发酵生产L－谷氨酸的方法 |
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| 申请号 | CN99122969.X | 申请日 | 1999-12-18 | 公开(公告)号 | CN100358999C | 公开(公告)日 | 2008-01-02 |
| 申请人 | 味之素株式会社; | 发明人 | 菅野壮平; 木村英一郎; 松井和彦; 仓桥修; 堀埜一成; 中松亘; | ||||
| 摘要 | 在优选含有浓度为20微克/升或更高的维生素B1的培养基中培养具有通过增加编码细胞内丙 酮 酸 脱氢酶的基因的拷贝数获得的增强的细胞内 丙酮酸 脱氢酶活性和具有谷 氨 酸生产能 力 的棒杆菌细菌，以致应该在培养基中积累L-谷氨酸，并且从培养物中收集L-谷氨酸。根据本 发明 ，已经培育了具有高L-谷氨酸生产能力的细菌菌株，并且提供了以低成本有效地生产L-谷氨酸的方法。 | ||||||
| 权利要求 | 1.具有L-谷氨酸生产能力和增强的细胞内丙酮酸脱氢酶活性的棒杆菌细 菌，其中通过增加编码丙酮酸脱氢酶的基因的拷贝数，或者通过将基因的表达 调节序列以一个更强的表达调节序列替代而获得增加的细胞内丙酮酸脱氢酶活 性。 |
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| 说明书全文 | 本发明涉及L-谷氨酸生产细菌和利用该细菌经发酵方法生产L-谷氨酸 的方法。L-谷氨酸是作为食物，药剂或诸如此类的重要氨基酸。到现在为止，通过利用属于短杆菌属，棒杆菌属(氨基酸发酵，Gakkai Shuppan 中心，195-215，1986)的棒杆菌L-谷氨酸生产细菌的发酵方法已经生产L- 谷氨酸。至于棒杆菌细菌，利用从天然或它的突变体分离野生型菌株以便提高 生产能力。 另外，也已经公开了通过重组DNA技术增强参与L谷氨酸生物合成途径 的酶的基因来提高生产L-谷氨酸的能力的各种技术。例如，日本专利未审公 开号，63-214189公开了通过增强谷氨酸脱氢酶基因，异柠檬酸脱氢酶基因， 顺乌头酸氢化酶基因和柠檬酸合成酶基因提高生产L-谷氨酸的能力的技术。 但是，利用丙酮酸脱氢酶基因培育生产L谷氨酸的棒杆菌细菌还是未知的。 本发明的一个目的是培育具有高L谷氨酸生产能力的细菌菌株，因此提供 了低耗价的更有效的生产L谷氨酸的方法以便满足更加增长的L谷氨酸的需 求。 本发明的发明人通过增强具有L-谷氨酸生产能力的棒杆菌细菌的丙酮酸 脱氢酶活性成功地获得了已经提高了L-谷氨酸生产能力的棒杆菌细菌并完成 了本发明。 即，本发明提供了下面的内容。 (1)具有L-谷氨酸生产能力并且具有增强的细胞内丙酮酸脱氢酶活性的棒 杆菌细菌。 (2)(1)的棒杆菌，其中通过增加丙酮酸脱氢酶的编码基因的拷贝数获得增 强的细胞内丙酮酸脱氢酶活性。 (3)(2)的棒杆菌细菌，其中编码丙酮酸脱氢酶的基因起源于大肠杆菌。 (4)包括培养在培养基中的(1)到(3)的任何一个的棒杆菌，以便在培养基中 生产和积累L-谷氨酸，并且从培养基中回收L-谷氨酸的步骤的生产L-谷 氨酸的方法。 (5)根据(4)的方法，其中培养基含有20微克/升或更多维生素B1。 (6)编码下面的(A)或(B)限定的蛋白质的DNA： (A)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质； (B)具有SEQ ID NO：10的氨基酸序列的蛋白质，序列中包括一个或几个 氨基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位(inversion)，并且具有丙酮酸脱氢 酶活性。 (7)在下面的(a)或(b)中限定的DNA的(6)中的DNA： (a)含有SEQ ID NO：9的核苷酸编号为2360到5120的核苷酸序列的 DNA； (b)与SEQ ID NO：9中的核苷酸编号为2360到5120的核苷酸序列或从该 核苷酸序列制备的探针在严格条件下可杂交，并且编码具有丙酮酸脱氢酶活性 的蛋白质的DNA。 (8)(7)的DNA，其中严格条件是在60℃，和对应于1×SSC和0.1％SDS 的盐浓度进行洗涤的条件。 用于本发明的术语“L-谷氨酸生产能力”指当在培养基中培养细菌时， 本发明的棒杆菌在培养基中积累L-谷氨酸的能力。这一L-谷氨酸生产能力 也可以是棒杆菌细菌的野生型菌株具有的特性，或通过繁育给予或增强的特 性。 下文中，将详细解释本发明。 <1>本发明的棒杆菌细菌 本发明的棒杆菌细菌是具有增强的细胞内丙酮酸脱氢酶活性和L-谷氨酸 生产能力的棒杆菌细菌。 棒杆菌细菌包括到目前为止分类为短杆菌属，但统一在目前的棒杆菌细菌 属的细菌(国际系统细菌杂志，41，255(1981))，并且包括属于密切相关棒杆菌细 菌属的青霉细菌属的细菌。这样的棒杆菌L-谷氨酸生产细菌的例子包括下面 所述。 嗜乙酰乙酸棒杆菌 醋谷棒杆菌 corynebacterium alkanolyticum 美棒杆菌 谷氨酸棒杆菌 黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌) corynebacterium melassecola corynebacterium thermoaminogenes 力士棒杆菌 谷氨酸棒杆菌 黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌) Brevibacterium immariophilum 谷氨酸棒杆菌 玫瑰色短杆菌 解糖短杆菌 生硫短杆菌 谷氨酸棒杆菌 白色短杆菌 蜡状短杆菌 嗜氨酸微杆菌 具体地说，例举了这些细菌的下面的菌株： 嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870 醋谷棒杆菌ATCC15806 corynebacterium alkanolyticum ATCC21511 美棒杆菌ATCC15991 谷氨酸棒杆菌ATCC13020，13032，13060 谷氨酸棒杆菌ATCC15990 Corynebacterium melassecola ATCC17965 Corynebacterium thermoaminogenes AJ12340 FERM BP-1539) 力士棒杆菌ATCC13868 谷氨酸棒杆菌ATCC14020 黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC13826，ATCC14067 Brevibacterium immariophilum ATCC14068 谷氨酸棒杆菌ATCC13665，ATCC13869 玫瑰色短杆菌ATCC13825 解糖短杆菌ATCC14066 生硫短杆菌ATCC19240 产氨棒杆菌(产氨短杆菌)ATCC6871 白色短杆菌ATCC15111 蜡状短杆菌ATCC15112 嗜氨酸微杆菌ATCC15354 从例如，美国典型培养物收藏中心可以提供这些菌株。