중합체성 표면의 개질 방법 |
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| 申请号 | KR1020157002165 | 申请日 | 2013-06-28 | 公开(公告)号 | KR1020150033697A | 公开(公告)日 | 2015-04-01 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 申请人 | 폴리머스 씨알씨 리미티드; | 发明人 | 아메링거토마스; 미거로렌스; 티센헬무트; 패식폴; 스타이안케이티; | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 摘要 | 본발명은중합체성표면을적어도하나의에틸렌적으로불포화된단량체를포함하는용액과접촉시키는단계; 및용액과접촉한중합체성표면을자외선에노출시켜중합체성표면위에코팅된단량체의그라프트-중합체를제공하는단계를포함하는중합체성표면의개질방법에관한것이다. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| 权利要求 | 하기 단계를 포함하는 중합체성 표면의 개질 방법: 중합체성 표면을 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체를 포함하는 용액과 접촉시키는 단계; 및 상기 용액과 접촉한 중합체성 표면을 자외선에 노출시켜 상기 중합체성 표면 상에 단량체의 그라프트-중합체 코팅을 제공하는 단계. 제1항에 있어서, 상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 노출 단계가 상기 중합체성 표면을 자외선에 단속적으로 노출시키는 것을 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제2항에 있어서, 상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 0.5 초 내지 3 분 범위로 3 피리오드(period) 이상의 UV 노출을 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제2항에 있어서, 상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 1 초 내지 60 초 범위로 3 피리오드 이상의 UV 노출을 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 5 초 내지 60 분 범위로 노출 사이의 시간 피리오드를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 10 초 내지 5 분 범위로 노출 사이의 시간 피리오드를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체성 표면의 자외선에 대한 단속적 노출이 1 초 내지 15 초 범위로 3 피리오드 이상의 UV 노출 및 1 초 내지 60 초 범위로 노출 사이의 시간 피리오드를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체성 표면 및 상기 용액이 각각 실질적으로 개시제를 포함하지 않는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액이 수성인, 중합체성 표면의 개질 방법. 제9항에 있어서, 상기 용액이 수혼화성 용매를 추가로 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 불활성 기체 분위기 하에 실행되는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체성 표면이 헤테로원자를 포함하지 않는 포화 중합체로 형성되는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체성 표면이 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리이소부틸렌, 에틸렌-알파올레핀 공중합체, 폴리스티렌, 스티렌 공중합체, 폴리-이소프렌, 폴리부타디엔, 폴리클로로프렌 고무, 폴리이소부틸렌 고무, 에틸렌-프로필렌디엔 고무 및 이소부틸렌-이소프렌 공중합체로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상의 중합체로 형성되는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 중합체성 표면이 폴리스티렌으로 형성되며, 상기 중합체성 표면이 1 초 내지 60 초 범위의 노출 사이의 간격으로 1 초 내지 15 초 범위의 피리오드 동안 3 피리오드 이상 자외선에 단속적으로 노출되는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 에틸렌적으로 불포화된 단량체가 카복실산 작용기를 포함하는 제1 단량체 및 생물부착성(biofouling properties)이 낮은 제2 단량체를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제15항에 있어서, 상기 제1 단량체는 아크릴산, 메타크릴산 및 2-카복시에틸 아크릴레이트로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상을 포함하고, 상기 제2 단량체는 아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트, 메톡시 폴리(에틸렌 글리콜) (메트)아크릴레이트, N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드 및 2-메타크릴로일옥시에틸 포스포릴콜린으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제15항에 있어서, 상기 제1 단량체로서 아크릴산을 포함하고 상기 제2 단량체로서 아크릴아미드를 포함하는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용액 중의 상기 제1 단량체 대 상기 제2 단량체의 몰비가 20:80 내지 90:10의 범위인, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 코팅이 세포 배양에 사용되는, 중합체성 표면의 개질 방법. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 개질된 중합체성 표면을 포함하는 세포 배양 플레이트. |
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| 说明书全文 |
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| 샘플 | O/C | N/C |
| PS (Nunclon TM Δ) | 0.079 | 0.000 |
| PS-AAM | 0.258 | 0.273 |
| PS-PEGMA-OH | 0.464 | 0.000 |
| PS-PEGMA-OMe | 0.416 | 0.000 |
| PS-NIPAM | 0.131 | 0.095 |
실시예 2
낮은 단백질 결합 특성을 나타내는 코팅의 UV 그라프트 중합
파트 A: 인간 혈청 알부민(HSA)의 유로퓸 태깅
하기 방법을 사용하여 유로퓸 태깅된 인간 혈청 알부민(Eu-HSA)을 제조하였다. 델피아 유로퓸 표지 시약(Perkin Elmer)을 사용하여 4 ℃(pH 9.3)에서 밤새 HSA(Sigma, 99%, 본질적으로 지방산을 결여함)를 표지화하였다. Superdex 75(30/10) 크기 배제 칼럼(GE Healthcare)에서의 고속 단백질 액체 크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography; FPLC)(Akta Purifier, GE Healthcare)를 사용하여 과잉의 표지 시약으로부터 Eu-표지된 HSA를 분리한 후, Eu-HSA 용액 농도를 아미노산 분석(Waters Alliance HPLC)을 통해 결정하였다. 하기 방식으로 Eu:HSA 표지화비를 결정하였다. 먼저, 100 nM Eu 표준액 및 델피아 증강액(Delfia Enhancement Solution)(Perkin Elmer)의 다양한 희석액을 사용하여 다수의 Eu 표준액을 제조하였다. 그 후, PHERAStar 다중-웰 플레이트 리더(BMG Technologies, λ ex = 337 nm, λ em = 620 nm, 카운트 지연 60 μs, 카운트 시간 400 μs)를 사용하여 이들 용액의 100 ㎕ 알리코트로부터 시간 분해 형광 카운트를 얻었다. 공지 농도의 Eu-HSA 용액 및 Eu 표준으로부터 얻은 시간 분해 형광 카운트를 비교하여 4.2의 Eu:HSA 표지화비를 계산하였다.
파트 B: 플레이트 준비
실시예 1에 기재된 실험 절차에 따라 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)를 AAM 및 PEGMA-OMe 그라프트 중합체로 코팅하였다. 그 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-Q TM 물로 웰을 철저히 세척하고 마지막으로 공기 건조시켰다. 계속하여, Eu-HSA를 기본으로 하는 어세이를 이용하여 플레이트의 단백질 흡착량을 분석하였다.
파트 C: 단백질 흡착 어세이
UV 그라프트 중합(파트 B) 후에 인산 완충 식염수(PBS)중의 Eu-HSA 및 HSA(1:1500 몰비) 양자 모두의 용액을 함유하는 0.1 ㎤의 용액으로 각 웰을 충전하였다. 사용된 총 HSA 농도는 100, 10 및 1 μg/㎤였다. 웰을 실온에서 16시간 동안 인큐베이션하고, PBS 완충액을 사용하여 6회 세척한 다음 델피아 증강액(Perkin Elmer)으로 처리하여 흡착된 Eu-HSA로부터 Eu 원자를 해리시켰다. PHERAStar 다중-웰 플레이트 리더(BMG Technologies, λ ex = 337 nm, λ em = 620 nm, 카운트 지연 60 μs, 카운트 시간 400 μs)를 사용하는 시간 분해 형광을 통해 이런 방식으로 얻어진 용액을 분석하였다. 공지의 Eu 농도 용액을 사용하여 얻어진 표준 곡선과 이들 용액으로부터 얻어진 카운트를 비교하여 흡착된 단백질량을 정량하였다.
3가지 상이한 HSA 농도를 사용하여 수행된, 단백질 흡착 어세이로부터의 결과를 표 2에 나타내었다. 모든 단백질 농도에서, 상업적으로 구입가능한 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트[PS (Nunclon TM Δ)] 위에서 검출된 흡착량은 미처리 폴리스티렌 플레이트(PS, Nunc)와 AAM[PS (Nunclon TM Δ-AAM] 및 PEGMA-OMe[PS (Nunclon TM Δ)-PEGMA-OMe]를 사용한 UV 그라프트 중합에 의해 개질된 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트 위에서 검출된 양을 훨씬 초과하였다. AAM 및 특히 PEGMA-OMe 개질된 플레이트 위에서 검출된 소량의 단백질은 UV 그라프트 중합 방법이 낮은 단백질 결합 표면 코팅을 생성하는데 사용될 수 있음을 입증한다.
| 용액 내의 단백질 농도 (㎍·cm -3 ) | 100 | 10 | 1 |
| 흡착량(ng·cm -2 ) | |||
| PS(Nunclon TM Δ) | 1101.0 | 153.5 | 18.0 |
| PS | 149.5 | 16.5 | 3.2 |
| PS(Nunclon TM Δ)-AAM | 76.0 | 8.8 | 2.5 |
| PS (Nunclon TM Δ)-PEGMA-OMe | 23.7 | 3.9 | 1.5 |
실시예 3
낮은 세포 부착 특성을 지닌 코팅의 UV 그라프트 중합
파트 A: 플레이트 준비:
실시예 1에 기재된 방법에 따라 AAM, PEGMA-OH 및 PEGMA-OMe 단량체 용액을 사용하는 UV 그라프트 중합체로 24 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)를 코팅하였다. PEGMA-OH 및 PEGMA-OMe의 경우에, 용액을 글로브 박스로 옮기기 전에 저해제 제거 비드(Sigma)로 충전된 칼럼을 사용하여 단량체 용액으로부터 저해제를 제거하였다. 실시예 1에 따라 UV 그라프팅 및 후속의 Milli-Q TM 물에 의한 세정 후에, 공기 건조시키기 전에 적어도 72 시간 동안 플레이트를 다량의 Milli-Q TM 물에서 추출하였다.
파트 B: HeLa 세포를 사용한 세포 부착 어세이
세포 파종 전에 페니실린 및 스트렙토마이신(Gibco)을 각각 120 및 200 ㎍·cm -3 의 농도로 함유하는 멸균 PBS(1 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 실온에서 4시간 동안 표면 개질된 24 웰 플레이트를 멸균하였다. 그 후, HeLa 세포를 각각의 시험 웰에 2x10 5 세포/웰의 농도로 파종하고 5% CO 2 를 함유하는 가습된 공기중에서 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다. 사용된 배양 배지는 10% 소 태자 혈청(FBS)를 함유하는 DMEM/Hams F12(Gibco)였다. 20시간의 인큐베이션 후, 4가지 샘플 복제물(replicate)을 각각 배양 배지 내에서 500 ㎍/㎤로 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)(MTT)에 의해 처리하고 추가의 4시간 동안 인큐베이션하여 24 웰 조직 배양 폴리스티렌(Nunclon TM Δ, Nunc) 대조군 표면에 대한 세포 부착의 정량적 수치를 얻었다. 대조군 표면 위의 세포 부착을 100%로 설정하고 다른 모든 표면 위의 부착을 대조군 표면 위 부착의 퍼센트로 표시하였다. 4시간의 인큐베이션 단계 후에 MTT 함유 용액을 웰에서 제거하였다. 그 후, 웰을 멸균 PBS로 3회 세척한 다음 1 ㎤/웰의 DMSO를 사용하여 MTT 포르마잔 결정을 세포로부터 해리시켰다. 플레이트를 플레이트 진탕기 위에 위치시키고 15분간 부드럽게 진탕하여 결정이 용해되고 용액이 잘 혼합되도록 하였다. 그 후, λ= 595 nm 시험 파장 및 λ= 655 nm의 기준 파장에서의 광학 밀도를 측정하기 위해 각 웰로부터 100 ㎕ 샘플을 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 20 시간에, MTT의 첨가 직전, 세포를 위상차 현미경(Olympus IMT-2, 10 x 대물렌즈)으로 관찰하고 세포 부착의 대표적인 이미지를 디지털 방식으로 기록하였다.
