用于释放病毒样颗粒的方法 |
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| 申请号 | CN201480008914.0 | 申请日 | 2014-02-14 | 公开(公告)号 | CN105073131B | 公开(公告)日 | 2017-06-27 |
| 申请人 | 英特维特国际股份有限公司; | 发明人 | V.法钦格; M.斯诺; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及用于从昆虫细胞中释放杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP）的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.用于从昆虫细胞中释放杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP）的方法，其特征在于所述方法无裂解或细胞破碎步骤，并且包括将所述昆虫细胞与盐混合的步骤，其中产生于混合的所述盐的水溶液包含至少300mOsmol/l的盐，所述盐的阳离子选自碱金属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl-、Br-和I-，其中所述VLP是猪圆环病毒2型（PCV2） VLP，并且其中所述昆虫细胞是草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）21（Sf21）细胞或草地贪夜蛾9（Sf9）细胞。 |
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| 说明书全文 | 用于释放病毒样颗粒的方法[0001] 本发明涉及用于从昆虫细胞中释放杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP）的方法。 [0002] 目前，当对抗传染病时，医学严重依赖疫苗。此类疫苗可以是减毒活疫苗或灭活疫苗，两者均具有其自身的优点和缺点。减毒活疫苗紧密模拟天然感染，并且因而它们触发的免疫应答与由剧毒形式的病毒或微生物触发的免疫应答可比较。然而，它们可能引起一些不希望的副作用，并且减毒水平是相当关键的。另一方面，灭活疫苗是安全的，但它们在几种情况下不像它们的活的对应物一样有效。 [0003] 在病毒疫苗的情况下，第三类疫苗获得越来越多的关注：所谓的基于病毒样颗粒（VLP）的疫苗。病毒样颗粒是在形态上紧密类似野生型病毒的颗粒。它们包含在野生型病毒上发现的所有免疫原性组分，并且它们包含以其天然组构和构象的这些组分。然而，它们不同于野生型病毒之处在于它们不能产生感染性子代病毒，因为它们缺乏病毒基因组。 [0004] 因此，它们是减毒活疫苗和灭活病毒疫苗两者的有吸引力的替代物。 [0005] VLP主要在细胞系统中体外产生。并且在许多情况下，它们在杆状病毒/昆虫细胞表达系统中产生。这些系统具有它们能够产生相对大量VLP的优点。 [0006] 在杆状病毒表达载体系统（BEVS）中表达的蛋白质可以是分泌的或非分泌的蛋白质。这暗示非分泌的VLP在它们可以进一步纯化前首先从昆虫细胞中释放。用于VLP释放的标准方法包括冻融、超声处理、高切力机械方法、珠方法、“细胞炸弹”、使用低渗介质的渗透压休克、去污剂的使用和酶促方法。 [0007] 然而，所有这些方法均不可避免地也导致细胞破碎或裂解，并且将细胞的整个内含物：RNA、DNA、蛋白质、细胞器、细胞碎片以及（在基于杆状病毒的系统的情况下）活的杆状病毒释放到周围介质内。明确的是大多数（如果不是全部）这些组分在VLP准备用于疫苗之前必须被去除。所需纯化水平暗示包括许多质量检查的费力的多步过程。 [0008] 因此，存在对将非分泌的VLP释放到细胞培养液内的方法的明确需要，所述方法避免同时释放细胞的全部核酸和蛋白质内含物。 [0009] 本发明的目的是提供用于释放VLP的方法，其降低或甚至避免上述问题。 [0010] 本发明中提供的方法特别适合于释放使用昆虫细胞在杆状病毒表达载体系统中表达的无包膜病毒的非分泌的VLP。 [0011] 目前惊讶地发现一旦包含无包膜VLP的昆虫细胞与盐混合，则使得产生于混合的盐的水溶液(salt in water solution)包含至少300mOsmol/L的盐，所述盐的阳离子选自碱金属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl-、Br-或I-；细胞释放VLP，而不释放其全部细胞内含物。该方法尤其适合于在悬浮无载体生长时的昆虫细胞。 [0012] 这确实是非常令人惊讶的现象：根据本发明的方法明显使得大多数细胞完整，如例如图4中可见的。这种VLP释放背后的机制仍不明确。 [0013] 因此，本发明的第一个实施方案涉及用于从昆虫细胞中释放杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP）的方法，其特征在于该方法无裂解或细胞破碎步骤，并且包括将昆虫细胞与盐混合的步骤，其中产生于混合的盐的水溶液包含至少300mOsmol/l的盐，所述盐的阳离子选自碱金属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl-、Br-和I-。 [0014] 为了该方法的目的，将昆虫细胞与盐混合，使得产生于混合的盐的水溶液包含至少300mOsmol/l的盐，所述盐的阳离子选自碱金属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl-、Br-和I-，应理解为包括下述步骤：将细胞培养液（其周围流体中的昆虫细胞）与盐混合至在混合后所得到的盐溶液包含至少300mOsmol/l的盐的程度，所述盐的阳离子选自碱金属和碱土金属，并且所述盐的阴离子选自Cl-、Br-和I-。 [0015] 不言而喻，混合可以以不同方式完成；例如通过将固体形式的盐加入细胞培养液中，或通过将盐的水溶液与细胞培养液混合。 [0016] 如本发明中所述，其为混合结果的盐的水溶液可以例如包含至少150 mM NaCl/L（这获得摩尔渗透压浓度为至少300 mOsmol NaCl/L的盐的水溶液）。如果如本发明中所述的盐溶液在MgCl2的基础上制备，则产生于混合的盐的水溶液将包含至少100 mM MgCl2/L（这获得摩尔渗透压浓度为至少300 mOsmol MgCl2/L的盐的水溶液）。 [0017] 下述实例仅充当举例说明；如果100 ml包含昆虫细胞和培养基的昆虫细胞培养物与100 ml 300 mM NaCl/L溶液混合，则产生于这个动作的最终200 ml流体包含150 mM NaCl/L。盐溶液的最终体积当然与根据本发明的方法的有利效应无关。如果75 ml包含昆虫细胞和培养基的昆虫细胞培养物与25 ml 1200 mM NaCl/L溶液混合，则产生于这个动作的最终100 ml流体包含300 mM NaCl/L。 [0018] 在本发明的出乎意料的现象的凝胶上的显示在图1中给出。如由图1可见的，显示在用根据本发明的方法处理后包含释放的VLP的细胞上清液的泳道非常干净(clean)（关于细节参见实施例部分）。 [0019] 尽管，如上所述，盐溶液的最终体积对于像这样的方法无关，但实际上在对细胞培养液实施根据本发明的混合步骤前引入浓缩步骤是有用的。浓缩步骤的主要原因在于用于商业目的的VLP生产需要相对大的细胞培养体积。直接从这些大体积中收获VLP不是有效的；从小体积中收获VLP需要少得多的处理。 [0020] 该步骤中的浓缩水平并不关键。细胞培养液浓缩成细胞培养液原始体积一半量的体积（即至50%的原始体积）已获得容易收获的显著优点。进一步浓缩至40%、30%、25%、20%、15%、10%或甚至5%以该优先次序是优选的。 [0022] 另一种常用方法是低速离心。低速离心随后去除一部分或全部细胞培养液导致浓缩，且最终导致细胞沉淀，但细胞仍将是完整的且仍由少量培养液包围。此类细胞沉淀随后可以容易地与盐的水溶液混合，以获得如本发明中所述的盐的水溶液。 [0023] 出于实际原因，非常合适的方法是简单贮存包含细胞的细胞培养液，并且让重力将细胞拉到容器底部。