면역치료용 조성물 및 방법 |
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| 申请号 | KR1020157011160 | 申请日 | 2013-10-02 | 公开(公告)号 | KR1020150063145A | 公开(公告)日 | 2015-06-08 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 申请人 | 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터; | 发明人 | 클로스크리스토퍼씨.; 새들레인마이클; | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 摘要 | 본발명은적어도하나의항원인식수용체및 하나의키메라공자극수용체를발현하는 T 세포, 세포독성 T 세포, 조절 T 세포및 자연살해(NK) 세포를포함하는면역반응성세포를제공한다. 상기면역반응성세포를이용하는방법은항원-특이적면역반응의증가가요구되는신생물및 다른병리의치료방법을포함한다. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 权利要求 | a. 낮은 친화도로 제1 항원에 결합하고, 상기 제1 항원에 대한 결합은 면역반응성 세포를 활성화시키는 항원 인식 수용체, 및 b. 제2 항원에 결합하고 면역반응성 세포를 자극시키는 키메라 공-자극 수용체(CCR)를 포함하는 면역반응성 세포. 청구항 1에 있어서, 상기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프성 세포로 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 항원은 종양 또는 병원체 항원인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 외인성 또는 내인성인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 재조합적으로 발현되는 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 벡터로부터 발현되는 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 공-자극 수용체(CCR)는 벡터로부터 발현되는 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역반응성 세포는 자가성(autologous)인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원은 CAIX, CEA, CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, 사이토메갈로바이러스(CMV)가 감염된 세포 항원, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 폴레이트 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL13R-a2, x-경쇄, KDR, LeY, Ll 세포 부착 분자, MAGE-Al, MUC1, 메소텔린, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, 태아종양성 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2 또는 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원은 CD133, 사이토메갈로바이러스(CMV)가 감염된 세포 항원, erb-B2, KDR, 메소텔린, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, 태아종양성 항원(h5T4), PSCA, PSMA, CD19, VEGF-R2 및 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 구별된 항원인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원은 HER2, MUC1, CD44, CD49f, EpCAM, CEA, CD133, 사이토메갈로바이러스(CMV)가 감염된 세포 항원, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, KDR, 메소텔린, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, 태아종양성 항원(h5T4), PSCA, PSMA, VEGF-R2 또는 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원은 CD10 및 CD19인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원은 CD56 및 CD138인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 항원은 메소텔린, 폴레이트 수용체-a, CD44 및 CD133으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구별된 항원인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체의 세포내 신호화 도메인은 CD3-사슬 신호화 도메인인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 공-자극 수용체(CCR)의 세포내 신호화 도메인은 CD97, CD11a-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CD5, OX40, 4-1BB 또는 CD28 신호화 도메인인 면역반응성 세포. 청구항 1 내지 청구항 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 19z1 또는 Pz1인 항원 수용체를 발현하는 면역반응성 세포. 종양에서 종양 세포사를 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 종양 세포를 낮은 친화도로 제1 종양 항원에 결합하고 상기 결합은 면역반응성 세포를 활성화시키는 항원 인식 수용체 및 제2 종양 항원에 결합하고 면역반응성 세포를 자극시키는 키메라 공-자극 수용체(CCR)를 포함하는 면역반응성 세포와 접촉시켜서 상기 종양에서 종양 세포사를 유도하는 단계를 포함하는 방법. 청구항 19에 있어서, 상기 방법은 종양 세포의 수를 감소시키는 방법. 청구항 19에 있어서, 상기 방법은 종양의 크기를 감소시키는 방법. 청구항 19에 있어서, 상기 방법은 상기 종양을 근절하는 방법. 개체에서 신생물을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 낮은 친화도로 제1 항원에 결합하고 상기 결합은 면역반응성 세포를 활성화시키는 항원 인식 수용체 및 제2 항원에 결합하고 면역반응성 세포를 자극시키는 키메라 공-자극 수용체(CCR)를 포함하는 유효량의 면역반응성 세포를 투여하여 상기 개체에서 신생물을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하는 방법. 청구항 23에 있어서, 상기 신생물은 전립선암, 유방암, B 세포 백혈병, 다발성 골수종 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. 청구항 23에 있어서, 상기 신생물은 유방암이고, 상기 제1 및 제2 종양 항원은 HER2, MUC1, CD44, CD49f, EpCAM, CEA, CD133, 사이토메갈로바이러스(CMV)가 감염된 세포 항원, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, KDR, 메소텔린, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, 태아종양성 항원(h5T4), PSCA, PSMA, VEGF-R2 또는 WT-1로 이루어진 군으로부터 선택되는 구별된 항원인 방법. 청구항 23에 있어서, 상기 신생물은 B 세포 백혈병이고, 상기 제1 및 제2 종양 항원은 CD10 및 CD19인 방법. 청구항 24에 있어서, 상기 신생물은 다발성 골수종이고, 상기 제1 및 제2 종양 항원은 CD56 및 CD138인 방법. 청구항 24에 있어서, 상기 신생물은 난소암이고, 상기 제1 및 제2 종양 항원은 메소텔린, 폴레이트 수용체-a, CD44 및 CD133으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구별된 항원인 방법. 청구항 23 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역반응성 세포는 낮은 친화도로 항원 인식 수용체를 갖는 것으로서 선택되는 방법. 청구항 23 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 낮은 친화도를 갖는 것으로서 세포 내에서 발현하기 위해 선택되는 방법. 청구항 23 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)인 방법. 청구항 23 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 외인성 또는 내인성인 방법. 청구항 23 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 벡터로부터 발현되는 방법. 청구항 23 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 공-자극 수용체(CCR)는 벡터로부터 발현되는 방법. 청구항 23 내지 청구항 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프성 세포로 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. 청구항 23 내지 청구항 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 개체에서 종양 부하(burden)를 감소 또는 근절시키는 방법. 종양 세포사를 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 낮은 친화도로 제1 항원에 결합하고 상기 결합은 면역반응성 세포를 활성화시키는 항원 인식 수용체 및 제2 항원에 결합하고 면역반응성 세포를 자극시키는 키메라 공-자극 수용체(CCR)를 포함하는 유효량의 면역반응성 세포를 투여하여 상기 개체에서 종양 세포사를 유도하는 단계를 포함하는 방법. 항원-특이적 면역반응성 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 키메라 공-자극 수용체(CCR)를 인코딩하는 핵산 서열을 면역반응성 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 키메라 공-자극 수용체는 면역반응성 세포를 자극시키는 세포내 신호화 도메인에 커플링된 항원-결합 도메인을 포함하고, 상기 면역반응성 세포는 낮은 친화도로 제1 항원에 결합하고 상기 결합은 면역반응성 세포를 활성화시키는 항원 인식 수용체를 포함하는 방법. 청구항 38에 있어서, 상기 방법은 키메라 항원 수용체를 인코딩하는 제2 핵산 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 키메라 항원 수용체는 면역반응성 세포를 활성화시키는 제2 세포내 신호화 도메인에 커플링된 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 방법. 청구항 38 또는 청구항 39에 있어서, 상기 종양 항원은 CAIX, CEA, CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, 사이토메갈로바이러스(CMV)가 감염된 세포 항원, EGP-2, EGP-40, EpCAM, erb-B2,3,4, FBP, 태아 아세틸콜린 수용체, 폴레이트 수용체-a, GD2, GD3, HER-2, hTERT, IL-13R-a2, x-경쇄, KDR, LeY, Ll 세포 부착 분자, MAGE-Al, MUC1, 메소텔린, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, 태아종양성 항원(h5T4), PSCA, PSMA, ROR1, TAG-72, VEGF-R2 또는 WT-1로 이루어진 목록으로부터 선택되는 구별된 항원인 방법. 청구항 38 내지 청구항 40 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)인 방법. 청구항 38 내지 청구항 41 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 외인성 또는 내인성인 방법. 청구항 38 내지 청구항 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 재조합적으로 발현되는 방법. 청구항 38 내지 청구항 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체는 벡터로부터 발현되는 방법. 청구항 38 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 공-자극 수용체(CCR)는 벡터로부터 발현되는 방법. 청구항 38 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL), 조절 T 세포, 인간 배아 줄기 세포, 및 림프성 세포로 분화될 수 있는 다능성 줄기 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법. 청구항 38 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 인식 수용체의 세포내 신호화 도메인은 CD3-사슬 신호화 도메인인 방법. 청구항 38 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메라 공-자극 수용체(CCR)의 세포내 신호화 도메인은 CD97, CD11a-CD18, CD2, ICOS, CD27, CD154, CD5, OX40, 4-1BB 또는 CD28 신호화 도메인인 방법. 이를 필요로 하는 개체에서 전립선암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개체에 낮은 친화도로 PSCA 또는 CD19에 결합하고 상기 결합은 면역반응성 세포를 활성화시키는 항원 인식 수용체 및 PSMA에 결합하고 면역반응성 세포를 자극시키는 키메라 공-자극 수용체(CCR)를 포함하는 치료학적 유효량의 T 세포를 투여하여 상기 개체에서 전립선암을 치료하는 단계를 포함하는 방법. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항의 면역반응성 세포 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약학적 조성물. 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 있어서, 신생물 또는 종양 질환의 치료에 사용하기 위한 면역반응성 세포. 낮은 친화도로 PSCA 또는 CD19에 결합하고 상기 결합은 면역반응성 세포를 활성화시키는 항원 인식 수용체 및 PSMA에 결합하고 면역반응성 세포를 자극시키는 키메라 공-자극 수용체(CCR)를 포함하며, 전립선암의 치료에 사용하기 위한 T 세포. 제1 항원에 결합하고 면역반응성 세포를 활성화시키는 항원 인식 수용체 및 제2 바이러스 항원에 결합하고 면역반응성 세포를 자극시키는 키메라 공-자극 수용체(CCR)를 포함하는 면역반응성 세포를 포함하는 키트. |
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| 说明书全文 |
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| 서열번호 | 이름 | |
| 1 | CD3ζ | |
| 2 | CD8 | |
| 3 | CD28 | |
| 4 | 4-1BB | |
| 5 | CD80 | |
| 6 | OX4OL | |
| 7 | 19z1 | |
| 8 | P28z | |
| 9 | CD19 | |
| 10 | PSMA | |
| 11 | P28BB |
본 발명의 방법에 유용한 핵산 분자는 본 발명의 폴리펩티드 또는 그의 절편을 인코딩하는 임의의 핵산 분자를 포함한다. 이러한 핵산 분자는 내인성 핵산 서열과 100% 동일할 필요는 없지만, 전형적으로 실질적인 동일성을 나타낼 것이다. 내인성 서열에 대해 "실질적인 동일성"을 갖는 폴리뉴클레오티드는 전형적으로 이중-가닥 핵산 분자의 적어도 한 가닥과 교잡할 수 있다. "교잡하는"은 다양한 가혹성(stringency) 조건 하에 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열들(예컨대, 본 명세서에서 개시된 유전자), 또는 그의 일부와 이중-가닥 분자의 쌍을 형성하는 것을 의미한다(예컨대, Wahi, GM and SL Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, AR (1987) Methods Enzymol. 152:507 참조).
예를 들면, 가혹한 염 농도는 대개는 약 750 mM NaCl 및 75 mM 트리나트륨 시트레이트 이하, 바람직하게는 약 500 mM NaCl 및 50 mM 트리나트륨 시트레이트 이하, 및 보다 바람직하게는 약 250 mM NaCl 및 25 mM 트리나트륨 시트레이트 이하일 것이다. 낮은 가혹성 교잡은 포름아미드와 같은 유기 용매의 존재시에 얻어질 수 있고, 높은 가혹성 교잡은 적어도 약 35% 포름아미드, 보다 바람직하게는 적어도 약 50% 포름아미드의 존재시에 얻어질 수 있다. 가혹한 온도 조건은 대개는 적어도 약 30℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 37℃, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 교잡 시간, 나트륨 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)와 같은 계면활성제의 농도, 및 담체 DNA의 포함 또는 배제와 같은 다양한 추가적인 파라미터는 본 기수분야의 기술자에게 잘 알려져 있다. 다양한 레벨의 가혹성은 필요에 따라 상기 다양한 조건들을 조합함으로써 달성된다. 바람직한 구현예에서, 교잡은 750 mM NaCl, 75 mM 트리나트륨 시트레이트 및 1% SDS 내에서 30℃에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 교잡은 500 mM NaCl, 50 mM 트리나트륨 시트레이트, 1% SDS, 35% 포름아미드 및 1001.1 g/㎖의 변성된(denatured) 연어 정자 DNA(ssDNA) 내에서 37℃에서 일어날 것이다. 가장 바람직한 구현예에서, 교잡은 250 mM NaCl, 25 mM 트리나트륨 시트레이트, 1% SDS, 50% 포름아미드 및 200 pg/㎖의 ssDNA 내에서 42℃에서 일어날 것이다. 상기 조건들에 대한 유용한 변동(variation)은 본 기술분야의 기술자에게 즉시 명확할 것이다.
대부분의 적용분야의 경우, 교잡 후의 세척 단계는 또한 가혹성이 다양할 것이다. 세척 가혹성 조건은 염 농도 및 온도에 의해 정의될 수 있다. 상기와 같이, 세척 가혹성은 염 농도를 감소시키거나 온도를 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들면, 세척 단계에 대한 가혹한 염 농도는 바람직하게는 약 30 mM NaCl 및 3 mM 트리나트륨 시트레이트 이하일 것이고, 가장 바람직하게는 15 mM NaCl 및 1.5 mM 트리나트륨 시트레이트 이하일 것이다. 세척 단계에 대한 가혹한 온도 조건은 대개는 적어도 약 25℃, 보다 바람직하게는 적어도 약 42℃, 및 보다 더 바람직하게는 적어도 약 68℃의 온도를 포함할 것이다. 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 30 mM NaCl, 3 mM 트리나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS 내에서 25℃에서 일어날 것이다. 보다 바람직한 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 트리나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS 내에서 42℃에서 일어날 것이다. 다른 구현예에서, 세척 단계는 15 mM NaCl, 1.5 mM 트리나트륨 시트레이트 및 0.1% SDS 내에서 68℃에서 일어날 것이다. 상기 조건들에 대한 추가적인 변동은 본 기술분야의 기술자에게 즉시 명확할 것이다.
