[0001] 本发明涉及有效纯化病毒载体(VV)、特别是属于逆转录病毒科的病毒载体的方法。更具体来讲，本发明涉及通过基于在包装细胞系中表达外源性细胞表面标记物的免疫学方法纯化VV。

[0002] 背景

[0003] 病毒载体通常用于将遗产物质递送入靶细胞内。现在VV在基因疗法应用中用于将治疗基因运送至患者。在临床应用中，必须发展高质量VV以符合管理机构规定的要求。具体来讲，必须发展更安全的生产细胞系用于大规模制备过程以获得大的病毒储库。同时，成本-效率和可扩展的纯化过程是制备待给予人的临床级病毒颗粒所必不可少的。

[0004] VV制备物的纯化必须防止因载体组分、细胞和培养基污染物比如血清所致的毒性、炎症或免疫反应(Baekland等, 2003; Tuschong等, 2002)。理想地纯化过程需要保证维持病毒传染性(稳定性)、病毒颗粒的高回收率、污染物比如DNA、蛋白质和转导抑制剂的去除，浓缩病毒上清液的可能性以及当然还有过程的可扩展性(Andreatis等, 1999; Lyddiatt和O'Sullivan, 1998)。

[0005] 今天，基于不同的技术已发展出不同的逆转录病毒载体纯化程序，所述技术特别是：基于离心的方法、膜分离法、色谱或其它基于用盐和聚合物比如PEG沉淀的方法。目前提出的纯化方案导致低回收率(约30%) (Rodrigues等, 2007)。所有这些方法最初发展用于蛋白质制备，它们进一步被修改用于纯化VV。因病毒颗粒的独特性和复杂性所致，必须改善纯化方法以获得高生产率和高通量，同时维持终产物的生物学活性，特别是传染性。

[0006] 又一个更近的实例报告于Merten等, 2011，其中公开在GMP条件下大规模制备慢病毒载体的方法，所述病毒载体待在试验性基因疗法临床试验背景中用于治疗Wiskott-Aldrich综合征。这种公开的方法包括慢病毒颗粒的制备和下游纯化工艺两者。具体来讲，纯化基于合并几种色谱步骤和基于膜的工艺步骤(包括阴离子交换和分子排阻色谱)的多步骤方案。虽然在生产率和终制备物中不存在DNA和蛋白质污染物方面的结果非常好，但纯化过程的最终收率在以前公开方法的范围内(低于30%)并且最终样品中病毒载体的传染性下降。

[0007] 病毒和细胞蛋白质在病毒成熟期间都被掺入病毒包膜内，特别是在所谓的出芽过程期间从宿主细胞释放(Arthur等, 1992)。例如，已显示多种内源性宿主细胞蛋白被掺入HIV-1包膜内，包括I和II类人淋巴细胞抗原(HLA)、CD44、补体调控蛋白等，反之比如CXCR4、CCR5和CCR3等蛋白被排出。根据这种发现，提示细胞类型特异性抗原可充当HIV-1复制的细胞起点的标记物(Roberts等, 1999)。此外，发展出一种能够区分淋巴细胞衍生的繁殖HIV病毒和巨噬细胞衍生的繁殖HIV病毒的免疫磁性病毒捕获测定法(Lawn等, 2000)。具体来讲，Lawn等显示有可能用能够结合CD26的抗体分离T细胞衍生的HIV病毒，并将其与巨噬细胞衍生的HIV-1病毒区分开，进而可用抗CD36抗体捕获巨噬细胞衍生的HIV-1病毒。CD26和CD36两者是在HIV-1感染期间分别在T细胞和巨噬细胞中过度表达的内源性宿主细胞蛋白。两种蛋白也掺入在病毒包膜中，从而允许选择性分离病毒。Lawn等测试了一组能够结合宿主细胞特异性抗原的抗体，之后才鉴定出成功的抗体。有趣的是，几种能够结合由巨噬细胞高水平内源性表达的抗原(CD32、CD64、CD88和CD89)的抗体反而不能捕获病毒，从而显示在宿主细胞表面上某些标记物的过度表达是捕获病毒的必要但非充分的条件。Lawn等并未显示由宿主表达的外源性蛋白可成功地掺入病毒包膜内，随后用于纯化功能上有活性的病毒颗粒。

[0008] 业已显示某些修饰的细胞表面标记物可用于纯化转导细胞。具体来讲，WO/ 9506723公开标记真核(哺乳动物)细胞的方法，其通过在这些细胞中表达编码细胞表面受体的核酸来实现，所述受体进一步提呈在细胞表面。这种细胞选择方法的特征在于使用核酸，其中编码受体胞内域的区域完全或部分缺失，或者被修饰以致提呈在表面的受体在与其结合配偶体结合之后不能实现任何信号转导。在公开的方法中采用的细胞表面受体是截短形式的低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)，其中已缺失胞内域。所得截短的细胞表面受体称为∆LNGFR。∆LNGFR蛋白的存在允许通过使用单克隆抗体和磁珠体外免疫选择遗传修饰的细胞。