每个菌株指派了它 的登记号，并且通过提供登记号可以要求提供每个菌株。在美国典型培养物收 藏中心(地址，12301 Parklawn大道，Rockville，马利兰20852，美国)的目录上表 明了对应于菌株的登记号。在国际贸易和工业部，工业科学和技术部，国家生 物科学和人技术研究院，按照布达佩斯条约的规定，以登记号FERM BP-1539 保藏AJ12340菌株。 <2>丙酮酸脱氢酶活性的扩增 为了在棒杆菌细菌细胞中扩增丙酮酸脱氢酶活性，通过将编码丙酮酸脱氢 酶的基因片断和在细菌中起作用的载体，优选多拷贝载体连接可以制备重组 DNA，并且导入具有L-谷氨酸生产能力的寄主细菌细胞中，以便转化细胞。 因此增加了在转化体菌株的细胞中编码丙酮酸脱氢酶的基因的拷贝数，结果， 扩增了丙酮酸脱氢酶的活性。 在大肠杆菌中，丙酮酸脱氢酶作为含有三个亚单位：E1，E2和E3的异源 低聚物存在，这些亚单位分别是aceE基因，aceF基因，1pd基因编码的，这些 基因形成操纵子。用于本发明的术语“编码丙酮酸脱氢酶的基因”或“丙酮酸 脱氢酶基因”指编码如丙酮酸脱氢酶复合物的操纵子，或编码具有丙酮酸脱氢 酶活性的单体的基因。具有丙酮酸脱氢酶活性的单体的例子是谷氨酸棒杆菌的 pdhA基因编码的E1亚单位。 对于丙酮酸脱氢酶基因，可以利用起源于棒杆菌细菌的那些以及起源于如 大肠杆菌细菌的其它生物体。 也已经阐述了大肠杆菌K-12的丙酮酸脱氢酶复合基因的核苷酸序列 (FEMS微生物通信，第44卷，P.417，1987)。所以，通过PCR可以获得丙酮 酸脱氢酶基因(聚合酶链式反应，参见，White，T.J.等人，遗传学趋势，5， 185(1989))，其中利用了基于核苷酸序列生产的引物，例如在序列表SEQ IDNO： 1和2表示的引物，和大肠杆菌染色体DNA作为模板。同样可以获得来自其 它微生物的丙酮酸脱氢酶基因。后面将说明起源于棒杆菌细菌的基因的制备。 用Saito和Miura的方法，从作为DNA供体的细菌可以制备染色体 DNA(H.Saito和K.Miura，生物化学生物物理论文，72，619(1963))。 优选地，将PCR扩增的丙酮酸脱氢酶基因与大肠杆菌和/或棒杆菌细菌的 细胞中可自主复制的载体DNA连接以便形成重组DNA。通过在大肠杆菌细胞 中导入重组DNA，随后可以容易地进行这一过程。在大肠杆菌细胞中可自主 复制的载体优选地是在寄主细胞中可自主复制的质粒载体，并且其例子包括 pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG399，pHSG398，RSF1010，等等。 在棒杆菌细菌中起作用的质粒指在棒杆菌细菌中可自主复制的质粒。例如 质粒包括下面所述。 pAM330(参见日本专利未审公开号，58-67699) pHM1519(参见日本专利未审公开号58-77895) pAJ655(参见日本专利未审公开号58-192900) pAJ611(参见同样) pAJ1844(参见同样) pCG1(参见日本专利未审公开号57-134500) pCG2(参见日本专利未审公开号，58-35197) pCG4(参见日本专利未审公开号57-183799) pCG11(参见同样) pHK4(参见日本专利未审公开号5-7491) 为了通过将丙酮酸脱氢酶基因和在棒杆菌细菌的细胞中起作用的载体连接 以制备重组DNA，利用对应于脱氢酶基因末端的限制酶消化载体。通常利用 连接酶如T4 DNA连接酶进行连接。 为了在棒杆菌细菌中导入如上所述制备的重组DNA，可以利用任何已知的 转化方法。例如，可利用的是利用氯化钙处理受体细胞以便增强DNA通透性 的方法，这已经在大肠杆菌K-12中有报道(参见Mandel，M和Higa，A，分子生 物学杂志，53，159(1970))，另外可利用的是从生长期的细胞制备感受态细胞， 接着在其中导入DNA的方法，这已经在枯草芽胞杆菌中报道(参见， Duncan，C.H.，Wilson，G.A.和Young，F.E，基因，1，153(1977))。除了这些，同时 可利用的是将DNA受体细胞制成可以容易地吸收重组DNA的原生质体或原 生质球，接着将重组DNA导入细胞的方法，这已知可用于枯草芽胞杆菌，放 线菌，和酵母(参见Chang，S.和Choen，S.N.，分子遗传学，168，111(1979)；Bibb， M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，O.A.，自然，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和 Fink，G.R.，美国科学院年报，75，1929(1978))。用于本发明的实施方案的转化 方法是电脉冲方法(指日本专利未审公开号2-207791)。 通过在棒杆菌的染色体DNA中导入多拷贝的丙酮酸脱氢酶基因也可以完 成丙酮酸脱氢酶活性的增强。为了在棒杆菌细菌的染色体DNA中导入多拷贝 的丙酮酸脱氢酶基因，利用其多拷贝存在于作为靶的染色体DNA的序列进行 同源重组。至于其多拷贝存在于染色体DNA，重复DNA的序列，可以利用存 在于可转座的元件的末端的倒置重复。同样，正如日本专利未审公开号2- 109985中公开的，可在转座子中插入丙酮酸脱氢酶基因，并且允许它转移以便 在染色体DNA中导入多拷贝数的丙酮酸脱氢酶基因。采用任一方法，转化菌 株的细胞内的丙酮酸脱氢酶基因的拷贝数增加，并且结果是，丙酮酸脱氢酶活 性被增强。表达调节序列的增强可以与丙酮酸脱氢酶基因的拷贝数的增加相结 合。 