교잡 기술은 본 기술분야의 기술자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면 하기 문헌들에 개시되어 있다: Benton and Davis (Science 196:180, 1977); Grunstein and Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger and Kimmei (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
"실질적으로 동일한"은 참조 아미노산 서열(예를 들면, 본 명세서에 개시된 아미노산의 임의의 하나) 또는 핵산 서열(예를 들면, 본 명세서에 개시된 핵산 서열의 임의의 하나)과 적어도 50% 동일성을 나타내는 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다. 바람직하게는, 이러한 서열은 아미노산 또는 핵산 레벨에서 비교를 위해 사용된 서열과 적어도 60%, 보다 바람직하게는 80% 또는 85%, 보다 바람직하게는 90%, 95% 또는 심지어 99% 동일하다.
서열 동일성은 전형적으로 서열 분석 소프트웨어를 이용하여 측정된다(예를 들면, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, BLAST, BESTFIT, GAP, 또는 PILEUP/PRETTYBOX 프로그램). 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및/또는 다른 변형에 대한 상동성(homology) 정도를 배치함으로써 동일하거나 유사한 서열을 일치시킨다. 보존적 치환은 전형적으로 다음 군 내에서의 치환을 포함한다: 글리신, 알라닌; 발린, 이소루신, 루신; 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민; 세린, 트레오닌; 리신, 아르기닌; 및 페닐알라닌, 티로신. 동일성의 정도를 결정하기 위한 예시적인 접근법에서, 매우 연관된 서열을 나타내는 e-3 및 e-100 사이의 가능성 점수를 이용하여 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다.
"유사체(analog)"는 참조 폴리펩티드 또는 핵산 분자의 기능을 갖는 구조적으로 연관된 폴리펩티드 또는 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "리간드"란 용어는 수용체에 결합하는 분자를 나타낸다. 특히, 상기 리간드는 다른 세포 상의 수용체에 결합하여 세포-대-세포 인식을 허용한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "구성적 발현(constitutive expression)"이란 용어는 모든 생리학적 조건 하에서의 발현을 나타낸다.
"질환"은 세포, 조직 또는 기관의 정상 기능을 손상시키거나 간섭하는 임의의 증상 또는 질병을 의미한다. 질환의 예는 신생물 또는 세포의 병원체 감염을 포함한다.
"유효량"은 신생물의 계속적인 증식, 성장 또는 전이(예컨대, 침입 또는 이동)을 정지, 개선 또는 억제하기에 충분한 양을 의미한다.
"내성의 강화(enforcing tolerance)"는 이식된 기관 또는 조직을 표적화하는 자가-반응성 세포 또는 면역반응성 세포의 활성을 방지하는 것을 의미한다.
"외인성"은 세포 내에 내인성으로 존재하지 않거나, 과-발현되었을 때 얻어지는 기능적 효과를 달성하기에 충분한 레벨로 존재하지 않는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, "외인성"이란 용어는 세포 내에서 발현되는 예컨대 외래의, 이종성(heterologous)의 임의의 재조합 핵산 분자 또는 폴리펩티드 및 과-발현된 핵산 분자 및 폴리펩티드를 포괄할 것이다.
"이종성 핵산 분자 또는 폴리펩티드"는 세포 또는 세포로부터 얻어진 샘플 내에 보통 존재하지 않는 핵산 분자(예컨대, cDNA, DNA 또는 RNA 분자) 또는 폴리펩티드를 의미한다. 상기 핵산은 다른 유기체(organism) 유래일 수 있거나, 예를 들면 세포 또는 샘플에서 보통 발현되지 않는 mRNA 분자일 수 있다.
"면역반응성 세포"는 면역 반응에서 기능을 하는 세포 또는 선조(progenitor) 또는 그의 자손(progeny)을 의미한다.
"단리된 세포"는 자연적으로 세포와 동반하는 분자 및/또는 세포 성분으로부터 분리된 세포를 의미한다.
"단리된", "정제된" 또는 "생물학적으로 정제된"이란 용어는 그 자연 상태에서 발견되는 것과 같이 보통 동반하는 성분이 다양한 정도로 없는 물질을 나타낸다. "단리물(isolate)"은 원래의 공급원(source) 또는 주위환경(surrounding)으로부터 분리된 정도를 나타낸다. "정제"는 단리보다 더 높은 분리 정도를 나타낸다. "정제된" 또는 "생물학적으로 정제된" 단백질은 다른 물질이 충분히 없어서 임의의 불순물이 상기 단백질의 생물학적 특성에 물질적으로 영향을 미치지 않거나 다른 불리한 결과를 초래하지 않는다. 즉, 본 발명의 핵산 또는 펩티드는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 때 세포성 물질, 바이러스성 물질, 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 없다면 정제된 것이다. 순도 및 동질성(homogeneity)은 전형적으로 분석적 화학 기술, 예를 들면 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 또는 고성능 액체 크로마토그래피를 이용하여 결정된다. "정제된"이란 용어는 핵산 또는 단백질이 전기영동 겔에서 필수적으로 하나의 밴드를 생성할 때 나타낼 수 있다. 변형, 예를 들면 인산화 또는 글리코실화를 당할 수 있는 단백질의 경우, 상이한 변형은 별도로 정제될 수 있는 상이한 단리된 단백질을 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "종양 항원-결합 도메인"이란 용어는 종양 상에 존재하는 특정 항원 결정기 또는 항원 결정기 세트에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 나타낸다.
"조정하는"은 양성적으로 또는 음성적으로 변경하는 것을 의미한다. 예시적인 조정은 1%, 2%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75%, 또는 100% 변화를 포함한다.
"신생물"은 세포 또는 조직의 병리학적 증식과 그 이후의 다른 조직 또는 기관으로의 이동 또는 침습에 의해 특정되는 질환을 의미한다. 신생물 성장은 전형적으로 조절되지 않고 진행형이며, 정상 세포의 증식을 일으키지 않거나 이의 중단을 초래하는 조건 하에 일어난다. 신생물은 방광, 뼈, 뇌, 유방, 연골, 교세포(glia), 식도, 나팔관, 쓸개, 심장, 내장, 신장, 간, 폐, 림프절, 신경 조직, 난소, 췌장, 전립선, 골격근, 피부, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 기도, 비뇨생식로, 요관, 요도 및 질로 이루어진 군으로부터 선택되지만 이에 한정되는 것은 아닌 기관, 또는 그의 조직 또는 세포 유형을 포함하는 다양한 세포 유형, 조직, 또는 기관에 영향을 미칠 수 있다. 신생물은 육종, 암종, 또는 형질세포종(혈장 세포의 악성 종양)과 같은 암을 포함한다. 본 발명이 사용될 수 있는 예시적인 신생물은 백혈병(예컨대, 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수단구성 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 급성 적백혈병, 만성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병), 진성적혈구 증가증, 림프종(호지킨 질환, 비-호지킨 질환), 발덴스트롬 매크로글로불린증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환(heavy chain disease), 및 육종 및 암종(예컨대, 섬유육종, 점액육종, 림프육종, 연골육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프관내피육종, 활막종, 중피종, 유윙 종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 대장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평상피 암종, 기저세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종 , 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 태생 암종, 윌름 종양, 경부암, 자궁암, 고환암, 폐 암종, 폐소세포 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경교종, 성상세포종, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 올리고덴드로신경교종, 신경초종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아세포종)과 같은 고형 종양을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 한 구현예에서, 본 발명의 스크리닝 방법은 유방암 또는 폐암의 치료에 유용한 조성물을 확인한다.
"수용체"는 하나 이상의 리간드에 선택적으로 결합하는 세포막 상에 존재하는 폴리펩티드 또는 그의 일부를 의미한다.
"인식하는"은 표적에 선택적으로 결합하는 것을 의미한다. 바이러스를 인식하는 T 세포는 전형적으로 상기 바이러스에 의해 발현되는 항원에 결합하는 수용체를 발현한다.
"병원체"는 질환을 초래할 수 있는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충 또는 프로토조아를 의미한다. 예시적인 바이러스는 레트로비리대(예컨대, HIV-1(HDTV-Ⅲ, LAVE 또는 HTLV-Ⅲ/LAV, 또는 HIV-Ⅲ로도 불림)와 같은 인간 면역결핍 바이러스; 및 HIV-LP와 같은 다른 단리물); 피코르나비리대(예컨대, 폴리오 바이러스, A 형 간염 바이러스; 엔테로바이러스, 인간 콕사키 바이러스, 리노바이러스, 에코바이러스); 칼시비리대(예컨대, 위장염을 일으키는 균주); 토가비리대(예컨대, 말 뇌염 바이러스, 루벨라 바이러스); 플라비리대(예컨대, 뎅기 바이러스, 뇌염 바이러스, 황열 바이러스); 코로노비리대(예컨대, 코로나바이러스); 라브도비리대(예컨대, 수포성 구내염 바이러스, 공수병 바이러스); 필로비리대(예컨대, 에볼라 바이러스); 파라믹소비리대(예컨대, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 홍역 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스); 오르토믹소비리대(예컨대, 인플루엔자 바이러스); 붕가비리대(예컨대, 한탄 바이러스, 붕가 바이러스, 플레보바이러스 및 나이로 바이러스); 아레나 비리대(출혈열 바이러스); 레오비리대(예컨대, 레오바이러스, 오르비바이러스 및 로타바이러스); 비르나비리대; 헤파드나비리대(B 형 간염 바이러스); 파르보비리대(파보바이러스); 파포바비리대(파필로마 바이러스, 폴리오마 바이러스); 아데노비리대(대부분의 아데노바이러스); 헤르페스비리대(헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus, HSV) 1 및 2, 바리셀라 조스터 바이러스, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV), 헤르페스 바이러스); 폭스비리대(바리올라 바이러스, 백시니아 바이러스, 폭스 바이러스); 및 이리도비리대(예컨대, 아프리카 돼지 열병 바이러스); 및 미분류 바이러스(예컨대, 델타 간염의 에이전트(agent)(B 형 간염 바이러스의 결함성 부수체(defective satellite)인 것으로 생각됨), 비-A, 비-B 간염의 에이전트(클래스 1 = 내부적으로 전염됨; 클래스 2 = 비경구적으로 전염됨(즉, C 형 간염)); 노르워크(Norwalk) 및 연관 바이러스, 및 아스트로바이러스)를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
예시적인 박테리아는 파스퇴렐라, 스타필로코사이, 스트렙토코커스, 에스케리치아 콜라이, 슈도모나스 종 및 살모넬라 종을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 감염성 박테리아의 구체적인 예는 헬리코박터 피롤리스, 보렐리아 부르고도르페리, 레지오넬라 뉴모필리아, 마이코박테리아 속(예컨대, M. 투베르쿨로시스, M. 아비움, M. 인트라셀룰라레, M. 칸사이, M. 고르도내), 스타필로코커스 아우레우스, 네이세리아 고노로이애, 네이세리아 메닝기티디스, 리스테리아 모노시토게네스, 스트렙토코쿠스 피오게네스(A 군 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스 아갈락티애(B 군 스트렙토코쿠스), 스트렙토코쿠스(비리단스 군), 스트렙토코쿠스 패칼리스, 스트렙토코쿠스 보비스, 스트렙토코쿠스(혐기성 속), 스트렙토코쿠스 뉴모니애, 병원성 캠필로박터 속(sp.), 엔테로코쿠스 속, 해모필루스 인플루엔재, 바실러스 안트라시스, 코리네박테리움 디프테리애, 코리네박테리움 속, 에리시펠로트릭스 루시오패티애, 클로스트리디� �� 페프프린저스, 클로스트리디움 테타니, 엔테로박터 아에로게네스, 클레브시엘라 뉴모니애, 파스투렐라 물토시다, 박테리오이데스 속, 푸소박테리움 누클레아툼, 스트렙토바실러스 모닐리포르미스, 트레포네마 필리디움, 트레포네마 페르테누에, 렙토스피라, 리케차, 및 악티노마이세스 이스라엘리를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
"특이적으로 결합하는"은 관심있는 폴리펩티드를 인식 및 결합하지만 자연적으로 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 생물학적 샘플과 같은 샘플 내의 다른 분자는 실질적으로 인식 및 결합하지 않는 폴리펩티드 또는 그의 절편을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "종양 항원"이란 용어는 면역 반응을 유도할 수 있는 종양에 의해 발현되는 임의의 폴리펩티드를 나타낸다.
"바이러스 항원"은 면역 반응을 유도할 수 있는 바이러스에 의해 발현되는 폴리펩티드를 의미한다.
"포함하다", "포함하는"이란 용어는 미국 특허법에서 이들에 대해 개시하고 있는 넓은 의미를 의도하는 것이며, "함유하다", "함유하는" 등을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같이, "치료"는 개인의 질환의 경로 또는 치료되는 세포를 변경하기 위한 시도에서의 임상적 개입을 나타내며, 예방을 위해 또는 임상적 병리의 경로 동안에 수행될 수 있다. 치료의 치료학적 효과는 질환의 출현 또는 재발을 방지하는 것, 증상을 완화하는 것, 질환의 임의의 직간접 병리학적 결과를 줄이는 것, 전이를 방지하는 것, 질환의 진행 속도를 감소시키는 것, 질환 상태를 개선 또는 완화시키는 것, 차도 또는 향상된 예후를 제한없이 포함한다. 질환 또는 질병의 진행을 방지함으로써, 치료는 병이 나거나 진단된 개체 또는 상기 질병을 갖는 것으로 의심되는 개체에서 질병으로 인한 악화를 방지할 수 있지만, 또한 치료는 질병의 위험이 있거나 상기 질병을 갖는 것으로 의심되는 개체에서 상기 질병 또는 질병 증상의 개시를 방지할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "개체"란 용어는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것과 같은 "면역손상된(immunocompromised)"이란 용어는 면역결핍을 갖는 개체를 나타낸다. 상기 개체는 대개 건강한 면역 시스템을 갖는 인간에서는 질환을 일으키지 않지만 기능이 약하거나 억제된 면역 시스템을 갖는 인간에게 영향을 미칠 수 있는 유기체에 의해 초래되는 감염인 기회 감염에 대해 매우 취약하다.
본 발명의 다른 측면들은 다음에 개시되며, 본 발명의 영역 이내이다.
