一种高产耐热蛋白酶及虫草素的蛹虫草菌株筛选及诱变方法 |
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| 申请号 | CN201611248967.7 | 申请日 | 2016-12-29 | 公开(公告)号 | CN106801017A | 公开(公告)日 | 2017-06-06 |
| 申请人 | 徐州鸿宇农业科技有限公司; | 发明人 | 高兆建; 杨杰; 孙会刚; 曹泽虹; 邵颖; 曹建冬; 沈彬彬; 顾强; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 微 生物 真菌 领域，涉及一株高产耐热蛋白酶和虫草素的蛹虫草菌种及其应用，该菌株是选取自然界新分离的蛹虫草野生型菌株作为出发菌株，经蛹虫草原生质体亚硝基胍与紫外线复合诱变处理后，分离筛选获得的菌种，该菌株已于2016年11月11日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏登记号为CGMCC No.13179，命名为HYCM12，分类命名为蛹虫草，本发明菌株深层液态通 风 发酵 虫草素含量达到2.89g/L，耐热蛋白酶活 力 达到5326U/ml。同时，本发明的方法具有操作简单、周期短、易于实现，原料来源丰富易取，成本低，无环境污染，所用设备、 试剂 价格便宜等优点，便于规模化生产。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种高产耐热蛋白酶及虫草素的蛹虫草菌株筛选及诱变方法，该方法包括： |
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| 说明书全文 | 一种高产耐热蛋白酶及虫草素的蛹虫草菌株筛选及诱变方法技术领域背景技术[0002] 蛹虫草[Cordyceps militaris (L.) Link]，又名北冬虫夏草，现代科学研究表明，蛹虫草具有丰富的活性物质，如虫草多糖、虫草素、虫草酸，氨基酸，蛋白酶等，具有抗肿瘤、抗氧化和衰老、抗炎抗菌、抗疲劳、抑制病毒生长、增强免疫力等多种药理作用和滋补功能，是具有开发潜力的一大药用宝典。在蛹虫草的活性成分中，虫草素（cordycepin），是蛹虫草中（尤其是核苷类）主要活性成分，是第一个被分离出的核苷类抗生素。虫草素具有多种生物活性，有抗菌、降血脂、减肥、抗肿瘤和抗癌等作用。蛹虫草是主要产虫草素的菌株，但其子实体生长周期长，产量低，虫草素的含量也比较低，从子实体中提取虫草素成本极高，价格昂贵，很难满足临床的广泛使用。 [0003] 另一方面，当前，畜牧行业饲料资源紧张、成本上涨，食品安全问题频发，环境污染日益严重，酶制剂作为一种绿色、安全、无污染的添加剂呈现出越来越明显的价值与作用。近年来，蛋白酶在饲料中广泛添加，对动物生产性能、养分消化率以及肠道健康有积极作用。向饲料中添加蛋白酶，可以对饲料中的一些抗营养因子以及难以被动物消化吸收的如来源于豆粕、菜粕、棉籽粕、玉米、小麦、鱼粉、肉骨粉、羽毛粉和血粉等的蛋白质有强的降解作用，消除抗营养因子的负面作用，提高蛋白饲料的利用价值。因此选育能够产生蛋白酶的菌株对开发虫草饲料具有重要意义。 发明内容[0004] 针对上述问题，本发明提供了一种高产耐热蛋白酶及虫草素的蛹虫草菌株筛选及诱变方法，其目的在于：通过菌株的两种诱变一轮筛选的诱变方案，使得诱变菌株菌丝生长速度较快且发酵后生物量增加，遗传性状稳定。 [0005] 本发明的技术解决方案：一种高产耐热蛋白酶及高产虫草素的蛹虫草菌株(Cordyceps militaris) HYCM12，已于2016年11月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC（地址为： 中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101），保藏编号：CGMCC No. 13179。 [0006] 一、本发明所述的蛹虫草菌株(Cordyceps militaris)的筛选方法，包括以下步骤：步骤一 蛹虫草(Cordyceps militaris)菌种的分离筛选： （1）菌株的分离筛选 2015年8月在山东省沂南县沂蒙山采集野生蛹虫草，采集地为土质疏松、腐殖质丰富的树林中，环境温度20 28℃，空气湿度为70 80%。总共采集到9株野生虫草菌株，将虫草从图~ ~ 层中慢慢剥离，清水反复冲洗虫草表面，直到处理干净为止。再用无菌滤纸吸干虫草表面水分。再用75%的乙醇或0.1升汞对表面消毒，再次无菌水冲洗。然后，从蛹虫草子座中小心切出一小块，置于虫草活化固体培养基上，22 26℃下静置培养。待菌丝长出后，每天观察。选~ 择无杂菌污染的菌丝进一步转接到新的PDA斜面培养基。将得到的所有菌株分别接到蛋白酶筛选固体培养基上，24 28℃静置培养3 4天，产看菌落周围是否有水解圈。最后得到产生~ ~ 水解圈的纯化蛹虫草菌株共5株。 [0008] 蛋白酶筛选固体培养基：20%马铃薯浸提液200ml，干酪素5 15g，蔗糖10 20g，~ ~KH2P04 1 2g，MgS04 7H20 0.5 1g，琼脂粉15g，pH6.5，补充去离子水至1000ml，121℃灭菌~ ~ 20min。 [0009] 20%的马铃薯浸提液的制备方法：去皮马铃薯200g，切成小块，加水800ml，大火煮沸后改为小火，继续煮30min，中间添加去离子水并搅拌，防止锅底焦糊，冷却后，过滤，收集滤液，添加去离子水至1000ml，即得到20%的马铃薯浸提液。 [0010] （2）出草试验：将分离筛选获得的5株菌株，进行出草试验，检验菌株是否具有出草能力。接种入装有 40 50g大米、80 120ml营养液的罐头瓶中。将接种好的罐头瓶置于人工气候箱中培养。23~ ~ ~ 26℃下先进行暗培养7～15天，待菌丝长满培养基后，在罐头瓶封口膜上打通通气孔并转入光照培养，培养温度调整为16 22℃，光照强度为，300～500Lux，空气相对湿度60～80％，培~ 养40～60天，子待子实体不再生长，表面形成粒状子囊壳、即子座成熟。采收并检测子实体产量和成分。得到一株虫草产量较高的菌株XZCM6，子实体产量平均鲜重51.6g/瓶。40℃烘干后，每瓶的平均干重9.81g/瓶，生物转化率为103.2%。虫草素含量达到2.157mg/g。 [0011] 营养液配方为葡萄糖8~15g，蛋白胨5~7g，KH2P04 2~3g，酵母膏1~2g，MgS04 0.5~1 g，VBl 5~10mg，20％马铃薯浸汁100ml，蚕蛹粉2~8 g，pH5～7，补充自来水至1000 mL。 [0012] 步骤二、本发明产耐热蛋白酶及虫草素的菌株HYCM12诱变方法如下：（1）菌株活化培养 将上述步骤二中分离得到的野生菌株XZCM6转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养， 25 28℃恒温静置培养4～5天，按照如上方法菌株活化2次。 ~ [0013] （2）菌株菌丝体制备从活化好的菌丝固体平板培养基上取1cm2菌丝块接种到装有40 mL PDA菌丝培养基的 250mL锥形瓶中，24 28℃，160 200 r/min进行恒温摇床震荡培养3 7天。 ~ ~ ~ [0014] 菌丝液体培养基配方：葡萄糖20~30g、蛋白胨5~8g、20%马铃薯浸出液200ml，(NH4)2S04 3 5g、KH2P04 1 2g、MgS04 7H20 1 2g、酵母粉4 6g，加水定容至lL，pH 6.5 7.0，121℃~ ~ ~ ~ ~ 灭菌20min。 [0015] (3) 原生质体制备将MgS04 7H20、甘露醇溶解于双蒸水中并配制成浓度为0.6 mol/L的渗透压稳定剂溶液，高压灭菌后备用。以0.6mol/L的渗透压稳定剂配制浓度分别为0.5 0.6%和0.8 1.2%(W/~ ~ V)的蜗牛酶及纤维素酶溶液，并用0.22nm微孔滤膜过滤，按照2:1的体积比混合备用。用渗透压稳定溶液将无菌滤纸过滤后的菌丝体洗涤3次。按照每100mg制备好的湿菌丝对应加入 1 1.5mL混合酶液的比例，向菌丝体中加入酶液并置于25 28℃摇床上50r/min缓缓震荡孵~ ~ 育3 6h。酶解后用无菌棉花柱过滤除去菌丝，滤液3000 4000r/min离心5 8min，温和地沉淀~ ~ ~ 原生质体，弃去上清，将原生质体悬于渗透压稳定剂中并适当稀释备用。 [0016] （4）原生质体亚硝基胍（NTG）与紫外线复合诱变用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为1 2 mg/mL。取1 mL NTG处理液与稀释成~ 一定浓度的1 mL原生质体悬液混合，于旋转式摇床，转速50 80r/min，26℃处理10 60min~ ~ 后，将处理液3000 4000r/min离心5 10min，弃去上清，用pH6.5，0.1 mol/L的无菌磷酸缓冲~ ~ 液洗涤菌体2 3次，终止反应。然后将洗涤后的原生质体稀释后取悬浮液4mL在30W紫外灯~ 下，照射距离30cm条件下，缓缓磁力搅拌下照射20s 60s，接着原生质体再生培养。 ~ [0017] （5）原生质体再生培养经亚硝基胍和紫外线诱变后的原生质体系列稀释后，吸取150 200μL涂布于再生固体~ 培养基平板做再生培养。 [0018] 原生质体再生培养基配方为：20%的马铃薯浸提液200ml，葡萄糖20 30g，蛋白胨4~ ~8g，酵母粉4 6g，KH2P04 1 2g，MgS04 7H20 0.5 1g，琼脂粉15g，维生素B1 0.02g，补充去离~ ~ ~ 子水至1000 mL，pH6.5 7.0，121℃灭菌20min；培养条件为：25 28℃避光恒温培养5 8天。将~ ~ ~ 生长较快的菌落再次接到新的再生培养基上，相同条件下培养，得到第一代诱变菌株。按照以上条件培养三次，得到第三代诱变菌株。将获得的第三代菌株接到蛋白酶筛选固体培养基上，25 28℃，培养3 7天，挑选水解圈大菌株保藏，进一步复筛。 ~ ~ [0019] 蛋白酶筛选固体培养基配方：20%马铃薯浸提液200ml，干酪素5 15g，蔗糖10 20g，~ ~KH2P04 1~2g，MgS04 7H20 0.5~1g，琼脂粉15g，pH6.5，补充去离子水至1000ml，121℃灭菌 20min。培养基灭菌后充分摇匀，随着摇动，在60 70℃下倒入平板中。 ~ [0020] （6）发酵复筛培养将在蛋白酶固态筛选培养基上水解圈大的菌株分别接种到装有30 50mL液体种子培养~ 基的250mL三角瓶中，24 28℃，160 200r/min摇床震荡培养3 6天。 ~ ~ ~ [0021] 液体种子培养基配方：20%的马铃薯浸提液200ml，葡萄糖20 30g，蛋白胨4 8g，酵~ ~母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04 7H20 0.5~1g，补充去离子水至1000 mL，pH6.5~7.0，121℃灭菌20min。