표 3에 MTT 어세이로부터 얻은 결과를 나타내었다. 결과는 PS(Nunclon TM Δ) 대조군 표면 위의 세포 부착과 비교하여 AAM, PEGMA-OH 및 PEGMA-OMe UV 그라프트 중합체로 개질된 표면 위의 HeLa 세포 부착이 매우 낮은 수준으로 감소하였음을 명백히 보여준다. 이 결과는 도 2a 및 도 2b에 나타낸 위상차 이미지에 의해서 추가로 뒷받침되었다. 이때, 20시간 후 AAM, PEGMA-OH 및 PEGMA-OMe UV 그라프트 중합체 코팅 위에서 관찰된 HeLa 세포의 외관은 유사하여, 표면 위에 부착되지 않았거나 느슨하게 부착된 응집 세포, 진탕 또는 헹굼에 의해 표면으로부터 쉽게 제거되는 둥근 세포들이었다. 예를 들어, 도 2a는 AAM 개질된 표면 위의 HeLa 세포의 대표적인 이미지를 제시한다. 비교하면, PS(Nunclon TM Δ) 대조군 표면 위에서 이 배양 피리오드 후에 HeLa 세포는 단단하게 부착되고 잘 퍼져있는 것으로 보였다(도 2b).
TM Δ) 대조군 표면 위에서 얻어진 것에 대해 정규화하였다.
| 샘플 | % 세포 부착 | sd |
| PS(Nunclon TM Δ)-AAM | 2.30 | 0.30 |
| PS(Nunclon TM Δ)-PEGMA-OH | 0.82 | 0.71 |
| PS(Nunclon TM Δ)-PEGMA-OMe | 0.52 | 0.08 |
| PS (Nunclon TM Δ) | 100.00 | 3.28 |
실시예 4
아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 코팅의 UV 그라프트 중합 및 후속의 활성화 및 아민 공유 결합
파트 A: AA 및 AAM 코팅의 UV 그라프팅
실시예 1에 기재한 바와 같이, 글로브 박스 내에서 15분을 초과하여 질소로 퍼지함으로써 5%(w/v)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 수용액을 탈기하였다. 그 후, 용액들을 혼합하여 5%, 10%, 20% 및 50%(v/v) AA 단량체를 함유하는 AAM 단량체 용액을 얻었다. 이 방식으로 만든 용액을 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다(웰당 0.15 ㎤).
여전히 글로브 박스 안에서, 상기 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 실시예 1에 기재한 바와 같이, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 30회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트의 웰을 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-Q TM 물로 철저히 세척하고 공기 건조시켰다. XPS 분석의 경우, 관심의 대상인 웰의 바닥은 절삭 공구를 사용하여 제거하였다.
도 3 및 표 4에 나타낸 데이터를 분석하면 단량체 혼합물의 UV 그라프트 중합이 성공적인 코팅을 초래하였음을 명백히 알 수 있다. 또한, 이들 결과는 적절한 단량체 혼합물을 선택함으로써 UV 그라프트 중합체 코팅의 조성이 제어될 수 있음을 입증한다. 단량체 공급물 내의 AA 비율을 증가시켜 제조한 코팅의 XPS 스펙트럼(도 3 참조)에서는 코팅 내의 (AA 단량체로부터의) 카복실산 작용기에서 유래한 C5 구성요소로부터의 기여가 증가하였다. 5% AA의 단량체 조성에서는 (AAM 단량체로부터의) 아미드 결합에서 유래한 C4 시그널이 우세한 반면, 50% AA의 단량체 조성에서는 C4 및 C5 시그널이 거의 대등한 강도를 나타내었다.
| 단량체 조성 | C1+C2 | C3 | C4 | C5 |
| 5% AA | 77.7 | 0.8 | 20.8 | 0.6 |
| 10% AA | 73.0 | 0.2 | 25.2 | 1.6 |
| 20% AA | 71.1 | 1.0 | 17.7 | 7.0 |
| 50% AA | 73.5 | 0.42 | 11.6 | 14.5 |
표 5에 나타낸 원소비는 이들 결과를 확인해준다. 단량체 공급물 내의 AA 함량을 증가시키면, 공중합체 코팅 내에 존재하는 산소량이 증가하는 반면 질소 함량은 감소하였다.
| 단량체 조성 | O/C | N/C |
| 5% AA | 0.288 | 0.228 |
| 10% AA | 0.317 | 0.233 |
| 20% AA | 0.329 | 0.182 |
| 50% AA | 0.425 | 0.109 |
파트 B: 카복실산 표면 작용기의 NHS 활성화
Milli-Q TM 물 내에 0.125 M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 및 0.125 M N -하이드록시석신이미드(NHS)를 함유하는 용액을 준비하고, 파트 A에 기재된 바와 같이 준비된 플레이트의 각 웰 내로 0.05 ㎤를 넣었다. 용액은 제조 직후에 웰에 첨가하였다. 20 분간 인큐베이션한 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)에서 Milli-Q TM 물을 사용하여 웰을 3회 세척하고 질소 스트림을 사용하여 건조시켰다. 그 후, NHS 활성화 플레이트를 후속 반응에 즉시 사용하였다.
파트 C: NHS 활성화 그라프트 중합체 코팅 위의 아민의 공유 고정화
0.1 M TFEA 용액을 Milli-Q TM 물을 사용하여 제조한 다음, 이의 0.05 ㎤ 알리코트들을 파트 B에 기재된 바와 같이 금방 준비된 플레이트의 각 웰 내로 옮겼다. 24 시간의 인큐베이션 후, Milli-Q TM 물을 사용하여 웰을 철저하게 세척하고, 공기 건조시키고, XPS로 분석하였다.
AA 함량을 증가시킴에 따라 얻어진 F/C 비의 증가(표 6)는 NHS에 의한 아크릴산의 활성화가 성공적이며 이런 방식으로 제조된 NHS 활성화 표면이 아민 함유 분자에 대해 매우 반응성임을 입증하였다.
| 단량체 조성 | O/C | N/C | F/C |
| 5% AA | 0.286 | 0.249 | 0.008 |
| 10% AA | 0.260 | 0.221 | 0.035 |
| 20% AA | 0.285 | 0.216 | 0.058 |
| 50% AA | 0.366 | 0.175 | 0.243 |
실시예 5
PEGMA-OH 코팅의 UV 그라프트 중합 및 후속의 활성화 및 아민의 공유 결합
1 cm x 1 cm의 크기를 지닌 Si-ALAPP 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였다. 실시예 1에 따라, Milli-Q TM 에서 5%(w/v) PEGMA-OH 용액을 제조하고, 글로브 박스 내에서 30분간 질소로 퍼지하여 탈기시켰다. 글로브 박스 안에서, 24 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)의 각 웰로 Si-ALAPP 웨이퍼 및 0.6 ㎤의 PEGMA-OH 용액을 첨가하였다.
여전히 글로브 박스 내에서, Si-ALAPP 샘플 및 PEGMA-OH 단량체 용액을 함유하는 24 웰 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음, 글로브 박스에서 빼내었다. 실시예 1에 기재한 바와 같이, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 20회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트에서 샘플을 제거하고, Milli-Q TM 물로 철저히 세척하고 공기 건조시켰다. 샘플을 무수 DMSO 중의 0.5 M 카보닐 디이미다졸(CDI) 용액 내에 2 시간 동안 담그었다. 그 후, 샘플을 Milli-Q TM 물로 헹군 다음, 7일 동안 PBS 완충액(pH 7.4) 중의 0.1 M TFEA 용액에 담그었다. 마지막으로 샘플을 Milli-Q TM 물로 세척하고, 공기 건조시키고 XPS로 분석하였다.
PEGMA-OH의 UV 그라프트 중합 후에, 표 7의 데이터로부터 관찰될 수 있는 바와 같은 ALAPP 코팅으로부터 질소 시그널의 완전한 감쇠는 10 nm(XPS 샘플링 깊이)를 초과하는 두께로 성공적인 코팅이 이루어졌음을 나타낸다. PEGMA-OH 기의 OH기가 CDI와 반응한 후, N/C 비의 증가가 관찰되었는데(표 7), 이는 성공적인 표면 활성화 반응을 입증한다. 마지막으로 TFEA와 CDI 활성화 표면의 반응 후 불소의 존재(표 7)는 이런 방식으로 제조된 표면의 아민 함유 분자에 대한 반응성을 입증하였다.
| 샘플 | O/C | N/C | F/C |
| Si-ALAPP-PEGMA-OH | 0.468 | 0.000 | 0.000 |
| Si-ALAPP-PEGMA-OH-CDI | 0.453 | 0.032 | 0.000 |
| Si-ALAPP-PEGMA-OH-CDI-TFEA | 0.458 | 0.018 | 0.018 |
실시예 6
열-대응성(thermo-responsive) 코팅의 경우 NIPAM 코팅의 UV 그라프트 중합
파트 A: NIPAM 코팅의 UV 그라프팅
조직 배양 폴리스티렌 플레이트(4 웰, Nunclon TM Δ, Nunc)을 수령한 대로 사용하였다. 실시예 1에 따라 N -이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 단량체를 사용하여 이들 기판 위에 UV 그라프트 중합체 코팅을 수행하였다. 질소 분위기 하의 글로브 박스에서, 5%(w/v)의 NIPAM 용액을 Milli-Q TM 물에서 제조하고 30분간 질소로 퍼지하였다. 이 단량체 용액의 알리코트(0.6 ㎤)들을 4 웰 플레이트의 각 웰 내로 옮겼다. 여전히 글로브 박스 내에서, 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음, 글로브 박스에서 빼내었다. 실시예 1에 따라, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 20회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트를 Milli-Q TM 물로 5회 세척한 다음, 플레이트를 다량의 Milli-Q TM 물에 72시간 동안 담그었다. 마지막으로 표면 개질된 플레이트를 공기 건조시켰다.
파트 B: NIPAM 그라프트 중합체 개질된 세포 배양 기판 위의 L929 세포 부착
10% 소 태자 혈청(FBS) 및 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 개질된 이글스 배지(modified Eagles medium)에서 마우스 섬유아세포(L929)를 배양하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 2%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(안티-안티, Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.8 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 플레이트의 웰을 멸균하였다. 2x10 5 세포/웰의 파종 밀도로 NIPAM UV 그라프트 중합체 개질된 4 웰 플레이트(파트 A에 기재됨)에 L929 세포를 파종하였다. 24 시간의 인큐베이션 후에, 플레이트를 가열된 현미경 스테이지 위에서 37 ℃의 온도로 유지하면서 대표적인 샘플의 세포 부착 위상차 이미지를 얻었다. 그 후, 가열된 스테이지를 제거하고 플레이트를 20 ℃로 냉각시켰다. 가열된 스테이지를 제거한 지 30 분 후에 다른 이미지를 기록하였다. 37 ℃ 및 20 ℃에서 얻은 위상차 이미지를 각각 도 4a 및 도 4b에 나타내었다. 37 ℃에서 얻은 이미지(도 4a)의 세포는 부착성이고 잘 퍼진 형태를 나타낸 반면, 20 ℃에서 얻은 이미지(도 4b)의 세포는 둥근 형태이고 표면으로부터 쉽게 세척될 수 있다. 이들 세포 배양 결과는 NIPAM UV 그라프트 중합체 코팅의 열-대응성 성질을 입증하며, 이는 생리학적 온도(37 ℃)에서의 세포-부착 특성 및 실온(20 ℃)에서의 비-세포 부착 특성으로 이어진다.