[0009] ∆LNGFR是目前在基因疗法中用于选择转导细胞的截短细胞表面标记物。例如，它应用于HSV-TK基因疗法中，所述疗法使单倍同一性造血干细胞移植(HSCT)能够安全地用于治疗血液系统恶性肿瘤。TK疗法采用携带自杀基因HSV-TK和标记基因∆LNGFR两者的逆转录病毒载体(Verzeletti等, 1998)。

[0010] 迄今为止，尚无∆LNGF受体用于纯化VV。

[0011] 因为必须制备纯化的VV用于临床应用，所以已进行几种尝试以获得允许良好地回收VV并且产生就稳定性而言仍然具有良好质量的充分安全的载体的有效纯化方法。目前采用的方法允许获得低回收率且在任何情况下都有一些限制，因为它们来自针对制备重组蛋白开发并适应于VV纯化的下游工艺。因此，需要有效、快速且可扩展的VV纯化方法以用于大规模制备载体用于基因疗法，所述方法允许获得良好回收率和维持高传染性的安全的病毒颗粒。

[0012] 发明概述

[0013] 本发明涉及VV、特别是属于逆转录病毒科的VV的纯化领域。目前用于VV纯化的下游工艺基于通常用于重组蛋白的方法。VV是用于基础研究和基因疗法临床试验的特殊颗粒，在后一种情况下，该颗粒需要临床级生产。因此纯化是必需的，但是由于VV的特殊性，有几项要求必须满足。纯化过程必须有效和快速，因为VV对环境条件敏感；必须可扩展，因为临床应用需要大批量。

[0014] 本发明提供一种纯化病毒颗粒的新策略，其基于开发此类颗粒将嵌入细胞质膜中的宿主细胞蛋白掺入其外部包膜内的性质。该纯化方法在于编码细胞表面标记物的外源基因在制备VV的包装细胞系中的表达。此类标记物暴露在包装细胞的细胞膜上。在病毒颗粒制备过程中，在成熟期间，细胞表面标记物通过出芽过程掺入病毒包膜内。当掺入病毒包膜时，标记物事实上是病毒表面标记物，但我们应当继续将所述标记物称为“细胞表面标记物”。然后可将病毒颗粒与能够识别此类标记物的抗体孵育，通过免疫学方法纯化。所有对包装细胞特别是包装上皮细胞而言是外源性的细胞表面蛋白都可在本发明用作细胞表面标记物。可采用的细胞表面标记物是例如CD26、CD36、CD44、CD3、CD25和其中胞内域缺失的低亲和力神经生长因子受体(∆LNGFR)。在优选实施方案中用于纯化过程的细胞表面标记物是∆LNGFR。

[0015] 所开发的纯化方法非常多用途，因为它适用于在成熟期间通过出芽过程掺入宿主细胞膜蛋白的任何VV，比如逆转录病毒、慢病毒、α病毒[如Semliki Forest病毒(SFV)，Sindibis病毒(SIN)]、棒状病毒[如水泡性口膜炎病毒(VSV)]和正粘病毒[如甲型流感病毒]。此外，纯化方法与制备方法关联，因为它需要标记物在包装细胞系中表达，因此允许其中制备和下游工艺以同一种原料(包装细胞系)为基础的整合方法。在这种情况下，有可能制备含有制备VV必需的所有元件以及编码纯化必需的细胞表面标记物的另一外源基因的稳定包装细胞系。这方面对于可扩展性和效率都特别有用。

[0016] 该方法基于使用能够结合细胞表面标记物的配体，以从上清液分离VV。优选配体是抗体并且通过免疫学方法获得病毒颗粒的分离。更优选该方法采用免疫磁性选择。本发明的方法可以容易地按比例放大和自动化，因为存在几种实施免疫磁性选择的仪器。

[0017] 此外提出的方法方便、非常快速且很有效：纯化效率高于目前使用的方法例如色谱方法比如那些采用DEAE和SEC柱的色谱方法所获得的效率。

[0018] 此外，已发现本发明的纯化方法允许高回收率，因为已显示在大多数小规模实验中通过该方法纯化的载体的滴度收率为至少85%或甚至更高(120%)。此外，在小规模实验中，用本发明方法纯化的慢病毒载体的传染性已获得相当大的增加(对瞬时和稳定制备分别为43%和60%)。这样的滴度收率和传染性增加用本发明纯化方法的单一主要步骤(即复合物病毒载体-配体的分离)达到，而不考虑可影响最终结果的其它步骤。