除了根据前面提到的基因增强，通过增强丙酮酸脱氢酶基因的表达调节序 列也可以获得丙酮酸脱氢酶活性的增强。具体地说，通过用更强的一个替代染 色体DNA或质粒上的丙酮酸脱氢酶基因的表达调节序列如启动子(参见日本专 利未审公开号1-215280)可以完成这种增强。例如，lac启动子，trc启动子，tac 启动子，λ噬菌体的PR启动子和PL启动子和诸如此类是已知的强启动子。这 些启动子的取代增强了丙酮酸脱氢酶基因的表达，并且因此丙酮酸脱氢酶活性 被增强了。 在本发明的棒杆菌细菌中，可以增强不是丙酮酸脱氢酶的催化L-谷氨酸 的生物合成的酶的活性。催化L-谷氨酸的生物合成的酶的说明性例子包括谷 氨酸脱氢酶，谷氨酰胺合成酶，谷氨酸合成酶，异柠檬酸脱氢酶，乌头酸水合 酶，柠檬酸合成酶，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，丙酮酸激酶，烯醇化酶，磷酸甘 油酸变位酶，磷酸甘油激酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，果 糖二磷酸醛缩酶，磷酸果糖激酶，葡萄糖磷酸异构酶和诸如此类。 催化从L-谷氨酸的生物合成途径分支生产L-谷氨酸以外的化合物的反 应的酶的活性可被降低或丢失。催化从L-谷氨酸的生物合成途径的分支生产 L谷氨酸以外的化合物的反应的酶的说明性例子包括α-酮戊二酸脱氢酶 (αKGDH)，异柠檬酸裂合酶，磷酸乙酰转移酶，乙酸激酶，乙酰氧乌酸合成酶， 乙酰乳酸合成酶，甲酸乙酰转移酶，乳酸脱氢酶，谷氨酸脱羧酶，1-吡咯啉 脱氢酶和诸如此类。在这些酶中，αKGDH是优选的。 另外，通过在具有L-谷氨酸生产能力的棒杆菌细菌中导入生物素活性抑 制物质如表面活性剂的热敏感突变，细菌变成能够在含有过量的生物素的缺乏 生物素活性抑制物质的培养基中生产L-谷氨酸(参见，WO96/06180)。作为这 样的棒杆菌细菌，可以提到的是WO96/06180中公开的谷氨酸棒杆菌 AJ130029。AJ13029菌株在1994年9月2日，以登记号为FERM P-14501保 藏于工业科学和技术部，国家生物科学和人技术研究院。然后在1995年8月1 日，根据布达佩斯条约变更为国际保藏，登记号为FERM BP-5189。 <3>谷氨酸棒杆菌的丙酮酸脱氢酶基因 通过利用谷氨酸棒杆菌例如谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为 模板，以及具有SEQ ID NO：11的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO：12 的核苷酸序列的引物的PCR可以获得谷氨酸棒杆菌的丙酮酸脱氢酶基因 (pdhA)。 除了如上所述通过PCR获得本发明的DNA外，也可以通过利用基于本发 明的DNA的核苷酸序列制备的低聚核苷酸制成的探针杂交，从谷氨酸棒杆菌 的染色体DNA文库获得本发明的DNA。 在Sambrook，J.，Fritsch，和E.F.，Maniatis，T.，分子克隆，冷泉港实验室出版社， 1.21(1989)中叙述了构建基因组DNA文库，杂交，PCR，质粒DNA的制备， DNA的消化和连接，转化和诸如此类的方法。 假如其编码的丙酮酸脱氢酶的活性没有破坏，本发明的DNA可以编码包 括在一个或几个位置具有一个或几个氨基酸的取代，缺失，插入，添加，或倒 位的丙酮酸脱氢酶。虽然根据蛋白质的三维结构中氨基酸残基的位置或类型， “几个”氨基酸的数目不同，但是它可以是2到400个，优选是2到100个， 更优选是2到20个。 例如，通过修饰丙酮酸脱氢酶基因的核苷酸序列，通过定点诱变方法获得 了编码与如上所述的丙酮酸脱氢酶基本相同的蛋白质的DNA以致在基因的特 异位点的一个或多个氨基酸残基包括了取代，缺失，插入，添加或倒位。通过 常规的已知突变处理可以获得如上所述的修饰的DNA。突变处理包括利用羟 胺体外处理编码丙酮酸脱氢酶的DNA的方法，和利用紫外辐射或突变剂如N -甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和通常用于突变处理的亚硝酸处理微 生物，如含有编码丙酮酸脱氢酶的DNA的大肠杆菌属的细菌的方法。 如上所述的核苷酸的取代，缺失，插入，添加或倒位包括天然存在的突变(突 变体或变异体)，例如微生物的菌株，种类或属的差异。 通过在适当的细胞中表达具有上述突变的DNA，和研究表达的产物的丙酮 酸脱氢酶活性获得编码与丙酮酸脱氢酶基本相同蛋白质的DNA。通过从编码 具有突变的丙酮酸脱氢酶的DNA或从含有它的细胞分离与具有例如SEQ ID NO：9中的2360到5125号核苷酸的核苷酸序列的DNA或从该DNA制备的 探针在严格条件下可杂交的并且编码具有丙酮酸脱氢酶的活性的蛋白质的 DNA也可以获得编码与丙酮酸脱氢酶基本相同的蛋白质的DNA。通过PCR 手段扩增SEQ ID NO：9的序列的适当区域可以制备探针。“严格条件”在本 文指形成所谓的特异杂合体且不形成非特异杂合体的条件。利用任意的数值是 难于清楚地表达这一条件的。但是，例如严格条件包括具有高度同源性的 DNA，例如具有同源性不少于40％的DNA相互杂交，并且同源性低于上述的 DNA不相互杂交的条件。可替代地，严格条件的例子是在对应于Southem杂 交中的洗涤的普通条件的盐浓度，即，60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC， 0.1％SDS时DNA相互杂交的条件。 在如上所述的条件下杂交的基因包括在基因中具有产生的终止密码子的那 些基因，和由于活性中心的突变而失去活性的那些基因。但是，通过将基因与 市场可得的活性表达载体连接，根据已知方法测量丙酮酸脱氢酶活性可以容易 地除去这样的突变基因(在酶学中的方法，9，248-249(1966))。 <4>利用本发明的棒杆菌生产L-谷氨酸 以常规的方法，利用含有碳源，氮源，和矿质盐以及所需的有机痕量营养 如氨基酸和维生素可以进行利用属于棒杆菌细菌且具有扩增的丙酮酸脱氢酶活 性和L-谷氨酸生产能力的细菌菌株生产L-谷氨酸。可以利用合成培养基或 天然培养基。可以利用任何种类的碳源和氮源，只要他们可以被培养的菌株利 用。 作为碳源，利用可以单独利用或相互结合利用的糖，如葡萄糖，甘油，果 糖，蔗糖，麦芽糖，甘露糖，半乳糖，淀粉水解产物和糖蜜或诸如此类；或有 机酸如乙酸，柠檬酸和琥铂酸或诸如此类。 