파트 C: NIPAM 그라프트 중합체 개질된 세포 배양 기판 위의 MSC 부착
표준 방법론을 사용하여 인간 골수 천자로부터 간엽성 줄기 세포(MSC)를 분리하였다. 즉, 골수를 먼저 밀도 구배(1.077 gms/100 ㎤)에 따라 분리하고 저밀도 분획을 수집하고, PBS에서 세척한 다음 세포를 20% FBS가 보충된 α-MEM 배지에 재현탁시켰다(예비-선별된 배치). 그 후, 세포를 약 5x10 5 세포/㎤의 밀도로 T-플라스크에 가하고 37 ℃에서 2-3 일간 인큐베이션하였다. 그 후, 비-부착성 분획을 제거한 다음, 신선한 배지 다음에 PBS를 사용하여 부드럽게 세척하여 부착성 MSC 만 남겼다. 신선한 알파-MEM 및 FBS를 첨가하고 세포를 7일간 배양하였다. EDTA와 Ca 및 Mg이 없는 PBS를 사용하여 이들을 분할하고(~1:3, 융합도(confluency)에 따라), 신선한 배지 및 혈청을 사용하여 다시 플레이팅하였다.
인간 MSC를 20% FBS 및 5 ng/㎤ 인간 재조합 FGF-2(Prospec)가 보충된 a-MEM 배지 내로 옮기고 NIPAM UV 그라프트 중합체 개질된 4 웰 플레이트(파트 A에 기재됨) 위에 1x10 5 세포/웰의 파종 밀도로 파종하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 2%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.3 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 플레이트의 각 웰을 멸균하였다. 37 ℃ 및 5% CO 2 의 가습된 인큐베이터에서 24 시간의 인큐베이션 후에, 플레이트를 온도 제어된 현미경 스테이지 위에서 37 ℃의 온도로 유지하면서 웰의 대표적인 영역에 대한 세포 부착의 위상차 이미지를 얻었다. 그 후, 온도 제어된 스테이지를 제거하고 플레이트를 20 ℃로 냉각시켰다. 가열된 스테이지를 제거한 지 30 분 후에 다른 이미지를 기록하였다. 37 ℃ 및 20 ℃에서 얻은 위상차 이미지를 각각 도 5a 및 도 5b에 나타내었다. 37 ℃에서 얻은 이미지(도 5a)의 세포는 부착성이고 잘 퍼져 있으며 거의 융합되어 있는 반면, 20 ℃에서 얻은 이미지(도 5b)의 세포는 응집되어 있고 일부 영역에서 표면으로부터 들어올려져 있다. 이들 인간 MSC 배양 결과는 다시금 NIPAM UV 그라프트 중합체 코팅의 열-대응성 성질을 입증하며, 이는 생리학적 온도(37 ℃)에서의 세포-부착 특성 및 실온(20 ℃)에서의 비-세포 부착 특성으로 이어진다.
실시예 7
마이크로입자에서 열-대응성 코팅의 경우 NIPAM 코팅의 UV 그라프트 중합
파트 A: 마이크로캐리어 입자에서 NIPAM 코팅의 UV 그라프팅
조직 배양 폴리스티렌 플레이트(24 웰, Nunclon TM Δ, Nunc)을 수령한 대로 사용하였다. 이들 플레이트의 각 웰에 50 mg의 MicroHex TM 마이크로캐리어 입자(Nunclon TM Δ, Nunc)를 첨가하였다. 실시예 1에 따라 N -이소프로필아크릴아미드(NIPAM) 단량체를 사용하여 마이크로캐리어 입자 위에 UV 그라프트 중합체 코팅을 수행하였다. 간단히 서술하면, 질소 분위기 하의 글로브 박스에서, 5%(w/v)의 NIPAM 용액을 Milli-Q TM 물에서 제조하고 30분간 질소로 퍼지하였다. 이 단량체 용액의 알리코트(0.6 ㎤)들을 마이크로입자를 함유하는 24 웰 플레이트의 각 웰 내로 옮겼다. 여전히 글로브 박스 내에서, 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음, 글로브 박스에서 빼내었다. 실시예 1에 따라, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 20회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 부드럽게 진탕하고 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 마이크로입자를 Milli-Q TM 물로 10회 세척하고, 원심분리하고, 각각의 세척 단계 후 마이크로입자를 재현탁시켰다. 마지막으로 표면 개질된 마이크로입자를 다량의 Milli-Q TM 물에 72시간 동안 인큐베이션한 다음, 진공하에 건조시켰다.
NIPAM UV 그라프트 중합 전후에 MicroHex TM 마이크로캐리어 입자를 XPS에 의해 분석하였다. 표 8에 나타낸 결과의 분석은 표면 코팅 절차가 성공적이었음을 입증하였다. 특히, 계산된 N/C 비율의 증가는 마이크로캐리어 입자 표면 위에 그라프트 중합체 층이 존재함을 나타내었다.
TM 마이크로캐리어 입자(Nunclon
TM Δ, Nunc)에 대해 얻어진 XPS 조망 스펙트럼으로부터 계산된 원소비
| O/C | N/C | ||
| MicroHex TM | 0.166 | 0.001 | |
| MicroHex TM -NIPAM | 0.157 | 0.123 | |
파트 B: NIPAM 그라프트 중합체 개질된 마이크로캐리어 입자 위의 L929 세포 부착
10% 소 태자 혈청 및 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 개질된 이글스 배지(MEM)에서 마우스 섬유아세포(L929)를 배양하였다. 실시예 3에 따라 비-세포 부착성 PEGMA-OH UV 그라프트 중합체 코팅으로 개질된 4 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)의 웰에 함유된 NIPAM UV 그라프트 중합체 개질된 마이크로입자(파트 A에 기재됨) 위에 L929 세포를 파종하였다. 각 웰은 0.1 ㎤의 포장된(packed) 표면 개질된 입자를 함유하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 각각 2%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.6 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 표면 개질된 마이크로캐리어 입자를 멸균하였다. 세포 파종 밀도는 2x10 4 세포/웰이었다. 24 시간의 세포 배양 피리오드 후, 플레이트를 가열된 현미경 스테이지 위에서 37 ℃의 온도로 플레이트를 유지하면서 대표적인 샘플의 세포 부착 위상차 이미지를 얻었다. 그 후, 가열된 스테이지를 제거하고 플레이트를 20 ℃로 냉각시켰다. 가열된 스테이지를 제거한 지 30 분 후에 다른 이미지를 기록하였다. 37 ℃ 및 20 ℃에서 얻은 위상차 이미지를 각각 도 6a 및 도 6b에 나타내었다. 37 ℃에서 얻은 이미지(도 6a)의 세포는 부착성이고 부분적으로 잘 퍼진 형태를 나타낸 반면, 20 ℃에서 얻은 이미지(도 6b)의 세포는 둥근 형태이고 표면으로부터 쉽게 세척 제거될 수 있다. 이들 세포 배양 결과는 마이크로입자 위의 열-대응성 NIPAM UV 그라프트 중합체 코팅의 효과를 입증하며, 이는 생리학적 온도(37 ℃)에서의 세포-부착 특성 및 실온(20 ℃)에서의 비-세포 부착 특성으로 이어진다.
실시예 8
3-차원 기판 위의 코팅의 평탄성(evenness)
조직 배양 폴리스티렌 플레이트(96 웰, Nunclon TM Δ, Nunc)를 수령한 대로 사용하였다. 실시예 1에 따라 AAM 단량체를 사용하여 이들 플레이트 위의 UV 그라프트 중합체 코팅을 얻었다. 간략히 설명하면, 글로브 박스(< 0.2% 산소를 함유하는 질소 분위기하) 내에서, 250 mg의 AAM을 5 ㎤ Milli-Q TM 물에 용해시키고 용액을 10분 동안 질소를 사용하여 퍼지시켜 잔류 산소를 제거하였다. 96 웰 플레이트의 각 웰을 0.15 ㎤의 단량체 용액으로 충전하였다. 글로브 박스 내에서 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 플레이트를 진공 밀봉한 후, UV 램프(λ~200-450 nm, 최대 강도 360-390 nm, 램프 길이 15 cm, 출력 1.8 kW, FUSION systems) 밑을 이동하는 컨베이어 벨트 위에 플레이트를 위치시켰다. 평균 벨트 속력을 1.8 m·min -1 으로 유지하여 통과당 약 4 초의 조사 시간이 되도록 하였다. 30회의 통과 중에 진공 밀봉된 플레이트를 UV 조사에 노출시켰다. 각각의 통과 후에 플레이트 배향을 90도씩 회전시켰다. 그 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-Q TM 물로 웰을 철저하게 세척하고 마지막에는 공기 건조시켰다. XPS 분석의 경우, 96 웰 플레이트 상의 선택된 웰의 바닥 및 벽면은 절삭 공구를 사용하여 제거하였다.
표 9에는 대표적인 웰의 상이한 영역에서의 UV 그라프트 중합 후에 XPS 분석에 의해 얻은 원소비를 나타내었다. 웰이 UV 그라프트 중합 중에 0.15 ㎤의 단량체 용액으로 충전되었으므로, 벽면 상부를 제외하고 웰의 모든 영역이 코팅될 것으로 예상되었다. 이 예상은 표 9에 나타낸 결과에 의해 확인되었다. 벽면의 상부(상부로부터 약 2 mm)에서 얻어진 O/C 및 N/C 비는 다른 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 샘플(Nunclon TM Δ, Nunc)에서 얻어진 것(표 1 참조)과 유사하였는데, 이는 플레이트의 이 부분이 UV 그라프트 중합 공정에 의해 영향을 받지 않았음을 시사한다. 그러나, 벽면의 개질되지 않은 상부와 비교하여 각각의 다른 영역의 경우 관찰된 O/C 및 N/C 비에 있어서의 유의한 변화는 각 경우에 성공적인 AAM 그라프트 중합체 코팅을 시사한다. 또한, 웰의 바닥, 벽면의 하부(바닥으로부터 약 2 mm) 및 웰의 중간 부분(벽면의 중간까지 올라간 곳)으로부터 얻어진 원소비는 이론적으로 예상된 값에 근접한, 유사한 O/C 및 N/C 값을 보였는데, 이는 웰의 표면 개질된 영역 전반에 걸쳐 10 nm(XPS 샘플링 깊이)를 초과하는 평평한 코팅 두께를 시사한다.
| 영역 | O/C | N/C |
| 웰의 바닥 | 0.259 | 0.259 |
| 벽면(바닥) | 0.259 | 0.248 |
| 벽면(중간) | 0.259 | 0.255 |
| 벽면(상부) | 0.085 | 0.010 |
실시예 9
96 웰 기판 위의 AA 및 AAM 코팅의 UV 그라프트 공중합, 펩티드의 공유 고정화 및 세포 반응에 대한 효과
파트 A: AA 및 AAM 공중합체 코팅의 UV 그라프팅
실시예 1에 따라, 글로브 박스 내에서 15분을 초과하여 질소로 퍼지함으로써 5%(w/v)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 수용액을 탈기하였다. 10%(v/v) AA 및 90%(v/v) AAM 단량체 용액을 혼합함으로써 이들로부터 용액을 제조하였다(10% AA). 이 방식으로 제조된 용액을 96 웰 플레이트의 웰로 옮겼다(웰당 0.15 ㎤).
여전히 글로브 박스 안에서, 상기 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 실시예 1에 기재한 바와 같이, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 30회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트의 웰을 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)를 사용하여 Milli-Q TM 물로 철저히 세척하고 공기 건조시켰다.