본 발명은 일반적으로 적어도 항원-인식 수용체(예컨대, TCR 또는 CAR) 및 키메라 공-자극 수용체(CCR)의 조합을 발현하는 유전적으로 변형된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 세포독성 T 림프구(CTL) 세포)를 포함하는 세포, 및 이를 신생물 및 항원-특이적 면역 반응의 증가가 요구되는 다른 병리의 치료에 사용하는 방법을 제공한다. 본 발명은 적어도 부분적으로는 항원-인식 수용체 및 키메라 공-자극 수용체에 의해 종양 세포에서 공-발현되는 2 가지 항원을 동시 관여(engagement)하는 것이 전신(systemic) 효과 없이 면역반응성 세포를 활성화 및 자극시키는데 유용하다는 발견에 기초한다. 특히, 한 항원만을 발현하는 조직에 대한 반응성은 바람직하게는 최소화되며, 한 항원만이 아니라 양쪽 항원 모두 존재시에 T 세포의 활성화를 유도한다. T 세포의 활성화는 항원(예컨대, CD19 또는 전립선 줄기 세포 항원(prostate stem cell antigen, PSCA))을 표적화하는 TCR 또는 CAR에 의해 매개된다. 공자극은 제2 항원(예컨대, 전립선-특이적 막 항원(prostate-specific membrane antigen, PSMA)을 표적화하는 "키메라 공자극 수용체"(CCR)에 의해 독립적으로 매개된다. 12,13 이러한 접근법은 이중-항원 양성(dual-antigen positive, DP) 종양에 대한 반응성은 증가시켰지만, 단일 항원 양성(single antigen positive, SP) 종양에 대한 향상된 반응성을 방지하는 것은 실패하게 되었다. 종양 감작(sensing) T 세포는 T 세포 활성화 자체로는 효과적이지 않지만 독립적인 공-발현 항원에 의해 관여된 CCR에 의해 종양 부위에서 기능적으로 구조되는(rescued) 레벨까지 T 세포 활성화를 약독화(attenuation)시킴으로써 SP 종양으로부터 DP 종양으로 분화하도록 할 수 있음이 발견되었다. 상기 접근법은 정상이거나 비-신생물인 SP 세포에는 영향을 미치지 않으면서 종양 미세환경 내에서 종양 근절을 위한 면역원성을 제공하며, 종래 입양적(adoptive) T 세포 치료에 대해 현저한 진보를 나타낸다.
또한, 상기 접근법은 신생물의 치료에 한정되는 것은 아니며, 항원-특이적 면역 반응의 증가가 요구되는 다양한 범위의 적용분야에 적용될 수 있으며, 이러한 적용분야는 신생물의 치료뿐만 아니라 병원체 감염 또는 감염성 질환에 대한 면역 반응을 향상시키는 것 및 자가면역 또는 동종 이식의 문맥에서 조절 T 세포에서의 면역 내성을 강화하는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
조혈 세포 혈통(lineage)
포유동물 조혈(혈액) 세포는 다양한 범위의 생리학적 활성을 제공한다. 조혈 세포는 림프성, 골수성 및 적혈구성 혈통으로 나누어진다. B, T 및 자연 살해(NK) 세포를 포함하는 림프성 혈통은 항체의 생산, 세포 면역 시스템의 조절, 혈액 내에서 외래 에이전트의 검출, 숙주에 외래인 세포의 검출 등을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "T 세포"란 용어는 흉선에서 성숙되는 림프구를 나타내며, 세포-매개성 면역을 주로 책임진다. T 세포는 적응 면역 시스템에 관여된다. 본 명세서에서 사용된 것과 같은 "자연 살해(NK) 세포"란 용어는 세포-매개성 면역의 일부이며 선천성 면역 반응 동안 작용하는 림프구를 나타낸다. 이들은 표적 세포에 대한 세포독성 효과를 수행하기 위하여 미리 활성화되는 것을 필요로 하지 않는다. 세포독성 T 세포(CTL 또는 킬러 T 세포)는 감염된 체세포 또는 종양 세포의 죽음을 유도할 수 있는 T 림프구의 서브세트(subset)이다.
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 세포
본 발명은 면역반응성 세포(예컨대, TCR, CAR)를 활성화시키는 항원-인식 수용체 및 키메라 공-자극 수용체(CCR)의 조합을 발현하는 세포 및 이러한 세포를 향상된 면역 반응을 필요로 하는 질환의 치료에 사용하는 방법을 제공한다. 한 접근법에서, 종양 항원-특이적 T 세포, NK 세포, CTL 세포 또는 다른 면역반응성 세포는 신생물의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 공-자극 리간드의 선택적인 농축을 위한 셔틀(shuttle)로서 사용된다. 예를 들면, CD19를 인식하는 키메라 항원 수용체 19z1을 발현하는 T 세포는 전립선 특이적 막 항원(PSMA)를 인식 및 결합하는 키메라 공-자극 수용체 P28BB를 발현하는 T 세포 내에서 공-발현된다. 이러한 세포는 전립선암의 치료 또는 예방을 위하여 이를 필요로 하는 인간 개체에 투여된다. 다른 접근법에서, 바이러스 항원-특이적 T 세포, NK 세포, CTL 세포는 바이러스 질환의 치료를 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 제1 CMV 항원을 인식하는 키메라 공-자극 항원 수용체 및 제2 CMV 항원을 인식 및 결합하는 키메라 항원 수용체는 CMV를 치료하기 위하여 세포독성 T 림프구 내에서 공-발현된다.
종양 항원-특이적 T 림프구(및 NK 세포)
본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 종양 항원-특이적 인간 림프구의 유형은 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 유전적으로 변형된 말초 공여자 림프구(Sadelain, M., et al., 2003 Nat Rev Cancer 3:35-45), a 및 p 헤테로다이머를 포함하는 전장(full-length) 종양 항원-인식 T 세포 수용체 복합체를 발현하는 유전적으로 변형된 말초 공여자 림프구(Morgan, RA, et al. 2006 Science 314:126-129), 종양 생검(biopsy) 내에서 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)로부터 유래되는 림프구 배양물(Panelli, MC, et al. 2000 J Immunol 164:495-504; Panelli, MC, et al. 2000 J Immunol 164:4382-4392), 및 인공 항원-제공 세포(artificial antigen-presenting cell, AAPC) 또는 맥동(pulsed) 수지상 세포(Dupont, J., et al. 2005 Cancer Res 65:5417-5427; Papanicolaou, GA, et al. 2003 Blood 102:2498-2505)를 도입하는 선택적으로 시험관내에서 확장된 항원- 특이적 말초혈 백혈구를 제한없이 포함한다. 상기 T 세포는 자가성, 동종, 또는 가공된 선조 또는 줄기 세포로부터 유래된 것일 수 있다.
임의의 적합한 종양 항원(항원성 펩티드)이 본 명세서에서 개시된 종양-관련 구현예에서 사용하기에 적합하다. 항원의 공급원은 암 단백질을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 항원은 펩티드 또는 온전한 단백질 또는 그의 일부로서 발현될 수 있다. 상기 온전한 단백질 또는 그의 일부는 자연형 또는 돌연변이형일 수 있다. 적합한 항원은 전립선 특이적 막 항원(PSMA) 및 전립선 줄기 세포 항원(PCSA)을 포함한다.
바이러스 항원-특이적 T 림프구(및 NK 세포)
예를 들면 면역손상된 개체에서의 병원체 감염 또는 다른 감염성 질환의 치료에 사용하기에 적합한 항원은 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스테인 바 바이러스(Epstein Barr Virus, EBV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 인플루엔자 바이러스에 존재하는 바이러스 항원을 제한없이 포함한다.
상기 CTL의 정제되지 않은 공급원은 예컨대 태아의 간, 말초혈 또는 제대혈과 같은 골수, 태아, 신생아 또는 성인 또는 다른 조혈 세포 공급원과 같은 본 기술분야에 알려진 임의의 것일 수 있다. 다양한 기술이 상기 세포를 분리하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, 음성 선택 방법은 비-CTL을 처음에 제거할 수 있다. mAB는 양성 및 음성 선택 모두의 경우에 특정 세포 혈통 및/또는 분화 단계와 연관된 마커를 확인하는데 특히 유용하다.
최종적으로 분화된 세포들의 많은 비율이 상대적으로 대략적인 분리에 의해 처음에 제거될 수 있다. 예를 들면, 자성 비드 분리는 많은 수의 무관한 세포를 제거하기 위해 처음에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 총 조혈 세포의 적어도 약 80%, 보통 적어도 70%가 세포 단리 이전에 제거될 것이다.
분리를 위한 절차는 밀도 구배 원심분리; 리세팅(resetting); 세포 밀도를 변형하는 입자에 대한 커플링; 항체-코팅된 자성 비드를 이용한 자성 분리; 친화 크로마토그래피; 보체(complement) 및 세포독소(cytotoxin)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는, mAb에 결합하거나 이와 함께 사용되는 세포독성 제제; 및 플레이트, 칩과 같은 고체 매트릭스에 부착된 항체를 이용한 패닝(panning), 세정 또는 임의의 다른 종래 기술을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
분리 및 분석을 위한 기술은 복수의 컬러 채널, 낮은 각 및 둔감한(obtuse) 광 산란 검출 채널, 임피던스(impedance) 채널과 같은 다양한 정도의 소피스티케이션(sophistication)을 갖는 유세포분석(flow cytometry)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 세포는 프로피디움 아이오다이드(propidium iodide, PI)와 같은 죽은 세포와 연관된 염료를 도입함으로써 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 세포는 2% 소 태아 혈청(fetal calf serum, FCB) 또는 0.2% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin, BSA) 또는 임의의 다른 적합한, 바람직하게는 멸균된 등장 배지를 포함하는 배지 내에 수집된다.
따라서, 본 발명은 일반적으로 제1 항원에 결합하고 면역반응성 세포를 활성화시키는 수용체 및 제2 항원에 결합하고 면역반응성 세포를 자극시키는 수용체를 포함하는 바이러스 특이적 또는 종양 특이적 T 세포와 같은 면역반응성 세포를 제공한다.
벡터
면역반응성 세포(예컨대, T 세포, CTL 세포, NK 세포)의 유전적 변형은 실질적으로 동질한(homogeneous) 세포 조성물을 재조합 DNA 구조체(construct)로 형질도입함으로써 달성될 수 있다. 바람직하게는, 레트로바이러스 벡터(감마-레트로바이러스 또는 렌티바이러스 중 하나)가 DNA 구조체를 세포 내로 도입하기 위하여 도입된다. 예를 들면, 항원(예컨대, 종양 항원 또는 그의 변이체 또는 절편)에 결합하는 수용체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 레트로바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 발현은 그 내인성 프로모터, 레트로바이러스 긴 말단 반복구조(long terminal repeat), 또는 관심있는 표적 세포 유형에 특이적인 프로모터로부터 구동될 수 있다. 비-바이러스 벡터도 사용될 수 있다.
종양 또는 바이러스 항원-특이적 세포를 제공하기 위한 세포의 초기 유전적 변형을 위하여, 일반적으로 레트로바이러스 벡터가 형질도입을 위해 도입되지만, 임의의 다른 적합한 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 운반 시스템이 사용될 수 있다. 적어도 2 가지 공-자극 리간드를 포함하는 항원 제공 복합체를 포함하는 세포를 제공하기 위한 세포의 후속 유전적 변형을 위하여, 레트로바이러스 유전자 전달(형질도입)이 마찬가지로 효과적인 것으로 판명된다. 레트로바이러스 벡터와 적절한 포장 라인의 조합이 또한 적합하며, 캡시드 단백질이 인간 세포의 감염을 위해 기능을 할 것이다. PA12(Miller, et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317(Miller, et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); 및 CRIP(Danos, et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 다양한 암포트로픽(amphotropic) 바이러스를 생성하는 세포주가 알려져 있다. VSVG, RD114 또는 GALV 외피를 갖는 위형(pseudotype) 입자 및 본 기술분야에 알려진 임의의 다른 입자와 같은 비-암포트로픽 입자도 또한 적합하다.
적합한 형질도입 방법은 또한 예컨대 브레그니 등의 문헌(Bregni, et al. (1992) Blood 80:1418-1422)의 방법에 의해 생성하는 세포를 이용하여 세포를 직접 공-배양하거나, 또는 바이러스 상등액(supernatant)만을 배양하거나, 예컨대 수 등의 문헌(Xu, et al. (1994) Exp. Hemat. 22:223-230) 및 휴즈 등의 문헌(Hughes, et al. (1992) J. Clin. Invest. 89:1817)의 방법에 의해 농축된 벡터 스톡(stock)을 적절한 성장 인자 및 폴리양이온과 함께 또는 없이 배양하는 것을 포함한다.
다른 바이러스 벡터의 형질도입을 사용하여 본 발명의 공-자극 리간드를 면역반응 세포에서 발현할 수 있다. 바람직하게는, 상기 선택된 벡터는 높은 감염 효율과 안정한 통합(integration) 및 발현을 나타낸다(예컨대, Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996; 및 Miyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:10319, 1997 참조). 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터는 예를 들면 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스, 소 파필로마 바이러스 또는 엡스테인-바 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스(예를 들면, 하기 문헌들의 벡터들도 참조: Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:31 1-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409,1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993; and Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995)를 포함한다. 레트로바이러스 벡터는 특히 잘 개발되어 있으며, 임상적 세팅에서 사용되고 있다(Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson et al., 미국 특허 제5,399,346호).
비-바이러스 접근법이 또한 세포 내에서 단백질을 발현하기 위해 도입될 수 있다. 예를 들면, 핵산 분자는 상기 핵산을 리포펙션(lipofection)(Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드(asialoorosomucoid)-폴리라이신 접합(Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989)의 존재 하에 투여하거나, 또는 수술적 조건 하에 미세-주사(micro-injection)함으로써(Wolff et al., Science 247:1465, 1990) 세포 내로 도입될 수 있다.
