一种通过理性调控生产不同分子量透明质酸的方法 |
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| 申请号 | CN201410555750.5 | 申请日 | 2014-10-17 | 公开(公告)号 | CN104371965A | 公开(公告)日 | 2015-02-25 |
| 申请人 | 江南大学; | 发明人 | 康振; 陈坚; 堵国成; 金鹏; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种通过理性调控生产不同分子量透明质酸的方法，属于 生物 工程 技术领域。本发明采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶hasA整合于枯草芽孢杆菌基因组上表达，同时，对枯草芽孢杆菌中UDP-GlcA和UDP-GlcNAc合成途径的基因，进行模 块 化组装表达分析，通过控制不同的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc浓度，实现枯草芽孢杆菌产不同分子量范围的透明质酸。本发明为高效制备特定分子量范围的透明质酸奠定了一定的 基础 ，适合于工业化生产应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种产透明质酸的重组枯草芽孢杆菌，是在重组表达透明质酸合酶的基础上，强化透明质酸前体物质UPD-N-乙酰氨基葡萄糖或UDP-D-葡萄糖醛酸的合成途径。 |
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| 说明书全文 | 一种通过理性调控生产不同分子量透明质酸的方法技术领域背景技术[0002] 透明质酸(hyaluronic acid，简称HA)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质，以其独特的分子结构和理化性质，使其具有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质。HA是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸以β-(1-3)和β-(1-4)糖苷键连接的双糖单位重复连接组成。根据不同的生物学功能，HA按照分子量大小可分为三类：大分子HA(分子6 4 6 4 量≥1.0×10)；中分子HA(<1.0×10 ～1.0×10)以及小分子量HA(≤1.0×10)。其中，大分子量的HA和中分子量的HA已经广泛应用于医学领域和化妆品领域，而小分子量HA由于能被人体吸收，用于人体自身HA等多糖合成的前体，因而在食品保健领域具有重要的应用前景。 [0003] HA广泛地存在于各种动物组织内，如鸡冠、关节滑液、软骨、眼玻璃体等，同时发现HA也存在于产气杆菌、绿脓杆菌和A、B、C溶血性链球菌等部分细菌中。由于动物提取工艺复杂、效率低以及存在病毒种间交叉感染和其它风险性的感染，近些年以来，透明质酸的获取已经普遍由传统的动物组织提法转变为微生物发酵法，而应用最广的是致病性弱的溶血性链球菌C族菌，如Streptococcus equi和S.zooepidemicus。随着DNA重组技术、DNA测序技术以及代谢工程的发展，构建重组工程菌株合成HA也引起了广泛关注。不同课题组已经在大肠杆菌(Escherichia coli)、乳酸乳球菌(Lactoccus lactis)中进行了HA合成途径的构建。然而，不管动物组织提取还是微生物代谢合成HA所获得的产物分子量范围不一，相差甚大，这给所需特定分子量范围的HA使用带了一定的困难，特别是给HA的产品质量带来较大的影响。因此，如何构建微生物重组菌株合成不同分子量HA、尤其是特定范围分子量的HA已经成为迫切需要解决的问题。 [0004] 基于食品安全和医疗卫生越来越高的要求，本发明应用食品安全级的枯草芽孢杆菌发酵生产HA。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)由于诸多优势(如安全、好氧生长、营养条件低、遗传操作工具完善等)也已被用于HA合成途径的构建。在过去几年里，虽然微生物发酵合成HA已经获得普遍的应用，然而获得的HA的分子量差别较大，而关于如何在食品级工程菌株Bacillus subtilis中通过基因工程技术直接发酵获得不同分子量范围的HA尚无报道。同时，构建合成不同分子量范围HA的重组菌株的前提是对微生物HA分子量调控机理的解析。 [0005] 在微生物体内由6-磷酸葡萄糖途径合成UDP-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)，由6-磷酸葡萄糖变构为6-磷酸果糖途径合成UPD-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)，再由这两个前体物质UDP-GlcNAc和UDP-GlcA交替作为底物，通过透明质酸合酶hasA合成透明质酸并分泌到胞外。本发明通过对HA的两个前体物质UPD-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)和UDP-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的合成途径进行模块化调控表达，进而引起胞内HA两个前体物浓度的变化，最终引起HA分子量及产量的变化。该发明操作过程简单，且产品分子量较集中，易于实现工业化生产制备特定分子量范围的透明质酸。 发明内容[0006] 本发明提供了一种产透明质酸的重组枯草芽孢杆菌，是在重组表达透明质酸合酶的基础上，强化透明质酸前体物质UPD-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)或UDP-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的合成途径。 [0007] 所述强化UPD-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)合成途径，是重组表达编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，或glmU与编码变位酶的基因glmM，或glmU与glmM、编码乙酰氨基转移酶的基因glmS，或glmU与glmM、glmS及编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi。 [0008] 所述强化UDP-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的合成途径，是重组表达编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，或tuaD与编码尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，或tuaD与gtaB、编码葡萄糖磷酸变位酶的基因pgcA。 [0009] 所述透明质酸合酶编码基因hasA可以来源于兽疫链球菌(Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌(Streptococcus equi)或类马链球 菌(Streptococcus equissp)。在本发明的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因hasA来源于兽疫链球菌，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 [0010] 所述葡萄糖磷酸变位酶、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、乙酰氨基、变位酶和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶可以来源于链球菌属(Streptococcus species)、大肠杆菌(Escherichia coli)和芽孢杆菌(Bacillus)。在本发明的一种实施方式中，编码上述所述途径酶的基因来源于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶(tuaD)、尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶(gtaB)、葡萄糖磷酸变位酶(pgcA)、磷酸葡萄糖异构酶(pgi)、乙酰氨基转移酶(glmS)、变位酶(glmM)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶(glmU)的核苷酸序列分别为SEQ ID NO.2-8所示。 [0011] 在本发明的一种实施方式中，重组表达基因时采用的载体可以为枯草芽孢杆菌游离型表达载体或者整合基因组用载体。本发明的一种实施方式是将透明质酸合酶基因hasA整合到枯草芽孢杆菌的基因组中进行表达，采用游离型载体pP43NMK表达UDP-GlcNAc和UDP-GlcA合成途径的基因。 [0012] 在本发明的一种实施方式中，重组表达基因时，游离型表达载体上采用组成型启动子P43(核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示)，基因组重组表达时采用木糖诱导型启动子Pxyl(核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示)。 [0013] 在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。 [0014] 本发明提供了一系列重组枯草芽孢杆菌，适用于生产不同分子量的HA： [0015] 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以pP43NMK载体表达glmU，发酵培养重组菌ZHA168/pP43NMK/glmU可生产平均分子量约为150万道尔顿的HA。 [0016] 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以pP43NMK载体串联表达glmU、glmM，发酵培养重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM可以生产平均分子量为200万道尔顿的HA。 [0017] 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以pP43NMK载体串联表达glmU、glmM、glmS，发酵培养重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS可以获得平均分子量为235万道尔顿的HA。 [0018] 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以pP43NMK载体串联表达glmU、glmM、glmS、pgi，发酵培养重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi可以获得平均分子量为260万道尔顿的HA。 [0019] 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以pP43NMK载体表达tuaD，发酵培养重组菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD可以获得平均分子量约140万道尔顿的HA。 [0020] 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以pP43NMK载体串联表达tuaD、gtaB，发酵培养重组菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB可以获得平均分子量约为97万道尔顿的HA。 [0021] 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以pP43NMK载体串联表达tuaD、gtaB、pgcA，发酵培养重组菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA可以获得平均分子量为89万道尔顿的HA。 [0023] 在本发明的一种实施方式中，发酵温度控制为37℃，发酵时间控制为48h。 [0024] 本发明还提供了一种理性调控透明质酸合成途径生产不同分子量透明质酸的方法，是在枯草芽孢杆菌中导入透明质酸合酶基因hasA，通过分别调控UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的合成途径基因，实现不同分子量范围的透明质酸的生产。通过过表达UDP-GlcA合成途径基因，提高UDP-GlcA的浓度以降低透明质酸的分子量，实现平均分子量范围为89-140万Da的透明质酸的合成。通过过表达UDP-GlcNAc合成途径基因提高UDP-GlcNAc的浓度，实现平均分子量为150-260万Da的透明质酸的合成。 [0025] 在本发明的一种实施方式中，所述表达强化UPD-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)合成途径，是重组表达编码UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，或glmU与编码变位酶的基因glmM，或glmU与glmM、编码乙酰氨基转移酶的基因glmS，或glmU与glmM、glmS及编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi。 [0026] 在本发明的一种实施方式中，所述表达UDP-D-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的合成途径，是重组表达编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，或tuaD与编码尿苷二磷酸(UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，或tuaD与gtaB、编码葡萄糖磷酸变位酶的基因pgcA。 [0027] 本发明利用枯草芽孢杆菌产透明质酸，与其他工程菌相比，该发明具有非常大的应用优势。首先，本发明过程中使用的宿主为食品级，完全满足医疗卫生和食品安全的要求，无内毒素和病原感染的风险，不会对产物的医用食品安全带来隐患；其次，通过分别调控HA两个前体物UDP-GlcNAc和UDP-GlcA浓度的变化，可以获得产不同分子量范围的HA生产重组菌株。基于应用分析，本发明方法在工业上用于制备特定分子量范围的透明质酸具有潜在而非常广泛的价值。附图说明 [0028] 图1所示为模块化重组UDP-GlcA和UDP-GlcNAc合成途径基因顺序示意图； [0029] 图2所示为含有不同组合基因重组质粒的枯草芽孢杆菌对HA的产量影响：1，ZHA168/pP43NMK/tuaD；2，ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB；3，ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA；4，ZHA168/pP43NMK/glmU；5，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM；6，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS；7，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi。； [0030] 图3所示为含有不同组合基因重组质粒的枯草芽孢杆菌对HA的分子量影响：1，ZHA168/pP43NMK/tuaD；2，ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB；3，ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA；4，ZHA168/pP43NMK/glmU；5，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM；6，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS；7，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi。 具体实施方式[0032] SEQ ID NO.1序列信息为兽疫链球菌来源的透明质酸合成酶编码序列；SEQ ID NO.2序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖脱氢酶基因tuaD编码序列；SEQ ID NO.3序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB编码序列；SEQ ID NO.4序列信息为枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖磷酸变位酶的基因pgcA的编码序列；SEQ ID NO.5序列信息为枯草芽孢杆菌来源的磷酸葡萄糖异构酶基因pgi的编码序列；SEQ ID NO.6序列信息为枯草芽孢杆菌来源的乙酰氨基转移酶的基因glmS的编码序列；SEQ ID NO.7序列信息为枯草芽孢杆菌来源的变位酶的基因glmM的编码序列；SEQ ID NO.8序列信息为枯草芽孢杆菌来源的UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU的编码序列；SEQ ID NO.9序列信息为枯草芽孢杆菌组成型启动子P43的基因序列；SEQ ID NO.10序列信息为枯草芽孢杆菌诱导型启动子Pxyl的基因序列。 [0033] HA发酵产物分子量检测分析方法：使用安捷伦公司的高效液相色谱仪1260进行分析，选择示差检测器RID，使用凝胶色谱柱Ultrahydrogel Linear进行分析。流动相选择0.1M硝酸钠进行洗脱，柱子温度设定为40摄氏度，进样量40μL，每个样品洗脱时间25min，使用中国食品药品检定研究院出产的右旋糖酐作为标准品，利用GPC软件进行平均分子质量的计算。 [0034] 实施例1整合重组质粒pAX01-hasA的构建 [0035] 本发明所用的透明质酸合酶hasA基因来源于为兽疫链球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246，兽疫链球菌接种于5ml M17液体培养基，在37℃200rpm培养16h。收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取兽疫链球菌株的基因组DNA。 [0036] 根据已公布的基因组信息序列，分别设计引物hasA-F/hasA-R,以提取的基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，扩增获取hasA基因。 [0037] 引物序列信息：5’-3’方向 [0038] hasA-F：CGCGGATCCATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC [0039] hasA-R：TGCATGCATTTATAATAATTTTTTACGTGTTCC [0040] 在上下游引物两端分别引入BamHI和SacII限制性酶切位点。PCR扩增获取的hasA片段和质粒pAX01分别采用BamHI和SacII进行双酶切，采用琼脂糖凝胶核酸电泳进行切胶回收，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，重组质粒pAX01-hasA构建成功。重组质粒转化Bacillus subtilis168，以20μg/ml的红霉素平板进行筛选整合重组子，并对重组菌株进行PCR验证和测序验证，对成功整合Pxyl-hasA的枯草芽孢杆菌菌株命名为ZHA168。基因组整合位点为lacA(β-半乳糖苷酶基因)。 [0041] 实施例2重组质粒pP43NMK/tuaD，pP43NMK/tuaD-gtaB，pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA的构建 [0042] Bacillus subtilis 168菌株接种于5ml LB培养基，37℃，200rpm培养16h。收集菌体，采用细菌基因组提取试剂盒提取兽疫链球菌株的基因组DNA。根据已公布的Bacillus subtilis168基因组信息序列，分别设计引物tuaD-F/tuaD-R、gtaB-F/gtaB-R和pgcA-F/pgcA-R。在上游引物tuaD-F的5端引入KpnI限制性酶切位点和P43 RBS序列(AAGAGAGGAATGTACAC)，在下游引物tuaD-R的5端引入XhoI和SacI限制性酶切位点；在上游引物gtaB-F的5端引入SacI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物gtaB-R的 5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点；在上游引物pgcA-F的5端引入SpeI(XbaI的同尾酶)限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物pgcA-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点。引物信息如下： [0043] tuaD-F：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGG[0044] tuaD-R：CCGCTCGAGCGGTACATTCGAGCTCTTATAAATTGACGCTTCCCAAG[0045] gtaB-F：CGGGGTACCGAGCTCAAGAGAGGAATGTACACATGAAAAAAGTACGTAAAGC[0046] gtaB-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTAGATTTCTTCTTTGTTTAGTAAACC[0047] pgcA-F：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGACTTGGAGAAAGAGCTATG[0048] pgcA-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTGCTGTTGACTCAACAAT[0049] 以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，分别扩增获取tuaD、gtaB和pgcA基因。 [0050] 质粒pP43NMK采用KpnI和XhoI双酶切，同时PCR扩增获得的tuaD基因产物也采用KpnI和XhoI双酶切，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目标条带，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，pP43NMK/tuaD质粒构建成功。 [0051] 同理，按上述操作将重组质粒pP43NMK/tuaD进行SacI和XhoI双酶切，gtaB片段PCR产物也进行SacI和XhoI双酶切。回收的两个片段进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，结果比对正确，pP43NMK/tuaD-gtaB质粒构建成功。 [0052] 在pP43NMK/tuaD-gtaB质粒基础上，按上述操作进行pgcA基因的组装：pP43NMK/tuaD-gtaB质粒采用XbaI和XhoI进行双酶切，而pgcA片段的PCR产物采用SpeI和XhoI双酶切，此步采用一对同尾酶进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，结果比对正确，pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA质粒构建成功。 [0053] 上述构建的三个重组质粒分别转化ZHA168宿主，获得三个重组枯草芽孢杆 菌 菌 株：ZHA168/pP43NMK/tuaD；ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB；ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA。 [0054] 实 施 例 3 重 组 质 粒 pP43NMK/glmU，pP43NMK/glmU-glmM，pP43NMK/glmU-glmM-glmS，pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi的构建 [0055] 根据已公布的Bacillus subtilis 168基因组信息序列，分别设计引物glmU-F/glmU-R、glmM-F/glmM-R、glmS-F/glmS-R和pgi-F/pgi-R。在上游引物glmU-F的5端引入KpnI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物glmU-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点，后续几个基因均采用SpeI和XbaI同尾酶进行连接；在上游引物glmM-F的5端引入SpeI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物glmM-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点；在上游引物glmS-F的5端引入SpeI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物glmS-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点。在上游引物pgi-F的5端引入SpeI限制性酶切位点和P43 RBS序列，在下游引物pgi-R的5端引入XhoI和XbaI限制性酶切位点。