파트 B: 카복실산 표면 작용기의 NHS 활성화 및 cRGD의 공유 고정화
Milli-Q TM 물 내에 0.125 M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 및 0.125 M N -하이드록시석신이미드(NHS)를 함유하는 용액을 준비하고, 파트 A에 기재된 바와 같이 준비된 10% AA 개질된 96 웰 플레이트의 각 웰 내로 0.05 ㎤를 넣었다. 용액은 제조 직후에 웰에 첨가하였다. 20 분간 인큐베이션한 후, 플레이트 세척기(Thermo Wellwash 4 MK 2)에서 Milli-Q TM 물을 사용하여 웰을 3회 세척하였다. 그 후, NHS 활성화 플레이트를 후속 반응에 즉시 사용하였다.
트리-아미노산 모티프인 아르기닌-글리신-아스파르트산( c (RGDfK), Peptides International)을 함유하는 NC 말단 폐환된 분자를 하기 방법에 따라 중합체 코팅에 공유적으로 부착시켰다. PBS 중의 200 ㎍/mL의 c (RGDfK)를 함유하는 용액의 알리코트(0.1 ㎤)를 상기 금방 제조된 NHS 활성화 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 4 ℃에서 밤새(15 h) 용액을 웰 내에서 인큐베이션한 후, 용액을 제거하고 웰을 PBS로 10회 세척하였다.
파트 C: 표면 개질된 96 웰 플레이트 위의 L929 세포 부착
10% 소 태자 혈청(FBS) 및 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 개질된 이글스 배지(MEM)에서 마우스 섬유아세포(L929)를 배양하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 각각 2%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.3 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 플레이트의 웰을 멸균하였다. 파트 B에 기재된 바와 같이 금방 제조된, 공유적으로 고정된 c (RGDfK)를 동반하는 플레이트의 웰 위에 L929 세포를 2x10 4 세포/웰의 파종 밀도로 파종하였다. 또한, NHS 활성화되지 않고 그 위에 c (RGDfK)가 공유적으로 고정되지도 않은 금방 제조된 플레이트의 웰에도 세포를 파종하였다. 20-22 시간의 인큐베이션 후, 대표적인 영역의 세포 부착 위상차 이미지를 얻었다. 얻어진 위상차 이미지를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. 공유적으로 고정된 c (RGDfK)를 함유하지 않은 샘플에 대해 얻은 이미지(도 7a)의 세포는 비-부착성이고 둥근 형태인 반면, c (RGDfK)가 공유적으로 고정된 샘플에 대해 얻은 이미지(도 7b)의 세포는 부착성이고 잘 퍼진 형태를 나타내었다. 이들 세포 배양 결과는 10% AA 및 90% AAM의 단량체 공급물로부터 형성되고 c (RGDfK)가 공유적으로 고정된 UV 그라프트 중합체 코팅의 세포 부착 특성 및 c (RGDfK)가 공유적으로 고정되지 않은 UV 그라프트 코팅의 비-세포 부착성을 입증한다.
실시예 10
MicroHex TM 기판 위의 AA 및 AAM 코팅의 UV 그라프트 공중합, 펩티드의 공유 고정화 및 세포 반응에 대한 효과
파트 A: 마이크로캐리어 입자 위의 AA 및 AAM 공중합체 코팅의 UV 그라프팅
조직 배양 폴리스티렌 플레이트(24 웰, Nunclon TM Δ, Nunc)을 수령한 대로 사용하였다. 이들 플레이트의 각 웰에 50 mg의 MicroHex TM 마이크로캐리어 입자(Nunclon TM Δ, Nunc)를 첨가하였다. 실시예 7에 따라 마이크로캐리어 입자 위에 UV 그라프트 중합체 코팅을 수행하였다. 간단히 서술하면, 질소 분위기 하의 글로브 박스에서, 5%(w/v)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 수용액을 15분 초과의 시간동안 질소로 퍼지하여 탈기시켰다. 10%(v/v)의 AA 및 90%(v/v)의 AAM 단량체 용액을 혼합함으로써 이들로부터 용액을 제조하였다(10% AA). 이 10% AA 단량체 혼합물의 알리코트(0.6 ㎤)들을 마이크로입자를 함유하는 24 웰 플레이트의 각 웰 내로 옮겼다. 여전히 글로브 박스 내에서, 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음, 글로브 박스에서 빼내었다. 실시예 1에 따라, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems) 아래로 30회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 부드럽게 진탕하고 90도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 마이크로입자를 Milli-Q TM 물로 10회 세척하고, 원심분리하고, 각각의 세척 단계 후 마이크로입자를 재현탁시켰다. 마지막으로 표면 개질된 마이크로입자를 다량의 Milli-Q TM 물에 72시간 동안 인큐베이션한 다음, 진공하에 건조시키고, XPS 분석하였다.
표 10에 나타낸 XPS 분석 결과는 마이크로캐리어 입자 위의 그라프트 중합이 성공적이었음을 명백히 입증한다. O/C 및 N/C 원자비 양자 모두 그라프트 중합 반응 후에 증가한 것으로 관찰되었다. 상대적인 O/C 및 N/C 비의 비교는 AAM 및 AA 단량체 양자 모두를 함유하는 코팅을 보여주었다. 이는 고해상도 C 1s 스펙트럼(나타내지 않음)의 분석에 의해 확인되었다.
TM 마이크로캐리어 입자(Nunclon
TM Δ, Nunc)에 대해 얻어진 XPS 조망 스펙트럼으로부터 계산된 원소비
| O/C | N/C | ||
| MicroHex TM | 0.166 | 0.001 | |
| MicroHex TM -10% AA | 0.258 | 0.149 | |
파트 B: 카복실산 표면 작용기의 NHS 활성화 및 c(RGDfK)의 공유 고정화
Milli-Q TM 물 내에 0.125 M 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC) 및 0.125 M N -하이드록시석신이미드(NHS)를 함유하는 용액을 준비하고, 입자가 과량의 용액에 의해 덮이는 방식으로 10% AA 개질된 MicroHex TM 마이크로캐리어 입자와 함께 인큐베이션하였다. 용액은 제조 직후에 개질된 마이크로입자에 첨가하였다. 때때로 진탕하면서 20 분간 인큐베이션한 후, 원심분리에 의해 마이크로입자를 Milli-Q TM 물을 사용하여 3회 세척하고 Milli-Q TM 물에 재현탁시켰다. 그 후, NHS 활성화 마이크로입자를 후속 반응에 즉시 사용하였다.
트리-아미노산 모티프인 아르기닌-글리신-아스파르트산( c (RGDfK), Peptides International)을 함유하는 NC 말단 폐환된 분자를 하기 방법에 따라 중합체 코팅에 공유적으로 부착시켰다. PBS 중의 200 ㎍/mL의 c (RGDfK)를 함유하는 용액의 알리코트(0.6 ㎤)를 상기 금방 제조된 NHS 활성화 MicroHex TM 마이크로캐리어 입자를 함유하는 각 웰에 첨가하였다. 계속하여, 마이크로입자를 Milli-Q TM 물로 10회 세척하면서 원심분리하고, 각 세척 단계 후 마이크로입자를 재현탁시켰다. 마지막으로 표면 개질된 마이크로입자를 세포 배양 실험 전 72 시간 동안 다량의 Milli-Q TM 물에서 인큐베이션하였다.
파트 C: 표면 개질된 마이크로캐리어 입자 위의 L929 세포 부착
10% 소 태자 혈청 및 1% 비-필수 아미노산을 함유하는 개질된 이글스 배지(MEM)에서 마우스 섬유아세포(L929)를 배양하였다. 실시예 3에 따라 비-세포 부착성 PEGMA-OH UV 그라프트 중합체 코팅에 의해 개질된 4 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)의 웰 내에 각각 함유된 10% AA 개질된 마이크로입자(파트 A에 기재됨) 및 c (RGDfK) 개질된 마이크로입자(파트 B에 기재됨) 위에 L929 세포를 파종하였다. 세포 파종 전, 실온에서 2-4 시간 동안, 각각 1%(v/v)의 항생제-항진균제 용액(Gibco)을 함유하는 멸균 PBS(0.3 ㎤/웰, pH 7.4)를 첨가하여 마이크로캐리어 입자를 멸균하였다. 각 웰은 0.1 ㎤의 포장된 표면 개질된 입자를 함유하였다. 세포 파종 밀도는 2x10 4 세포/웰이었다. 20-22 시간의 세포 배양 기간이 지난 후, 각 샘플에 대한 대표적인 영역의 세포 부착 위상차 이미지를 얻었다. 얻어진 위상차 이미지를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다. 공유적으로 고정된 c (RGDfK)를 함유하지 않은 샘플에 대해 얻은 이미지(도 8a)의 세포는 비-부착성이고 둥근 형태인 반면, c (RGDfK)가 공유적으로 고정된 샘플에 대해 얻은 이미지(도 8b)의 세포는 부착성이고 잘 퍼진 형태를 나타내었다. 이들 세포 배양 결과는 10% AA 및 90% AAM의 단량체 공급물로부터 형성되고 c (RGDfK)가 공유적으로 고정된 UV 그라프트 중합체 코팅의 세포 부착 특성 및 c (RGDfK)가 공유적으로 고정되지 않은 UV 그라프트 코팅의 비-세포 부착성을 입증한다.
실시예 11
중합체 그라프팅: 연속적 대 단속적 UV 조사
파트 A: 코팅의 제조
규소 웨이퍼(Si)를 약 7 x 7 mm 치수의 정사각형으로 절단하고, 2%(v/v) RBS-35 ? 계면활성제 용액에서 초음파 세정하고, 에탄올로 헹구고, Milli-Q TM 물을 사용하여 철저히 헹군 다음, 정제 질소 하에 건조시켰다. Si 웨이퍼 조각을 사용 직전에 60분간 ProCleaner TM 기구(Bioforce Nanoscience, USA)에서의 UV/오존 처리에 의해 추가로 세정하였다. 라디오-주파수 글로 방전(radio-frequency glow discharge; RFGD) 기술을 이용하여 알릴아민 단량체로부터의 아민 작용성을 지닌 가교된 중합체성 박막을 Si 웨이퍼 조각 위에 침착시켰다. 반응 챔버를 < 0.003 mbar의 압력까지 완전히 비운 다음 알릴아민 증기로 충전하여 서서히 0.200 mbar의 압력으로 상승시켰다. 이때, 200 kHz의 주파수 및 20 W의 부하 전력으로 25초간 전극에 전압을 적용하였다. 그 후, 생성된 알릴아민 코팅(Si-ALAPP)을 추가로 사용하기 전에 Milli-Q TM 물에서 헹구었다.