作为氮源，可能利用铵，硫酸铵，碳酸按，氯化铵，磷酸铵，或乙酸铵或 诸如此类。 作为有机痕量营养，利用了氨基酸，维生素，脂肪酸，核酸，那些含有诸 如蛋白胨，酪蛋白氨基酸，酵母提取物，和大豆蛋白质分解产物的那些物质和 诸如此类。当利用生长需要氨基酸和诸如此类的营养缺陷型突变体，必须补充 需要的营养成份。 本发明的棒杆菌细菌可以生产与以常规方法，甚至在存在维生素B1的量小 于常规L-谷氨酸生产细菌的培养需要的量，如20微克/升或更少的维生素B1 时获得的量相当的L-谷氨酸。在另一方面，通过在用于培养本发明的棒杆菌 细菌的培养基中加入20微克/升或更多，优选500微克/升或更多维生素B1可 以增加L-谷氨酸的生产量。 以通气培养进行培养，而控制发酵温度为20-45℃，pH为5-9。当在培 养过程中pH下降时，通过加入碳酸钙或碱如氨气中和培养基。在10小时到4 天的培养后以如上所述的这样的方式，在培养肉汤中积累大量的L谷氨酸。 在以常规的方法进行培养后从培养的肉汤收集L谷氨酸。例如，在从培养 肉汤除去细胞后，通过浓缩肉汤以便结晶L-谷氨酸，或通过离子交换层析或 诸如此类的方法可以收集L-谷氨酸。 附图的简要说明 图1显示了维生素B1对棒杆菌细菌的L-谷氨酸生产能力的影响。 图2显示了质粒pK1的构建。 图3显示了质粒pSFK6的构建。 实施本发明的最好方式 下文中，参考下面的实施例更具体地解释本发明。 实施例1 <1>克隆大肠杆菌K-12的丙酮酸脱氢酶基因 已经阐述了大肠杆菌K-12的丙酮酸脱氢酶基因的核苷酸序列(FEMS微生 物学通信，44卷，417，1987)。根据报道的核苷酸序列合成了序列表中的SEQ ID NOS：1和2表示的引物，利用起源于大肠杆菌K-12的JM109菌株的染色 体DNA(Takara Shuzo有限公司生产)作为模板通过PCR扩增丙酮酸脱氢酶基 因。 在合成的引物中，SEQ ID NO：1基本对应于FEMS微生物学通信，第44 卷，PA17，1987中叙述的丙酮酸脱氢酶基因的核苷酸序列的1039到1071位 核苷酸，但它含有第1039，第1042和第1046位核苷酸的A的取代，第1040 和第1043位核苷酸的T的取代，第1044位核苷酸的G的取代，和限制酶XhoI 的识别序列的插入。SEQ ID NO：2基本对应于FEMS微生物学通信第44卷， P.417，1987中叙述的丙酮酸脱氢酶基因的核苷酸序列的第7700到第7732位 核苷酸的序列的互补链，但它含有第7726，7727，7730位核苷酸的A的取代， 第7729位核苷酸的C的取代，第7724位核苷酸的T的取代，和限制酶XhoI 的识别序列的插入，并且它代表了它的5’末端。 以常规方法制备大肠杆菌JM109菌株的染色体DNA(生物工程实验的文 章，生物科学和生物工程协会编辑，日本，97-98，Baifukan，1992)。对于PCR， 利用了在185页“PCR-ho Saizensen中提到的标准反应条件(PCR的前线)”(Takeo Sekiya等人编辑，Kyoritu Shuppan有限公司，1989)。 以常规方法纯化得到的PCR产物，利用限制酶XbaI和Xho I处理，利用 连接试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产的)连接到利用限制酶XbaI和XhoI消 化的pHSG396(Takara Shuzo有限公司生产的)，并且用于转化大肠杆菌JM109 的感受态细胞(Takara Shuzo有限公司生产)中。在含有1 0微克/毫升的IPTG(异 丙基-β-D-硫代半乳糖苷氰酸酯)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3- 吲哚-β-D-半乳糖苷)和20微克/毫升氯霉素的L-培养基(10克/升细菌用胰 蛋白胨，5克/升细菌用酵母提取物，5克/升NaCl和15克/升琼脂，pH7.2)上应 用细胞，并且培养过夜。然后，挑选形成的白色菌落，进行单个菌落的分离以 便获得转化体菌株。 通过利用碱性方法从转化体制备质粒(生物工程实验课本，生物科学和生物 工程协会编辑，日本，第105页，Baifukan，1992)，并且制备插入在载体中的DNA 片断的限制图谱，和报道的丙酮酸脱氢酶基因的限制图谱比较(FEMS微生物学 通信，44卷，P.417，1987)。将含有相同限制图谱的插入DNA片断的质粒命 名为pHSGEPDH。 利用限制酶XbaI和SacI处理制备的质粒pHSGEPDH，利用连接试剂盒 (Takara Shuzo有限公司生产)连接到限制酶XbaI和SacI消化的pMW219(Nippon 基因生产)，并且用于转化大肠杆菌JM109的感受态细胞(Takara Shuzo有限公 司生产)。将细胞涂布于含有10微克/毫升IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳 糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-绿-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)和25 微克/毫升卡那霉素的L-培养基(10克/升细菌用胰蛋白胨，5克/升细菌用酵母 提取物，5克/升NaCl，15克/升琼脂，pH7.2)上，并且培养过夜。然后，挑选形 成的白色菌落，进行单个菌落分离以便获得转化体。利用碱性方法(生物工程实 验课本，生物科学和生物工程协会编辑，日本，第105页，Baifukan，1992)从转 化体制备质粒，制备插入载体的DNA片断的限制图谱，并且与报道的丙酮酸 脱氢酶基因的限制图谱比较。将含有具有相同限制图谱的插入的DNA片断的 质粒命名为pMWEPDH。 另外，为了证实克隆的丙酮酸脱氢酶基因的表达，通过Willims等人的方 法测量含有pMWEPDH的JM109菌株和JM109菌株的丙酮酸脱氢酶活性(酶 学方法，第9卷，pp.248-249，1966)。作为结果，含有pMWEPDH的JM109 菌株显示出的丙酮酸脱氢酶活性约四倍地高于JM109菌株，正如表1所示，所 以证实了丙酮酸脱氢酶基因的表达。 