养基(BSM)、甘油分批补料培养基和100%甲醇诱导培养基参照文献“Pichia Fermentation Process Guidelines(Version B,053002,Invitrogen”中的方法配制。整个发酵过程采用分批培养、甘油分批补料培养、100%甲醇诱导培养三个阶段。
[0167] PTM1的制备方法:将CuSO4·7H2O 6.0g、NaI 0.08g、MnSO4·H2O 3.0g、Na2MoO4·2H2O0.2g、酸0.02g、CoCl20.5g、ZnCl220.0g、FeSO4·7H2O 65.0g、生物素0.2g和浓硫酸5.0mL混匀,加水至1L。
[0168] BMGY由溶剂和溶质组成:溶剂为100mmol/L磷酸缓冲液(pH 6.0);溶质及其-5浓度如下:1%(g/100mL)酵母膏,2%(g/100mL)蛋白胨,1.34(g/100mL)YNB;4×10 %(g/100mL)生物素,1%(体积分数)甘油。
[0169] BMMY:用0.5%(体积分数)甲醇代替BMGY中的1%(体积分数)甘油。
[0170] BSM的制备方法:将26.7mL 85%(g/100mL)H3PO4水溶液、CaSO40.93g、K2SO418.2g、MgSO4·7H2O 14.9g、KOH 4.13g和甘油40.0g混匀,加蒸馏水至1L。
[0171] 甘油分批补料培养基:将50%(g/100mL)甘油水溶液高压灭菌,然后每升加入PTM112mL。
[0172] 100%甲醇诱导培养基:每升100%甲醇加入12mL PTM1。
[0173] 2、发酵
[0174] (1)种子培养
[0175] 将0.2mL重组菌pPIC9K-Echi47/GS115菌液接种200mL BMGY,30℃、250rpm过夜培养至OD600为10.0左右,得到种子培养液。
[0176] (2)分批培养(基础培养)
[0177] 将2.0L发酵基本培养基(BSM)加入发酵罐,并将发酵罐灭菌,用28%浓氨水调pH4.0,每升起始发酵液加入PTM14.35mL;然后接种步骤(1)的种子培养液(接种量10%;体积比),转速700rpm,通气量1.0vvm,30℃发酵18-24h;发酵过程中,溶DO从100%逐渐下降,直至5%左右,维持一段时间后回升至60%左右。
[0178] (3)甘油分批补料培养
[0179] 待分批培养至甘油耗尽(根据DO spikes操作,30s内溶氧迅速上升至接近70%又迅速下降),流加甘油分批补料培养基,甘油分批补料培养基的流速为18.4mL/h/L起始发酵液,控制温度30℃、pH 4.0,始终监视DO,通过调整流加速度、转速和通气量等保持DO>20%;流加时间4-5h,待OD600达180-220左右,停止流加。
[0180] (4)100%甲醇诱导培养
[0181] 停止流加甘油后,根据DO spikes,饥饿30min左右后流加100%甲醇诱导培养基,在4h内使流速从3.6mL/h/L起始发酵液线性增加至10.9mL/h/L起始发酵液左右,监控DO>15%、控制温度30℃、调pH 6.0,诱导表达230h,得到发酵产物,离心,得到发酵上清液(含有几丁质酶)。
[0182] 将重组菌pPIC9K/GS115代替重组菌pPIC9K-Echi47/GS115菌液进行上述发酵步骤,得到发酵上清液1。
[0183] 将GS115代替重组菌pPIC9K-Echi47/GS115菌液进行上述发酵步骤,得到发酵上清液,得到发酵上清液2。
[0184] 3、发酵结果
[0185] 检测步骤2得到的上清液中的几丁质酶的酶活力大小,检测方法参照上述实施例2的步骤二中的1。酶活力单位定义:在40℃条件下,每分钟分解胶体几丁质释放出1μmol还原糖(以GlcNAc作为标准)所需的酶量定义为一个酶活力单位(U)。
[0186] 检测结果表明:重组菌pPIC9K-Echi47/GS115的发酵上清液中的几丁质酶的酶活力为152U/mL,而采用重组菌pPIC9K/GS115或GS115代替重组菌pPIC9K-Echi47/GS115菌液进行上述发酵步骤得到的发酵上清液中均未检测到酶活力。
QQ群二维码
意见反馈