N 2 글로브 박스 안에서 10%(w/v)의 농도로 H 2 O에서 AAM 용액을 제조하고 N 2 를 사용하여 60분간 퍼지하였다. 그 후, AAM 용액을 Si-ALAPP 샘플에 적용하여 AAM 용액이 3 mm 깊이가 되도록 하고 국내 진공 식품 저장 시스템(Sunbeam)을 사용하여 폴리프로필렌 백 내로의 산소 유입에 대해 밀봉하였다. 밀봉된 샘플을 N 2 글로브 박스에서 빼내고 고전력 UV 램프(Fusion Systems FS300s with 9 mm D-bulb)에 의해 발생한 UV 방사선에 노출시켰다. 보통의 작업에서, 샘플을 컨베이어(Fusion UV Systems, Inc. LC6B Benchtop Conveyor) 상의 램프 아래로 통과시키고, 각각의 통과는 2849(UVA), 822(UVB), 81.5(UVC), 및 2922(UVV) mJ/㎠(휴대용 UV 계측기(EIT UV Power Puck II)를 사용하여 측정됨)를 유발하였다. 이들 수치를 알게 됨으로써 상이한 공정 프로토콜에 대한 UV 방사선량을 동등하게 할 수 있었다. 시험된 프로토콜은 1) 단속적(벨트 위에서 22회 통과), 2) 단속적 + 지연(22회 통과 및 각 통과 사이에 30초 지연), 및 3) 연속적(22회 통과와 동등한 UV 방사선량을 전달하는 시간동안 램프 아래의 장소에 샘플을 고정시킴)이었다. 목적하는 UV 방사선 노출 후, 샘플을 넉넉한 물로 세척한 다음 여과되고 정제된 질소 스트림 하에 건조시키고 분석하였다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고 얻어진 결과를 표 11에 나타내었다. RFGD 박막 침착(Si-ALAPP) 후, 샘플의 조성은 이런 종류의 코팅에 대해 예상된 바와 같이 C 및 N이 풍부하였다. AAM 단량체 용액에서 샘플의 연속적 조사 후, O 및 N 양자 모두의 원자 퍼센트는 주로 폴리아크릴아미드를 포함하는 그라프트 중합체 코팅과 일치하게 증가하였다(PAAM 이론적 조성과 비교하여). 단속적 방식 및 단속적 + 지연 방식으로 AAM 단량체 용액의 존재하에 샘플을 조사한 것도 그라프트 폴리아크릴아미드 코팅에 대해 이론적으로 예상된 것과 부합하는 코팅을 생성하였다. 고해상도 C 1s 스펙트럼(나타내지 않음)은 3가지 모든 경우에 폴리아크릴아미드 코팅의 존재를 확인해주었다. 두께가 XPS 기술의 분석 깊이(5 - 10 nm) 미만이 아니면 일반적으로 XPS 기술에 의해 코팅의 두께를 추산하는 것은 가능하지 않다.
| 샘플 | C (at. %) | O (at. %) | N (at. %) | O/C | N/C |
| PAAM(이론적) | 60.7 | 19.7 | 19.7 | 0.33 | 0.33 |
| Si-ALAPP | 76.8 | 12.6 | 10.4 | 0.16 | 0.14 |
| 연속적 | 64.6 | 18.3 | 17.1 | 0.28 | 0.27 |
| 단속적 | 62.3 | 18.8 | 16.8 | 0.30 | 0.27 |
| 단속적 + 지연 | 60.4 | 19.6 | 16.9 | 0.32 | 0.28 |
조사중인 3가지 조건을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 두께를 추산하기 위하여, 프로필로메트리(profilometry)를 사용하였다. 이 경우에, 주사기 바늘의 팁을 사용하여 코팅된 샘플을 스크래칭하여 아래의 Si 웨이퍼를 노출시켰다. 그 후, 다양한 스크래치/위치에 대해 프로필로미터(Dektak by Veeco)를 사용하여 스크래치의 깊이를 측정하고 Si-ALAPP 기판 표면과 비교하였다. 중복된 프로필로메트리 실험 결과를 표 12에 나타내었다. Si-ALAPP 샘플의 두께(전형적으로 25-30 nm 두께)에 대한 데이터는 포함되어 있지 않다. 그라프트 중합체 코팅에 대한 두께 데이터는 Si-ALAPP 기판의 표면을 기준으로 하였다.
표 12의 데이터는 제조된 코팅의 건조 두께가 연속적 < 단속적 < 단속적 + 지연의 순서로 증가하였음을 명백히 보여주었다. 분명히, 연속적 UV 조사를 사용하여 생성된 코팅의 건조 두께는 단속적 UV 조사 조건 하에 생성된 2가지 코팅보다 유의적으로 적었다. 또한, 단속적 + 지연 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅이 단속적 UV 조사에 의해 만들어진 코팅에 비해 유의적으로 더 두꺼웠다.
세포 배양 응용의 경우에, 생성된 코팅의 수화 두께는 건조 두께보다 더 관계가 있다. 코팅의 수화 두께를 추산하기 위하여, 원자간력 현미경(Atomic Force Microscope; AFM) 기술을 이행하였다. 이때, 실리카 콜로이드 입자(직경 ~ 4 ㎛)를 외팔보 스프링(cantilever spring)에 접착시켜(Epon 1004, Shell) 공지 기하형태(예: 구형)의 탐침을 제공하였다. 그 후, 인산 완충 식염수(PBS)(pH 7.4) 용액 중의 실리카 콜로이드와 그라프트 중합체성 코팅 사이의 상호작용을 분리 거리의 함수로 측정하였다. 실리카 콜로이드가 코팅과 접촉함에 따라, 반발력이 발생하며, 그 범위는 코팅의 수화 두께를 추산할 수 있게 한다. 액세포(fluid cell) 내부에 장착된 샘플 위의 여러 위치에서 MFP-3D AFM(Asylum Research, Santa Barbara, CA)을 사용하여 상호작용력을 측정하였다. 외팔보(cantilever)의 스프링 상수는 문헌(Cleveland, J. et al., (1993), Rev. Sci. Instrum., 64, 403-5)의 공명법을 사용하여 결정하였고, 실리카 입자의 반경은 광학 현미경 검사를 사용하여 결정하였다. 이동한 피에조(piezo) 거리의 함수로서의 외팔보 굴절을 MFP-3D 소프트웨어를 사용하여 분리 거리의 함수로서의 힘에 대해 기준화하였다. 비-압축성 표면, 예컨대 Si 웨이퍼 조각을 사용하여 기준 측정을 수행하였고, 강성 접촉에서 굴절의 반대 기울기를 사용하여 광검출기를 보정하였다.
| 샘플 | 건조 두께 (nm) | 수화 두께 (nm) | 팽윤비 | 탄성률 (Pa) |
| 연속적 | 136 ± 38 | 708 ± 20 | 5.2 | 200 |
| 단속적 | 231 ± 11 | 4056 ± 155 | 17.5 | 90 |
| 단속적 + 지연 | 302 ± 10 | 5549 ± 288 | 18.3 | 90 |
표 12에 나타낸 연속적, 단속적 또는 단속적 + 지연 UV 조사 조건을 사용하여 제조된 그라프트 중합체성 코팅에 대한 수화 두께 데이터를 분석하면 연속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅이 단속적 UV 조사 조건을 사용하여 제조된 2가지 코팅보다 유의적으로 더 얇은 것을 명백히 알 수 있다. 또한, 단속적 + 지연 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅이 단속적 UV 조사에 의해 만들어진 코팅보다 유의적으로 더 두꺼웠다.
3가지 코팅의 팽윤비(표 13 참조)를 분석하면, PBS 용액을 사용하여 수화되는 경우 단속적 UV 조사에 의해 만들어진 코팅이 연속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅보다 훨씬 더 팽윤할 수 있는 것으로 나타났다. 이는 필시 코팅 내부의 가교도 때문이다. 연속적 UV 조사는 4 공정을 유발할 것이다: (i) 자유 라디칼 형성, (ii) 쇄 절단, (iii) 가교 반응, 및 (iv) 중합체 쇄 성장. 이들 4가지 공정은 단속적 UV 조사를 사용하여 제조되는 그라프트 중합체성 코팅의 경우에도 일어날 것이지만, 4가지 공정의 상대적인 균형은 아마도 상이할 것이다. 양자의 경우에 자유 라디칼 형성이 동일하다고 가정하면, 단속적 UV 조사는 연속적 경우에 비해 샘플이 UV를 사용하여 조사되지 않을 때 더 많은 중합체 성장을 유발하고, 코팅 내부에 더 적은 가교를 유발하여야 한다. 이 가정은 단속적 UV 조사를 사용하여 제조된 샘플의 경우에 건조 및 수화 두께 양자 모두가 더 크다는 것으로부터 증명된다. 연속적 UV 조사를 사용하여 제조된 샘플의 경우에 얻어진 팽윤비의 감소는 코팅 내부에 더 높은 정도의 가교가 있음을 시사한다. 동일한 정도의 가교와 함께 더 두꺼운 코팅들, 예컨대 단속적 UV 조사를 사용하여 제조된 코팅들은 매우 유사한 팽윤비를 나타낼 것이다. UV 조사가 없는 부가적인 시간(단속적 + 지연)은 중합체성 코팅 그라프트 층 두께를 증가시키는데 영향을 미치며, 이는 다시금 샘플이 조사되지 않을 때, 더 짧은 비-조사 시간(단속적)의 경우에 비해 더 많은 중합체 성장이 이루어지며, 연속적 UV 조사 조건에 비해 훨씬 더 많은 중합체 쇄 성장이 이루어짐을 시사한다.
표 12는 또한, AFM 직접 상호작용력 데이터를 분석하고 힘 곡선을 헤르츠 이론을 사용하여 생성된 모델 데이터에 맞게 조정함으로써 얻어진 3가지 코팅 조건에 대한 탄성률 값을 보고한다. 이때, 2가지 단속적 조건을 사용하여 생성된 코팅이 연속적 조사를 사용하여 제조된 것에 비해 약간 더 부드러운 것은 명백하다. 이 데이터는 단속적 UV 조사를 사용하여 만들어진 코팅 내부에 더 적은 가교가 존재한다는 가정을 뒷받침한다.
실시예 12
상이한 코팅 알키텍처에 대한 세포 반응
파트 A: UV 방사선의 단속적 노출을 사용하는, 개시제가 결여된 UV 그라프트 공중합체 코팅의 형성
실시예 1에 따라, 글로브 박스(산소 농도 <0.1%) 내에서 15분을 초과하여 질소로 퍼지함으로써 상이한 몰비(0-100%)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 단량체의 10%(w/v) 수용액을 탈기하였다. 그 후, 이 방식으로 제조된 용액들을 96 웰 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)의 웰로 옮겼다. 각 웰에 첨가된 단량체 용액의 부피는 0.07 ㎤였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 상기 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 약 1.8 m/분의 속력으로 컨베이어 벨트(Fusion Systems LC6B Benchtop Conveyor) 위에서 플레이트를 UV 램프(FUSION Systems FS300s, 9 mm D-bulb) 아래로 35회 통과시켰다. 각 통과 후 플레이트를 180도 돌려 더욱 균일한 UV 조사가 이루어지게 하였다. 그 후, 플레이트를 흐르는 Milli-Q TM 물로 철저히 세척한 다음, 실온에서 매일 물을 교체하면서 72 시간 동안 다량의 Milli-Q TM 물에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 마지막으로 다중웰 플레이트 샘플을 공기 건조시켰다.
파트 B: 거대-개시제를 기본으로 하는 UV 그라프트 공중합체 코팅의 형성
96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)를 문헌[Griesser HJ., Vacuum 39 (1989) 485]에 기재된 라디오 주파수 글로 방전 플라즈마 반응기 내로 도입하였다. 다중웰 플레이트의 베이스와 동일한 치수를 갖는 직사각형 구리 전극 위에 플레이트를 놓았다. 그 후, 20 W의 전력, 200 kHz의 주파수 및 0.33 mbar의 초기 단량체 압력에서 25 s 동안 알릴아민 플라즈마 중합체(ALAPP) 박막의 침착을 수행하였다.
계속하여, 실온에서 2시간 동안 1%(w/v)의 PI 농도로 3.8 mg/mL의 N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카보디이미드 하이드로클로라이드 (EDC)(Sigma)를 함유하는 90%(v/v) DMF(Merck) 및 10%(v/v) Milli-Q TM 물의 혼합물과 인큐베이션하여 문헌[L. Meagher, H. Thissen, P. Pasic, RA Evans, G. Johnson, WO2008019450-A1] 기재되고 사내 합성된 거대-개시제 폴리(아크릴산-코-디에틸-디티오카밤산 4-비닐-벤질 에스테르)(PI)를 아민 작용기화 다중웰 플레이트 표면에 공유 고정화하였다. 그 후, 플레이트를 90%(v/v) DMF(Merck) 및 10%(v/v) Milli-Q TM 물의 혼합물로 3회 및 Milli-Q TM 으로 3회 세척한 다음 공기 건조시켰다.