유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 수단은 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 전기천공 및 프로토플라스트(protoplast) 융합을 이용한 시험관내 형질감염을 포함한다. 정상 유전자를 개체의 병이 난 조직 내로 이식하는 것은 또한 정상 핵산을 배양가능한 세포 유형(예컨대, 자가성 또는 이종성의 원형 세포 또는 그의 자손) 내로 생체외에서(ex vivo) 전달하고, 이후 상기 세포(또는 그의 후손)가 표적 조직 내로 주사되거나 전신적으로 주사됨으로써 달성될 수 있다. 재조합 수용체는 또한 전이효소(transposase) 또는 표적화 뉴클레아제(nuclease)(예컨대, 징크 핑거 뉴클레아제, 메가뉴클레아제 또는 TALE 뉴클레아제)를 이용함으로써 도출 또는 얻어질 수 있다. RNA 전기천공에 의해 일시적 발현이 얻어질 수 있다. 폴리뉴클레오티드 치료 방법에서 사용하기 위한 cDNA 발현은 임의의 적합한 프로모터(예컨대, 인간 사이토메갈로바이러스(CMV), 원숭이 바이러스 40(SV40), 또는 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터)로부터 지향되고, 임의의 적절한 포유동물 조절 인자 또는 인트론(예컨대, 연장 인자 1c 인핸서(enhancer)/프로모터/인트론 구조)에 의해 조절될 수 있다. 예를 들면, 필요시, 특정 세포 유형에서 우세하게 유전자 발현을 지향하는 것으로 알려진 인핸서를 사용하여 핵산의 발현을 지향할 수 있다. 사용되는 인핸서는 조직- 또는 세포-특이적 인핸서로 특정되는 것들을 제한없이 포함할 수 있다. 다른 한편으로, 게놈성 클론이 치료적 구조체로 사용된다면, 조절은 유사한 조절 서열에 의해 매개되거나, 필요시 전술한 임의의 프로모터 또는 조절 인자를 포함하는 이종성 공급원으로부터 유래되는 조절 서열에 의해 매개될 수 있다.
이후, 결과물인 세포는 변형되지 않은 세포의 경우와 유사한 조건 하에 성장될 수 있으며, 상기 변형되지 않은 세포는 다양한 목적으로 확장 및 사용될 수 있다.
또한, 본 발명에는 19z1, CD19, CD8, CD3, dsRed, P28BB, PSMA, CD28, 4-1BB, GFP 폴리펩티드 또는 면역반응성 세포에서 발현될 때 항-신생물 활성을 향상시키는 방식으로 변형된 그의 절편이 포함된다. 본 발명은 서열 내에 변경(alteration)을 생성함으로써 아미노산 서열 또는 핵산 서열을 최적화하는 방법을 제공한다. 이러한 변경은 어떤 돌연변이, 결실, 삽입 또는 번역후 변형을 포함할 수 있다. 본 발명은 본 발명의 임의의 자연 발생형 폴리펩티드의 유사체를 추가로 포함한다. 유사체는 본 발명의 자연 발생형 폴리펩티드와 아미노산 서열의 차이, 번역후 변형 또는 이들 모두에 의해 상이할 수 있다. 본 발명의 유사체는 일반적으로 본 발명의 자연 발생형 아미노산 서열의 전부 또는 일부와 적어도 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 동일성을 나타낼 것이다. 서열을 비교하는 길이는 적어도 5, 10, 15 또는 20 개 아미노산 잔기, 바람직하게는 적어도 25, 50 또는 75개 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 100 개 이상의 아미노산 잔기이다. 다시, 동일성의 정도를 결정하는 예시적인 접근법에서, 매우 연관된 서열을 나타내는 e 3 및 e -100 사이의 가능성 점수를 이용하여 BLAST 프로그램이 사용될 수 있다. 변형은 폴리펩티드의 생체내 및 시험관내 화학적 유도, 예컨대 아세틸화, 카르복실화, 인산화 또는 글리코실화를 포함하며, 이러한 변형은 폴리펩티드 합성 또는 가공 동안에, 또는 단리된 변형 효소의 처리 후에 일어날 수 있다. 유사체는 또한 1차 서열에서의 변경에 의해 본 발명의 자연 발생형 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 이들은 자연형 또는 유도된 유전적 변이체를 포함한다(예를 들면, 조사(irradiation) 또는 에탄메틸설페이트에 대한 노출에 의하거나, 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed.), CSH Press, 1989, or Ausubel et al., supra)에서 개시된 것과 같은 위치-특이적 돌연변이유발(mutagenesis)에 의한 무작위 돌연변이유발의 결과물임). 또한, L-아미노산 이외의 잔기, 예컨대 D-아미노산 또는 비-자연 발생형 또는 합성 아미노산, 예컨대 - 또는 - 아미노산을 함유하는 고리화 펩티드, 분자 및 유사체가 포함된다.
전장 폴리펩티드에 더하여, 본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드 또는 펩티드 도메인의 임의의 하나의 절편을 제공한다. 본 명세서에서 사용된 것과 같이, "절편"이란 용어는 적어도 5, 10, 13 또는 15 개 아미노산을 의미한다. 다른 구현예에서, 절편은 적어도 20 개의 인접한(contiguous) 아미노산, 적어도 30 개의 인접한 아미노산, 또는 적어도 50 개의 인접한 아미노산이고, 다른 구현예에서는 적어도 60 내지 80, 100, 200, 300 개 이상의 인접한 아미노산이다. 본 발명의 절편은 본 기술분야의 기술자에게 알려진 방법에 의해 생성될 수 있거나, 보통의 단백질 가공의 결과물일 수 있다(예컨대, 생물학적 활성에 필요하지 않은 발생기의(nascent) 폴리펩티드로부터 아미노산을 제거하거나, 대안적인 mRNA 스플라이싱(splicing) 또는 대안적인 단백질 가공 사건에 의해 아미노산을 제거함).
비-단백질 유사체는 본 발명의 단백질의 기능적 활성을 모방하도록 디자인된 화학적 구조를 갖는다. 이러한 유사체는 본 발명의 방법에 따라 투여된다. 이러한 유사체는 원래 폴리펩티드의 생리학적 활성을 상회할 수 있다. 유사체의 디자인 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있으며, 유사체의 합성은 면역반응성 세포에서 발현될 때 결과물인 유사체가 원래 폴리펩티드의 항-신생물 활성을 증가시키도록 화학적 구조를 변형시킴으로써 이러한 방법에 따라 수행될 수 있다. 상기 화학적 변형은 대안적인 R 기로 치환하는 것 및 참조 폴리펩티드의 특정 탄소 원자에서의 포화도를 변형시키는 것을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 상기 단백질 유사체는 생체내 분해에 대해 상대적으로 저항적이며, 그 결과 투여시 치료 효과가 보다 지속된다. 기능적 활성을 측정하는 분석은 하기 실시예에서 개시되는 것들을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
공-자극 리간드
적어도 하나의 공-자극 리간드와의 상호작용은 면역 세포(예컨대, T 세포)의 완전한 활성에 중요한 비-항원 특이적 신호를 제공한다. 공-자극 리간드는 종양 괴사 인자(TNF) 리간드, 사이토카인(예컨대, IL-2, IL-12, IL-15 또는 IL-21) 및 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리 리간드를 제한없이 포함한다.
종양 괴사 인자(TNF)는 전신 염증에 관여하는 사이토카인이며, 급성 상 반응을 자극한다. 그 일차적인 역할은 면역 세포의 조절에 있다. 종양 괴사 인자(TNF) 리간드는 다수의 공통적인 특성을 공유한다. 상기 리간드의 대부분은 짧은 세포질 세그먼트 및 상대적으로 긴 세포외 영역을 함유하는 Ⅱ형 막통과 단백질(세포외 C-말단)로 합성된다. TNF 리간드는 신경 성장 인자(nerve growth factor, NGF), CD4OL(CD4OL)/CD154, CD137L/4-1BBL, 종양 괴사 인자 알파(TNFα), CD134L/OX4OL/CD252, CD27L/CD70, 파스 리간드(FasL), CD3OL/CD153, 종양 괴사 인자 베타(TNF(3)/림포톡신-알파(LTa)), 림포톡신-베타(ur(3)), CD257/B 세포-활성화 인자(BAFF)/Blys/THANK/Tall-1, 글루코콜티코이드-유도성 TNF 수용체 리간드(glucocorticoid-induced TNF Receptor ligand, GITRL) 및 TNF-연관 아폽토시스-유도성 리간드(TNF-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL), LIGHT(TNFSF14)를 제한없이 포함한다. 상기 면역글로불린(Ig) 수퍼패밀리는 세포의 인식, 결합 또는 부착 공정에 관여하는 세포 표면 및 가용성 단백질의 큰 군이다. 상기 단백질은 면역글로불린과 구조적 특성을 공유한다. 이들은 면역글로불린 도메인(접힘)을 갖고 있다. 면역글로불린 수퍼패밀리 리간드는 모두 CD28에 대한 리간드인 CD80 및 CD86을 제한없이 포함한다.
본 발명의 유전적으로 변형된 면역반응성 세포(예컨대, T 세포, NK 세포, CTL 세포 또는 그의 선조)를 포함하는 조성물은 신생물, 병원체 감염 또는 감염성 질환을 치료하기 위하여 개체에 전신으로 또는 직접 제공될 수 있다. 한 구현예에서, 본 발명의 세포는 관심있는 기관(예컨대, 신생물에 의해 영향을 받는 기관) 내로 직접 주사된다. 다른 한편으로, 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 조성물은 관심있는 기관에 예를 들면 순환 시스템(예컨대, 종양 맥관구조(vasculature)) 내로 투여함으로써 간접 제공된다. 시험관내 또는 생체내에서 T 세포, NK 세포 또는 CTL 세포의 생산을 증가시키기 위하여 상기 세포의 투여 전, 도중 또는 후에 확장 및 분화 제제가 제공될 수 있다.
상기 변형된 세포는 임의의 생리학적으로 허용가능한 비히클(vehicle) 내에서 보통은 혈관내로 투여될 수 있지만, 이들은 또한 뼈 또는 세포가 재생 및 분화를 위한 적절한 부위를 찾을 수 있는 다른 편리한 부위(예컨대, 흉선) 내로 도입될 수 있다. 보통, 적어도 1×10 5 세포가 투여될 것이고, 결국 1×10 10 이상 도달할 것이다. 본 발명의 유전적으로 변형된 면역반응성 세포는 정제된 세포의 군집(population)을 포함할 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 군집 내의 유전적으로 변형된 면역반응성 세포의 백분율을 형광 활성화 세포 분류(fluorescence activated cell sorting, FACS)와 같은 다양한 잘 알려진 방법을 이용하여 즉시 결정할 수 있다. 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 군집 내의 바람직한 순도 범위는 약 50 내지 약 55%, 약 55 내지 약 60%, 및 약 65 내지 약 70%이다. 보다 바람직하게는, 상기 순도는 약 70 내지 약 75%, 약 75 내지 약 80%, 약 80 내지 약 85%이다. 보다 더 바람직하게는, 상기 순도는 약 85 내지 약 90%, 약 90 내지 약 95%, 및 약 95 내지 약 100%이다. 용량(dosage)은 본 기술분야의 기술자에 의해 즉시 조정될 수 있다(예컨대, 순도가 감소되면 용량의 증가가 필요할 수 있다). 상기 세포는 주사, 카테터 등에 의해 도입될 수 있다. 필요시, IL-2, IL-3, IL-6 및 IL-11과 같은 인터루킨뿐만 아니라 다른 인터루킨들, G-, M- 및 GM-CSF와 같은 콜로니 자극 인자, 감마-인터페론과 같은 인터페론 및 에리트로포이에틴을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 인자들이 또한 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유전적으로 변형된 면역반응성 세포 또는 그의 선조 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다. 투여는 자가성 또는 이종성일 수 있다. 예를 들면, 면역반응성 세포 또는 선조는 한 개체로부터 얻어지고, 동일한 개체 또는 상이한 호환가능한(compatible) 개체에 투여될 수 있다. 말초혈에서 유래된 본 발명의 면역반응성 세포 또는 그의 자손(예컨대, 생체내, 생체외 또는 시험관내 유래)은 카테터 투여를 포함하는 국소 주사, 전신 주사, 국소 주사, 정맥내 주사 또는 비경구 투여를 통해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물(예컨대, 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 함유하는 약학적 조성물)을 투여할 때, 일반적으로 단위 용량의 주사가능한 형태(용액, 서스펜션(suspension), 에멀전(emulsion))로 제형화될 것이다.
제형
유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 포함하는 본 발명의 조성물은 멸균 액체 제조물(preparation), 예컨대 등장 수용액, 서스펜션, 에멀전, 분산물 또는 점성 조성물로서 편리하게 제공될 수 있으며, 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 제조물은 보통 겔, 다른 점성 조성물 및 고체 조성물보다 제조하기가 쉽다. 추가로, 액체 조성물은 특히 주사에 의해 투여하기가 다소 더 편리하다. 반면에, 점성 조성물은 특정 조직과 더 긴 접촉 기간을 제공하도록 적절한 점도 범위 내로 제형화될 수 있다. 액체 또는 점성 조성물은 예를 들면 물, 생리식염수, 인산염 완충 생리식염수, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매체일 수 있는 담체를 포함할 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 본 발명의 실행에 이용되는 상기 유전적으로 변형된 면역반응성 세포를 필요시 다양한 양의 다른 성분들을 갖는 필요한 양의 적절한 용매 내에 포함시킴으로써 제조될 수 있다. 이러한 조성물은 멸균수, 생리학적 생리식염수, 글루코오스, 덱스트로오스 등과 같은 적합한 담체, 희석제 또는 부형제와 혼합될 수 있다. 상기 조성물은 또한 동결건조될 수 있다. 상기 조성물은 습윤제, 분산제, 또는 에멀전화제(예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제, 발색제 등과 같은 보조 물질들을 투여 경로 및 원하는 제조법에 기초하여 함유할 수 있다. 인용에 의해 본 명세서에 포함되는 "REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985와 같은 표준 교과서는 과도한 실험 없이 적합한 제조물을 제조하기 위해 참고될 수 있다.
항균 보존제, 항산화제, 킬레이트화제 및 완충액을 포함하는 상기 조성물의 안정성 및 멸균성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 활동의 방지는 예를 들면 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산 등과 같은 다양한 항생제 및 항진균제에 의해 보증될 수 있다. 주사가능한 약학적 형태의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로서 일어날 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 사용되는 임의의 비히클, 희석제 또는 첨가제는 유전적으로 변형된 면역반응성 세포 또는 그의 선조와 호환되어야만 할 것이다.
상기 조성물은 등장일 수 있으며, 즉 이들은 혈액 및 눈물 유체와 동일한 삼투압을 가질 수 있다. 원하는 등장(isotonicity)의 본 발명의 조성물은 염화나트륨 또는 덱스트로오스, 붕산, 나트륨 타르트레이트, 프로필렌 글리콜 또는 다른 무기 또는 유기 용질과 같은 다른 약학적으로 허용가능한 제제를 이용하여 달성될 수 있다. 나트륨 이온을 함유하는 완충액용으로는 염화나트륨이 특히 바람직하다.