[0019] 也已实施大规模实验并已获得非常好的结果。事实上，使用分离复合物病毒载体-配体的单一步骤，就病毒滴度而言回收率是60%。在开始分离阶段之前，通过初步过滤和离心步骤(其粗略清除污染物和转导抑制剂)并且还通过与受体的配体孵育来使病毒上清液富集其病毒滴度。在整个多步骤纯化过程后的最终滴度收率(收获病毒上清液对比最终纯化产物)达到大于100%。鉴于在文献中公开的整个纯化过程的滴度收率为约30% (Rodrigues等2007)或者在大规模制备的情况下甚至更低(Merten等2011)，这些是非常好的结果。此外，根据本发明方法大规模纯化的VV导致3倍的传染性增加，该增加比用相同方法小规模获得的增加还多。这是非常重要和意想不到的优点，因为除了用常规方法进行纯化以外文献还描述传染性的下降(Merten等2011)。

[0020] 发明陈述

[0021] 根据本发明第一方面，提供纯化病毒载体的方法，其包括：

[0022] i. 将编码细胞表面标记物的外源基因和感兴趣基因(GOI)引入包装细胞系[0023] ii. 培养这样获得的生产细胞系

[0024] iii. 收集含有在其外包膜上携带所述细胞表面标记物的病毒载体颗粒的上清液[0025] iv. 将所述上清液与能够结合所述细胞表面标记物的配体孵育

[0026] v. 分离复合物配体-病毒载体

[0027] vi. 获得纯化的病毒载体颗粒

[0028] 在本发明另一方面将含有在其外包膜上携带细胞表面标记物的病毒载体颗粒的上清液过滤，任选浓缩然后与能够结合所述细胞表面标记物的配体孵育。

[0029] 优选病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、α病毒载体[如从Semliki Forest病毒(SFV)、Sindibis病毒(SIN)获得的载体]、棒状病毒载体[如从水泡性口膜炎病毒(VSV)衍生的载体]和正粘病毒载体[如从甲型流感病毒衍生的载体]。更优选病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

[0030] 在一个实施方案中细胞表面标记物是对包装细胞系(其优选为上皮包装细胞系)而言为外源性的任何细胞表面标记物。优选细胞表面标记物选自CD26、CD36、CD44、CD3、CD25和∆LNGFR。

[0031] 更优选细胞表面标记物是∆LNGFR。

[0032] 在本发明一方面细胞表面标记物的表达是瞬时的。

[0033] 在本发明另一方面细胞表面标记物的表达是稳定的。

[0034] 在一个实施方案中将GOI和细胞表面标记物表达在同一个转移载体中。

[0035] 在另一个实施方案中将GOI和细胞表面标记物表达在独立的载体中。

[0036] 优选配体是选自激动剂、拮抗剂、肽、拟肽、抗体、抗体片段、亲和体(affibody)的化学或生物学实体。在本发明又一方面配体连接至可从上清液分离的部分。

[0037] 优选配体是抗体。

[0038] 更优选抗体与磁珠缀合，通过对含有复合物抗体-病毒载体的溶液施加磁场获得分离。

[0039] 优选通过除去磁场获得病毒载体。更优选在柱上实施复合物抗体-病毒载体的分离，通过除去磁场并将其进一步从柱洗脱获得病毒载体。

[0040] 在一个实施方案中通过断裂细胞表面标记物-抗体键从抗体分离病毒载体。

[0041] 在本发明另一方面提供在包装细胞系中表达的外源性细胞表面标记物，用于纯化由所述包装细胞系制备的病毒载体。

[0042] 优选病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、α病毒载体[如从Semliki Forest病毒(SFV)、Sindibis病毒(SIN)获得的载体]、棒状病毒载体[如从水泡性口膜炎病毒(VSV)衍生的载体]和正粘病毒载体[如从甲型流感病毒衍生的载体]。更优选病毒载体是慢病毒载体或逆转录病毒载体。

[0043] 细胞表面标记物对包装细胞系而言是外源性的，优选对上皮包装细胞而言是外源性的。优选细胞表面标记物选自CD26、CD36、CD44、CD3、CD25和ΔLNGFR。