글로브 박스(산소 농도 <0.1%) 내에서 15분을 초과하여 질소로 퍼지함으로써 상이한 몰비(0-100%)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 단량체를 함유하는 10%(w/v) 수용액을 탈기하였다. 그 후, 이 방식으로 제조된 용액들을 PI 개질된 ALAPP에 의해 처리된 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트의 웰로 옮겼다. 각 웰에 첨가된 단량체 용액의 부피는 0.20 ㎤였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 상기 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉한 다음 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 플레이트를 UV 램프(Spectroline, model XX-15A) 밑에 놓고 6 시간 동안 주문 제작한 박스 내에서 10 mW/㎠의 강도로 연속적으로 조사하여 중합을 달성하였다. 그 후, 플레이트를 Milli-Q TM 물로 적어도 3회 철저히 세척한 다음, 실온에서 72 시간 동안 다량의 Milli-Q TM 물에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 마지막으로 다중웰 플레이트 샘플을 공기 건조시켰다.
파트 C: 코팅 조성의 특성조사 및 세포 반응
각각 2가지 상이한 UV 기반-코팅법을 사용하여 TCPS(파트 A) 또는 TCPS-ALAPP-PI(파트 B) 기판 위의 AA 및 AAM 용액을 사용하여 제조된 단일중합체 및 공중합체 코팅에 대해 X-선 광전자 분광법(XPS) 분석을 수행하였다. 얻어진 결과를 표 13 및 14에 나타내었다. 결과를 분석하면, 모든 경우에 코팅이 기판으로부터 성공적으로 성장하였음이 입증되었다. 개시제-결여 단속적 UV 코팅법에 의해 생성된 코팅에 대해 관찰된 O/C 및 N/C 원소비(파트 A)는 특정 단량체 용액으로부터 유래한 단일중합체성 또는 공중합체성 코팅에 대한 예상된 이론치에 근접하였는데, 이는 코팅 내의 AA 및 AAM 몰비가 단량체 공급액 내의 몰비와 유사함에 대한 증거가 된다. O/C 및 N/C 양자 모두의 비에 있어서도 명백한 경향이 관찰되었다. 거대-개시제 기반 UV 방법에 의해 제조된 코팅(파트 B)에 있어서도 동일한 경향이 관찰되었다. 그러나, 후자의 경우에 관찰된 원소비는 이 방법에 의해 달성된 코팅 두께의 감소로 인하여 예상된 이론치와 다소 상이하였으며, 이는 XPS 기술의 탐침 깊이 미만의 건조 두께를 나타내는 코팅을 초래하였다(즉, 일부 데이터는 코팅 및 기판 양자 모두로부터의 기여를 포함한다).
| 몰% AA | O/C | N/C |
| 0 | 0.299 | 0.281 |
| 5 | 0.301 | 0.256 |
| 10 | 0.339 | 0.230 |
| 15 | 0.341 | 0.224 |
| 20 | 0.366 | 0.212 |
| 25 | 0.396 | 0.201 |
| 30 | 0.399 | 0.187 |
| 40 | 0.414 | 0.170 |
| 50 | 0.505 | 0.131 |
| 55 | 0.455 | 0.134 |
| 60 | 0.453 | 0.140 |
| 70 | 0.510 | 0.076 |
| 85 | 0.562 | 0.045 |
| 100 | 0.566 | 0.033 |
| 샘플 | O/C | N/C |
| ALAPP | 0.152 | 0.112 |
| ALAPP-PI | 0.157 | 0.099 |
| 0 몰% AA | 0.240 | 0.241 |
| 5 몰% AA | 0.278 | 0.241 |
| 10 몰% AA | 0.291 | 0.224 |
| 20 몰% AA | 0.333 | 0.203 |
| 50 몰% AA | 0.302 | 0.092 |
| 100 몰% AA | 0.332 | 0.058 |
HeLa 세포, 인간 간엽성 줄기 세포(hMSC) 또는 L929 마우스 섬유아세포를 사용하여 코팅에 대한 세포 부착을 평가하였다. 표면 개질된 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트 및 96 웰 조직 배양 폴리스티렌 대조군 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)를 사용하여 세포 배양 실험을 수행하였다. 개시제-결여 단속적 UV 코팅법을 사용하여 제조한 샘플을 15 kGy(Steritech)의 선량을 사용하여 감마 조사로 멸균하였다. 거대-개시제 기반 UV 코팅법을 사용하여 제조한 샘플을 실온에서 4 시간 동안 각각 120 및 200 ㎍/㎤의 농도로 페니실린과 스트렙토마이신을 함유하는 포스페이트 완충 식염수(PBS) 용액과 인큐베이션하여 세포 배양 직전에 멸균하였다.
HeLa 세포 부착은 10% 소 태자 혈청(FBS), 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 보충된 신선한 둘베코 개질된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)/Hams F12 배지에서 2x10 4 세포/웰의 파종 밀도로 산정하였다.
인간 간엽성 줄기 세포(hMSC) 부착은 Mesencult ? -XF 배지(Stemcell TM Technologies)에서 7875 세포/웰의 파종 밀도로 산정하였다.
L929 세포 부착은 10% FBS, 1% v/v 비-필수 아미노산 및 1% v/v 안티-안티가 보충된 MEM + GlutaMAX TM -I 배지(Gibco)에서 7875 세포/웰의 파종 밀도로 산정하였다.
각각의 세포 유형에서, 플레이트는 5% CO 2 를 함유하는 가습된 공기 중에서 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션하였다.
HeLa 세포의 경우, 24 시간의 인큐베이션 후에 200 ㎕의 배양 배지로 웰을 세척하여 현탁되고 느슨하게 결합된 세포를 제거함으로써 세포 부착을 정량하였다. 그 후, DMEM/Hams F12 용액 중의 (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)(MTT)를 각 웰에 가하고 플레이트를 37 ℃에서 4 시간 동안 인큐베이션하였다. 각 웰에서 배지를 제거하고 DMSO(100 ㎕/웰)로 대체하였다. 595 nm의 파장에서 세포 생존력의 색채 측정(colorimetric measurement)을 하기 전에 플레이트 진탕기 위에서 15 분간 플레이트를 부드럽게 진탕하여 착색(stain)을 용해시켰다. 시험 샘플로부터 측정된 흡광도 값을 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 대조군 웰에서 측정된 것의 퍼센트로 표시하였다.
hMSC 세포의 경우, 24 시간의 인큐베이션 후에 200 ㎕의 배양 배지로 웰을 세척하여 현탁되고 느슨하게 결합된 세포를 제거함으로써 세포 부착을 정량하였다. 그 후, 배양 배지 중의 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 100 ㎕를 각 웰에 가하고 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO 2 에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 490 및 655 nm에서 마이크로플레이트 판독기(BioTek)로 결과를 판독하였다. 양쪽 파장으로부터의 판독 결과 사이의 차이를 얻어 평균하였다. 그 후, TCPS 표면으로부터 얻은 판독결과와 비교하여 데이터를 정규화하였다.
L929 세포의 경우, 24 시간의 인큐베이션 후에 200 ㎕의 배양 배지로 웰을 세척하여 현탁되고 느슨하게 결합된 세포를 제거함으로써 세포 부착을 정량하였다. 그 후, 10% FBS 및 최소의 필수 아미노산을 함유하는 MEM 배지(Gibco) 중의 [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-5-(3-카복시메톡시페닐)-2-(4-설포페닐)-2H-테트라졸륨(MTS) 100 ㎕를 각 웰에 가하고 플레이트를 37 ℃ 및 5% CO 2 에서 3 시간 동안 인큐베이션하였다. 490 및 655 nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기(BioTek)로 결과를 판독하였다. 양쪽 파장에서의 판독 결과 사이의 차이를 얻어 평균하였다. 그 후, TCPS 표면으로부터 얻은 판독결과와 비교하여 데이터를 정규화하였다.
도 9는 2가지 상이한 UV 방법을 사용하여 제조된 코팅에 대응한 세포 부착 결과를 중합체성 코팅의 조성의 함수로서 보여준다. 코팅은 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM)의 한정된 몰비로부터 형성된 단일중합체 또는 공중합체였다. 단속적 UV 노출에 의해 생성된 개시제-결여 UV 기반 코팅의 경우(파트 A), hMSC 부착은 55% 이하의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS 위에서 얻어진 세포 부착의 10% 미만의 수준으로 효과적으로 감소하였다. 비교하면, 거대-개시제 기반의 UV 접근법을 사용하여 제조된 코팅의 경우(파트 B), HeLa 세포 부착은 10% 미만의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS 위에서 얻어진 값의 10% 미만의 수준으로만 효과적으로 감소하였다. 선들은 시선을 안내하기 위하여 도시되었다(n≥3).
도 9에 나타낸 데이터를 분석하면, 이는 폴리스티렌 기판 표면 위에 존재하는 공중합체 코팅 내의 AA 및 AAM 몰비가 동일한 경우에, 코팅법에 따라 상이한 세포 부착 반응이 관찰됨을 명백히 시사한다. 단속적 UV 조사에 의해 생성된 개시제-결여 UV 기반 코팅의 경우에(파트 A에 기재됨), 세포 부착은 55% 이하의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS 값의 10% 미만의 수준으로 효과적으로 감소될 수 있다. 비교하면, 거대-개시제 기반의 UV 접근법을 사용하여 제조된 코팅의 경우, 세포 부착은 10% 미만의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS 값의 10% 미만의 수준으로만 효과적으로 감소하였다. 이들 결과는, 각각, 인간 간엽성 줄기 세포(hMSC) 및 HeLa 세포를 사용하여 얻어졌다. 또한, 도 10에 나타낸 데이터를 분석하면, 동일한 코팅 위에서는 상이한 세포 유형(hMSC 및 L929 세포)을 사용하여 유사한 세포 부착 결과가 얻어짐을 명백히 알 수 있다. 이 결과는 단속적 UV를 사용하는 개시제-결여 UV 기반 코팅법에 의해 생성된, 전체 범위의 AA/AAM 몰조성에 걸쳐 얻어졌다. 결과는 유사한 세포 부착 결과가 달성됨을 명백히 입증한다. 양쪽 세포 유형의 경우, 세포 부착은 55% 이하의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS의 10% 미만의 수준으로 효과적으로 감소하였다. 선들은 시선을 안내하기 위하여 도시되었다.
비교하면, 실시예 13에 나타낸 데이터의 분석은 연속적 조사를 사용하여 제조된 40 몰% AA-co-AAM 표면의 경우 동일하게 낮은 L929 부착이 관찰되었음을 명백히 보여준다.
도 10은 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM)를 기본으로 하는 공중합체 코팅에 대한 상이한 세포 유형의 반응을 보여준다. 코팅은 단속적 UV를 사용하는 개시제-결여 UV 기반 코팅법에 의해 생성되었다. hMSC 및 L929 세포를 사용하여 유사한 세포 부착 결과가 얻어졌다. 양쪽 세포 유형의 경우, 세포 부착은 55% 이하의 AA 몰퍼센트에 대해 TCPS의 10% 미만의 수준으로 효과적으로 감소하였다. 선들은 시선을 안내하기 위하여 도시되었다(n≥3).