然后按照6 10%的接种量以上培养好的种子液到装有100 200ml液体发酵培养基~ ~ 的1000ml三角瓶中。过滤，测定发酵液中虫草素含量及蛋白酶活力。通过筛选得到一株虫草素含量和蛋白酶活力较高的菌株，命名为HYCM12。将该菌株保藏备用。 [0022] 液体发酵培养基配方：可溶性淀粉20 30g、葡萄糖10 20g、大豆蛋白胨10 15、硫酸~ ~ ~铵5 8g、酵母提取物5 8g、KH2P04 1 2g、MgS04 7H20 0.5 1g、ZnS04 7H20 0.05 0.1 g、~ ~ ~ ~ ~ FeS04 7H20 0.02 0.05g、VB1 0.1 0.5g，加水定容至1L，pH 6.5 7.0，121℃温度下灭菌~ ~ ~ 20min，23 26℃ 160 180r/min震荡培养4 8天。 ~ ~ ~ [0024] 2）本发明采用了两种诱变一轮筛选的诱变方案，两次诱变是对原生质体进行的亚硝基胍-紫外线复合诱变，原生质体辐射诱变技术是一种行之有效的微生物育种新方法，原生质体对辐射敏感性更强，更容易获得优良性状的菌株，诱变后进行了一次筛选。诱变效率高的前提下，而筛选过程只有一次，大大减少了工作量。 [0025] 3）本发明得到的诱变菌株菌丝生长速度较快且发酵后生物量增加，遗传性状稳定。 [0026] 4）经过诱变后，获得的高产菌株蛹虫草虫草素及耐热蛋白酶含量大幅度提高；诱变菌株发酵液中虫草素含量与原始出发菌株相比均有显著提高，其中，发酵液上清中虫草素含量为2.89g/L，为出发原始菌株的4.5倍；耐热蛋白酶含量为5326U/ml,是野生菌株的3.4倍。诱变效果明显。 [0027] 5）诱变获得的高产菌株经过10次以上的连续传代培养，每代液体发酵培养，均测定有虫草素及耐热蛋白酶含量。诱变菌株性状稳定，活性成分产量不退化，具较好的遗传稳定性；6）本发明获得的诱变菌株可以以廉价的农副产品作为培养基，能够大幅度降低培养基成本；液体发酵时间周期缩短，发酵条件更易于发酵控制，解决了固体发酵培养劳动强度大、发酵周期长的缺点，具备优异的工业化生产前景。 具体实施方式[0028] 下面通过实施例来对本发明做进一步描述：1、菌株的分离筛选 2015年8月在山东省沂南县沂蒙山采集野生蛹虫草，采集地为土质疏松、腐殖质丰富的树林中，环境温度20 28℃，空气湿度为70 80%。总共采集到9株野生虫草菌株，将虫草从图~ ~ 层中慢慢剥离，清水反复冲洗虫草表面，直到处理干净为止。再用无菌滤纸吸干虫草表面水分。再用75%的乙醇或0.1升汞对表面消毒，再次无菌水冲洗。然后，从蛹虫草子座中小心切出一小块，置于虫草活化固体培养基上，22 26℃下静置培养。待菌丝长出后，每天观察。选~ 择无杂菌污染的菌丝进一步转接到新的PDA斜面培养基。将得到的所有菌株分别接到蛋白酶筛选固体培养基上，24 28℃静置培养3 4天，产看菌落周围是否有水解圈。最后得到产生~ ~ 水解圈的纯化蛹虫草菌株共5株。 [0029] 虫草活化固体培养基：蔗糖10 20g，蛋白胨2 5g，酵母粉1 2g，20%的马铃薯浸提液~ ~ ~1000ml，琼脂粉15g，pH6.0 7.0，121℃灭菌20min。 ~ [0030] 蛋白酶筛选固体培养基：20%马铃薯浸提液200ml，干酪素5 15g，蔗糖10 20g，~ ~KH2P04 1 2g，MgS04 7H20 0.5 1g，琼脂粉15g，pH6.5，补充去离子水至1000ml，121℃灭菌~ ~ 20min。 [0031] 20%的马铃薯浸提液的制备方法：去皮马铃薯200g，切成小块，加水800ml，大火煮沸后改为小火，继续煮30min，中间添加去离子水并搅拌，防止锅底焦糊，冷却后，过滤，收集滤液，添加去离子水至1000ml。 [0032] 、出草试验：将分离筛选获得的5株菌株，进行出草试验，检验菌株是否具有出草能力。