필요시, 상기 조성물의 점도는 약학적으로 허용가능한 점증제를 이용하여 선택된 레벨에서 유지될 수 있다. 메틸셀룰로오스가 바람직한데, 그 이유는 즉시 경제적으로 이용가능하고 취급이 용이하기 때문이다. 다른 적합한 점증제는 예를 들면 잔탄 검, 카르복시메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 셀룰로오스, 카르보머 등을 포함한다. 상기 점증제의 바람직한 농도는 선택된 제제에 의존할 것이다. 중요한 점은 선택된 점도를 달성하게 되는 양을 사용하는 것이다. 명백하게, 적합한 담체 및 다른 첨가제의 선택은 정확한 투여 경로 및 특정한 제형, 예컨대, 액체 제형의 본성에 의존할 것이다(예컨대, 상기 조성물이 용액, 서스펜션, 겔 또는 시간 방출 형태 또는 액체-충진 형태와 같은 다른 액체 형태로 제형화되는지 여부).
본 기술분야의 기술자는 상기 조성물의 성분들은 화학적으로 불활성이도록 선택되어야 하고, 본 발명에서 개시된 것과 같은 유전적으로 변형된 면역반응성 세포의 생존력 및 효율에 영향을 미치지 않을 것임을 인식할 것이다. 이것은 화학적 및 약학적 원칙을 갖는 기술자에게 아무 문제가 없을 것이며, 또는 문제들은 표준 교과서를 참고하거나 본 명세서 및 본 명세서에서 인용된 문헌들로부터 단순한 실험(과도한 실험을 포함하지 않음)에 의해 즉시 피할 수 있다. 본 발명의 유전적으로 변형된 면역반응성 세포의 치료학적 용도에 관한 한 가지 고려사항은 최적의 효과를 달성하기 위해 필요한 세포의 양이다. 투여되는 세포의 양은 치료되는 개체에 대해 다양할 것이다. 한 구현예에서, 10 4 내지 10 10 사이, 10 5 내지 10 9 사이, 또는 10 6 내지 10 8 사이의 본 발명의 유전적으로 변형된 면역반응성 세포가 인간 개체에 투여된다. 보다 효과적인 세포는 훨씬 적은 수로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 약 1×10 8 , 2×10 8 , 3×10 8 , 4×10 8 및 5×10 8 의 본 발명의 유전적으로 변형된 면역반응성 세포가 인간 개체에 투여된다. 효과적인 복용량(dose)에 고려되어야 하는 요소의 정확한 결정은 크기, 연령, 성별, 체중 및 특정 개체의 증상을 포함하는 각 개체에 개별적인 인자들에 기초할 수 있다. 용량은 본 명세서 및 본 기술분야의 지식으로부터 본 기술분야의 기술자에 의해 즉시 확인될 수 있다.
상기 기술자는 본 발명의 방법에서 투여되는 조성물 내의 세포 및 최적 첨가제, 비히클 및/또는 담체의 양을 즉시 결정할 수 있다. 전형적으로, (상기 활성 세포(들) 및/또는 제제(들) 이외의) 임의의 첨가제는 인산염 완충 생리식염수 내에서 0.001 내지 50 중량% 용액의 양으로 존재하며, 상기 활성 성분은 약 0.0001 내지 약 5 중량%, 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 1 중량%, 보다 더 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 0.05 중량% 또는 약 0.001 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10 중량%, 및 훨씬 더 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5 중량%와 같은 마이크로그램 내지 밀리그램의 제곱수(order)로 존재한다. 물론, 동물 또는 인간에 투여되는 임의의 조성물 및 특정 투여 방법의 경우, 예컨대 마우스와 같은 설치류의 적합한 동물 모델에서 예컨대 치사 복용량(lethal dose, LD) 및 LD50을 결정하는 것에 의한 독성; 및 적합한 반응을 일으키는 상기 조성물(들)의 복용량, 그 내부의 성분들의 농도 및 상기 조성물(들)의 투여 시간을 결정하는 것이 바람직하다. 이러한 결정은 기술자의 지식, 본 명세서 및 본 명세서에 인용된 문헌들로부터 과도한 실험을 요구하지 않는다. 그리고, 순차적인 투여를 위한 시간은 과도한 실험없이 확인될 수 있다.
치료 방법
본 명세서에는 개체에서 신생물을 치료하는 방법이 제공된다. 또한, 본 명세서에는 면역손상된 인간 개체와 같은 개체에서 병원체 감염 또는 다른 감염성 질환을 치료하는 방법이 고려된다. 상기 방법은 본 발명의 T 세포, NK 세포 또는 CTL 세포를 존재하는 증상의 완화 또는 재발의 방지와 같은 원하는 효과를 달성하기에 효과적인 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 치료의 경우, 투여되는 양은 원하는 효과를 생성하기에 효과적인 양이다. 유효량은 한번 또는 일련의 투여로 제공될 수 있다. 유효량은 볼루스(bolus)로, 또는 연소적인 관류(perfusion)에 의해 제공될 수 있다.
"유효량"(또는 "치료학적 유료량")은 치료시 유익한 또는 원하는 임상적 결과를 얻기에 충분한 양이다. 유효량은 1 회 이상의 복용량으로 개체에 투여될 수 있다. 치료의 관점에서, 유효량은 질환의 진행을 완화, 개선, 안정화, 되돌림 또는 늦춤, 또는 그렇지 않다면 상기 질환의 병리학적 결과를 감소시키기에 충분한 양이다. 상기 유효량은 일반적으로 사례별로 기초하여 내과의사에 의해 결정되며, 본 기술분야의 기술자의 범위 이내이다. 유효량을 달성하기 위한 적절한 복용량을 결정할 때 몇 가지 인자가 전형적으로 고려된다. 상기 인자는 개체의 연령, 성별 및 체중, 치료되는 증상, 증상의 심각성 및 투여되는 항원-결합 절편의 형태 및 효과적인 농도를 포함한다.
항원-특이적 T 세포를 이용한 입양적 면역치료의 경우, 전형적으로 10 6 -10 10 (예컨대, 10 9 ) 범위의 세포 복용량이 투입된다. 유전적으로 변형된 세포를 숙주 내로 투여하고, 이후 분화될 때, T 세포는 상기 특이적 항원에 대해 특이적으로 지향하도록 유도된다. T 세포의 "유도"는 결실 또는 아네르기(anergy)에 의해서와 같은 항원-특이적 T 세포의 불활성화를 포함할 수 있다. 불활성화는 자가면역 질병과 같은 내성을 확립 또는 재확립하는데 특히 유용하다. 상기 변형된 세포는 정맥내, 피하, 비강내, 종양내, 척추강내, 흉막내, 복강내 및 흉선에 직접 투여를 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 본 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 이를 필요로 하는 개체에서 면역 반응을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 한 구현예에서, 본 발명은 개체에서 신생물을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 종래의 치료적 개입에 듣지 않는 전립선암 또는 전이된 전립선암을 갖는 개체의 치료에 유용한 치료를 제공한다. 치료에 적합한 인간 개체는 전형적으로 임상적 기준에 의해 구별될 수 있는 2 개의 치료 군을 포함한다. "진행된 질환" 또는 "높은 종양 부하(burden)"를 갖는 개체는 임상적으로 측정가능한 종양을 갖는 개체이다. 임상적으로 측정가능한 종양은 종양 질량에 기초하여 검출할 수 있는 종양이다(예컨대, 촉진, CAT 스캔, 초음파검사, 유방조영상 또는 X-선에 의해; 그 자신에 대한 양성 생화학적 또는 조직병리학적 마커는 상기 군집을 확인하는데 불충분함). 본 발명의 구현예인 약학적 조성물은 상기 개체에 투여되어 그 증상의 객관적인 완화와 함께 항-종양 반응을 일으킨다. 이상적으로, 종양 질량의 감소는 결과로서 일어나지만, 임의의 임상적 향상이 이점을 구성한다. 임상적 향상은 진행의 감소된 위험 또는 속도 또는 종양의 병리학적 결과에서의 감소를 포함한다.
적합한 개체의 두 번째 군은 "보조제(adjuvant) 군"으로 본 기술분야에 알려져 있다. 이들은 신생물의 이력을 갖고 있지만 다른 치료 모드(mode)에 반응성이 있는 개인이다. 이전의 치료는 외과적 절제, 방사선치료 및 전통적인 화학치료를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 그 결과, 상기 개인들은 임상적으로 측정가능한 종양이 없다. 그러나, 이들은 원래 종양 근처 또는 전이 중 하나에 의해 상기 질환의 진행 위험이 있는 것으로 의심된다. 상기 군은 고-위험 및 저-위험 개인으로 추가로 세분될 수 있다. 상기 세분은 처음 치료 전후에 관찰된 특성에 기초하여 이루어진다. 상기 특성은 임상 기술분야에 알려져 있으며, 각각의 상이한 신생물에 대해 적합하게 정의된다. 고위험 아군의 전형적인 특성은 종양이 이웃하는 조직으로 침입하거나, 림프절이 관여된 것을 보여주는 인간이다.
다른 군은 신생물에 대한 유전적인 성향을 갖지만, 아직 신생물의 확증된 임상적 증상은 갖지 않는다. 예를 들면, 유방암과 연관된 유전자 돌연변이에 대해 양성으로 검사되었지만 아직 가임기인 여성은 예방적 수술을 수행하기에 적합할 때까지 신생물의 출현을 예방적으로 방지하기 위하여 치료시 본 명세서에 개시된 하나 이상의 항원-결합 절편을 받기 원할 수 있다.
임의의 교모세포종, 흑색종, 신경아세포종, 선암종, 신경교종, 연조직 육종 및 다양한 암종(전립선암 및 소세포 폐암을 포함함)의 신생물을 갖는 인간 신생물 개체는 특히 적절한 개체이다. 적합한 암종은 성상세포종, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 올리고덴드로신경교종, 상의세포종, 수모세포종, 원시 신경 외배엽 종양(primitive neural ectodermal tumor, PNET), 연골육종, 골원성 육종, 췌장 관 선암종, 소세포 및 대세포 폐 선암종, 연골종, 혈관육종, 내피육종, 편평세포 암종, 기관지폐포암종, 상피 선암종, 및 그의 간 전이, 림프관육종, 림프관내피육종, 간세포암, 담관암, 활막종, 중피종, 유윙 종양, 횡문근육종, 대장 암종, 기저세포 암종, 한선 암종, 유두 암종, 피지선 암종, 유두 선암종, 낭선암종, 수질 암종, 기관지 암종, 신장세포 암종, 담관 암종, 융모암종, 정상피종, 태생 암종, 윌름 종양, 고환 종양, 수모세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 올리고덴드로신경교종, 뇌수막종, 신경아세포종, 망막아세포종, 백 혈병, 다발성 골수종, 발덴스트롬 매크로글로불린증, 및 중쇄 질환, 관 및 소엽 선암종과 같은 유방 종양, 자궁 경부의 편평 및 선암종, 자궁 및 난소 상피 암종, 전립선 선암종, 방광의 이행성(transitional) 편평세포 암종, B 및 T 세포 림프종, (마디성 및 확산성) 형질세포종, 급성 및 만성 백혈병, 악성 흑색종, 연조직 육종 및 평활근육종을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아닌 종양학 분야에서 알려진 임의의 것들을 추가로 포함한다.
상기 개체는 진행된 형태의 질환을 가질 수 있으며, 이 경우 치료 목적은 질환 진행의 경감 또는 되돌림 및/또는 부작용의 개선을 포함할 수 있다. 상기 개체는 이미 치료된 적이 있는 증상의 이력을 가질 수 있으며, 이 경우 치료 목적은 전형적으로 재발 위험의 감소 또는 지연을 포함할 것이다.
따라서, 본 발명은 개체에서 신생물을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 종양 항원에 결합하고 면역반응성 세포(예컨대, TCR, CAR)를 활성화시키는 수용체 및 다른 종양 항원에 결합하고 상기 면역반응성 세포를 자극시키는 수용체를 인코딩하는 벡터를 포함하는 유효량의 면역반응성 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 상기 신생물은 전립선암, 유방암, 혈액암(예컨대, 백혈병, 림프종 및 골수종), 난소암, 방광암, 뇌암, 대장암, 장암, 간암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 위암, 교모세포종 및 인후암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 상기 종양 항원은 탄소 안하이드라아제(carbonic anhydrase) Ⅸ(CAIX), 암태아 항원(carcinoembryonic antigen, CEA), CD5, CD7, CD10, CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD34, CD38, CD41, CD44, CD49f, CD56, CD74, CD133, CD138, 사이토메갈로바이러스(CMV)에 감염된 세포의 항원(예컨대, 세포 표면 항원), 상피 당단백질-2(EGP-2), 상피 당단백질-40(EGP-40), 상피 세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule, EpCAM), 수용체 티로신-단백질 키나아제 erb-B2,3,4, 폴레이트-결합 단백질(folate-binding protein, FBP), 태아 아세틸콜린 수용체(acetylcholine receptor, AChR), 폴레이트 수용체-a, 강글리오사이드 G2(GD2), 강글리오사이드 G3(GD3), 인간 표피 성장 인자 수용체 2(human Epidermal Growth Factor Receptor 2, HER-2), 인간 텔로머라아제 역전사효소(human telomerase reverse transcriptase, hTERT), 인터루킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL-13Ra2), i c-경쇄, 키나아제 삽입 도메인 수용체(kinase insert domain receptor, KDR), 루이스 Y(Lewis Y, LeY), L1 세포 부착 분자(L1CAM), 멜라노마 항원 패밀리 A1(MAGE-A1), 뮤신(Mucin) 1(MUC1), 메소텔린(MSLN), NKG2D 리간드, 암-고환 항원 MY-ES0-1, 태아종양성 항원(h5T4), 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선-특이적 막 항원(PSMA), 종양-연관성 당단백질(tumor-associated glycoprotein) 72(TAG-72), 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor) R2(VEGF-R2), 또는 윌름 종양 단백질(WT-1)의 하나 이상이다.
종양 항원에 결합하고 면역반응성 세포(예컨대, TCR, CAR)를 활성화시키는 수용체 및 다른 종양 항원에 결합하고 면역반응성 세포(예컨대, CCR)를 자극시키는 수용체를 인코딩하는 벡터가 표면에 발현된 결과, 입양적으로 전달된 인간 T 또는 NK 세포는 상기 종양 부위에서 연장되고 선택적인 세포용해 활성을 갖는다. 또한, 종양 또는 바이러스 감염에 위치 및 증식한 이후에, 공-자극 리간드 발현 T 세포는 상기 종양 또는 바이러스 감염 위치를 생리학적 항-종양 또는 항-바이러스 반응에 관여하는 넓은 범위의 면역 세포(종양 침윤 림프구, NK-, NKT-세포, 수지상 세포 및 대식세포)에 대해 매우 전도성인 환경으로 되돌린다.