[0044] 更优选细胞表面标记物是ΔLNGFR。

[0045] 在本发明一方面细胞表面标记物的表达是瞬时的。

[0046] 在本发明另一方面细胞表面标记物的表达是稳定的。

[0047] 发明详述

[0048] 将通过非限制性实例的方式描述本发明的优选特征和实施方案的详细说明。

[0049] 本发明可由采用(除非另外说明)化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学常规技术的本领域普通技术人员实施。所有此类技术公开和解释于出版的文献中。参见例如J. Sambrook, E. F. Fritsch, 和T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (分子克隆：实验室手册), 第2版, 第1-3篇, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M.等(1995和定期增刊; Current Protocols in Molecular Biology (分子生物学现有方案), 9、13和16章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); Current Protocols in Immunology (免疫学现有方案), 12章, John Wiley & Sons, New York, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, 和A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques (DNA分离和测序:必要技术), John Wiley & Sons; J  . M. Polak和James O'D. McGee, 1990, In Situ Hybridization: Principles and Practice (原位杂交:原理和实施); Oxford University Press; M. J . Gait (编者), 1984, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (寡核苷酸合成:实施途径), Irl Press; 和，D. M. J. Lilley和J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology (酶学方法:DNA结构部分A： DNA合成和物理分析，酶学中的方法), Academic Press。所有这些出版物都通过引用结合。

[0050] 纯化方法

[0051] 本发明提供一种新的VV纯化方法。优选本发明涉及用于纯化VV的方法，VV包括γ逆转录病毒(原型: 莫洛尼鼠白血病病毒, Mo-MLV)、慢病毒(原型: HIV)、α病毒[如Semliki Forest病毒(SFV)、Sindibis病毒(SIN)]、棒状病毒[如水泡性口膜炎病毒(VSV)]和正粘病毒[甲型流感病毒]。提出的纯化方法基于病毒成熟期之一。病毒颗粒通过出芽过程从宿主细胞分泌，通过该过程病毒衣壳被由病毒生产细胞衍生的质膜包裹。这样做时，病毒将几种通常嵌入细胞质膜中的宿主细胞蛋白掺入其外包膜中。

[0052] 由瞬时或稳定包装系统制备的VV以同样方式从包装细胞释放。本发明的方法基于通过使用针对外源性宿主质膜蛋白的抗体可特异性纯化VV这一假设。

[0053] 根据本发明第一方面提供纯化VV的方法，它基于编码细胞表面标记物的外源基因在包装细胞系中的表达。细胞表面标记物是对包装细胞而言为外源性的蛋白，其表达在细胞膜上。一旦表达，此类标记物固定在包装细胞膜上，因此在VV成熟期间固定在由所述包装细胞制备的VV的外包膜上。根据本发明的方法，将含有在其包膜上嵌有细胞表面标记物的病毒颗粒的上清液收集并与能够识别此类标记物的配体孵育。任选地，特别是对于其中必须处理和纯化大体积的大规模VV纯化，将上清液过滤和浓缩，然后再悬浮并与配体孵育。所有这些初步步骤允许粗略清除污染物和转导抑制剂，因此促成在中间制备物观察到的病毒滴度富集，从而促成纯化病毒颗粒的最终滴度。除了这些初步步骤以外，将复合物配体-VV与培养基分离，然后获得VV。分离阶段是本发明纯化方法的主要步骤。可通过断裂配体与细胞表面标记物之间的键将VV与配体分离。

[0054] 在优选实施方案中配体是抗体。

[0055] 本发明的方法可概括为5个主要阶段：

[0056] 1)细胞表面标记物在用于VV的包装细胞系中的表达

[0057] 2)病毒颗粒制备

[0058] 3) 与能够识别细胞表面标记物的配体孵育

[0059] 4)复合物配体-受体分离

[0060] 5)纯化的病毒颗粒的回收

[0061] 标记物的表达和病毒颗粒的制备

[0062] 本发明的纯化方法基于外源性细胞表面标记物在用于VV的包装细胞系中的表达。在优选实施方案中细胞表面标记物对于上皮包装细胞而言是外源性的。优选细胞表面标记物选自CD26、CD36、CD44、CD3、CD25和在缺失胞内域的截短形式的低亲和力神经生长因子受体(∆LNGFR)。在优选实施方案中细胞表面标记物是∆LNGFR。细胞表面标记物的表达可通过几种方式获得。在本发明一方面，细胞表面标记物可以瞬时表达在包装细胞系中。在一个实施方案中细胞表面标记物和治疗基因两者都表达在同一个转移载体中。在另一个实施方案中细胞表面标记物和治疗基因表达在独立的载体中。

[0063] 在本发明另一方面细胞表面标记物的表达是稳定的。本发明因此提供包装细胞系，它包含制备VV所必需的所有结构元件比如病毒gag/pol、rev、任选tat和感兴趣的包膜蛋白，以及细胞表面标记物。在一个实施方案中，所有这些基因都稳定地整合在稳定的包装细胞系中。在另一个实施方案中瞬时表达制备VV所必需的元件。包装细胞系除了可用于引入含有GOI的转移载体以外还可用于制备VV。这种包装细胞系代表含有制备VV所必需的所有元件并允许快速、安全和有效的纯化方法的整合技术方案。

