[0001] 本发明属于生物技术、生物质利用和食品领域，具体涉及一种高温糖苷水解酶基因及其表达蛋白与应用。背景技术：

[0002] 糖苷水解酶是水解两个糖分子或糖分子与非糖分子之间糖苷键的一类酶。糖苷水解酶广泛应用于生物和化学产业，如食品、饮料、饲料、医药、化工、服装和造纸等领域。其中，纤维素酶由于生物质产业的迫切需求而受到最为广泛的重视。另外，有些糖苷水解酶具有转糖苷作用，用于合成低聚糖和苷类物质，如一些半乳糖苷酶能利用乳糖合成低聚半乳糖，有些β-葡萄糖苷酶能利用醇和糖合成烷基糖苷。低聚半乳糖具有保湿性良好、甜度低、热能低(非消化)、对酸和热稳定等特性，它能促进肠道益生菌(双歧杆菌)的生长，促进脂类代谢等，有重要保健作用和医用价值，在功能食品领域受到广泛的关注，被广泛应用在保健品、乳品工业、糖果、饮料等领域。而烷基糖苷是一种重要的化工原料。总体而言，目前糖苷水解酶存在催化效率低、稳定性不足、应用成本高等问题，限制了相关产业的发展，开发高效、稳定的糖苷水解酶是生物、化工和食品等产业的迫切需求。极端高温菌长期生活在高温环境，形成独特的酶体系，其分泌的酶有耐热性强、催化效率高、催化机理独特等特点，高温糖苷水解酶的开发将加快生物和化工相关产业的发展。本发明提供一种高效多功能高温糖苷水解酶基因及表达产物。该酶在75℃下水浴12h其酶活仍保持100％，表现出极强的热稳定性，该酶同时具有β-葡萄糖苷酶、纤维素外切酶、β-木糖苷酶、β-半乳糖苷酶和低聚半乳糖合成酶活性，其中β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶活性分别接近和超过文献报道的最高值。该酶与商业纤维素酶协同水解秸秆，能明显提高葡萄糖和木糖产率；催化低聚半乳糖(GalOS)合成速率是文献报道的10-15倍，达265.2g L-1h-1，具有潜在的工业应用价值。

[0003] 发明目的：

[0004] 本发明的目的是针对现有糖苷水解酶存在热稳定性差、催化效率低、使用成本高等问题，提供一种高温糖苷水解酶CoGH1A基因及其表达蛋白与应用，包含高温糖苷水解酶CoGH1A基因、基因的重组载体和重组工程菌、高温糖苷水解酶CoGH1A氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基取代、缺失及添加形成的具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白质，以及该糖苷水解酶的蛋白表达和应用。具体包括如下：

[0005] 1、一种高温糖苷水解酶CoGH1A的基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

[0006] 2、一种高温糖苷水解酶CoGH1A，其氨基酸系列如SEQ ID NO.2所示。

[0007] 3、高温糖苷水解酶CoGH1A氨基酸序列SEQ ID NO.2中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基取代、缺失及添加形成的具有糖苷水解酶活性的衍生蛋白质。

[0008] 4、一种用于扩增高温糖苷水解酶CoGH1A基因的方法，其特征在于所使用的引物为：

[0009] PX13001 5’-GCCGCGCGGCAGCATGAGTTTTCCAAAAG-3’

[0010] PX13002 5’-GCGGCCGCAAGCGTTTATGAATTTTCCTTTATATAC-3’

[0011] 5、一种高温糖苷水解酶CoGH1A基因序列的重组载体pET-28b-CoGH1A及其转化而得的重组工程菌株，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)。

[0012] 6、本发明提供制备上述高温糖苷水解酶CoGH1A表达和纯化的方法。

[0013] 7、高温糖苷水解酶CoGH1A在生物质水解中的应用，与商业纤维素酶协同水解，能同时提高葡萄糖和木糖的得率。

[0014] 8、高温糖苷水解酶CoGH1A在乳糖水解和低聚半乳糖合成中的应用。它能迅速分解牛

[0015] 奶中的乳糖，利用乳糖合成低聚半乳糖的合成速率是文献报道的10-15倍。

[0016] 技术方案：

[0017] 为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

[0018] (1)高温糖苷水解酶CoGH1A基因重组载体和重组工程菌的构建

[0019] 提取热解纤维素菌C.owensensis的基因组，设计引物分别PCR扩增高温糖苷水解酶CoGH1A的基因，再酶切连接到载体pET-28b上，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选并通过测序鉴定阳性重组载体，提取重组载体质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得还有重组载体的重组工程菌。