接种入装有 40 50g大米、80 120ml营养液的罐头瓶中。将接种好的罐头瓶置于人工气候箱中培养。23~ ~ ~ 26℃下先进行暗培养7～15天，待菌丝长满培养基后，在罐头瓶封口膜上打通通气孔并转入光照培养，培养温度调整为16 22℃，光照强度为，300～500Lux，空气相对湿度60～80％，培~ 养40～60天，子待子实体不再生长，表面形成粒状子囊壳、即子座成熟。采收并检测子实体产量和成分。得到一株虫草产量较高的菌株XZCM6，子实体产量平均鲜重51.6g/瓶。40℃烘干后，每瓶的平均干重9.81g/瓶，生物转化率为103.2%。虫草素含量达到2.157mg/g。 [0033] 营养液配方为：葡萄糖8~15g，蛋白胨5~7g，KH2P04 2~3g，酵母膏1~2g，MgS04 0.5~1 g，VBl 5 10mg，20％马铃薯浸汁100ml，蚕蛹粉2 8 g，pH5～7，补充自来水至1000 mL。~ ~ [0034] 、菌株鉴定菌株XZCM6形态特征鉴定：菌株的特征如下： 形态特征： 在黑暗条件下PDA培养基上24 26℃培养6 8天 后，整个菌落呈纯白色的绒~ ~ 毛状、菌落直径为17 32mm，菌丝生长旺盛、粗壮、菌丝致密，有光泽。显微镜下观察，菌丝细~ 胞多核、菌丝体顶端形成分生孢子梗，孢子梗顶端不膨大，无分枝，分生孢子以链状方式着生。孢子呈椭圆状。整体形状与蛹草拟青霉极为相似，初步鉴定该菌株无性型为拟青霉属(Paecilomyces militaris)的一个种。 [0035] 在栽培大米培养基上培养，待菌丝长满后，将栽培瓶移入出草室内，在薄膜中央扎4～6个孔，保持相对湿度60%～90%和足够的散射光，5～7天后培养料表面或四周有桔黄色色素形成，进一步光照培养后，长出子实体，子实体橘黄色，柄粗壮，头部膨大呈球形，出草整齐均匀，出草率高。子实体高1 4cm、直径5 7mm。 ~ ~ [0036] 菌株XZCM6的分子鉴定：提取菌株XZCM6基因组，依据真菌ITS序列中最保守的序列设计引物，引物如下：ITS 1： 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS 4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。引物由上海英俊生物工程技术有限公司合成。PCR 反应体系为(20 μL): ddH2O 12.7 μL，，10×PCR buffer 2.0 μL，dNTP mix (2.5 mmol/L) 2.0 μL，正向引物(10 μmol/L) 1.0 μL，反向引物(10 μmol/L) 1.0 μL，TaqFlexiPolymerase (5 U/μL) 0.3 μL， 模板 1.0 μL。热循环参数94℃预变性5min，94℃变性30s，56℃退火60s，72℃延伸2min，循环30次，72℃延伸10min。用pGM-T载体克隆测序。测得序列与从NCBI中比对获得的相近菌株的ITS序列采用ClustalX1.83进行多序列比对。 [0037] 其测定结果如下：1 AAGTAAAAGT CGTAACAAGG TCTCCGTTGG TGAACCAGCG GAGGGATCAT TAACGAGTTT 61 TCCAACTCCC AACCCTTTGT GAACATACCT ATCGTTGCTT CGGCGGACTC GCCCAGCGCC 121 TGGACGCGGG CCTGGGCGGC GGCCGTCGGG GGCCCCAAAC ACTGTATCTA CCAGTTTTTC 181 TGAATCCGCC GCAAGGCAAA ACAAATGAAT CAAAACTTTC