다른 구현예에서, 본 발명은 병원체에 감염(예컨대, 바이러스 감염, 박테리아 감염, 진균 감염, 기생충 감염 또는 프로토조아 감염)된 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명은 면역손상된 개체에서 면역 반응을 향상시키는데 특히 유용하다. 본 발명의 방법을 이용하여 치료할 수 있는 예시적인 바이러스 감염은 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스테인 바 바이러스(EBV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 인플루엔자 바이러스 감염을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
따라서, 본 발명은 개체에서 병원체 감염을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 명세서에 개시된 것과 같은 면역반응성 세포를 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
키트
본 발명은 신생물, 병원체 감염, 면역 질병 또는 동종 이식의 치료 또는 예방을 위한 키트를 제공한다. 한 구현예에서, 상기 키트는 단위 제형 내에 활성화 항원 수용체 및 공-자극 항원 수용체를 포함하는 면역반응성 세포를 유효량으로 함유하는 치료적 또는 예방적 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 공-자극 리간드를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 키트는 치료적 또는 예방적 백신을 함유하는 멸균 용기를 포함한다. 상기 용기는 박스, 앰풀, 병, 바이알, 튜브, 백, 파우치, 블리스터-팩(blister-pack), 또는 본 기술분야에 알려진 다른 적합한 용기 형태일 수 있다. 이러한 용기는 플라스틱, 유리, 적층 종이(laminated paper), 금속 포일(foil), 또는 약제를 수용하기에 적합한 다른 물질로 만들어질 수 있다.
필요시, 상기 면역반응성 세포는 상기 세포를 신생물, 병원체 감염, 면역 질병 또는 동종 이식을 갖거나 이들이 발생할 위험성이 있는 개체에 투여하기 위한 설명서와 함께 제공된다. 상기 설명서는 일반적으로 신생물, 병원체 감염, 면역 질병 또는 동종 이식을 치료 또는 예방하기 위한 조성물의 사용에 관한 정보를 포함할 것이다. 다른 구현예에서, 상기 설명서는 다음 중 적어도 하나를 포함한다: 치료제의 설명; 신생물, 병원체 감염, 면역 질병 또는 동종 이식 또는 그의 증상을 치료 또는 예방하기 위한 복용량 스케줄 및 투여; 예방책; 주의사항; 지시사항; 금기사항; 과복용 정보; 부작용; 동물 약리학; 임상 연구; 및/또는 참고문헌. 상기 설명서는 용기 위에 직접 인쇄되거나(존재시), 용기에 적용된 라벨, 또는 별도의 시트, 팜플릿, 카드 또는 용기 내에 또는 용기와 함께 공급된 폴더일 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 키메라 공자극 수용체(CCR) 벡터 디자인 및 원발성(primary) 인간 T 세포의 형질도입을 통한 발현을 나타내는 그래프이다. 도 1a는 면역글로불린 가변 도메인의 중쇄 및 경쇄를 CD3의 세포질 신호화 도메인에 융합된 CD8 막통과 도메인에 융합하는 것에 의한 CAR의 생성을 나타낸다. 내부 리보좀 유입 위치(Internal Ribosomal Entry Site, IRES)를 이용하여 바이시스트론성(bicistronic) 발현을 가능하게 함으로써, CAR 발현은 dsRED 형광과 연관되어 용이하게 검출될 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 상기 CCR은 scFv를 4-1BB(aka CD137) 세포질 신호화 도메인에 융합된 21 CD28 막통과 및 신호화 도메인에 융합시킴으로써 생성되었다. 15 CCR 발현은 hrGFP의 비시스트론성 발현과 연관될 수 있다(데이터는 나타내지 않음). 약자: LTR - 긴 말단 반복구조(Long Terminal Repeat); SD - 스플라이스 공여 부위(Splice Donor site); SA - 스플라이스 수용 부위(Splice Acceptor site), VH 또는 V L - 각각 가변 중쇄 또는 경쇄 도메인; EC - 세포외 도메인(Extracellular domain), TM - 막통과 도메인; C - 세포질 도메인; IRES - 내부 리보솜 유입 위치; dsRED - 디스코소마 속 붉은색 형광 단백질( Discosoma sp. Red fluorescent protein), hrGFP - 인간 재조합 녹색 형광 단백질(Human Recomninant Green Fluorescent Protein). 도 1b는 상기 레트로바이러스 벡터를 이용한 원발성 인간 T 세포의 대표적인 형질도입 효율을 나타낸다. 도 1c는 본 발명을 위한 상이한 복수의 CAR를 이용한 CTL의 형질도입을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2d는 2 가지 항원에 결합시 인간 T 세포의 이중-수용체인 CAR/CCR-매개성 활성화가 강력한 CTL 기능, 장기간의 증식, 및 향상된 종양 근절을 허용함을 보여준다. 도 2a는 키메라 수용체를 발현하는 T 세포는 CD19에 특이적인 CAR가 T 세포에 의해 발현될 때 CTL 분석에서 형질도입되지 않거나 P28BB 형질도입된 T 세포와 비교하여 항원에 양성인 세포를 용해시켰음을 보여준다. 좌표(plot)는 n>4의 실험을 나타내며, 오차 막대는 3 회 반복의 평균의 표준 편차를 나타낸다. 도 2b는 항원의 하나 또는 양쪽 모두를 발현하는 인간 종양 세포주와 공-배양된 0, 1, 또는 2 개의 키메라 수용체를 발현하는 T 세포의 31 일에 걸친 절대 T 세포 계수에 의한 T 세포의 장기간 증식을 보여준다. 화살표는 신선하게 조사된 종양 세포를 이용하여 T 세포를 재-자극한 것을 나타낸다. 이중-수용체를 발현하는 T 세포가 양쪽 항원 모두를 만날 때에만 강력한 장기간의 증식이 관찰되었다. 좌표는 n>4의 실험을 나타내며, 오차 막대는 3 회 반복의 평균의 표준 편차를 나타낸다. 도 2c는 루시퍼라아제(luciferase)를 발현하는 CD19 + PSMA + PC3 인간 전립선 종양을 갖고 있는 NSG 마우스에 1.0×10 6 T 세포를 정맥내(intravenously, IV) 투입함으로써 종양-감작 T(TTS) 세포에 의한 전신 종양 근절의 효능을 나타낸다. 종양의 부하는 BLI를 이용하여 매주 정량적으로 측정하였다. 각 군의 대표적인 2 마리 마우스의 이미지는 컬러로 나타낸 종양의 발광으로부터 픽셀 강도로 보여진다. 종양 부하의 평균은 군 당 6 마리 마우스의 평균값으로부터의 표준 편차를 나타내는 오차 막대와 함께 좌표로 나타내었다. 도 2d는 CD19에만 양성인 세포는 마우스의 왼쪽 옆구리에, PSMA에만 양성인 세포는 마우스의 오른쪽 옆구리에, 및 CD19 및 PSMA 모두에 양성인 세포는 마우스의 등에 1×10 6 PC3 종양 세포를 피하 주사하는 3 가지 종양 마우스 모델을 이용한 DP 종양의 선택적인 근절을 나타낸다. 키메라 수용체의 19z1, P28BB 중 하나, 또는 19z1 + P28BB 모두를 발현하는 T 세포는 종양 투입 7 일 후 정맥내로 투입되었다. 상기 종양을 갖는 군 당 2 마리 마우스의 대표적인 이미지는 컬러로 나타낸 종양의 발광으로 보여진다. 종양은 칼리퍼(caliper)를 이용하여 정량적으로 측정되었고, 종양의 부피는 각 종양에 대해 시간에 대한 좌표로 나타내었다. 오차 막대는 6 마리 마우스의 평균으로부터의 표준 편차를 나타낸다. 통계적인 유의성은 19z1 T 세포 및 19z1 + P28BB T 세포로부터 얻어진 값과 비교하여 양측-꼬리 비쌍 T 검정(two-tailed unpaired T test)을 이용하여 결정하였고, p 값은 <0.05에 대해서는 "*"로, 또는 <0.01에 대해서는 "**"로 나타낸다.
도 3a 내지 도 3e는 2 가지 전립선 종양 항원을 표적화할 때 인간 전립선 종양을 종양-감작 T(TTS) 세포가 선택적으로 근절하는 것을 나타낸다. 도 3a는 CD3에 대한 특이성도 갖고 있는 양특이성 항체로의 조립에 대한 PSCA에 특이적인 3 가지 상이한 scFv의 평가를 나타낸다. T 세포는 PSCA + PC3 종양 세포 및 다양한 양으로 첨가된 항체와 함께 20:1의 비로 공-배양되었고, 특이적인 용해가 측정되었다. 도 3b는 세포독성 분석에서 다양한 효능을 나타내는 항-PSCA scFv를 이용한 CAR의 생성을 나타낸다. PSCA를 발현하는 표적 세포의 CAR 매개성 특이적 용해는 Hzl 또는 Mzl 중 어느 하나에 대한 동일한 용해 레벨을 달성하기 위하여 50배 높은 작용기(effector):표적 비를 필요로 함으로써 Lzi scFv의 감소된 효능을 입증하였다. 도 3c 및 도 3d는 PSCA 및 PSMA를 발현하는 전신 전립선 종양의 선별적인 근절을 나타내며, 3 가지 효율적인 scFv를 이용함으로써 조사되었다. 종양(도 5)은 도 2에 나타낸 것과 같이 확립 및 처리되었다. 14 일 후, Mzl + P28BB(도 3c) 또는 Lzl + P28BB(도 3d)에 대한 1.0×10 6 키메라 수용체 양성 T 세포는 정맥내 투입되었다. 각 군으로부터의 대표적인 2 마리 마우스의 이미지는 컬러(푸른색 = 5×10 5 내지 붉은색 = 2×10 7 광자)로 나타낸 종양으로부터 발광으로 나타낸다. 평균 종양 부하는 발광에 의해 정량화되었고, 군 당 5 마리 마우스의 평균값으로부터의 표준 편차를 나타내는 오차 막대를 이용하여 좌표로 나타내었다. PSMA를 수용한 2 마리 마우스(초록선)는 49 일 후에 죽었고, 따라서 발광에 대한 평균값은 56 일 및 63 일에 대한 3 개의 값의 평균이었다. 도 3e는 PSCA + PSMA + 종양에 대한 선택적인 항종양 반응만을 나타내며, 도 2d와 유사하게 PSCA - PSMA + 및 PSCA + PSMA - 종양도 함께 갖는 마우스에서 Lzl + P28BB T 세포에 의해 달성되었다. 통계적 유의성은 Lzl T 세포 및 Lzl + P28BB T 세포로부터 얻어진 값과 비교하여 양측-꼬리 비쌍 T 검정을 이용하여 결정하였고, p 값은 <0.05에 대해서는 "*"로, 또는 <0.01에 대해서는 "**"로 나타낸다.
도 4a 내지 도 4d는 향상된 사이토카인 분비를 나타내며, BclxL 발현은 DP 종양에서 공-배양될 때 TTS 세포에 의해 발견된다. 도 4a는 형질도입되지 않은 PC3 세포(엠프티(Empty)) 또는 CD19+PSMA + PC3 세포 중 어느 하나를 이용한 첫 번째 항원 자극 48 시간 후 형질도입되지 않은 T 세포 또는 19z1, P28BB로 형질도입된 T 세포, 또는 양쪽 모두의 멀티플렉스 사이토카인 분석을 나타낸다. 오차 막대는 2 개의 생물학적 복제물로부터의 표준 편차를 나타낸다. 도 4b 내지 도 4d는 형질도입되지 않은 T 세포 또는 Hzl(도 4b), Mzl(도 4c), 및 Lzl(도 4d)로 형질도입된 T 세포의 멀티플렉스 사이토카인 분석을 나타내며, 항-PSCA CAR, P28BB CCR, 또는 CAR + CCR 모두는 엠프티 또는 PSCA+PSMA+PC3 세포의 어느 하나를 이용하여 두 번째 항원 자극된 48 시간 후에 나타낸다. 도 4e는 처음 항원 자극 24 시간 후에 형질도입되지 않은 T 세포 또는 19z1, P28BB, 또는 양쪽 모두로 형질도입된 T 세포의 세포 용해물을 이용하여 수행된 BclxL에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. Akt의 총량이 로딩 대조군(loading control)으로 사용되었다.
도 5는 GFP-반딧불이 루시퍼라아제(GFP/Luc) 및 종양 항원의 융합 단백질의 발현에 대한 전립선 종양 세포의 생성을 나타낸다. 형질도입되지 않은 PC3 세포(엠프티)는 레트로바이러스 발현 구조체를 이용하여 GFP-Luc 및 CD19, PSMA, PSCA의 어느 하나, 또는 2 가지 항원들의 조합으로 형질도입되었다. 세포는 GFP/Luc, CD19, PSMA 및/또는 PSCA에 대한 이중 순도 FACS를 통해 정제되었다.
도 6a 내지 도 6c는 종양-감작 T 세포의 개념을 설명한다. 도 6a는 효율적인 CAR을 발현하는 TTS 세포는 A + 113 + 세포에 의해 강력하게 자극되어 A + 세포에 대한 면역 반응을 촉진하게 됨을 나타낸다. CAR+CCR+ 세포는 CD3 활성화 신호를 제공하는 CAR를 갖는 종양 항원 A + 세포와 결합할 수 있다. 그 결과 단기간에 세포 용해가 될 수 있다. CAR + CCR + 세포는 CD28 및 CD137 신호를 제공하는 CCR을 갖는 종양 항원 B + 세포에 결합할 수 있다. 상기 신호 단독으로는 용해 또는 증식을 유도하기에 충분하지 않다. CAR + CCR + 세포가 CAR 및 CCR을 갖는 종양 항원 A + B + 세포에 결합할 때만 활성화 및 자극이 모두 제공될 수 있다. 그 결과, 강력한 용해, T 세포 증식, 향상된 사이토카인 분비, BclxL의 상향조절(upregulation), 및 생체내에서 선별적으로 종양을 근절하는 능력이 생성된다. 그러나, CAR의 효율에 따라, 상기 CAR+CCR+ 세포는 잠재적으로 재순환하여 CAR에 특이적인 항원에 대해 단일 양성인 세포를 용해시킬 수 있다. 도 6b는 CAR의 효율을 감소시킴으로써 A + B + 세포가 A+ 세포에 대한 반응을 피하면서 A + 13 + 세포에 선택적으로 반응 및 근절하기 위해 접하게 될 때 CCR 결합에 의해 TTS 세포가 기능적으로 구조될 수 있음을 나타낸다. 도 6c는 종양 항원에 결합시 TCR 활성화 신호를 제공하는 한 CAR 및 상이한 종양 항원에 결합시 자극 신호를 제공하는 2번째 CAR을 공-발현시킴으로써 T 림프구가 양쪽 항원 모두를 발현하는 종양만 근절하고 어느 한 항원만을 발현하는 종양은 근절하지 않을 것임을 보여준다.