[0020] (2)上述高温糖苷水解酶CoGH1A的蛋白纯化和酶学活性测定

[0021] 将获得的重组工程菌转接培养，IPTG诱导酶蛋白表达。通过超声波破碎细胞，高速离心和Ni-NTA sepharose 4B亲和层析分离纯化；然后通过SDS-PAGE电泳和分子筛鉴定蛋白分子大小和聚合态，发现高温糖苷水解酶CoGH1A以单体或三聚体的形式存在；最后浓缩，测定蛋白浓度，分析蛋白的酶学性质。

[0022] (3)上述高温糖苷水解酶CoGH1A在生物质水解中的应用

[0023] 以秸秆等生物质为原料，用不同比例的高温糖苷水解酶CoGH1A和商业纤维素酶酶解在50-70℃，pH 5-7的条件下酶解48-72h，测定纤维素和半纤维素的酶解率，说明添加高温糖苷水解酶CoGH1A对纤维素和半纤维素酶解的促进作用。

[0024] (4)高温糖苷水解酶CoGH1A在乳糖水解和低聚半乳糖合成中的应用

[0025] 以不同浓度4％-50％(w/w)的乳糖为底物，高温糖苷水解酶CoGH1A在70-80℃，pH 5-7条件下下催化10min-2h，高效液相色谱仪(PHLC)分析乳糖、半乳糖、葡萄糖和低聚半乳糖浓度变化，测定该酶对乳糖水解和低聚半乳糖合成的效率。

[0026] 有益效果：高温糖苷水解酶CoGH1A在生物质制备可发酵糖和低聚半乳糖生产等方面具有潜在的工业应用价值。附图说明

[0027] 图1：高温糖苷水解酶CoGH1A凝胶层析和凝胶电泳图

[0028] 图2：图2高温糖苷水解酶CoGH1A最适温度、pH和热稳定性

[0029] 实施例1：高温糖苷水解酶CoGH1A重组工程菌株的构建

[0030] 细菌基因组DNA的提取：

[0031] 在75℃，厌氧环境下培养C.owensensis菌，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养细菌的基因组DNA，-20℃冻存备用。

[0032] PCR引物设计：

[0033] 根据公开的C.owensensis基因组序列信息，预测高温糖苷水解酶CoGH1A基因，设计克隆所用的PCR引物。用于扩增高温糖苷水解酶CoGH1A基因的引物如下：

[0034] PX13001 5’-GCCGCGCGGCAGCATGAGTTTTCCAAAAG-3’

[0035] PX13002 5’-GCGGCCGCAAGCGTTTATGAATTTTCCTTTATATAC-3’

[0036] 从基因组DNA中PCR扩增基因：

[0037] 以C.owensensis基因组DNA为模板，应用设计引物进行PCR扩增高温糖苷水解酶CoGH1A基因，琼脂糖凝胶电泳检测确认扩增DNA片段，用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物。

[0038] 高温木聚糖酶Co Xylosidase A基因的酶切与连接：

[0039] 高温木聚糖酶Co Xylosidase A基因DNA片段和质粒pET-28b进行双酶切(Nde I/Xho I)，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因DNA及质粒载体。将酶切回收后的基因DNA和质粒载体用T4DNA连接酶反应连接。

[0040] 高温糖苷水解酶CoGH1A基因DNA的处理与连接：

[0041] 用高保真DNA聚合酶依据所设计引物扩增质粒pET-28b。用T4DNA聚合酶处理载体DNA和回收的高温糖苷水解酶CoGH1A基因DNA，用T4DNA连接酶反应连接。

[0042] 转化和重组质粒的提取：

[0043] 取连接产物加入到80μl Top10感受态细胞中，冰浴30min,43℃热激90s，再立即冰浴3min，加入500μl LB液体培养基，37℃，震荡培养2h。低速离心菌液，弃去部分上清，将剩余菌体重悬，涂布于含有40μg/ml卡那霉素的LB平板上，于37℃培养箱中培养过夜。挑取单菌落进行菌液PCR鉴定，测序确定阳性克隆，用质粒小提试剂盒提取该阳性克隆质粒。

[0044] 重组质粒转化获得重组工程菌：

[0045] 将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，于含有40μg/ml卡那霉素的LB平板上37℃培养过夜。挑取单菌克隆于含有40μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中培养，用30％的甘油保存菌种，获得以E.coli BL21(DE3)为宿主菌构建的高温糖苷水解酶CoGH1A基因重组菌株。

[0046] 实施例2：高温糖苷水解酶CoGH1A基因的表达和纯化

[0047] 表达：

[0048] 重组菌先分别接种于6ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃200rpm振荡培养过夜。然后以2％的量转接到100～400ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基，37℃200rpm振荡培养至OD600达到0.4左右，加入IPTG至终浓度0.5mM，37℃200rpm振荡培养5小时。离心收集菌体。