表1 菌株 PDH活性(单位/毫克蛋白质) JM109 0.03 JM109/pMWEPDH 0.12 <2>含有起源于大肠杆菌K-12的JM109的丙酮酸脱氢酶基因和棒杆菌细 菌的复制原点的质粒的构建 为了构建含有大肠杆菌JM109的丙酮酸脱氢酶基因和棒杆菌细菌的复制原 点的质粒，通过利用限制酶BamHI，和KpnI消化具有起源于已经获得的在棒杆 菌细菌中可自主复制的质粒pHM1519的复制原点(农业生物化学，48，2901- 2903(1984)的质粒pHK4(日本专利未审公开号，5-7419)，利用DNA平齐化 试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产的平齐化试剂盒)将末端平齐化，利用XbaI 接头(Takara Shuzo有限公司生产)插入含有克隆进入上面的<1>的大肠杆菌 JM109菌株的丙酮酸脱氢酶基因的质粒pMWEPDH的XbaI位点。这一质粒命 名为pEPDH。 <3>在棒杆菌细菌中导入pEPDH和培养物的评估 通过电脉冲方法(参见日本专利未审公开号2-207791)以质粒pEPDH转化 谷氨酸棒杆菌AJ13029菌株以便获得转化体。如下培养获得的转化体 AJ13029/pEPDH用于L-谷氨酸生产。将在含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B 平板培养基上获得的AJ13029/pEPDH菌株的细胞接种到含有30克葡萄糖，1 克KH2PO4，0.4克MgSO4.7H2O，30克(NH4)2SO4，0.01克FeSO4.7H2O，0.01克 MnSO4.7H2O，15毫升大豆水解产物，200微克盐酸硫胺素，60微克生物素，25 毫克卡那霉素，和1升纯净水中的50克CaCO3(利用KOH调节到pH8.0)的培 养基中，在31.5℃振摇培养直到培养基中的蔗糖消耗完。在具有如上所述的同 样组成，但量为5％的培养基中接种获得的培养物，在37℃培养振摇直到培养 基中的蔗糖消耗完。作为对照，在如上所述的同样的方法中培养通过电脉冲方 法利用pHK4转化的谷氨酸棒杆菌AJ13029菌株。 在完成培养后，通过Asahi化学工业有限公司生产的生物技术分析仪AS- 210测量培养基中积累的L-谷氨酸的量。结果显示在表2。 在1994年9月2日，将谷氨酸棒杆菌AJ13029菌株储藏在国际贸易和工业 部，工业科学和技术部，国际生物科学和人健康研究院，收到的登记号为FERM P-14501。然后，根据布达佩斯条约，在1995年8月1日，以登记号FERM BP -5189变更为国际保藏。 表2 菌株 L-谷氨酸的产量(％) AJ13029/pHK4 55.1 AJ13029/pEPDH 57.3 <4>维生素B1的加入对谷氨酸生产能力的影响的评估 为了研究加入维生素B1(硫胺素)的作用，硫胺素是丙酮酸脱氢酶的辅酶， 磷酸硫胺素(TPP)的前体，在含有如下的各种浓度的维生素B1的培养基中培养 具有增强的丙酮酸脱氢酶活性的菌AJ13029/pEPDH用于L-谷氨酸生产。 将在含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板培养基上培养获得的 AJ13029pEPDH菌株的细胞接种到含有30克葡萄糖，1克KH2PO4，0.4克 MgSO4.7H2O，30克(NH4)2SO4，0.01克FeSO4.7H2O，0.01克MnSO4.7H2O，15毫升 大豆水解产物，60微克生物素，25毫克卡那霉素，和在1升纯净水中的50克 CaCO3的培养基上(利用KOH调节到pH8.0)，在31.5℃培养，振摇直到培养基 中的糖消耗完。以具有如上所述的相同组成的培养基的5％的量或含有10微 克，20微克，200微克，2毫克或20毫克盐酸硫胺素的相同培养基中接种得到 的培养物，在37℃培养，振摇直到培养基中的多糖消耗完。作为对照，以如上 所述的同样方法培养通过电脉冲方法利用pHK4转化的谷氨酸棒杆菌AJ1 3029 菌株(参见日本专利未审公开号2-207791)。在完成培养后，通过Asahi化学工 业公司生产的AS-210生物技术分析仪测量培养基中积累的L-谷氨酸的量。 表3显示了结果。 表3 菌株 盐酸硫胺素浓度(微克/升) L-谷氨酸的产(％) AJ13029/pHK4 0 10 20 200 2000 20000 53.5 53.6 54.3 55.1 55.5 55.6 AJ13029/pEPDH 0 10 20 200 2000 20000 53.6 53.9 55.0 57.3 57.7 57.8 从上面的结果，可以发现属于通过导入丙酮酸脱氢酶基因增强丙酮酸脱氢 酶活性的属于棒杆菌细菌的谷氨酸生产细菌显示L-谷氨酸产量增加。 另外，也发现当细菌在含有维生素B1浓度为20微克/升或更高的培养基中 培养时，无论对于属于棒杆菌细菌的L-谷氨酸生产细菌还是对于属于导入丙 酮酸脱氢酶基因增强丙酮酸脱氢酶活性的棒杆菌细菌的L-谷氨酸生产细菌， 产量都提高了。 实施例2 <1>克隆起源于谷氨酸棒杆菌ATCC13869的pdhA基因 在大肠杆菌，铜绿假单胞菌，和结核分支杆菌的丙酮酸脱氢酶的E1亚单位 中，选择展示高度同源性的区域，根据这些区域合成SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4显示的引物。利用这些引物和先进遗传技术公司生产的细菌基因组DNA 纯化试剂盒制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体作为模板，在“PCR技 术”，第8页，Henry Ehrlich，Stockton出版社，1989编辑，中叙述的标准反应 条件进行PCR。将反应溶液进行琼脂糖凝胶电泳，发现约1.3kb的DNA片断 扩增了。 利用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的合成DNA对获得的DNA的两个 核苷酸序列的末端进行测序。根据Sanger的方法(分子生物学杂志，143， 161(1980))，通过利用DNA测序试剂盒(应用生物系统公司生产)进行核苷酸的 测序。将确定的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，与大肠杆菌，铜绿假单胞菌， 和结核分支杆菌的丙酮酸脱氨酶的E1亚单位比较。