引物信息如下： [0056] glmU-F：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGGATAAGCGGTTTGCAGTTG[0057] glmU-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTATTTTTTATGAATATTTTTCAC[0058] glmM-F：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGGGCAAGTATTTTGGAACAGACGG[0059] glmM-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCTAATCCCATTTCTGACCGGAC[0060] glmS-F：CGGGGTACCAAGAGAGGAATGTACACATGTGTGGAATCGTAGGTTATATCGG[0061] glmS-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTACTCCACAGTAACACTCTTCGC[0062] pgi-F：GGACTAGTAAGAGAGGAATGTACACATGACGCATGTACGCTTTGAC [0063] pgi-R：CCGCTCGAGCGGACTCTAGTCTAGATTAATCTTCCAGACGTTTTTCAAGC[0064] 以提取的枯草芽孢杆菌基因组DNA为模板，采用标准的PCR扩增体系和程序，分别扩增获取glmU、glmM、glmS和pgi基因。 [0065] 质粒pP43NMK采用KpnI和XhoI双酶切，同时PCR扩增获得的glmU基因产物也采用KpnI和XhoI双酶切，经1％的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目标条带，回收产物进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，比对正确，pP43NMK/glmU质粒构建成功。在pP43NMK/glmU质粒基础上，按上述操作分别进行glmM、glmS和pgi基因的组装：pP43NMK/glmU质粒采用XbaI和XhoI进行双酶切，而glmM片段的PCR产物采用SpeI和XhoI双酶切，此步采用一对同尾酶进行连接，体系10μl：1μl双切的载体，4μl双切的目的片段，5μl Solution连接酶，16℃连接过夜，转化JM109感受态细胞，挑取单菌落PCR验证，阳性重组子进行测序，结果比对正确，pP43NMK/glmU-glmM质粒构建成功。按上述操作过程，成功构建后续两个重组质粒pP43NMK/glmU-glmM-glmS和pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi。 [0066] 上述所有质粒进行测序比对，结果正确。分别转化ZHA168菌株，获得四个重组枯草芽孢杆菌菌株：ZHA168/pP43NMK/glmU，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS，ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi。 [0067] 实施例4重组枯草芽孢杆菌菌株的摇瓶发酵 [0068] 挑取上述构建的8个重组菌株：ZHA168、ZHA168/pP43NMK/tuaD、ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB、ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA、ZHA168/pP43NMK/glmU、ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM、ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS、ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi，单克隆接种于5ml LB培养基，置于200rpm37℃过夜培养。16h后接种于250ml三角摇瓶(装液量25ml)中，发酵培养基为无机盐培养基：2％酵母粉，7％蔗糖，磷酸二氢钠15.6g/L，硫酸钾3.9g/L。按10％的接种量转接于摇瓶，置于200rpm37℃培养，在接种后第2h添加2g/L的木糖进行诱导hasA基因表达，发酵培养48h。 [0069] 收集发酵液，10000rpm下室温离心10min。发酵液上清转移置另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇充分混匀沉淀发酵液中的透明质酸。室温下静置1h，再10000rpm下室温离心20min，去除干净液体，白色沉淀加入发酵液等体积的1M NaCl溶液充分溶解，适当稀释后，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法检测HA酸含量。从附图2看出，表达UDP-GlcNAc途径的合成基因，HA的产量逐渐提高，说明提高UDP-GlcNAc的浓度有助于HA的合成，重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS的产量最高，达到3.66g/L。而表达UDP-GlcA途径的合成基因，随着表达基因的增多，HA产量略有降低，重组菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA产量为2.3g/L。 [0070] HA产物的分子量测定结果如图3显示，过表达UDP-GlcNAc途径基因，提高UDP-GlcNAc的浓度，HA的分子量逐步增大：表达重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU可以获得平均分子量约为150万道尔顿的HA，表达重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM可以获得平均分子量约为200万道尔顿的HA，表达重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS可以获得平均分子量约为235万道尔顿的HA，表达重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM-glmS-pgi可以获得平均分子量约为260万道尔顿的HA。而提高UDP-GlcA的浓度，HA分子量降低：表达重组菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD可以获得平均分子量约为140万道尔顿的HA，表达重组菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB可以获得平均分子量约为97万道尔顿的HA，表达重组菌株ZHA168/pP43NMK/tuaD-gtaB-pgcA可以获得平均分子量约为89万道尔顿的HA，相对于提高UDP-GlcNAc的分子量差别较大结果。 |
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