[0049] 纯化：

[0050] 向菌体加入适量binding buffer(50mM Tris-HCl pH7.5，300mM NaCl)重悬，超声破碎重组菌，高速离心，收集上清。将上清于65℃温育半小时，可沉淀大量非耐热的宿主菌蛋白，再高速离心收集上清。将收集上清过Ni-NTA亲和层析柱，先用6个柱体积的banding buffer洗柱，再用少量Elution Buffer(50mM Tris-HCl pH 7.5，300mMNaCl，500mM咪唑)洗脱，SDS-PAGE电泳检测洗脱液，即发现得到高纯度的目的蛋白。将蛋白通过Superdex 200层析柱换上柠檬酸缓冲液(50mM柠檬酸盐pH 6.0，150mMNaCl)，进一步纯化并结合SDS-PAGE电泳检测蛋白聚集状态，收集分子筛滤出的蛋白液，SDS-PAGE电泳检测，此结果如图1所示。然后将收集的蛋白液加入到超滤管，离心浓缩得到纯化的蛋白液。

[0051] 实施例3：高温糖苷水解酶CoGH1A的酶学性质测定

[0052] 应用50mM的柠檬酸缓冲液(pH 6.0)为酶解缓冲液，测定了高温糖苷水解酶CoGH1A对不同底物的酶解性能。这些底物包括浓度分别为1mM的对硝基苯酚葡萄糖苷(pNPGlu)、对硝基苯酚半乳糖苷(pNPGal)、对硝基苯酚纤维二塘苷(pNPC)、对硝基苯酚木糖苷(pNPX)、纤维二糖和半乳糖，1％(w/w)的滤纸瓜尔豆胶。在75℃酶解5-30min后，测定对硝基苯酚、葡萄糖或还原糖的量。以每分钟是放1微摩尔硝基苯酚、葡萄糖或还原糖的量定义为1个酶活单位(U)。高温糖苷水解酶CoGH1A酶解不同底物的酶活见表1。可以看出，该酶的β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-纤维二糖水解酶、β-木糖苷酶酶活分别为3215、1621、603和140U mg-1。它也能水解滤纸和瓜尔豆胶，表现出广泛的底物适应性。

[0053] 表1高温糖苷水解酶CoGH1A酶解不同底物的酶活

[0054]

[0055] 以1mM的对硝基苯酚半乳糖苷(pNPGlu)为底物，测定了高温糖苷水解酶CoGH1A的最适温度、ph和热稳定性，如图2所示。最适温度为75-85℃，最适ph为5.5，在75℃下保存12h后其活性没有任何变化，表现出极强的热稳定性。

[0056] 测定了高温糖苷水解酶CoGH1A酶解不同底物的动力学参数，如表2所示。其中以对硝基苯酚半乳糖苷和对硝基苯酚半乳糖苷为底物的催化指数分别接近和高于文献报道的最高值，表现出潜在的工业化应用前景。

[0057] 表2CoGH1A酶解不同底物的动力学参数

[0058]

[0059] 实施例4：高温糖苷水解酶CoGH1A与商业纤维素酶协同水解生物质

[0060] 高温糖苷水解酶CoGH1A和诺维信纤维素酶CTec2协同酶解汽爆秸秆，它们的添加量分别为20U/g汽爆秸秆和10FPU/g汽爆秸秆，初始底物浓度为20g汽爆秸秆/L，在50mM醋酸缓冲液酶解72h后测定产生的葡萄糖和木糖浓度，与单独诺维信纤维素酶CTec210FPU/g汽爆秸秆酶解结果相比，葡萄糖和木糖浓度分别提高35％和41％。在生物质制备可发酵糖方面表现出很强的应用价值。

[0061] 实施例5：高温糖苷水解酶CoGH1A降解乳糖和合成低聚半乳糖

[0062] 分别用乳糖起始浓度为40g L-1和500g L-1的糖溶液进行酶解，酶解反应在pH 5.5柠檬树缓冲液70℃下进行，高温糖苷水解酶CoGH1A的添加量为2.5U mL-1。在乳糖起始浓度为40g L-1时，酶解10min，乳糖的降解率达到83％，而文献报道的半乳糖苷酶酶解乳糖，酶解-1率达到80％所需的时间为2h以上。在乳糖起始浓度为500g L 时，酶解50min，低聚半乳糖的得率达到44％，低聚半乳糖合成速率达到265.2g L-1h-1，低聚半乳糖合成速率是文献报道
10倍以上。