结果，观察到了高度的同 源性。所以，判断了PCR扩增的DNA片断应该是编码谷氨酸棒杆菌ATCC13869 的丙酮酸脱氢酶的E1亚单位的pdhA基因的部分，如下克隆了它的上游区和 下游区。 通过利用限制酶EcoRI，BamHI，HindIII，PstI，SalI，和XbaI(Takara Shuzo有限 公司生产)消化谷氨酸棒杆菌ATCC13869染色体获得DNA片断，克隆了它们 的上游区和下游区。利用在序列表中用于上游区的克隆的SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6显示的引物和用于下游区的克隆的SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8 显示的引物，和利用LA PCR体外克隆试剂盒(Takara Shuzo有限公司生产)进 行克隆。作为利用试剂盒的PCR的结果，从EcoRI，HindIII，PstI，SalI和XbaI消 化的上游区分别扩增约0.5，2.5，3.0，1.5和1.8kb的DNA片断，从用BamHI，HindIII 和PstI消化的下游区分别扩增约1.5，1.0和3.5kb的DNA片断。所以，确定了 这些DNA片断的核苷酸序列。 结果，发现在扩增的DNA片断中进一步包含了约920个氨基酸的开放读 码框架，认为是启动子区的区域也存在于它的上游。因为从开放读码框架的核 苷酸序列推断的产物的氨基酸序列显示了与大肠杆菌和诸如此类已知的丙酮酸 脱氢酶的E1亚单位的高度同源性，估计开放读码框架是编码谷氨酸棒杆菌 ATCC13869的丙酮酸脱氢酶的E1亚单位的pdhA基因。序列表的SEQ ID NO： 9表示了这一开放读码框架，启动子区，和认为终止子的区域。另外，SEQ ID NO：9和10显示了从这一开放读码框架推断产物的氨基酸序列。已经知道存 在于蛋白质的N末端的甲硫氨酸残基经常与蛋白质的功能相关，估计在翻译 后，它受到肽酶的作用被去除，因为它起源于起始密码子ATG。同样，在前 面提到的蛋白质的情况中，已经去除了N末端的甲硫氨酸残基。但是，GTG 的序列存在来自SEQ ID NO：7显示的ATG上游的6个碱基，从那个密码子 可以翻译氨基酸。 另外，其它微生物如大肠杆菌的丙酮酸脱氢酶包括了三个亚单位，E1，E2， 和E3，并且编码它们的基因经常组成操纵子。但是，认为是丙酮酸脱氢酶的E2 和E3亚单位的任何开放读码框架不存在于上面阐述的pdhA基因的下游的约 3kb的区域。相反，因为发现估计是终止子的序列存在于这一开放读码框架的 下游，认为谷氨酸棒杆菌菌株ATCC13869的丙酮酸脱氢酶的E2和E3亚单位 存在于染色体的其它区域。 <2>在pdhA扩增菌株的谷氨酸生产的产量提高的影响的评估 (1)构建质粒用于pdhA扩增 根据前面提到的pdhA基因的核苷酸序列合成SEQ ID NO：11和12显示的 引物。利用这些引物和先进遗传技术公司生产的细菌基因组DNA纯化试剂盒 制备的谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体作为模板，在Henry Ehrlich，Stockton 出版社编辑的，1989，第8页“PCR技术”叙述的标准反应条件，进行PCR 以便扩增pdhA基因。在合成的引物中，SEQ ID NO：11对应于序列表中SEQ ID NO：9中显示的PdhA基因的核苷酸序列的第1397到第1416位核苷酸的序列。 SEQ ID NO：12对应于与序列表中SEQ ID NO：9的第5355到5374位核苷酸 的序列互补的链，并且表示是来自它的5’末端。 以常规方法纯化扩增的PCR产物，利用限制酶SalI和EcoT22I消化。 在另一方面，构建了在大肠杆菌细胞和棒杆菌细胞中可自主复制的质粒载 体。 首先，构建了具有粪链球菌的药物抗性基因的载体。从含有这一基因的已 知质粒通过PCR扩增粪链球菌的卡那霉素抗性基因。已经阐述了粪链球菌的 卡那霉素抗性基因的核苷酸序列(Trieu-Cuot，P.和Courvalin，P.，基因，23(3)，331 -341(1983))。根据这一序列，合成了SEQ ID NO：13和14显示的引物，通 过利用pDG783(Anne-Marie Guerout-Fleury等，基因，167，335-337(1995))作 为模板进行PCR以便扩增含有卡那霉素抗性基因和它的启动子的DNA片断。 用Takara Shuzo有限公司生产的SUPREC02纯化上面的DNA片断，利用 限制酶HindIII和HincII完全消化并且末端平齐化。利用Takara Shuzo有限公 司生产的平齐化试剂盒进行末端平齐化。将这一DNA片断和利用SEQ ID NO： 15和16显示的引物和pHSG399(参见S.Takeshita等人，基因，61，pp.63-74(1987)) 作为模板经PCR并且纯化和末端平齐化PCR产物获得的扩增产物混合，并且 连接。利用Takara Shuzo有限公司生产的DNA连接试剂盒第2版进行连接反 应，利用连接DNA转化大肠杆菌JM109(Takara Shuzo有限公司生产)的感受态 细胞，并且应用于L培养基(10克/升细菌用胰蛋白胨，5克/升细菌用酵母提取 物，5克/升NaCl，和15克/升琼脂，pH7.2)，培养基中含有10微克/毫升IPTG(异 丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3- 吲哚-β-D半乳糖苷)和25微克/毫升卡那霉素，并且培养过夜。然后，挑选 形成的蓝色菌落，进行单个菌落分离以便获得转化体。 利用碱方法(生物工程实验课本，生物科学和生物工程协会编辑，日本，第 105页Baifukan，1992)从转化体制备质粒，并制备限制图谱。将具有在图2中显 示的限制图谱的相当限制图谱的质粒命名为pK1。这一质粒稳定地包含在大肠 杆菌中，并且给予寄主卡那霉素抗性。另外，因为它含有1acZ’基因，它适于用 作克隆载体。 利用限制酶HindIII完全消化从谷氨酸棒杆菌ATCC13869提取的质粒 pAM330(参见日本专利未审公开号58-67699)，并且末端平齐化。将它连接到 限制酶BsaAI完全消化的前面提到的pK1。