도 9 및 10의 전반적인 데이터는 2가지의 매우 상이한 UV 기반 중합법에 의해 상이한 코팅 알키텍처가 생성되었으며 이 차이는 세포 반응(즉, 세포 부착)에서의 관찰된 차이에 책임이 있다는 가정을 명백히 뒷받침한다. 또한, 데이터는 개시제-결여 UV 기반 코팅법에 의해 생성된 코팅이 AA 및 AAM 조성의 훨씬 더 넓은 범위의 몰비에 걸쳐 상이한 세포 유형의 세포 부착을 방지하는데 더욱 효과적임을 입증한다. 세포 부착이 혈청 단백질의 비-특이적 흡착에 의해 이루어진다는 사실로 인하여, 개시제-결여 UV 기반 코팅법이 훨씬 더 넓은 범위의 AA 및 AAM 몰비에 걸쳐 비-특이적 혈청 단백질 흡착을 방지하는데 더욱 효과적이라고 결론지을 수 있다.
실시예 13
중합체 그라프팅: 연속적 대 단속적 UV 조사
파트 A: 코팅의 제조
규소 웨이퍼(Si)를 7 x 7 mm 치수의 정사각형으로 절단하고, 2%(v/v) RBS-35 ? 계면활성제, 2%(v/v) 에탄올 용액에서 초음파 세정하고, Milli-Q TM 물을 사용하여 철저히 헹구고, 정제 질소 기체의 고속의 여과된 스트림을 사용하여 건조시켰다. Si 웨이퍼 조각을 사용 직전에 60분간 ProCleaner TM 기구(Bioforce Nanoscience, USA)에서의 UV/오존 처리에 의해 추가로 세정하였다. 문헌[Griesser HJ., Vacuum 39 (1989) 485]에 기재된 라디오 주파수 글로 방전 플라즈마 반응기 내로 규소 웨이퍼 샘플을 도입하였다. 상부 전극과 동일한 치수를 나타내는 둥근 하부 구리 전극 위에 샘플을 놓았다. 20 W의 전력, 200 kHz의 주파수 및 0.20 mbar의 개시 단량체 압력에서 25 s 동안 알릴아민 플라즈마 중합체(ALAPP) 박막의 침착을 수행하였다. 생성된 알릴아민 코팅(Si-ALAPP)을 추가로 사용할 때까지 공기 중에 놔두었다.
40 몰% 아크릴산(AA) 및 60 몰% 아크릴아미드(AAM)를 함유하는 7.5%(w/v) 수용액을 질소 글로브 박스 안에서 제조하고, 여기에서 Si-ALAPP 샘플을 함유하는 PTFE 용기 내로 옮겼다. 각 용기에 첨가된 단량체 용액의 부피는 4 mL였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 단량체 용액을 함유하는 용기를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 밀봉된 샘플을 고전력 UV 램프(Fusion UV Systems LH6 with 9 mm D-bulb)에 의해 발생한 UV 방사선에 노출시켰다. 보통의 작업에서, 샘플을 램프 아래 고정된 스테이지 위에 위치시키고 조사하였다. 한정된 "온" 피리오드의 노출 및 한정된 "오프" 피리오드의 비-노출이 설정될 수 있도록 압축 공기 셔터가 열리고 닫히도록 프로그래밍하였다. 휴대용 UV 계측기(EIT UV Power Puck II)를 사용하여 임의의 주어진 설정값 하에 샘플에 도달하는 총 에너지 및 조도(irradiance)를 결정하였다. 이들 수치를 알게 됨으로써 상이한 공정 프로토콜에 대한 동일한 UV 방사선량을 결정할 수 있었다.
시험된 상이한 공정 프로토콜을 표 15에 나타내었다.
| 샘플 | ON & (s) | OFF & (s) | 사이클 | UVC (J/㎠) |
| 연속적 1 | 15 | n/a | 1 | 0.58 |
| 연속적 2 | 30 | n/a | 1 | 0.99 |
| 연속적 3 | 45 | n/a | 1 | 1.41 |
| 연속적 4 | 60 | n/a | 1 | 1.83 |
| 연속적 5 | 75 | n/a | 1 | 2.25 |
| 연속적 6 | 90 | n/a | 1 | 2.67 |
| 연속적 7 | 120 | n/a | 1 | 3.51 |
| 단속적(연속적 6) - 20 OFF - 1 | 1 | 20 | 53 | 2.67* |
| 단속적(연속적 6) - 20 OFF - 2 | 1.9 | 20 | 35 | 2.67* |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 1 | 1 | 20 | 19 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 2 | 2.9 | 20 | 9 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 3 | 4.7 | 20 | 6 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 4 | 10 | 20 | 3 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 5 | 15 | 20 | 2 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 1 OFF - 1 | 1 | 1 | 19 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 10 OFF - 1 | 1 | 10 | 19 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 30 OFF - 1 | 1 | 30 | 19 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 60 OFF - 1 | 1 | 60 | 19 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 1 OFF - 3 | 4.7 | 1 | 6 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 40 OFF - 3 | 4.7 | 40 | 6 | 0.99* |
| 단속적(연속적 2) - 60 OFF - 3 | 4.7 | 60 | 6 | 0.99* |
* 표적 수치
* & 수치는 장비에 사용된 설정값을 나타낸다.
목적하는 UV 방사선 노출 후, 샘플을 풍부한 양의 물로 세척한 다음 여과 정제된 질소 스트림 하에 건조시키고 분석하였다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고 얻어진 결과를 표 16에 나타내었다.
| 샘플 | O (at. %) | N (at. %) | C (at. %) | O/C | N/C |
| Si-ALAPP(계열 1) | 17.5 | 8.5 | 73.4 | 0.24 | 0.12 |
| 연속적 1 | 26.2 | 9.1 | 63.5 | 0.41 | 0.14 |
| 연속적 2 | 26.4 | 9.2 | 63.5 | 0.42 | 0.14 |
| 연속적 3 | 27.4 | 9.1 | 62.4 | 0.44 | 0.15 |
| 연속적 4 | 27.3 | 9.1 | 62.2 | 0.44 | 0.15 |
| 연속적 5 | 27.4 | 9.0 | 62.3 | 0.44 | 0.14 |
| 연속적 6 | 27.2 | 9.0 | 62.7 | 0.43 | 0.14 |
| 연속적 7 | 25.0 | 10.9 | 63.1 | 0.40 | 0.17 |
| Si-ALAPP(계열 2) | 17.6 | 8.5 | 73.0 | 0.24 | 0.12 |
| 단속적(연속적 6) - 20 OFF - 1 | 27.2 | 9.3 | 62.3 | 0.44 | 0.15 |
| 단속적(연속적 6) - 20 OFF - 2 | 27.6 | 9.3 | 61.8 | 0.45 | 0.15 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 1 | 27.6 | 9.2 | 61.9 | 0.45 | 0.15 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 2 | 27.7 | 9.1 | 61.9 | 0.45 | 0.15 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 3 | 27.5 | 9.2 | 61.9 | 0.44 | 0.15 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 4 | 27.8 | 9.2 | 61.7 | 0.45 | 0.15 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 5 | 27.3 | 9.1 | 62.3 | 0.44 | 0.15 |
| Si-ALAPP(계열 3) | 16.0 | 12.4 | 71.3 | 0.22 | 0.17 |
| 단속적(연속적 2) - 1 OFF - 1 | 27.6 | 9.9 | 62.2 | 0.44 | 0.16 |
| 단속적(연속적 2) - 10 OFF - 1 | 27.3 | 9.8 | 62.7 | 0.43 | 0.16 |
| 단속적(연속적 2) - 30 OFF - 1 | 27.3 | 9.5 | 62.9 | 0.43 | 0.15 |
| 단속적(연속적 2) - 60 OFF - 1 | 27.5 | 9.6 | 62.6 | 0.44 | 0.15 |
| 단속적(연속적 2) - 1 OFF - 3 | 27.6 | 9.8 | 62.4 | 0.44 | 0.16 |
| 단속적(연속적 2) - 40 OFF - 3 | 26.6 | 9.9 | 63.3 | 0.42 | 0.16 |
| 단속적(연속적 2) - 60 OFF - 3 | 27.1 | 9.7 | 62.9 | 0.43 | 0.15 |
알릴아민 플라즈마 중합체 박막 침착(Si-ALAPP) 후의 조성은 예상한 바와 같았다. 단량체 용액에서 샘플의 연속적 조사 후, 아크릴아미드 및 아크릴산으로 구성된 그라프트 공중합체 코팅과 일치하게 O 및 N 양자 모두의 원자 퍼센트가 증가하였다.
타원편광반사법(Ellipsometry)을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 두께를 추산하였다(JA Woolam Co, M2000). 각각의 각도에서 20초간 4개 각도(60, 65, 70 및 75 도)에서 상 데이터를 수집하였다. Tauc-Lorentz 일반 진동자 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다. 타원편광반사법 실험 결과를 표 17에 나타내었다.
| 샘플 | 두께* (nm) |
| Si-ALAPP(계열 1) | 29.04 |
| 연속적 1 | 15.2 |
| 연속적 2 | 33.81 |
| 연속적 3 | 63.21 |
| 연속적 4 | 95.64 |
| 연속적 5 | 115.93 |
| 연속적 6 | 151.98 |
| 연속적 7 | NM |
| Si-ALAPP(계열 2) | 29.52 |
| 단속적(연속적 6) - 20 OFF - 1 | 212.8 |
| 단속적(연속적 6) - 20 OFF - 2 | 196.44 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 1 | 28.68 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 2 | 22.61 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 3 | 37.17 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 4 | 38.33 |
| 단속적(연속적 2) - 20 OFF - 5 | 37.59 |
| Si-ALAPP(계열 3) | 32.9 |
| 단속적(연속적 2) - 1 OFF - 1 | 122.09 |
| 단속적(연속적 2) - 10 OFF - 1 | 66.66 |
| 단속적(연속적 2) - 30 OFF - 1 | 96.97 |
| 단속적(연속적 2) - 60 OFF - 1 | 115.53 |
| 단속적(연속적 2) - 1 OFF - 3 | 108.95 |
| 단속적(연속적 2) - 40 OFF - 3 | 134.79 |
| 단속적(연속적 2) - 60 OFF - 3 | 127.83 |
* NM = 불충분한 코팅 품질로 인하여 측정되지 않음
* 층 두께(즉, 밑에 있는 ALAPP 층을 포함하지 않음)
샘플 '연속적 7'은 측정될 수 없었다. 일부 중복 샘플 위에서, ALAPP는 온도 상승 및 장기간의 연속적 노출 시간에 의한 분해로 인하여 Si 기판으로부터 탈적층되었다. 다른 중복 샘플 위에서, 형성되었던 코팅은 매우 불균질하였다.
샘플 '연속적 6'은 탈적층되기 직전인 것으로 보였고, 일부 중복 샘플의 어떤 면적에서는 탈적층이 발생하였다. 그러나, 코팅 두께는 측정가능하였다. 샘플 '연속적 6' 및 샘플 '단속적(연속적 6) - 20 OFF - 1' 및 '단속적(연속적 6) - 20 OFF - 2'을 비교하면, 3가지 모든 샘플들이 0.99 J/㎠의 동일한 UVC 방사선량을 수령하였고, 연속적으로부터 단속적 노출 요법으로 이동함에 따라 a) Si로부터 ALAPP의 탈적층 없이 코팅을 제조할 수 있는 능력, 및 b) 더 두꺼운 코팅 양자 모두를 초래하였음은 분명하다. 연속적 노출과 비교하여 단속적 노출을 변화시키면서 이 계열의 샘플들에서 얻어진 두께의 증가는 실시예 11에 제시된 데이터 세트와 일치한다. 실시예 11에서, 단속적 UV 노출은 PBS에서 더 높은 정도로 팽윤하고 더 낮은 탄성률을 나타내는 더 두꺼운 코팅을 초래하였다. 본 실시예에 제시된 데이터 세트에서도 동일한 경향이 나타나리라고 가정하는 것이 합리적이다.