AACAACGGAT CTCTTGGCTC 241 TGGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAACTGCG ATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGA 301 ATCATCGAAT CTTTGAACGC ACATTGCGCC CGCCAGCATT CTGGCGGGCA TGCCTGTTCG 361 AGCGTCATTT CAACCCTCGA CGTCCCATGG GGGATGTCGG CGTTGGGGAC CGGCAGCACA 421 CCGCCGCCCC CGAAATGAAG TGGCGGCCCG TCCGCGGCGA CCTCTGCGTA GTACTCCAAC 481 TCGCACCGGG AACCCGACGT GGCCACGCCG TAAAACGCCC AACTCTGAAC GTTGACCTCG 541 GATCAGGTAG GAATACCCGC TGAACTTAAG CATAT 对所测ITS序列与GenBank中的ITS序列进行比较，结果表明菌株XZCM6的ITS基因序列与序列数据库中所有Cordyceps militaris系列菌株的序列相似度均达到了99.2％。根据ITS序列鉴定特点，序列相似性>99％时，可判断为相同种。结合前面的菌丝结构及分生孢子的产孢类型和栽培特性，可以确定所测菌株XZCM6是蛹虫草（Cordyceps militaris）。 [0038] 、蛹虫草菌株的复合诱变和选育方法（1）菌株活化培养 将上述分离得到的野生菌株XZCM6转接到PDA固体斜面培养基进行活化培养，25 28℃~ 恒温静置培养4～5天。按照如上方法菌株活化2次。 [0039] （2）菌株菌丝体制备从活化好的菌丝固体平板培养基上取1cm2菌丝块接种到装有40 mL PDA菌丝培养基的 250mL锥形瓶中，24 28℃，160 200 r/min进行恒温震荡培养3 7天。菌丝液体培养基配方： ~ ~ ~ 葡萄糖20 30g、蛋白胨5 8g、20%马铃薯浸出液200ml，(NH4)2S04 3 5g、KH2P04 1 2g、MgS04~ ~ ~ ~ 7H20 1 2g、酵母粉4 6g，加水定容至lL，pH 6.5 7.0，121℃灭菌20min。 ~ ~ ~ [0040] (3) 原生质体制备将MgS04 7H20、甘露醇溶解于双蒸水中并配制成浓度为0.6 mol/L的渗透压稳定剂溶液，高压灭菌后备用。以0.6mol/L的渗透压稳定剂配制浓度分别为0.5 0.6%和0.8 1.2%(W/~ ~ V)的蜗牛酶及纤维素酶溶液，并用0.22nm微孔滤膜过滤，按照2:1的体积比混合备用。用渗透压稳定溶液将无菌滤纸过滤后的菌丝体洗涤3次。按照每100mg制备好的湿菌丝对应加入 1 1.5mL混合酶液的比例，向菌丝体中加入酶液并置于25 28℃摇床上50r/min缓缓震荡孵~ ~ 育3 6h。酶解后用无菌棉花柱过滤除去菌丝，滤液3000 4000r/min离心5 8min，温和地沉淀~ ~ ~ 原生质体，弃去上清，将原生质体悬于渗透压稳定剂中并适当稀释备用。 [0041] （4）原生质体亚硝基胍（NTG）与紫外线复合诱变用丙酮试剂将亚硝基胍溶液配制成终浓度为1 2 mg/mL。取1 mL NTG处理液与稀释成~ 一定浓度的1 mL原生质体悬液混合，于旋转式摇床，转速50 80r/min，26℃处理10 60min~ ~ 后，将处理液3000 4000r/min离心5 10min，弃去上清，用pH6.5，0.1M的无菌磷酸缓冲液洗~ ~ 涤菌体2 3次，终止反应。