在约1-18小时后，取决于收获体积和容器大小，到目前为止大多数细胞存在于底部10%的细胞培养液中，使得无细胞的上部90%的细胞培养液可以被弃去。该方法避免离心和/或超滤大体积的细胞培养液的任务。如此获得的在底部10%的细胞培养液中的含VLP细胞，随后可以立即用于如本发明中所述将昆虫细胞与盐混合的步骤中。 [0024] 因此，该实施方案的优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于将昆虫细胞与盐混合的步骤之前为其中浓缩昆虫细胞的浓缩步骤。 [0025] 原则上，选自碱金属和碱土金属的阳离子可以用于根据本发明的方法。然而，对于选自Na+、Mg2+、Ca2+和K+的阳离子存在优选，因为它们是廉价的且对于医学用途是可接受的。 [0026] 因此，本发明的该实施方案的另一种优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于阳离子选自Na+、Mg2+、Ca2+和K+。 [0027] 优选阴离子是Cl-，因为具有Cl-阴离子的盐是廉价的，并且它们对于医学用途是高度可接受的。 [0028] 因此，该实施方案的更优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于盐选自NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2。 [0029] 包含携带VLP的昆虫细胞的细胞培养液另外包含培养细胞必需的许多组分。它还包含细胞的废产物(waist products)。这些产物是不需要的副产物，其对于包含VLP的最终疫苗可能是有害的。 [0030] 此类组分因此优选在对细胞应用根据本发明的方法之前，与包含VLP的昆虫细胞分开。这可以容易地通过下述完成：使细胞沉淀，弃去上清液且将细胞重悬浮于如本发明中所述的盐溶液中。如果这小心地完成，则到目前为止的大部分上清液可以被去除。在那种情况下，产生于细胞和盐混合的盐的水溶液基本上由如本发明中所述的盐和水组成。基本上在此处意指产生于混合的盐的水溶液包含小于10%的细胞培养液。优选地，产生于混合的水溶液包含小于8%、小于6%、小于4%或甚至小于2%的细胞培养液。 [0031] 因此，该实施方案的优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于产生于混合的盐的水溶液基本上由如本发明中所述的盐和水组成。 [0032] 根据本发明的方法适合于一般在BEVS中表达的非分泌的无包膜VLP。 [0033] 该方法因此尤其适合于BEVS衍生的细小病毒科（Parvoviridae）和圆环病毒科（Circoviridae）（具有对于其目前在商业基础上制备VLP的几个成员的病毒科）的成员的VLP。 [0034] 因此，本发明的该实施方案的另一个优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于无包膜病毒是细小病毒科或圆环病毒科的成员。 [0035] 在无包膜病毒基础上用于兽医学中的重要的细小病毒科和圆环病毒科疫苗的实例是猪细小病毒（PPV）和猪圆环病毒2型（PCV2），所述无包膜病毒可以以在基于杆状病毒的昆虫细胞系统中制备的VPL形式成功施用。 [0036] 因此，本发明的该实施方案的更优选形式涉及根据本发明的方法，其特征在于无包膜病毒是猪细小病毒（PPV）或猪圆环病毒2型（PCV2）。 [0037] 在BEVS中生产VLP原则上还导致杆状病毒的产生。此类杆状病毒是不需要的VLP的副产物，并且因此它们必须被去除或至少灭活。 [0039] 这种减少是非常有利的，因为在应用根据本发明的方法后，待灭活的病毒量相对低，并且因此需要使用更少量的灭活化学品。 [0040] 仅作为实例；当盐的水溶液保持在30-40℃之间的温度下时，可以容易地获得在1000至10.000倍之间的病毒滴度下降。 [0041] 在其期间必须应用某一温度的时间取决于所选择的温度：在约40℃的温度下，在1小时后获得病毒滴度中的10倍减少，而在约35℃的温度下，在5-6小时后获得此类减少。