[0064] 除了引入转移载体以外，通过培养含有稳定整合或瞬时表达的细胞表面标记物的包装细胞系获得产物。病毒颗粒在出芽过程期间将细胞表面标记物掺入其包膜中并且将它们释放在上清液内。纯化的病毒颗粒可通过利用如上文描述的外源性细胞表面标记物的存在而获得。

[0065] 在另一个实施方案中提供生产细胞系，它包含VV制备必需的所有结构元件比如病毒gag/pol、rev、任选tat、感兴趣的包膜蛋白和GOI，以及细胞表面标记物。在培养生产细胞后，含有细胞表面标记物的病毒颗粒释放在上清液中，利用如上文描述的外源性细胞表面标记物的存在将其纯化。

[0066] 与配体孵育和复合物配体-细胞表面标记物的分离

[0067] 可分离含有掺入其包膜的细胞表面标记物的病毒颗粒。根据本发明的纯化方法，将含有VV的上清液与能够识别细胞表面标记物的配体孵育。在另一个实施方案中将含有VV的上清液首先过滤和浓缩，然后与配体孵育。配体连接至允许从上清液分离并因而离析配体-VV复合物的另一种结构。可用于本发明的配体是化学或生物学实体，包括但不限于激动剂、拮抗剂、肽、拟肽、抗体、抗体片段、亲和体。

[0068] 优选配体是抗体且本发明的方法包括用于分离复合物抗体-VV的免疫选择。在这种情况下，可根据其与抗细胞表面标记物抗体的反应性选择在其包膜上含有细胞表面标记物的VV。

[0069] 更优选本发明的方法包括免疫磁性选择。免疫磁性选择指抗体与能够通过磁铁与抗原结构分离的顺磁微球(珠)偶联。例如，可将含有将细胞表面标记物掺入其包膜内的VV的上清液与初级IgG抗细胞表面受体抗体孵育。然后可将逆转录病毒上清液与包被抗IgG次级Ab的免疫磁珠孵育，并施加至磁铁以分离携带所述标记物的逆转录病毒载体。在从逆转录病毒上清液分离后，可通过除去磁场回收分离的载体。作为替代，可使抗细胞表面受体抗体与磁珠直接缀合。在这种情况下，在单一孵育期后立即对溶液施加磁场。

[0070] 本领域已知用于本发明的顺磁微球，它们是聚合物颗粒，具有范围从50 nm小尺寸比如市售获得的Miltenyi Biotec的MACS®微珠，至0.5-500 μm的较大颗粒比如市售获得的Invitrogen的Dynabeads®。顺磁微球可直接或间接与能够结合掺入VV包膜的细胞表面标记物结合的感兴趣的特异性抗体缀合。本领域已知抗体与顺磁珠的缀合方法，包括例如交联、在官能团上形成共价键、生物素-抗生物素蛋白系统等。通过对含有由缀合至顺磁珠并与细胞表面标记物连接的抗体组成的复合物的溶液施加磁场可实现从病毒上清液分离VV。

[0071] 在本发明优选方面免疫磁性选择在柱上实施。具体来讲，可将含有VV的上清液直接与能够识别细胞表面标记物的抗体孵育，此类抗体与顺磁珠缀合。在另一个实施方案中将含有VV的上清液首先过滤和任选浓缩，然后按前文描述孵育。在孵育后，将上清液或过滤和任选浓缩的溶液应用于置于磁选机中的柱上，以除去杂质和分离由于磁场而停留在柱中的病毒颗粒。

[0072] 纯化颗粒的回收

[0073] 根据本发明的方法，工艺的最后阶段是回收纯化的病毒颗粒。通过从磁场清除病毒颗粒获得这样的回收。如果纯化在柱上进行，则通过除去磁场获得回收。然后可通过断裂配体与细胞表面标记物之间的键将病毒载体与配体分离。本领域已知断裂所述键的方法，包括使用置换配体或含有酶的适当溶液。根据配体和受体及其键的性质采用适当的方法。

[0074] 效率、扩大和自动化

[0075] 本发明的方法非常有效并且简单和快速。目前提出的纯化方法允许约30%回收率。引人注目的是在大多数小规模实验中本发明的方法允许获得至少85%或甚至更高(120%)的滴度收率。在这种情况下，参考本发明方法的主要步骤：复合物病毒载体-配体的分离，计算滴度收率。上述滴度收率来自与外源性受体的配体孵育的未纯化颗粒的滴度与纯化颗粒的滴度之间的比率。在小规模实验中的未纯化颗粒通过初步过滤步骤从VV上清液获得，然后与外源性受体的配体孵育。结果显示用本发明方法所获得的就病毒滴度而言的回收率非常高。