然后将洗涤后的原生质体稀释后取悬浮液4mL在30W紫外灯下，照~ 射距离30cm条件下，缓缓磁力搅拌下照射20s 60s。接着原生质体再生培养。 ~ [0042] （5）原生质体再生培养经亚硝基胍和紫外线诱变后的原生质体系列稀释后，吸取150 200μL涂布于再生固体~ 培养基平板做再生培养。原生质体再生培养基配方为：20%的马铃薯浸提液200ml，葡萄糖20~30g，蛋白胨4~8g，酵母粉4~6g，KH2P04 1~2g，MgS04 7H20 0.5~1g，琼脂粉15g，维生素B1 0.02g，补充去离子水至1000 mL，pH6.5 7.0，121℃灭菌20min；培养条件为：25 28℃避光恒~ ~ 温培养5 8天。将生长较快的菌落再次接到新的再生培养基上，相同条件下培养，得到第一~ 代诱变菌株。按照以上条件培养三次，得到第三代诱变菌株。将获得的第三代菌株接到蛋白酶筛选固体培养基上，25 28℃，培养3 7天，挑选水解圈大菌株保藏，进一步复筛。蛋白酶筛~ ~ 选固体培养基配方：20%马铃薯浸提液200ml，干酪素5~15g，蔗糖10~20g，KH2P04 1~2g，MgS04 7H20 0.5 1g，琼脂粉15g，pH6.5，补充去离子水至1000ml，121℃灭菌20min。培养基灭~ 菌后充分摇匀，随着摇动，在60 70℃下倒入平板中。 ~ [0043] （6）发酵复筛培养将在蛋白酶固态筛选培养基上水解圈大的菌株分别接种到装有30 50mL液体种子培养~ 基的250mL三角瓶中，24 28℃ 160 200r/min震荡培养3 6天。液体种子培养基配方：20%的~ ~ ~ 马铃薯浸提液200ml，葡萄糖20 30g，蛋白胨4 8g，酵母粉4 6g，KH2P04 1 2g，MgS04 7H20 ~ ~ ~ ~ 0.5 1g，补充去离子水至1000 mL，pH6.5 7.0，121℃灭菌20min。然后按照6 10%的接种量以~ ~ ~ 上培养好的种子液到装有100 200ml液体发酵培养基的1000ml三角瓶中。温度为26～32℃，~ 摇床转速调整为180～210 r/min，发酵3 5天。过滤，测定发酵液中虫草素含量及蛋白酶活~ 力。通过筛选得到一株虫草素含量和蛋白酶活力较高的菌株，命名为HYCM12，将该菌株保藏备用。该菌株液体发酵培养基中发酵培养，虫草素含量达到最大值2.89g/L。其产耐热性蛋白酶活力达到5326U/ml。虫草素含量为诱变前野生菌株产量的4.5倍，耐热蛋白酶活力是野生菌株的3.4倍。诱变效果明显。 [0044] 液体发酵培养基配方：可溶性淀粉20 30g、葡萄糖10 20g、大豆蛋白胨10 15、硫酸~ ~ ~铵5 8g、酵母提取物5 8g、KH2P04 1 2g、MgS04 7H20 0.5 1g、ZnS04 7H20 0.05 0.1 g、~ ~ ~ ~ ~ FeS04 7H20 0.02 0.05g、VB1 0.1 0.5g，加水定容至1L，pH 6.5 7.0，121℃灭菌20min），23~ ~ ~ ~ 26℃ 160 180r/min震荡培养4 8天。 ~ ~ [0045] （7）菌株遗传稳定性测定以上复筛后将产量较高的HYCM12菌株进行遗传稳定性考察。连传10代，每代均先接入种子液，每株菌每代培养3个液体摇瓶，以种子液按照6-10%的接种量接种发酵培养基，23- 26℃，发酵4-8d。发酵结束，菌株显示稳定的发酵性能。将诱变菌株HYCM12保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 13179。 [0046] 综上，本发明达到预期目的。 |
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