본 발명의 실행은, 달리 특정하지 않는 한, 본 기술분야의 기술자의 범위 내인 분자 생물학(재조합 기술을 포함함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 종래의 기술을 도입한다. 이러한 기술은 하기의 문헌들에 충분히 설명되어 있다: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Muiiis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991). 상기 기술들은 본 발명의 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 제조에 적용가능하며, 이와 같이 본 발명을 제조 및 실행하는데 고려될 수 있다. 특정 구현예에 대해 특히 유용힌 기술은 하기 섹션에서 논의될 것이다.
하기 실시예는 본 기술분야의 통상의 기술자에게 본 발명의 분석, 스크리닝 및 치료 방법을 제조 및 이용하는 방법을 완전한 개시와 설명으로 제공하기 위한 것이며, 본 발명자들이 본 발명으로서 간주하는 것의 범위를 한정하기 위한 의도는 아니다.
실시예 1. 키메라 항원 수용체( CAR ) 및 키메라 공-자극 수용체( CCR )를 공-발현하는 T 세포는 확립된 종양을 근절하였다.
본 발명은 종양 세포에 의해 공-발현되는 2 가지 항원이 동시에 관여하는 "종양-감작 T 세포"를 제공한다. 중요한 것은, 항원 중 어느 하나만 발현하는 조직에 대한 반응성은 무시해도 될 정도여야 하고, 어느 한 항원이 아니라 양쪽 항원 모두 존재시에만 T 세포 활성화가 촉발되는 것이 발견되었다는 점이다. 본 발명은 적어도 부분적으로는 조합시에 선택적인 T 세포 면역반응을 제공하고, 따라서 이러한 접근법이 임상적으로 의미가 있다는 발견에 기초한다. 첫 번째는 한 항원(예컨대, CD19 또는 전립선 줄기 세포 항원인 PSCA)에 대한 T 세포 활성화를 할당하는 것으로서, 이는 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)에 의해 매개될 수 있다. 공자극은 제2 항원(예컨대, 전립선-특이적 막 항원인 PSMA)을 표적화하는 "키메라 공자극 수용체(CCR)"에 의해 독립적으로 매개된다. 상기 접근법의 결과 이중 항원 양성(DP) 종양에 대한 면역반응성은 증가되지만, 단일 항원 양성(SP) 종양에 대한 향상된 면역반응성을 피하는 데는 실패하였다. 종양 감작 T 세포가 SP 종양으로부터 DP 종양으로 분화시키기 위해 중요한 두 번째 원칙은 그 자체로는 효과적이지 않지만 독립적으로 공-발현되는 항원에 의해 관여되는 CCR에 의해 종양 부위에서 기능적으로 구조되는 레벨까지 T 세포 활성화를 줄이는 것이다. CAR 및 CCR은 HLA-펩티드 복합체보다는 세포 표면 항원을 인식하기 때문에, 이러한 방식으로 가공된 T 세포는 종양에 직접 표적화되고, 상기 표적화된 항원을 교차-제공하는 세포와 동시에 상호작용하지는 않을 것이다. 본 명세서에서 설명한 것과 같이, 이러한 접근법의 결과 다수의 종양을 갖는 마우스에서 선택적으로 종양을 근절하게 되었다.
2 가지 구별되는 항원-특이적 수용체를 이용하여 T 세포 활성화 및 공자극 신호 모두가 생체내에서 공급될 수 있음을 입증하기 위하여, B 세포 마커인 CD19 14 를 인식할 때 CD3 활성화 신호를 제공하는 CAR과 PSMA 12 ,15 에 특이적인 CCR의 조합을 평가하였다. 종열(tandem) 세포질 도메인 18 -21 을 포함하는 CD28 및 4-1BB 16 ,17 간의 상승작용으로 인하여, 4-1BB 세포질 도메인은 개시된 것과 같이 PSMA CCR P28 15 에 부가되었다(도 1a). 2 원형 인간 말초혈 T 세포를 19z1 및/또는 P28BB 수용체를 이용하여 형질도입하였고, 4,570% 범위의 형질도입 효율로 양쪽 수용체 모두를 즉시 검출가능하게 발현함을 보였다(도 1b). 모든 후속 연구에서 항-CD19 CAR(19z1), 항-PSMA CCR(P28BB), 항-CD19 CAR 및 항-PSMA CCR 모두의 조합(19z1+P28BB) 및 목(mock)-형질도입된 대조군(mock)을 포함하는 4 가지 군의 T 세포를 분석하였다(도 1c). CD19 및/또는 PSMA에 노출될 때의 시험관내 세포독성 및 증식성 반응은 CD19에 대해 지향하는 세포독성은 예상한 것과 같이 19z1에 의해서는 부여되었지만 PSMA의 존재하에서는 변경되지 않았음을 보여주었다.
19z1+P28BB 군에 대해서는 19z1-형질도입된 T 세포의 분획으로 표준화되고 P28BB 군에서는 P28BB-형질도입된 분획으로 표준화된 T 세포 군의 정량적 비교는 19z1 및 19z1+P28BB T 세포가 50:1 E:T 비에서 40-47%의 CD19 + 표적을 특이적으로 용해시켰지만 P28BB-형질도입된 T 세포는 PSMA + 표적을 용해시키는데 실패하였음을 보여주었다(도 2a). 그러나, 외인성 사이토카인의 부재 하에 상기 항원들을 반복적으로 노출하면, 양쪽 항원 모두를 발현하는 인공 항원 제공 세포(AAPC)에서 공-배양될 때 19z1+P28BB T 세포만이 31 일 동안 58배 확장되는 강력한 증식을 나타내었다. 이와 대조적으로, 19z1 또는 P28BB 세포는 CD19 + PSMA - APC에 대한 19z1+P28BB T 세포에서와 같이 처음 14 일에 걸쳐 단지 보통의 확장을 나타내었다(도 2b). 양쪽 항원의 존재시 T 세포가 더 강하게 활성화되는 추가적인 증거는 19z1+P28BB T 세포에서 사이토카인 생성 및 항-아폽토시스 분자인 BclxL의 유도에 대한 정량적인 평가에 의해 제공되었으며, 어느 항원 하나만 존재할 때보다 CD19 + PSMA + APC가 존재할 때 구별되게 더 컸다(도 4a, 도 4e).
처음에, 이중-양성(CD19 + PSMA + ) 종양 세포를 갖는 면역손상된 NOD/SCID-yC KO(NSG) 마우스에서 상기 이중-수용체 발현 T 세포가 확립된 전신 인간 전립선 종양을 근절하는 생체내 능력을 테스트하였다. 상기 NSG 마우스는 2.0×10 6 반딧불이-루시퍼라아제를 발현하고 CD19 및 PSMA 모두를 발현하는 PC3 종양 세포로 전신 생착(engraft)되었고(도 5), 이후 1.0×10 6 19z1, 19z1+P28BB, P28BB 또는 대조군 T 세포를 단일 정맥내 투입하여 19 일 동안 처리되었다. 35 일 후, P28BB T 세포 또는 대조군 T 세포를 수용하는 마우스는 종양 부하로 인해 희생되었다. 이와 대조적으로, 19z1 T 세포로 처리된 마우스는 종양 부하가 현저하게 감소되었다. 두드러진 것은, 19z1+P28BB T 세포로 처리된 마우스는 종양 부하가 검출가능하지 않았다(도 2c). 투입후 모니터링한 70 일에 걸쳐서, 상기 CD19 + 종양은 결국 19z1 T 세포를 수용한 마우스에서 재발되었지만, 19z1+P28BB T 세포를 수용한 모든 마우스에서는 완전한 차도가 지속되었다(도 2c). 상기 결과는 종양의 근절이 달성되었음을 강하게 나타낸다.
그러나, 상기 발견은 19z1+P28BB T 세포에 의한 CD19 + PSMA - 종양의 잠재적인 기준선(base line) 근절로 인한 우려를 제공하였다. T 세포의 재순환으로 인해 이중-양성 CD19 + PSMA + 종양을 갖는 수용자(recipient)에서 T 세포 면역반응성이 원하지 않게 향상될 가능성이 있었다. 상기 가설을 테스트하기 위하여, 마우스의 왼쪽 옆구리에 CD19 + PSMA - 종양을, 오른쪽 옆구리에 CD19 - PSMA + 종양을, 및 등에 CD19 + PSMA + 종양을 피하 투입하였다. 1 주일 후, 마우스에 19z1, P28BB, 또는 19z1+P28BB T 세포(1.0×10 6 세포) 중 하나를 정맥내 투여하였다. P28BB T 세포를 수용한 마우스는 3 가지 모든 종양에서 진행하였고, 35 일 내에 희생이 필요하였다(도 2d). 19z1 T 세포로 처리된 마우스에서, CD19 + PSMA - 및 CD19 + PSMA + 종양은, 결국 진행하지 전에, P28BB T 세포의 수용자에서의 진행과 비교하여 실질적으로 감소되었다. 이전의 결과와 부합되게, 19z1+P28BB T 세포로 처리된 마우스는 CD19 + PSMA + 종양의 완전한 근절을 보여주었다. 그러나, 가설과 같이, CD19 + PSMA - 종양의 거부는 또한 실질적으로 향상되었고 19z1 T 세포의 수용자에서 관찰되는 것보다 뛰어났다(도 2d 아래쪽 패널). 따라서, 2 가지 항원을 표적화하는 분할(split) 신호 접근법은 T 세포 반응성을 제한하는 것과 단일 항원 종양을 보호하는데 실패하였다.
단일 항원 반응성의 문제를 해소하기 위하여, T 세포 활성화는 거의 없어지는 지점까지 최소화되고 정확한 CDR이 관여됨으로써 발현되는 이중 항원 부위에서만 구조되어야 하는 것이 제안되었다. 따라서, 줄어든 활성을 갖는 CAR이 추구되었다. 상기 실험의 경우, PSCA 및 PSMA를 표적화하는 임상적으로 의미가 있는 항원의 조합이 사용되었다. PSCA에 대해 상이한 결합 친화도를 갖는 3 가지 PSCA-특이적 scFv를 평가하였다(도 3a). Hzl scFv는 종양 세포를 피코그램 범위로 효과적으로 용해시킨 반면에, Lzl scFv는 유사한 특이적 용해 효능을 달성하기 위하여 1,000-10,000배 많은 항체를 필요로 하였다. 상기 scFv는 세포독성 분석에서 상이한 활성을 갖는 3 가지 CD3-기반의 CAR을 유도하기 위해 사용되었다(도 3b). 상기 CAR 중 2 가지인 Hzl 및 Mzl은 PSCA+ 표적에 대해 보통의 용해 활성을 나타내었다(50:1의 E:T 비에서 20%의 특이적 용해). 이와 대조적으로, 3 번째 CAR인 Lzl은 10%만 도달하였고, 이를 비효율적인 항원 수용체로 정성화하였다. 상기 체계는 어느 한 수용체만 갖는 세포와 비교하여 19z1+P28BB T 세포(도 4a) 및 Hzl+P28BB T 세포(도 4b)에 의해 향상된 사이토카인의 분비를 보여주는 사이토카인 방출 분석에서 추가로 확인되었다. 상기 향상은 Mzl+P28BB T 세포(도 4c)에서는 덜하였으며, Lzl+P28BB T 세포(도 4d)에서는 훨씬 더 감소하였다.
PSCA+PSMA- 반응성 T 세포의 치료 효능 및 표적화 프로필(profile)을 평가하기 위하여, PSCA+PSMA- 및/또는 PSCA+PSMA+ 종양을 갖는 동물에서 상기 T 세포의 항-종양 활성을 테스트하였다. 먼저, PSCA+PSMA+ 세포를 선택적으로 근절하는 Mzl+P28BB 및 Lzl+P28BB T 세포의 능력을 테스트하기 위하여, 마우스를 PSMA, PSCA 또는 이들 모두에 양성인 2×10 6 의 FFLuc-발현 PC3 세포로 정맥내 접종하였다(도 5). 14 일 후, 한 세트의 마우스는 1×10 6 Mzl+P28BB CAR+ T 세포를 정맥내 투입으로 수용하였고, 다른 세트는 1×10 6 Lzl+P28BB CARP T 세포를 수용하였다. 보다 효율적인 Mzl+P28BB T 세포로 처리된 PSCA+PSMA 종양 세포를 갖는 마우스는 Lzl+PBB T 세포로 처리된 마우스보다 더 큰 종양 축소(regression)를 나타내었다(도 3c). CD19 실험(도 2c)과 유사하게, 상기 종양은 결국 재발 및 진행하였다. 그러나, PSCA+PSMA+ 종양 세포를 갖는 마우스에서는 Mzl+P28BB T 세포가 강력하고 장기간의 종양 근절을 유도하였다. Lzl+P28BB T 세포에서 덜 강력한 것과 일치하게, Lzl+P28BB 세포로 처리된 PSCA+PSMA+ 종양 세포를 갖는 마우스에서의 종양 근절은 더 느렸음에도 불구하고 동일하게 성공적이었고, 그 결과 모든 처리된 마우스가 더 강한 종양 근절 및 장기간의 생존을 보였다(도 3c). 종양 근절은 PSCAVSMA- 또는 PSCA-PSMA+ 종양 중 어느 하나를 갖는 대조군 마우스에서는 향상되지 않았다(도 3c). PSCAVSMA- 종양에 대한 배경 활성의 보다 엄격한 평가를 PSCA+PSMA+ 및 PSCAPSMA+ 종양을 갖는 동물의 문맥에서도 테스트하였다. Lzl+P28BB T 세포는 PSCA+PSMA 종양 근절의 증가없이 PSCA+PSMA+ 종양의 근절을 매개하였는데(도 3e), 이는 Lzl T 세포에 의해 유도된 것과 차이가 없었다.