一般地，将产生于混合的盐的水溶液保持在某一温度下18-24小时无论如何均为合适的。 [0042] 经常用于VLP表达的两个昆虫细胞样本是SF9或SF21细胞。本发明中所述的方法可以非常成功地应用于这两种细胞。 [0043] 因此，本发明的该实施方案的另一个优选形式涉及根据本发明的方法，其中昆虫细胞是SF9或SF21细胞。 [0044] 所述方法通常是一般应用于纯化杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP）的方法的一部分，其包括多个步骤，其中为a）用编码VLP-蛋白质的重组杆状病毒感染昆虫细胞，b）培养昆虫细胞，c）从昆虫细胞中释放VLP，和d）分离VLP的步骤。 [0045] 正是步骤c）（释放VLP的步骤）将高度获益于根据本发明的方法。 [0046] 因此，本发明的又另一个实施方案涉及用于纯化杆状病毒表达的无包膜病毒的病毒样颗粒（VLP）的方法，其中该方法包括下述步骤： [0047] a）用编码VLP-蛋白质的重组杆状病毒感染昆虫细胞， [0048] b）培养昆虫细胞， [0049] c）从昆虫细胞中释放VLP， [0050] d）分离VLP， [0051] 其特征在于该方法无裂解或细胞破碎步骤，并且步骤c包括根据本发明的用于释放VLP的方法。 [0052] 实施例. [0053] 实施例1：PCV2 VLP的产生。 [0055] 为了获得最大量的表达产物，进行预实验以优化获得重组PCV-2 ORF-2 VLP的条件。所有实验均使用在悬浮培养中的草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda）21（Sf21）细胞在28℃下进行。处于来自原种（Master seed）的第4次传代水平的BacPCV-2-ORF-2病毒用于感染。对于优化的生产，在感染时的细胞密度为1.4 x 106细胞/ml，感染复数（MOI）为0.01，并且培养在感染后继续6天。所得到的混合物命名为表达产物收获物。 [0056] 根据Laemmli（Laemmli，U. K.（1970）. Nature 227，680-685）的方法，对低速离心前和后的细胞培养液的样品实施变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。使用的4-12%梯度凝胶由考马斯亮蓝进行染色。实施例中的所有凝胶也均是根据Laemmli的变性SDS-聚丙烯酰胺凝胶。 [0057] 实施例2：从昆虫细胞中释放VLP。 [0058] 细胞根据实施例1进行收获。在图1中，标题为“收获物”的泳道显示细胞培养收获物的蛋白质含量。该泳道显示培养液和细胞中存在的所有蛋白质，包括细胞蛋白质、杆状病毒蛋白质和VLP相关蛋白质。 [0059] 在以200g将收获物离心后，将90%的无细胞上清液更换为相等体积的盐的水溶液，使得在混合后的最终浓度为0.15、0.20、0.25和0.30 mM NaCl。这些混合物在40℃下保持18小时，并且剩余细胞随后通过以3000g离心旋转下来(spun down)。对上清液实施凝胶电泳。 [0060] 如图1中可见的，在标题为“上清液”的泳道中，上清液包含实际上纯的PCV2 VLP蛋白质（和痕量的非VLP蛋白质）。 [0061] 实施例3：碱盐和磷酸盐缓冲液的比较。 [0062] 在该实验中，收获细胞培养液，将细胞以200 g沉淀，去除90%的上清液，并且将细胞重悬浮于等体积的PB（250 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4、PB + 0.5 M NaCl、H2O（= WFI =注射用水）和如本发明中所述的0.5 M NaCl的水溶液中。 [0063] 温育在40℃下过夜完成。细胞随后通过以3000g离心进行去除。由图2可见，WFI单独不释放VLP，而PB+NaCl、NaCl的水溶液和PB的确释放VLP。如由泳道WFI + NaCl（=注射用水+ NaCl，= NaCl的水溶液）可见的，这获得最高量的纯VLP，以及非VLP相关蛋白质的最低背景。 [0064] 所有样品的抗原质量（以抗原单位/ml - AU/ml表示）均通过ELISA相对于已知抗原质量的参考标准品进行测定。随后，所有测试样品的回收率（以%计）相对于收获物样品的回收率进行计算。作为替代方法，在凝胶上的PCV2特异性蛋白质条带的强度相对于收获物样品的PCV2特异性蛋白质条带的强度进行计算。 [0065] 实施例4：在高温下的碱盐和磷酸盐缓冲液的比较。 [0066] 在该实施例中，收获细胞培养液，将细胞以200 g沉淀，去除90%的上清液，并且将细胞重悬浮于等体积的PB（250 mM磷酸盐，pH 7.4、PB + 0.5 M NaCl、0.01 M PBS（8g NaCl/L、0.2g KCl/L、1.44g Na2HPO4/L、0.2g KH2PO4/L，pH 7.1）和如本发明中所述的0.5 M NaCl的水溶液中。 [0067] 进行几种稀释，以便比较细胞培养液的稀释水平的效应。在一个实验中，将在30 ml收获的细胞培养液中的细胞浓缩10倍，并且随后与盐的水溶液混合至50 ml的终末体积。在第二个实验中，将在30 ml收获的细胞培养液中的细胞浓缩10倍，并且随后与盐的水溶液混合至25 ml的终末体积。在第三个实验中，将在30 ml收获的细胞培养液中的细胞浓缩10倍，并且随后与盐的水溶液混合至10 ml的终末体积。 [0068] 温育在40℃下过夜完成。细胞随后通过以3000 g离心进行去除。由图3中的凝胶可见，PB、PB+NaCl、PBS和NaCl 的水溶液（WFI + NaCl）均的确释放VLP。如由泳道WFI + NaCl（=注射用水+ NaCl，= NaCl的水溶液）可见的，这获得最高量的纯VLP，以及非VLP相关蛋白质的最低背景。相同效应对于所有三个浓度均可见。 [0069] 另外，使用WFI + NaCl的实验也在45℃下完成。如由泳道“WFI + NaCl，45℃”可见的，在该温度下的温育获得与在40℃下的WFI + NaCl处理可比较的图片：VLP蛋白质具有可比较的少量的蛋白质杂质。 [0070] 实施例5：细胞在盐于水中的环境(salt in water environment)中的行为。 [0071] 在该实验中，显微镜图片由在细胞培养液中的昆虫细胞和根据依照本发明的方法处理的细胞制成。细胞保持为未经处理的细胞培养液或实施根据本发明的方法，在这种情况下，与盐的水溶液混合使得产生于混合的盐的水溶液包含0.3 M NaCl/L。 [0072] 图4显示了结果：左侧图片显示了未处理的昆虫细胞，而右侧图片显示了在混合后包含0.3 M NaCl/L的盐的水溶液中的昆虫细胞。如立即可见的，右侧图片中的细胞事实上仍是完整的，并且与左侧图片中的细胞相比较，由于其存在于包含0.3 mM NaCl/L的盐的水溶液的高渗环境中，它们甚至在尺寸中略微更小。 [0073] 实施例6：温育温度对杆状病毒滴度的影响。 [0074] 在该实施例中，通过低速离心收获30 ml细胞，去除90%的无细胞的培养液，并且随后将剩余细胞沉淀重悬浮于25 ml盐的水溶液中至0.5 M NaCl/L的终末浓度。 [0075] 对因此获得的上清液实施35℃、37℃和40℃的温度持续1、2、4、6或18小时（过夜）。细胞随后通过以3000g离心进行去除。如由图5可见的，在35℃下过夜可以获得约100倍的杆状病毒滴度减少。在40℃下，在1-2小时后已获得100倍的减少，而在6-18小时后获得1000倍的减少。 [0076] 实施例7：各种浓度的几种碱金属的比较。 [0077] 该实验比较通过不同盐的VLP释放。细胞如上所述进行收获，去除90%的无细胞的细胞培养液体积。其后，加入各种盐的水溶液，由此盐的水溶液的体积始终等于浓缩的收获物体积的那种，以便实现5倍的终末细胞浓度。测试用各种浓度的NaCl、KCl、MgCl2和CaCl2执行。细胞随后通过以3000g离心进行去除。在混合后的浓度呈现于下表1中。 [0078] [0079] *该样品衍生自相同收获物，但在与剩余样品不同的日期用0.3M NaCl进行处理。 [0080] 表1。 [0081] 结果呈现于图6中。