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一种通过生物发酵一步制备泼尼松龙的方法
申请号	CN201510976860.3	申请日	2015-12-21	公开(公告)号	CN106893753A	公开(公告)日	2017-06-27
申请人	天津金耀集团有限公司;			发明人	王福军; 张杰; 王延年;
摘要	本发明涉及一种在以醋酸氢化可的松为原料，通过采用简单节杆菌Arthrobacter Simple ATCC 21032经过生物发酵一步直接生成泼尼松龙的制备方法。
权利要求	1.一种在以醋酸氢化可的松为原料，通过采用简单节杆菌Arthrobacter Simple ATCC 21032经过生物发酵一步直接生成泼尼松龙的制备方法。 2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是将醋酸氢化可的松粉碎或以溶剂溶解，投入已培养好节杆菌的发酵罐中进行生物转化，转化后提取得到泼尼松龙。 3.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述溶解底物的溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、DMF中的一种或几种，溶解倍数优选常温下能将底物溶解的最小倍数。 4.如权利要求1所述的制备方法，其特征是：所述的底物优选微粉化为D90≤30μm的微粒。 5.如权利要求1所述的制备方法，其特征是作为底物的化合物(1)的投料浓度为≤4％。 6.如权利要求1所述的制备方法，其特征是作为底物的醋酸氢化可的松的投料浓度优选1％～3％，发酵温度为29℃～32℃，反应时间为36～72小时。 7.如权利要求1所述的生物脱氢方法，其特征是所述的生物脱氢反应可以采用以下发酵工艺。 8.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述方法采用的斜面培养基培养基采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，琼脂2.0％，以及余量的蒸馏水，用无机碱溶液调至pH7.0-7.2，用于斜面培养。 9.如权利要求8-11所述的制备方法，其特征是所述方法采用的无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾中的一种或几种。 10.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述方法在采用粉碎醋酸氢化可的松投料前向发酵液中加入0.01～3％(v/v)促溶剂。
说明书全文	一种通过生物发酵一步制备泼尼松龙的方法技术领域： [0001] 本发明涉及一种泼尼松龙的制备方法，是通过生物发酵进行1，2位脱氢和21醋酸酯水解反应，从醋酸氢化可的松一步制备泼尼松龙。背景技术： [0002] 泼尼松龙一种常见的皮质激素，既可以作为皮质激素治疗药物，也可以作为其他皮质激素药物的原料，具有广泛的应用价值，十分重要。国内外对于该产品的制备研究持续不断。 [0003] [0004] 国内生产泼尼松龙常用的起始原料为来源于双烯的霉菌氧化物，它先经过C11位氧化后再经过C1、2位脱氢，之后再在侧链进行修饰得到21位酯化。此工艺的难点在于C11位羰基和C1、2位双键的引入，由于在C11位周围，没有活性功能基团对其起影响，常规条件下很难将C11位羟基氧化成C11位羰基；而且沃式氧化物经过C11位氧化后，下一步的C1、2位脱氢很难进行，存在着收率低、成本高的问题。 [0005] 肖俊等人报道(氢化泼尼松试制和分析的研究，南昌大学学报(工科版)，第24卷第4期，63-65)以醋酸泼尼松为起始物，经过酮基与脲缩合、硼氢化钠还原、水解制得。当然保护酮基的手段还有很多，例如用乙二醇进行缩合，也可以进行类似的反应。 [0006] 孙新宇等人报道(双水相体系中甾类化合物6-甲基氢化可的松的生物转化研究，浙江工业大学学报，第35卷第6期，617-620)报道对6-甲基氢化可的松进行1,2位脱氢制备6-甲基泼尼松龙。 [0007] 泼尼松龙的结构是在孕甾母核上具有1位和4位双键、11位羟基、21位羟基、17位羟基多个基团，而醋酸氢化可的松通过1，2位脱氢和21位水解两个单元反应形成1，2位双键和21位羟基。常见的制备方法，是通过生物法得出1，2位双键，如江苏远大仙乐药业有限公司申请的发明CN201510076695.6；再通过碱水解得到21位羟基，如天津天药药业股份有限公司申请的CN200510016229.5发明。而通常认为直接用醋酸氢化可的松作起始原料，进行C1、 2位的生物发酵，得到醋酸泼尼松龙，此工艺的缺点在于生物发酵的收率低，导致成本高。 [0008] 事实上，1，4位双键、21位羟基是目前抗炎甾体激素的常用基本结构。