따라서, 상기 결과는 T 세포 활성화를 단일 항원-발현 조직에 대한 반응성을 점화할 위험성을 일으키지 않으면서 한 표적화 항원을 발현하는 조직에 대한 면역 반응성을 방지하고 2 가지 항원이 공-발현되는 종양 부위에서 T 세포 활성화를 구조하는 지점까지 감소시킬 가능성을 설명한다. 이와 같이 함으로써, 그 결과는 특이성 및 안정성을 결정하는 하기 2 가지 상보적인 결과를 달성하기 위한 원칙의 증명을 설명한다: 1) 조합적 항원 인식을 통해 독특한(unique) 표적 항원의 부재시 표적 특이성을 생성하는 능력; 및 2) 실질적으로 표적 항원 공발현 부위로 활성화를 국한하도록 활성화 및 공자극 신호를 적정하는 것에 의한 하나의 항원만을 발현하는 세포의 보호.
표적화된 T 세포 치료는 치유적 치료를 제공할 잠재력을 갖지만, 그 적용가능성은 적합한 종양-특이적 표적의 부족에 의해 제한된다. 실제로 종양-외(extra-tumoral)의 발현은 2-4"가 때때로 내성이 있지만 결국 치사적인 11 "온-표적, 오프-종양" 효과로 나타난다. 본 명세서에 개시된 상기 방법은 조합적 항원 인식을 통해 적정된 활성화 및 공자극 신호를 공급함으로써 향상된 표적화를 제공한다(도 6a 내지 도 6c).
생리학적 항원 제공에서 22 , T 세포는 활성화 및 공자극 신호를 수용함으로써 림프절에서 프라임(prime)되고, T 세포의 작용기 기능이 공자극에 의존적이지 않은 말초 부위로 이동한다. 유사하게, 항원 수용체 및 CCR을 통해 관여된 T 세포는 다른 말초 부위로 재순환되고, 표적화된 항원 중 하나만 발현하는 조직에 대해 고조된 세포독성 활성을 나타낼 수 있다(도 6a). 따라서, 본 발명의 전략은 비-종양 세포를 포함하는 하나의 항원에 대해서만 양성인 세포를 남겨두기 위하여 이러한 잠재적인 전신 효과의 문제를 해소하기 위해 개발되었다(도 6b). 3 가지 종양 마우스 모델(PSCA + , PSMA + 및 PSCA + PSMA + )에서, PSCA + PSMA - 및 PSCA - PSMA + 종양을 남겨 놓으면서 PSCAVSMA + 의 근절이 달성되었다(도 3e).
본 발명의 연구에서 나타난 것과 같이, DP 종양에 대한 선택성은 독성이 덜하고(도 3b) 사이토카인의 분비 레벨이 감소된(도 4a 내지 도 4d) 세포를 생성하는 CAR의 효율을 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 19z1 및 Hzl CAR 모두에 대해 TH1 및 TH2 사이토카인의 레벨이 모두 상대적으로 높지만, 덜 효율적인 CAR인 Mzl 및 Lzl을 사용하면 상기 레벨을 감소시키게 된다. Lzl T 세포와 비교하여 Lzl+P28BB T 세포에서 사이토카인 레벨이 향상되는 것은 IL-2 및 IL-13을 제외하고는 최소화되었다. IL-2는 증식을 유도하고 TH1 또는 TH2 반응 중 하나를 촉진할 수 있지만 23 , IL-13은 4-1BB/CD137 신호화에 특이적인 TH2 반응과 연관된다. 24,25
PSCA 및 PSMA는 어느 것도 절대적으로 전립선에 특이적이지는 않지만 전이성 전립선암의 치료를 위한 유망한 표적이다. 26,27 인간 개체에서, PSCA 발현은 전립선암에서, 및 신우, 요관, 방광 및 요도 내에서 발견되었다. 28 PSMA의 발현은 원발성 전립선암, 전이뿐만 아니라 Ⅱ형 성상세포, 신장 근위세뇨관 및 내장 솔 가장자리(brush border)와 강하게 연관된다. 29 따라서, 이중 PSCA/PSMA 표적화는 전립선암 표적화를 증가시키고 상기 정상 조직에 대한 반응성을 감소시킬 것으로 기대된다. 상기 원칙은 특히 진정한 종양-특이성을 부여하는 한 쌍의 항원을 발현하는 다른 종양 유형으로 확장될 수 있음이 인식된다. 예를 들면, HER2, MUC2, CD44, CD49f 및/또는 EpCAM은 유방암을 치료하기 위해 이러한 방식으로 사용될 수 있다. 30,31 마찬가지로, 메소텔린, 폴레이트 수용체, CD44 및/또는 CD133은 난소암을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 32,33 독특한 표적 항원/구조가 명확하게 확인되어 있지 않은 종양 출발 세포 또는 암 줄기 세포의 표적화는 이러한 접근법을 이용하여 특히 매력적일 것이다.
상기 접근법의 중요한 측면은 단일 항원에 대한 반응시 T 세포 활성화를 제한하고 거의 없앤다는 점이다. 약한 활성화 신호만 제공하는 낮은 친화도 또는 낮은 결합도를 갖는 CAR은 이러한 효과를 달성하는데 유용한 것으로 나타났다. 다른 한편으로, 낮은 친화도 또는 낮은 결합도를 갖는 내인성 TCR이 항원-특이적 공자극을 제공하기 위하여 CCR과의 조합으로 사용될 수 있다. 전체적으로, 상기 결과는 종양-감작 T 세포에 의한 조합적 항원 인식을 통해 안정성과 함께 효능을 조화시킴으로써 가공된 T 세포의 활성을 제한하는 것의 이점을 나타낸다.
감마레트로바이러스 벡터 구축 및 바이러스 생산
감마레트로바이러스 벡터 SFG-19z1은 널리 개시되어 있다. 14 상기 백본 구조체를 사용하여 scFv의 5'에 위치하는 NcoI 부위 및 scFv의 3'에 위치하는 Nod 부위를 이용하는 방향성 클로닝에 의해 scFv가 SFG-HZl, SFG-Mzl 및 SFG-Lzl을 생성하도록 교환하였다. SFG-P28BB를 생성하기 위하여, 상기 융합된 CD28 및 CD137 도메인을 SFG-P28BBz1으로부터 PCR 증폭하였고, 5' NcoI 부위 및 3' BamHI 부위를 이용하여 PSMA scFv의 3'에 라이게이션(ligation)하여 BB 도메인의 3'에 중지 코돈을 포함시켰으며, 상기 CD3 도메인은 제거하였다. 21 dsRED와 공발현되는 CAR 및 hrGFR과 공발현되는 CCR에 대한 바이시스트론성 유전자 발현은 이전에 개시된 것과 같은 내부 리보좀 유입 위치를 이용하여 달성하였다. 벡터를 사용하여 세포주를 일시적으로 전달감염시켜 이전에 개시된 것과 같은 안정한 바이러스 생산 주를 생성하였다.
항- PSCA scFv 의 생성
이전에 개시된 것과 같이 하이브리도마로부터 약화된(degenerate) 프라이머를 사용하여 비-중첩 에피토프의 PSCA 항원 특이성을 부여하는 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인을 증폭함으로써 Hzl, Mzl 및 Lzl로 명명된 3 가지 신규한 PSCA 특이적 scFv를 생성하였다. 36 링커를 이용하여 상기 VH 및 VL 도메인을 함께 융합하였고, 5' SphI 내지 3' NotI 부위를 이용하여 상기 SFG-19z1 백본 내에 CD19 scFv를 교체하기 위해 사용하였다.
원발성 T 세포의 단리, 레트로바이러스 형질도입 및 배양
피콜 구배(Ficoll gradient)를 이용하여 말초혈 백혈구를 단리하였고, 이전에 개시된 것과 같이 형질도입하였다. 간략하게, 2 &g/㎖의 피토헴아글루티닌(phytohemagglutinin)을 이용하여 48 시간 활성화시킨 후, 레트로넥틴(retronectin)이 코팅된 플레이트에서 다음 48 시간에 걸쳐서 세포를 스핀접종(spinoculation)을 통해 1 시간 동안 2 회 형질도입하였고, 20 U/㎖의 IL-2를 첨가하였다. 벡터 발현을 위해 3 일을 허용한 후, 유세포분석을 통해 형질도입 효율을 결정하였고, 다양한 분석 및 입양 전달을 위해 크기가 큰 비분류 세포를 사용하였다.
항원 발현 종양 세포주의 생성
ATCC로부터 PC3 인간 전립선 종양 세포주를 입수하였고, PC3-GFP/Luc를 생성하기 위하여 레트로바이러스로 형질도입하였으며, 이어서 이를 사용하여 레트로바이러스 형질도입을 통해 10 PC3-CD19, PC3-PSMA, PC3-CD19-PSMA, PC3-PSCA 및 PC3-PSCA-PSMA를 생성하였다.
CTL 크롬 방출 살해 분석
원하는 항원을 발현하는 표적 세포를 51 Cr을 이용하여 표지하였고, 감소하는 작용기:표적 비에서 T 세포와 함께 공-배양하였다. 4 시간 배양한 후, 상등액을 제거하였고, 크롬으로부터 방출된 방사능을 측정하기 위해 사용하였다. T 세포와 배양되지 않은 표적 세포의 배경 방사능을 빼고, 0.2% 트리톤 X-100에 의해 완전히 용해된 표적 세포로부터 측정된 방사능으로 나눔으로써 특이적 용해를 결정하였다.
장기간 T 세포 증식 분석
원하는 항원을 발현하는 종양 세포를 5:1의 작용기:표적 비로 1.0×10 6 T 세포와 공-배양하기 전에 30 Gy로 조사하였다. 인비트로젠 카운테스(Invitrogen Countess) 세포 계수기를 이용하여 T 세포를 매주 계수하였고, 이후 조사된 종양 세포를 이용하여 재-자극시켰다. 상기 공-배양물에 외인성 사이토카인은 첨가하지 않았다.
마우스에서 종양 모델의 생성
PC3 종양 세포를 잭슨 실험실(Jackson Laboratories)로부터 입수하거나 MSKCC 기관 동물 돌봄 및 이용 위원회, MSKCC Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인된 04-10-024 프로토콜하에 내부적으로 기른 NOD/SCID-IL2Ry 마우스 내로 투입하였다. 전신 종양 실험을 위하여, 마우스에 1.0×10 6 키메라 수용체 양성 T 세포가 투입된 14 일 후에 2.0×10 6 종양을 투입하였다. 피하 종양 실험을 위하여, 종양 부위 당 1.0×10 6 종양 세포를 주사하였고, 7 일 동안 확립하였으며, 1.0×10 6 키메라 양성 T 세포를 IV 투입하였다.
종양 부하의 정량화
전신 종양 실험을 위하여, 이전에 개시된 것과 같이 IVIS 100 시스템(Caliper Life Sciences)을 이용하여 종양 부하와 발광의 양을 연관시킴으로써 바이오발광 이미징(bioilluminescent imaging, BLI)을 사용하여 종양 부하를 정량적으로 측정하였다. 피하 종양의 경우, 칼리퍼를 사용하여 종양의 크기를 측정하였다. 종양의 부피는 각 종양의 길이, 폭 및 높이를 곱함으로써 계산하였다.
양특이성 항체 매개성 종양 용해
표준 4 시간 크롬 방출 분석에서 CD3 특이적 scFv에 융합된 PSCA 특이적 scFv를 함유하는 양특이성 항체를 20:1의 비로 PSCA+ PC3와 공-배양된 형질도입되지 않은 T 세포에 다양한 양으로 각각 첨가하였다.
유세포분석
세포를 LSRⅡ 유세포분석기를 이용하여 분석하거나, 이전에 개시된 것과 같이 FACSAria 세포 분류기(BD Biosciences)를 이용하여 분류하였다. 16 세포 표면의 키메라 수용체의 검출은 AF647 접합된 염소-항-마우스 항체(Invitrogen)를 이용함으로써 직접 달성될 수 있었다. CD4-PE-Cy7, CD8-퍼시픽 블루 및 CD19-APC에 대한 항체는 인비트로젠으로부터 입수하였고, PSCA 항체는 하이브리도마 상등액으로부터 정제하였으며, PSMA 항체는 MBL 인터내셔널로부터 입수하였다.
사이토카인 분석
장기간 T 세포 증식 실험으로부터 2 번째 종양 자극한 48 시간 후에 상등액을 수확하였고, 구입(custom) 멀티플렉스 시스템인 HCYTMAG-60K(Millipore)를 이용함으로써 사이토카인 분석을 위해 사용하였으며, 이전에 개시된 것과 같이 Luminex 100 기기(Luminex)를 이용하여 분석하였다. 21
웨스턴 블롯 분석
장기간 T 세포 증식 실험으로부터 처음 종양을 자극한 24 시간 후에 세포를 수확하였고, BclxL 발현의 웨스턴 블롯 분석을 위해 사용하였다. BclxL 및 Akt 1차 항체(Cell Signaling Technology)를 이용하여 이전에 개시된 것과 같이 웨스턴 블롯을 수행하였다. 21
상기 개시된 내용으로부터, 다양한 용법 및 조건을 채택하기 위하여 본 명세서에서 개시된 본 발명에 변동 및 변형이 이루어질 수 있음이 명확할 것이다. 이러한 구현예는 또한 하기 청구항의 범위 이내이다.
본 명세서에서 다양하게 정의된 임의의 인자들의 목록을 인용하는 것은 임의의 단일 인자 또는 나열된 인자들의 조합(또는 서브조합)으로서 상기 다양한 것들의 정의를 포함한다. 본 명세서의 구현예를 인용하는 것은 임의의 단일 구현예 또는 임의의 다른 구현예 또는 그의 일부와의 조합으로서 상기 구현예를 포함한다.
본 발명은 그 개시된 내용이 인용에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함되는 2007년 3월 30일자로 출원된 미국 가출원 제60/921,144호의 이익을 주장하는 2010년 3월 8일자로 출원된 국제 특허 출원 제PCT/US2008/004251호의 35 USC §371에 의한 미국 국내 단계 출원인 미국 특허 출원 제12/593,751호에 관한 것일 수 있다.
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