泳道2显示了如收获物（在样品五倍稀释后（例外：泳道12：未稀释的收获物样品）中存在的蛋白质。在凝胶上的收获物样品的回收率（表1）在表中指示为100，如在凝胶上测定的相对回收呈现于表1的右侧第二栏中。抗原质量回收呈现于表1的最右一栏中。由图6中的凝胶和表两者可见，所有处理均具有比泳道2中的制剂（收获物）更高的回收率，并且所有处理均提供了干净的VLP制剂。（泳道9中相对低的回收率值视为假象，因为如泳道9中测试的制剂的抗原质量测定显示如预期的高回收率）。图7显示了在如凝胶上确定的VLP回收率和如通过基于标准ELISA测试的抗原质量测定确定的VLP回收率之间存在良好关联。 [0082] 实施例8：对产生猪细小病毒的SF9和SF21细胞应用该方法。 [0083] 该实验旨在显示该方法同样适合于其他无包膜的非分泌的VLP。在该实验中，选择BEVS衍生的细小病毒科的VLP：猪细小病毒PPV）。另外，在该实验中，使用两个不同物种的常用昆虫细胞：SF9细胞和SF21细胞。 [0084] 用表达猪细小病毒VLP的重组杆状病毒感染SF9和SF21细胞。（“收获物”，图8，泳道2和7）。其后将细胞以200g沉淀，去除90%的上清液（图8，泳道4和9），并且将细胞重悬浮于等体积的PBS（图8，泳道3和8）或0.3 M NaCl的水溶液中。在NaCl 处理的样品在40℃下过夜温育后，将样品以3000g离心，收集上清液（图8，泳道6和11），并且将沉淀重悬浮于等体积的PBS中（图8，泳道5和10）。 [0085] 图8显示了该方法当应用于在SF9和SF21细胞中产生的PPV-VLP时的结果。泳道2：收获物；泳道3：收获物，重悬浮于PBS中的沉淀，泳道4：收获物上清液；泳道5：收获物，0.3 M NaCl 40℃过夜，沉淀；泳道6：收获物，0.3 M NaCl 40℃过夜，上清液；泳道7：收获物；泳道 8：收获物，重悬浮于PBS中的沉淀，泳道9：收获物上清液；泳道10：收获物，0.3 M NaCl 40℃过夜，沉淀；泳道11：收获物，0.3 M NaCl 40℃过夜，上清液。 [0086] 当与泳道3相比较时，由泳道5可见，根据本发明的方法的处理实际上从昆虫细胞释放所有VLP：如泳道5中所示，在处理后沉淀的细胞几乎不包含或不包含VLP。当与泳道3相比较时，由泳道4可见，与对于PCV2 VLP可见的相反，产生CPV VLP的昆虫细胞已在上清液中释放一部分VLP。关于这点的原因未知。然而，根据本发明的方法也可以非常适合地应用于这些CPV VLP，因为如果不应用本发明的方法，则在收获后相当大量的CPV VLP保持陷在(trapped in)细胞中。 [0088] 图1：该图显示了使用各种浓度的NaCl的水溶液，在40℃下对包含VLP的昆虫细胞应用根据本发明的方法的效应。 [0089] 图2：该图显示了使用盐的水溶液中的各种盐，对包含VLP的昆虫细胞应用根据本发明的方法的效应。 [0090] 图3：该图显示了使用盐的水溶液中的各种盐，在高温下对包含VLP的昆虫细胞应用根据本发明的方法的效应。 [0091] 图4：该图片显示了在其培养基中的昆虫细胞（左侧图片）和在用根据本发明的方法处理后的昆虫细胞（右侧图片）之间的比较。 [0092] 图5：该图片显示了在高温下的延长温育对杆状病毒滴度的影响。 [0093] 图6：该图显示了使用NaCl、MgCl2、CaCl2和KCl作为盐的水溶液中的碱盐，对包含VLP的昆虫细胞应用根据本发明的方法的效应。 [0094] 图7：该图显示了如在凝胶上测定的和如通过抗原质量ELISA测定的，使用根据本发明的方法获得的VLP量之间的关系。 [0095] 图8：该图显示了对两种不同的昆虫细胞系应用根据本发明的方法的效应，所述两种不同的昆虫细胞系表达杆状病毒衍生的猪细小病毒VLP。 [0096] 泳道2、7：收获物。泳道3、8：收获物，重悬浮于PBS中的沉淀。泳道4、9：收获物上清液。泳道5、10：收获物，0.3 M NaCl O/N 40℃，沉淀。泳道6、11：收获物，0.3 M NaCl O/N 40℃，上清液。 |
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