由于上世纪五十年代以来，科学家对上述基团合成方法反复摸索，已经形成了成熟的制备工艺，一般是通过生物脱氢制备1,2位双键，而21-羟基通过对21位进行碘化，再置换得出21位醋酸酯，在水解得出羟基。这条工艺路线的单元反应经过数代人的摸索，被认为是最为合理的制备路线，已经形成了行业的共识。近年来科研人员努力地方向更多的是对于单步工艺进行革新和改良，但是囿于传统经验思维，目前还没有开展工艺路线的调整。发明内容 [0009] 为了提高收率，实验人员通过不断地研究，在研究中惊奇的发现在以醋酸氢化可的松为原料，通过采用简单节杆菌Arthrobacter Simple ATCC 21032经过生物发酵可以一步直接生成泼尼松龙， [0010] [0011] 一种在以醋酸氢化可的松为原料，通过采用简单节杆菌Arthrobacter Simple ATCC 21032经过生物发酵一步直接生成泼尼松龙的制备方法。 [0012] 上述的制备方法，其特征是将醋酸氢化可的松粉碎或以溶剂溶解，投入已培养好节杆菌的发酵罐中进行生物转化，转化后提取得到泼尼松龙。 [0013] 上述的制备方法，其特征是所述溶解底物的溶剂选自甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环、DMF中的一种或几种，溶解倍数优选常温下能将底物溶解的最小倍数。 [0014] 上述的制备方法，其特征是：所述的底物优选微粉化为D90≤30μm的微粒。 [0015] 上述的制备方法，其特征是作为底物的化合物(1)的投料浓度为≤4％。 [0016] 上述的制备方法，其特征是作为底物的醋酸氢化可的松的投料浓度优选1％～3％，发酵温度为29℃～32℃，反应时间为36～72小时。 [0017] 上述的生物脱氢方法，其特征是所述的生物脱氢反应可以采用以下发酵工艺。 [0018] 上述的制备方法，其特征是所述方法采用的斜面培养基培养基采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，琼脂2.0％，以及余量的蒸馏水，用无机碱溶液调至pH7.0-7.2，用于斜面培养。 [0019] 上述的制备方法，其特征是所述方法采用的斜面培养基培养基采用以下％配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，琼脂2％，自来水配制，用无机碱溶液调至pH至7.0- 7.2，用于斜面培养。 [0020] 上述的制备方法，其特征是所述方法采用的发酵培养基为以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，KH2PO40.25％，玉米浆1％，以及余量的蒸馏水，用无机碱溶液调至pH 7.0-7.2，用于一级、二级培养和最终的生物反应中。 [0021] 上述的制备方法，其特征是所述方法采用的发酵培养基为以下配比：蛋白陈0.4％，葡萄糖0.6％，玉米浆0.6％，磷酸二氢钾0.07％，磷酸氢二钾0.05％，以及余量的蒸馏水，用无机碱溶液调至pH 7.0-7.2，用于一级、二级培养和最终的生物反应中。 [0022] 上述的制备方法，其特征是所述方法采用的无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钠、碳酸钾中的一种或几种。 [0023] 如权利要求8-11所述的制备方法，其特征是所述方法采用的无机碱为氢氧化钠、氢氧化钾中的一种或几种。 [0024] 上述的制备方法，其特征是所述方法在采用粉碎醋酸氢化可的松投料前向发酵液中加入0.01～3％(v/v)促溶剂。上述的制备方法，其特征是所述的促溶剂为优选吐温-80。 [0025] 将醋酸氢化可的松粉碎或以溶剂全溶或半溶，投入已培养好节杆菌或简单节杆菌的发酵罐中进行生物脱氢反应，转化后提取得到泼尼松龙。所述溶剂选自但不仅限于甲醇、乙醇、四氢呋喃、二氧六环，DMF(N,N-二甲基甲酰胺)中的一种或几种，所述粉碎投料的醋酸氢化可的松优选微粉化D90(90％通过粒径)≤40μm的微粒。优选粉碎投料时向发酵液中加入0.01～3％(v/v)促溶剂，所述的促溶剂为优选吐温-80。 [0026] 醋酸氢化可的松的投料浓度为≤4％(相对于发酵液容积)；优选投料浓度为1％～3％，发酵温度30～34℃，优选促溶剂加入量为0.2～0.5％(v/v)。生物脱氢反应时间30～72小时。 [0027] 生物反应结束后终止反应，优选采用将发酵液升温至70～90℃而使菌体灭活的方法，终止反应后用优选采用溶媒萃取发酵液的形式提取泼尼松龙。所述萃取用溶媒优选乙酸乙酯。 [0028] 所述生物反应所使用简单节杆菌(拉丁命名：Arthrobacter simplex)优选以下菌株Arthrobacter Simple ATCC 21032。 [0029] 简单节杆菌(拉丁命名：Arthrobacter simplex)AS 1.754、AS 1.94(均由中国科学院微生物研究所提供)。 [0030] 所述的生物脱氢反应可以采用以下发酵工艺： [0031] 斜面培养→一级培养→一级培养→加入化合物(1)发酵进行生物脱氢反应→终止反应。 [0032] 所述的生物发酵工艺还可采用任何公知的生物发酵工艺方法，如参考《生物合成药物学》(化学工业出版社，2000年出版，褚志义主编；666～675页)中公开的生物发酵工艺。 [0033] 所述的生物脱氢所用的培养基优选采用以下配比： [0034] 斜面培养基(％)：葡萄糖1.3，酵母膏1.3，琼脂2.0，以及余量的蒸馏水，pH7.0-7.2，用于斜面培养 [0035] 发酵培养基(％)：葡萄糖1.0，酵母膏0.16，KH2PO40.25，玉米浆1，以及余量的蒸馏水，pH 7.0-7.2，用于一级、二级培养和最终的生物脱氢反应中。实施例 [0036] 底物转化率的测定：转化率用反应过程中转化为产物的底物质量占初始底物总质量的百分比来表示。采用HPLC测定，分离柱为C18柱，检测波长为240nm，流动相是乙腈：水(体积比)＝60：40的溶于流速为1.5mL/min。采用面积归一法计算底物转化率。 [0037] 斜面培养：将斜面培养基分装于20×200mm的试管中，灭菌30min后摆成斜面。斜面于37℃培养箱中放置2d，观察无染菌情况即可进行接种。接种后斜面于30℃下培养2d，然后置于4℃冰箱中保存。 [0038] 一级培养：从生长良好的简单节杆菌斜面上取菌体，接入装有30ml培养基的250mL三角瓶中，30～34℃，180r/min振荡培养，24小时 [0039] 二级培养：将完成一级培养后的发酵液以5％～10％接种量接入装有150ml培养基的1000mL二级种子培养三角瓶中，以同样的条件进行二级培养，二级培养时间为24小时[0040] 生物脱氢和水解：与二级培养相同的接种量接入5L发酵罐中，培养温度29～32℃，搅拌转速150r/min，通气量2.0L/min，培养24小时后加入底物进行生物脱氢反应。 [0041] 斜面培养基1采用以下配比：葡萄糖1.3％，酵母膏1.3％，琼脂2.0％，以及余量的蒸馏水，用无机碱溶液调至pH7.0-7.2，用于斜面培养。 [0042] 斜面培养基2采用以下配比：酵母膏0.5％，蛋白胨0.5％，葡萄搪1％，琼脂2％，自来水配制，用无机碱溶液调至pH至7.0-7.2，用于斜面培养。 [0043] 发酵培养基1为以下配比：葡萄糖1.0，酵母膏0.16％，KH2PO40.25％，玉米浆1％，以及余量的蒸馏水，用无机碱溶液调至pH 7.0-7.2，用于一级、二级培养和最终的生物反应中。 [0044] 发酵培养基2为以下配比：蛋白陈0.4％，葡萄糖0.6％，玉米浆0.6％，磷酸二氢钾0.07％，磷酸氢二钾0.05％，以及余量的蒸馏水，用无机碱溶液调至pH 7.0-7.2，用于一级、二级培养和最终的生物反应中。 [0045] DMF：N，N-二甲基甲酰胺 [0046] 实施例1： [0047] 将简单节杆菌(Arthrobacter Simple ATCC 21032)依次进行分别使用斜面培养基培养、一级培养和二级培养，培养温度为29-32℃，将溶于有机溶剂的醋酸氢化可的松投入发酵培养基的5L发酵罐中，投料浓度见下表，反应温度为31±1℃。反应时间见下表，反应完成后升温至70℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得泼尼松龙转化率。 [0048] [0049] 实施例2： [0050] 具体制备方法培养基、投料浓度均同实施例1，仅是在醋酸可的松投入前在发酵培养基的5L发酵罐中加入吐温80。 [0051] [0052] 对照实施例1： [0053] 将简单节杆菌(AS 1.94)依次进行分别使用斜面培养基培养、一级培养和二级培养，培养温度为29-32℃，将溶于有机溶剂的醋酸氢化可的松投入发酵培养基的5L发酵罐中，投料浓度见下表，反应温度为31±1℃。反应时间见下表，反应完成后升温至70℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得泼尼松龙转化率为4.5％。 [0054] [0055] [0056] 对照实施例2： [0057] 将简单节杆菌(AS 1.754)依次进行分别使用斜面培养基培养、一级培养和二级培养，培养温度为29-32℃，将溶于有机溶剂的醋酸氢化可的松投入发酵培养基的5L发酵罐中，投料浓度见下表，反应温度为31±1℃。反应时间见下表，反应完成后升温至70℃终止反应，采用乙酸乙酯萃取提取发酵液，将有机相浓缩，测得泼尼松龙转化率。 [0058] [0059] 经检测，对照实施例得到的基本上是醋酸泼尼松龙(大于70％)和极少量的醋酸氢化可的松，而泼尼松龙极少。

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