利用连接的DNA转化谷氨酸棒杆 菌ATCC13869。通过电脉冲方法进行转化(参见日本专利未审公开号2- 207791)。在含有25微克/毫升的卡那霉素的M-CM2B平板(10克/升聚蛋白胨， 10克/升酵母提取物，5克/升NaCl，10微克/升生物素和15克/升琼脂，pH7.2) 上进行转化体的选择。在培养2天后，挑选菌落，进行单个菌落的分离以便获 得转化体。从转化体制备质粒，制备限制图谱。将具有图3显示的限制图谱的 同样的限制图谱的质粒命名为pSFK6。这一质粒可在大肠杆菌细胞和棒杆菌细 胞中自主复制，给予寄主卡那霉素抗性。 利用限制酶SalI和PstI消化前面提到的质粒pSFK6。利用连接试剂盒 (TakaraShuzo有限公司生产)将这一消化产物与前面提到的PCR产物的SalI- EcoT22I片断连接在一起，并且用于转化大肠杆菌JM109的感受态细胞 (TakaraShuzo有限公可生产)。在含有10微克/毫升IPTG(异丙基-β-D-硫代 吡喃半乳糖苷)，40微克/毫升X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷) 和25μg/ml卡那霉素的L培养基(10克/升细菌用胰蛋白胨，5克/升细菌用酵母 提取物，5克/升NaCl，和15克/升琼脂，pH7.2)中培养细胞，并且过夜培养。然 后，挑选形成的白色克隆，进行单个菌落分离以便获得转化体。 利用碱方法(生物工程实验课本，生物科学和生物工程协会编辑，日本， P.105，Baifukan，1992)从转化体制备质粒，制备在载体中插入的DNA片断的限 制图谱，并且与SEQ ID NO：9中显示的pdhA基因的限制图谱比较。将含有 具有同样的限制图谱的插入DNA片断的质粒命名为pSFKBPDHA。 (2)在谷氨酸棒杆菌ATCC13869和谷氨酸棒杆菌AJ13029中导入 pSFKBPDHA，并且评估培养瓶中的培养物 利用电脉冲方法(参见日本未审公开号：2-207791)，利用质粒pSFKBPDHA 转化谷氨酸棒杆菌AJ13869和谷氨酸棒杆菌AJ13029以便获得转化体。如下所 述培养获得的转化体ATCC13869/pSFKBPDHA和AJ13029/pSFKBPDHA用于 谷氨酸的生产。将在含有25微克/毫升卡那霉素的CM2B平板上培养获得的 AJ13029/pSFKBPDHA的细胞接种到含有30克葡萄糖，1克KH2PO4，0.4克 MgSO4.7H2O，30克(NH4)2SO4，0.01克MnSO4.7H2O，15毫升 大豆水解产物，200微克盐酸硫胺素，60微克生物素，25毫克卡那霉素，和在 1升纯净水中的50克CaCO3的培养基(利用KOH调节到pH8.0)，在31.5℃培 养，振摇直到培养基中的蔗糖消耗完。 将得到的培养物接种到具有如上所述的同样的组成的培养基中，不同的是 没有加入5％的量的生物素。然后，在31.5℃培养了ATCC13869和在37℃培 养AJ13029，振摇直到培养基中的蔗糖消耗完。作为对照，以如上所述的方法 培养通过电脉冲方法利用pSFK6转化的谷氨酸棒杆菌ATCC13869和 AJ13029。在完成培养后，利用Asahi化学工业有限公司生产的生物技术AS-210 分析仪测量培养基中积累的L-谷氨酸的量，表4显示了结果。 表4 菌株 L-谷氨酸的产量(％) ATCC13869/pSFK6 48.3 ATCC13869/pSFKBPDHA 532 AJ13029/pSFK6 52.3 AJ13029/pSFKBPDHA 59.2 从这些结果，发现在谷氨酸棒杆菌ATCC13869和谷氨酸棒杆菌AJ13029 中即使仅仅扩增pdhA基因对于提高L-谷氨酸产量也是有效的。 序列表 <110>Ajinomoto有限公司 <120>通过发酵生产L-谷氨酸的方法 <130>OP941 <141>1999-12- <150>JP 10-360619 <151>1998-12-18 <160>16 <170>Patent In Ver.2.0 <210>1 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：扩增大肠杆菌丙酮酸脱氢酶基因的引物 <400>1 ggctctagag cgagagttca atgggacagg ttc 33 <210>2 <211>33 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：扩增大肠杆菌丙酮酸脱氢酶基因的引物 <400>2 ggcctcgagg gaaaaagtac agcagcgccc act 33 <210>3 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：扩增谷氨酸棒杆菌pdhA的引物 <220> <221>misc feature <222>(3，6，8，15，18，20) <223>n＝肌苷 <400>3 acngtntcna tgggnctngg ncc 23 <210>4 <211>23 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：扩增谷氨酸棒杆菌pdhA的引物 <220> <221>misc_feature <222>(6，12，15，18，20) <223>n＝肌苷 <400>4 ccttcnccgt tnagngtngt ncg 23 <210>5 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：用于LA体外克隆谷氨酸棒杆菌的pdhA基因的引物 <400>5 ttgcagttaa ccacgaaggt caggttgtcc 30 <210>6 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：用于LA体外克隆谷氨酸棒杆菌pdhA基因的引物 <400>6 tggatgagac cacgtgattc tggctcgtcc 30 <210>7 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：用于LA体外克隆谷氨酸棒杆菌pdhA基因的引物 <400>7 acagatcctg cacgaaggca tcaacgaggc 30 <210>8 <211>30 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的描述：用于LA体外克隆谷氨酸棒杆菌pdhA基因的引物 <400>8 tcatcgctgc gggtacctcc tacgccaccc 30 <210>9 <211>5370 <212>DNA <213>谷氨酸棒杆菌 <220> <221>CDS <222>(2360)...