[0076] 病毒颗粒非常不稳定且对环境条件敏感。特别是，在VV包膜上存在细胞表面标记物原则上可影响此类包膜的组成以及其结构和病毒包膜蛋白的可用性，转而影响载体的向性，从而引起病毒滴度和传染性的问题。相反，通过本发明的方法，不影响或甚至增加滴度，引人注目的是用此类方法纯化的慢病毒的传染性小规模增加(对瞬时和稳定制备分别是43%和60%)。这些结果令人惊奇，因为存在有可能负面影响载体向性和传染性的结构元件。

[0077] 本发明又一个优点是该方法可以简单地扩大和自动化。鉴于其中通过使用免疫磁性选择纯化VV的情况，有可能采用能够实施自动选择的机器(如CliniMacs®  Plus Instrument, 来自Miltenyi Biotec)。此类机器必须能够在固体支持物比如柱上实施液体交换和通过产生磁场实施免疫磁性选择。自动化帮助制备大的VV储库，因为它允许纯化大量病毒上清液。用本发明方法大规模纯化VV允许在主要的特定分离阶段获得至少60%滴度收率(与受体的配体孵育的未纯化颗粒的滴度对比纯化颗粒的滴度)。未纯化颗粒在大规模实验中通过初步纯化步骤（过滤，任选浓缩）从VV上清液获得，然后与外源性受体的配体孵育。这些步骤各自粗略清除污染物和转导抑制剂，经受分离的样品的病毒滴度渐次富集。整个大规模过程的滴度收率(收获病毒上清液的滴度对比纯化颗粒的滴度)结果大于100%。鉴于据报告整个纯化过程的滴度收率为约30% (Rodrigues等2007)或在大规模制备的情况下甚至更低(Merten等2011)，这些是非常重要的结果。用本发明方法大规模纯化允许VV的传染性增加，其导致在分离后传染性为未纯化颗粒的传染性的约3倍。此外，为了使对用本发明纯化方法获得的制备物质量有概念，有可能计算慢病毒传染性颗粒数(从病毒滴度可推出的转染单位)对比总物理颗粒数(可从如报告于Salmon和Trono, 2006的1ng p24Gag对应7
于10个物理颗粒这一常规方程获得,)。非常有趣的是注意到通过本发明的方法，如显示于例如表4的实验2，从含有1个传染性颗粒/5,318总物理颗粒的上清液(非常差的原料)开始，有可能获得含有1个传染性颗粒/250个总物理颗粒的纯化制备物，其在LV制剂的质量和功能性方面都有非常好的富集。

[0078] 现在将通过非限制性实施例和参考附图描述本发明的其它优选特征和实施方案，其中：

[0079] 附图说明。

[0080] 图1. 基于抗∆LNGFR-Ab的纯化过程的示意图。“构建体”表示瞬时或稳定制备待纯化VV所需要的质粒或载体(步骤1)。可将选择标记物∆LNGFR的盒掺入转移载体构建体内或在自包装细胞瞬时或稳定表达的不同质粒中。将VV通过与磁珠偶联的抗∆LNGFR Ab纯化，然后其保留在磁性柱中(步骤2)并最终洗脱(步骤3)。纯化的VV可与连接的珠一起使用(步骤3.1)或者在除去连接的珠后使用(步骤3.2)。

[0081] 图2. 本发明实验程序的示意图。将程序分为3个简单步骤：1) VV的磁性标记，其在于将上清液与抗-∆LNGFR Ab缀合的微珠混悬液在室温下孵育30分钟：2) VV的磁性分离，其在于将样品应用于放入磁选机的磁性柱内；所有样品组分(即污染物、蛋白质和过量Ab)流过并通过几次洗涤进一步清除；3) VV的洗脱，其在于从磁选机移出柱和收集纯化的VV。纯化的VV可与连接的珠一起使用(步骤3.1)或者在清除连接的珠以后使用(步骤3.2)。

[0082] 图3. 概括小规模实验数据的图。将VV滴度收率计算为纯化VV滴度相对于将样品上样至柱之前磁性标记VV的滴度的百分数。数值是5次慢病毒载体实验的平均数，由RD2-MolPack-Chim3.14包装克隆稳定产生所述慢病毒载体，其携带RD114-TR包膜(稳定LV, RD114-TR)；6次慢病毒载体实验的平均数，通过瞬时转染HEK-293T产生所述慢病毒载体，其携带VSV-G包膜(瞬时转染LV, VSV-G)；5次逆转录病毒载体实验的平均数，由AM12-SFCMM-TK克隆48产生所述逆转录病毒载体，其携带Ampho包膜(稳定RV, Ampho)。实施例