(5125) <400>9 tcacgttacg gcgatcaaca ccgcaaccac tacgagaaga tctccaaacg agaccaagag 60 cgcttctaag cccgtctcat tttgcacctg ccattctgtg aggatatggc aggtgctttt 120 tcatgccact atcttggggt tctcggtatt agatcttctg ataaaaaccc gatagttttc 180 ttgcgctagacactaattac ggcaccgctt aagcatggtc gtgacacgta aaacctgact 240 taggccattt tgatgtggtg tagatcatat tgacgtcaat gaatgaagtg actaactccg 300 ccgaatccac atcgtctaaa aggcctgggc gaccacgtaa agacgggcac gacgagaaga 360 tcatcgacgc aactttacgg ctcatcgaca gcaatcgtcc cgtcacggtc aatgcagttg 420 tcaaagaaag cggagtggca cgtgcagcgg tttatcgacg ctggcccagg ctagtggatc 480 tagtagcgga agctttagat gccgggcgag ctccagttga aatagatacc ccaggggaca 540 tcaaagagac cttgattgat gggctgttta caaatcaggc gaaaaccact ggagtctcct 600 atcctcgtca gcgatttcgc aaacggctcg agttggtgat gtcagatcaa gaattacagc 660 tcgcctaatg gaattcacat gtgaagagac gtcgagaagc aaatattcgc gcgctgcaag 720 tcgcgcaaga aaaaggccaa atccgggcgg atctagacat cgaggcgtgc ctcgatgcaa 780 tccttggggt gttttattac caatcggtcg cgcgtggagt aaatttcacc gaccaaggta 840 caacgcaacg atgcagagaa gccttggagg tgatctggca tggaatggaa ccttaaattc 900 aggttctgac gaggtgcgaa gcaagttgtc gcgcgccgca cctcagtatc cggatcaact 960 taatttcgaa gtgctgggtt ttctcgcgca tacccaatgc gtaccgatgt gcccatgagc 1020 gaaaaacagg ccacgataag tttcttaaaa cttatcgtgg cctgcttcta tatttgtgcg 1080 ccctgacggg ctcgaaccgc cgacctgctg ggtgtaaacc agctgctctt ccagctgagc 1140 taaaggcgcg cacgtgcttt tctagaacca ccttggtggc ctcgaaagca acgagtgaaa 1200 tactaacaca caatctccac agacctaaaa tcgctgctca ggccgtggaa attagcgatt 1260 gttaaggctt cttgtttcca cgctggacga ggcaagaacc ttgccaatta ccgagacgtt 1320 ccgccttggt ctgcacgaga cctgccagtt gtgctgattc agagataact ccaggagcca 1380 gggctccttc tttaccaatg ccaggagtca acacccagat acgaccattc tcagcgaggg 1440 agcggatgga atccacaagt ccgtcgacga gatcgccgtc atcctcgcgc caccagagca 1500 gcacgacatc gcacagctcg tcggtttctt catcgagtag ttcctcaccg attgcatctt 1560 cgatggactc gctgatcagc gtgtcggaat cttcatccca tccaatttct tgaacgatat 1620 gacccgattg aatgccgagt agttgagcat aatcctgggc accttgcttg actgcgcccg 1680 gagcgtcggc cactttaata atcctcctcg tgtgggcccc gatgtgtttt tcgattacat 1740 ggattcaaca tgaaaccgcg gggctattga tatatccgaa ttgcacatta ccgtccaacc 1800 ggtactttga accacctttc cctggaattt tttccttttc ctcccccttt acgctcaaga 1860 atcaatgaat tcaatcactg gccagcgatt aacttttcga gttttcagtc ttggatttcc 1920 acaattctct tcaaaataat ggtggctaga tttttcatca aaccctcacc aaaaggacat 1980 cagacctgta gttttatgcg attcgcgtca aacgtgagag aaacatcaca tctcacggga 2040 aactacccga 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