[0083] 实施例I: VV的制备

[0084] MLV逆转录病毒载体(RV)的稳定制备

[0085] 在37℃在5% CO2气氛下使鼠NIH-3T3衍生的e4070-假型AM12-SFCMM-TK克隆48包装细胞生长在补充10% FBS (BioWhittaker™)和2 mM谷氨酰胺的DMEM (Dulbecco氏改良Eagle培养基) (BioWhittaker™ , Cambrex  Bio Science Walkersville, Inc. Walkersville, MD)或X-VIVO 15中。在转导构建体SFCMM-3 Mut2后获得AM12-SFCMM-TK克隆48，它编码修饰形式的HSV-TK基因，其特征在于在ORF 330位核苷酸的单个沉默突变(WO 2005/123912)。通过使用Am12-SFCMM-3 Mut 2细胞的抗-∆LNGFR mAb免疫选择转导的细胞，然后通过有限稀释进行克隆(0.3个细胞/孔)。AM12-SFCMM-TK克隆48含有2拷贝的SFCMM-3 Mut2载体。在滚瓶或在填充床32-升生物反应器中在X-VIVO 15培养基中在1%谷氨酰胺、10% PBS和异亮氨酸/色氨酸/枸橼酸钠的存在下制备GMP级逆转录病毒载体上清液批次。

[0086] 慢病毒载体(LV)的稳定制备

[0087] 使人HEK-293T及其衍生物RD2-MolPack-Chim3包装细胞在补充10% FCS和PSG的Dulbecco氏改良Eagle培养基(DMEM)中繁殖。RD2-MolPack-Chim3.14和Chim3.25克隆稳定地制备第二代LV用于抗-HIV基因疗法。用整合载体通过序贯整合包装构建体和转移载体获得克隆。简言之，将HEK-293T细胞用编码腺伴随病毒(AAV) Rep-78蛋白的质粒瞬时转染，然后用杂交棒状病毒-AAV载体感染，其中棒状病毒主链含有由AAV反向末端重复(ITR)序列侧接的表达HIV-1结构gag、pol、调控性rev和hygro抗性基因的整合盒(国际专利申请号WO 2012/028680)。这种系统允许ITR侧接的盒Rep78-介导性整合入HEK-293T基因组内，产生名为PK-7的第一中间克隆。从PK-7克隆开始，通过序贯整合表达HIV-1调控tat和嵌合RD114-TR包膜基因的SIN-LV和表达抗HIV Vif显性失活转基因Chim3的Tat-依赖性LV载体获得RD2-MolPack-Chim3.14和Chim3.25包装克隆(国际专利申请号WO 2012/028681 )。通过将有限稀释度的细胞接种在96孔板(0.1-0.3个细胞/孔)中获得克隆。关于每种细胞类型克隆实验，通过在光学显微镜下目测观察选择至少5-10个单个克隆或更多个，并将其逐渐扩繁。
通过小规模培养在T25或T75烧瓶中和通过大规模培养在T162烧瓶中从RD2-MolPack-Chim3获得LV。

[0088] LV的瞬时制备

[0089] 通过瞬时共转染以下质粒从HEK-293T细胞获得假型LV：包装构建体CMV-GPRT、VSV-G构建体和2nd-gen.P∆N-Chim3转移载体(国际专利申请号WO 2012/028681)。包装:包膜:转移载体的比率对应于6.5:3.5:10 μg DNA。用标准Ca2+-PO4方法或FugeneTM6系统按照制造商说明书( Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)实施瞬时转染，获得相似结果。在转染后48小时收获上清液，通过0.45-μm滤器过滤。

[0090] 实施例II：通过抗-LNGFR Ab小规模纯化VV

[0091] VV的小规模纯化如下进行。将含有VV的上清液用含有0.5% BSA的PBS 1:5 (vol/vol)稀释，然后用0.45 μm滤器过滤。将1至5ml稀释的上清液与抗-LNGFR Ab缀合的微珠混悬液(CD271微珠 Miltenyi Biotec, GmbH, Germany 目录号130-091-330)以1:40比率(vol/vol)孵育。然后将样品在转台上在室温(RT)下孵育30分钟。将磁性标记的样品上样至放入磁选机的柱(Miltenyi, MS柱 目录号130-042-201)。在收集流过液用于分析和用0.5 ml洗涤缓冲液(含有2% FCS和0.5% BSA的PBS)洗涤3次后，从磁选机取出柱，收集纯化的VV。

[0092] 实施例III：滴度计算

[0093] 在8 μg/ml聚凝胺(Sigma-Aldrich, St Louis, MO)的存在下通过以1,240×g达1小时离心接种(spinoculation)一个周期转导SupT1细胞，在SupT1细胞上计算VV滴度。使用FlowJo软件(Tree Star, Inc., Ashland, OR)，通过如描述于Porcellini等, 2009 & 2010的流式细胞术分析(FACS Calibur BD Bioscience, San Jose, CA)  ∆LNFGR表达，监测转导效率。只有范围为5至20%阳性细胞的转导值用于根据下式计算滴度：TU = [细胞数×(%阳性细胞/100)]/上清液体积(以ml计)。

[0094] 实施例IV：在小规模制备中纯化VV对比未纯化VV的效价分析

[0095] 如表1和表2概括，使用3种类型的VV实施了几个实验，所述VV通过不同方式制备并用独特包膜假型化。用稳定的包装细胞系 RD2-MolPack-Chim3.14或通过瞬时转染如在实施例I报告的HEK-293T细胞制备表达Chim3转基因的第2代LV。在第一种条件下，用嵌合RD114-TR包膜使LV假型化，所述嵌合RD114-TR包膜由猫科内源性逆转录病毒RD114包膜的胞外域和跨膜域和A-MLVenv 4070A的胞质尾区(TR)构成(Sandrin等, 2002)，而在第二种条件下用水泡性口膜炎病毒糖蛋白G (VSV-G)包膜使LV假型化。γRV用AM12-SFCMM-TK克隆48制备，携带MLV e4070包膜。

[0096] 每次实验都在以下条件进行：1)稀释的上清液体积(1ml上清液用PBS/2% FCS/0.5% BSA 1:5稀释)；2)上清液:微珠混悬液(vol/vol)比率1:40；3)抗-LNGFR Ab直接偶联磁珠(CD271微珠)。分析的输出对应于相对于未纯化磁性标记VV而言纯化VV滴度收率的百分数(图3A)和纯化VV的传染性增加量的百分数(图3B)。滴度计算在SupT1细胞上进行，详见实施例III。显著地，稳定制备的LV的收率超过100% (平均121%)，瞬时制备的LV的收率是
90%。这意味着无论它们固定的包膜类型怎么样，LV的纯化在除去血清蛋白或可能降低滴度值的其它污染物方面都非常有效。γRV的纯化收率略低于LV (85%)。此外，用本发明方法纯化的慢病毒载体的传染性已获得相当大的增加(对瞬时和稳定制备分别是43%和60%)。

[0097] 实施例V：通过抗-LNGFR Ab大规模纯化VV

[0098] VV的大规模纯化如下进行。通过在冷冻台式离心机中在+4℃低速(3,400×g)离心16小时将含有LV的过滤上清液(0.45μm) (800 ml)浓缩8倍。使VV沉淀再悬浮于100 ml缓冲液PBS/EDTA 0.5%人血清白蛋白(HSA)中，然后与抗-LNGFR Ab缀合的微珠混悬液(CD271微珠, Miltenyi Biotec, 目录号130-091-330)以1:40比率(vol/vol)在150-ml转移袋(Miltenyi Biotec 目录号183-01)中孵育。然后将样品在室温在轨道摇床上孵育30分钟。
将磁性标记的样品上样至CliniMacs® Plus仪器上，启动自动分离程序Enrichment 3.2。回收40ml纯化的LV，通过效价计算评估等分试样的纯化性能。

[0099] 实施例VI：在大规模制备中纯化对比未纯化VV效价的分析

[0100] 使用从稳定包装细胞系RD2-MolPack-Chim3.25产生的表达Chim3转基因的第2代LV，进行了2个实验。在表3和4概括结果。每个实验如实施例V描述实施。分析的输出对应于相对于与缀合至磁珠的抗-LNGFR Ab结合的未纯化病毒颗粒(表3)或相对于上清液(表4)而言，纯化VV的滴度收率百分数和纯化LV传染性增加量的百分数两者。滴度计算在SupT1细胞上进行，如公开于实施例III。在复合物病毒载体-配体的单个分离步骤中大规模纯化的滴度收率(表3, EL/输入)为约60%。在开始分离阶段之前，通过初步过滤和离心步骤并且还通过与受体的配体孵育使病毒上清液富集其病毒滴度，所述初步过滤和离心步骤粗略消除污染物和转导抑制剂。在整个多步骤纯化过程后的最终滴度收率(收获病毒上清液对比最终的纯化产物) (表4, EL/上清液) 大于100%：实验1为118%和实验2为231%。最重要的是，纯化颗粒的传染性明显增加至未纯化颗粒的3倍，这与小规模实验相比是甚至更高的富集，提示从VV功能性来看大规模和自动化进一步增加该过程的收率。

[0101]

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