데이터 세트에서 분명한 경향 중의 하나는 "온" 시간이 변화하지만 UVC는 일정하게 유지되는 경우, 얻어지는 코팅 두께가 유사하다(그리고 일반적으로 연속적 조사에 의해 얻어지는 두께보다 더 두껍다)는 점이다. 이 데이터를 분석하면, 총 UVC 선량이 코팅 두께를 결정하는데 매우 중요하다는 결론에 이른다.
또한, 샘플 제조 중에 "오프" 시간의 영향을 고려할 때 관찰될 수 있는 일부 명백한 경향이 있다. 실시예 11은 조사 후 지연이 더 두꺼운 코팅을 초래함을 입증하였다. 본 발명자들은 이것이 샘플이 UV 램프로부터 옮겨진 후의 지속적인 중합때문이며, 다시금 UV 램프 아래에 놓여지기 전의 지연이 추가의 중합 및 더 두꺼운 코팅을 허용한다는 결론을 내렸다. 여기에서, 본 발명자들은 "오프" 시간이 증가할 때(지연 시간의 증가와 균등), 더 큰 코팅 두께가 얻어짐을 알 수 있다. 예를 들어, "오프" 시간이 10 s 에서 60 s로 증가하면(샘플: 단속적(연속적 2) - 10 OFF - 1, 단속적(연속적 2) - 30 OFF - 1, 및 단속적(연속적 2) - 60 OFF - 1), 두께는 67 nm 에서 116 nm로 증가하였다. 따라서, "온" 시간이 고려되는 경우, 두께 증가에 기여하는 것은 총 UVC 노출이다. "오프" 시간의 경우, 두께 증가에 기여하는 것은 "오프" 시간의 길이이다.
이전 실시예들과 유사한 프로토콜을 사용하여 공유 고정화된, 세포 부착성 사이클릭 RGDfK 펩티드와 함께 L929 섬유아세포를 배양하고 대조군(부착 펩티드 없음)과 비교하였다. 모든 경우에, 세포들이 부착되고 코팅 위에 잘 퍼졌다. 세포수, 세포 원형도 또는 세포에 의해 점유된 면적에 있어서 유의한 차이는 보이지 않았다. 연속적 조사에 의해 제조된 대조군 표면도 세포 부착에 저항성이었다.
실시예 14
중합체 그라프팅: 단속적 UV 조사의 사이클 증가
파트 A: 코팅의 제조
실시예 13에 따라, 40 몰% 아크릴산(AA) 및 60 몰% 아크릴아미드(AAM)를 함유하는 7.5%(w/v) 수용액을 질소 글로브 박스 안에서 제조하고, 여기에서 Si-ALAPP 샘플을 함유하는 48-웰 조직 배양 폴리스티렌 플레이트의 웰 내로 옮겼다. 각 웰에 첨가된 단량체 용액의 부피는 227 ㎕였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 플레이트를 UV 램프(Fusion UV Systems LH6, 9 mm D-bulb) 하에 컨베이어 벨트(Fusion UV Systems DRS 10/12 Conveyor) 위에서 5, 15, 25, 35, 또는 45회 통과시켰다. 그 후, 웨이퍼를 단량체 용액으로부터 제거하고 Milli-Q TM 물로 적어도 3회 철저히 세척한 다음 실온에서 72 시간 동안 다량의 Milli-Q TM 물에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 마지막으로 샘플을 공기 건조시켰다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고 얻어진 결과를 도 11에 나타내었다. 통과 회수가 증가함에 따라 결정된 조성이 ALAPP의 조성으로부터 40 몰% 폴리(AA-co-AAM) 공중합체의 이론적 조성을 향하여 변화하였는데, 이는 코팅 두께가 약 10 nm의 XPS 샘플링 깊이보다 커지는 것으로 증가함을 나타낸다. UV 통과가 많은 경우 관찰된 이론적 조성으로부터의 편차는 공중합의 동력학 때문일 수 있다.
타원편광반사법을 사용하여 형성된 그라프트 중합체 코팅의 두께를 추산하였다(JA Woolam Co, M2000). 각각의 각도에서 20초간 4개 각도(60, 65, 70 및 75 도)에서 상 데이터를 수집하였다. Tauc-Lorentz 일반 진동자 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다. 타원편광반사법 실험 결과를 도 12에 나타내었다.
이전 실시예들과 유사한 프로토콜을 사용하여 공유 고정화된, 세포 부착성 사이클릭 RGDfK 펩티드와 함께 L929 섬유아세포를 배양하고 대조군(부착 펩티드 없음)과 비교하였다. 모든 경우에, 세포들이 부착되고 코팅 위에 잘 퍼졌다. 세포수, 세포 원형도 또는 세포에 의해 점유된 면적에 있어서 유의한 차이는 보이지 않았다. 하나의 예외가 UV 5회 통과로 제조된 샘플이었는데, 여기에서는 세포 부착이 관찰되었고, 이는 아마도 세포가 밑에 있는 ALAPP를 감지하였기 때문인 것으로 보인다.
실시예 15
중합체 그라프팅: UVB 및/또는 UVC 차단의 효과
파트 A: 코팅의 제조
규소 웨이퍼(Si)를 7 x 7 mm 치수의 정사각형으로 절단하고, 2%(v/v) RBS-35 ? 계면활성제, 2%(v/v) 에탄올 용액에서 초음파 세정하고, Milli-Q TM 물을 사용하여 철저히 헹구고, 정제 질소 하에 건조시켰다. Si 웨이퍼 조각을 사용 직전에 60분간 ProCleaner TM 기구(Bioforce Nanoscience, USA)에서의 UV/오존 처리에 의해 추가로 세정하였다. 문헌[Griesser HJ., Vacuum 39 (1989) 485]에 기재된 라디오 주파수 글로 방전 플라즈마 반응기 내로 규소 웨이퍼 샘플을 도입하였다. 상부 전극과 동일한 치수를 나타내는 둥근 하부 구리 전극 위에 샘플을 놓았다. 20 W의 전력, 200 kHz의 주파수 및 0.20 mbar의 개시 단량체 압력에서 25 s 동안 알릴아민 플라즈마 중합체(ALAPP) 박막의 침착을 수행하였다. 그 후, 생성된 알릴아민 코팅(Si-ALAPP)을 추가로 사용하기 전에 Milli-Q TM 물에서 헹구었다.
40 몰% 아크릴산(AA) 및 60 몰% 아크릴아미드(AAM)를 함유하는 7.5%(w/v) 수용액을 질소 글로브 박스 안에서 제조하고, 여기에서 Si-ALAPP 샘플을 함유하는 PTFE 용기 내로 옮겼다. 각 용기에 첨가된 단량체 용액의 부피는 4 mL였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 단량체 용액을 함유하는 용기를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 또한, 샘플 표면 상의 UVA, UVB 및 UVC 강도를 감쇄시키기 위하여 일부 경우에 필터를 폴리머백 내부에 놓았다. 사용된 조건은 구체적으로 다음과 같다: 100% UVA, 100% UVB 및 100% UVC; 100% UVA, 30% UVB 및 0% UVC; 및 마지막으로 90% UVA, 0% UVB 및 0% UVC. 이들 수치는 Power Puck 강도 측정 디바이스 및 다양한 필터를 사용하여 결정하였다. 그 후, 밀봉된 샘플을 N 2 글로브 박스에서 빼내어 고전력 UV 램프(Fusion UV Systems LH6 with 9 mm D-bulb)에 의해 발생한 UV 방사선에 노출시켰다. 보통의 작업에서, 샘플을 램프 아래 고정된 스테이지 위에 위치시켰다. 한정된 "온" 피리오드의 노출 및 한정된 "오프" 피리오드의 비-노출이 달성될 수 있도록 압축 공기 셔터가 열리고 닫히도록 프로그래밍하였다. 휴대용 UV 계측기(EIT UV Power Puck II)를 사용하여 임의의 주어진 설정값 하에 샘플에 도달하는 총 에너지 및 방사선 유형을 결정하였다. 각 경우에, 샘플에 20 사이클의 UV 노출을 적용하였으며, 각 사이클에서 UV는 2 s 동안 "온"이고 10 s 동안 "오프"였다.
파트 B: 코팅의 특성조사
코팅에 대해 얻어진 XPS 결과를 표 18에 나타내었으며, 여기에서는 얻어진 3가지 코팅 모두의 조성이 원자 퍼센트 뿐아니라 O/C 및 N/C 원소비 양자 모두의 측면에서 매우 유사함을 관찰할 수 있다. 도 xxx에 나타낸 것은 대표적인 고해상도 C 1s 스펙트럼이다. 분석된 샘플 각각에 대해 얻어진 3가지 스펙트럼의 형태도 매우 유사하였으며, 이는 조성이 유사할 뿐아니라 탄소계 작용기의 상대적 비율도 유사함을 시사한다. XPS 데이터를 분석하면 조사된 3가지 유형의 UV 광선 모두, 즉, UVA, UVB 및 UVC의 존재하에 그라프팅이 일어나며 생성된 모든 코팅이 약 10 nm의 XPS 분석 깊이보다 큰 두께를 나타냄을 알 수 있다.
| 샘플 | O (at. %) | N (at. %) | C (at. %) | O/C | N/C |
| 샘플 2(100 % UVA, 100% UVB, 100% UVC) | 27.7 | 9.0 | 60.9 | 0.45 | 0.15 |
| 샘플 3(90 % UVA, 0% UVB, 0% UVC) | 26.8 | 9.2 | 63.4 | 0.42 | 0.14 |
| 샘플 4(100 % UVA, 30% UVB, 0% UVC) | 27.5 | 9.4 | 62.2 | 0.44 | 0.15 |
UVA, UVB 및 UVC 퍼센트를 변화시키면서 만들어진 코팅이 조성에 있어서 유사하기는 하지만, 두께는 100% UVA, 100% UVB 및 100% UVC가 100% UVA, 30% UVB 및 0% UVC보다 두껍고, 이는 90% UVA, 0% UVB 및 0% UVC보다 두꺼은 순서로 다양했다.
실시예 16
중합체 그라프팅: 아르곤 분위기
파트 A: 코팅의 제조
상이한 몰비(0-100%)의 아크릴산(AA) 및 아크릴아미드(AAM) 단량체의 7.5%(w/v) 수용액을 밀폐 용기 내에서 3회 사이클의 동결-펌프-융해에 의해 탈기시킨 후 아르곤-충전된 글로브 박스 안으로 옮겼다(산소 농도 <0.03%). 실시예 13에 따라, 이 방식으로 제조된 용액을 일부 웰이 Si-ALAPP 샘플을 함유하는 48-웰 조직 배양 폴리스티렌(TCPS) 플레이트(Nunclon TM Δ, Nunc)의 웰 내로 옮겼다. 각 웰에 첨가된 단량체 용액의 부피는 172 ㎕(웨이퍼 제외) 및 227 ㎕(웨이퍼 포함)였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 상기 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 플레이트를 UV 램프(Fusion UV Systems LH6, 9 mm D-bulb) 하에 컨베이어 벨트(Fusion UV Systems DRS 10/12 Conveyor) 위에서 40회 통과시켰다. 그 후, 플레이트와 웨이퍼를 Milli-Q TM 물로 철저히 세척한 다음 매일 물을 교체하면서 실온에서 72 시간 동안 다량의 Milli-Q TM 물에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 마지막으로 다중웰 플레이트 샘플 및 웨이퍼를 공기 건조시켰다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고, 얻어진 결과를 표 19에 나타내었다. XPS 분석으로부터 얻어진 데이터를 분석하면, 코팅 조성들이 예상된 바와 같음을 알 수 있었다. 예를 들어, 공급액 중의 AAM 단량체 몰퍼센트가 감소함에 따라 코팅 내 질소의 원자 퍼센트도 감소하였다. 질소 함량의 감소와 병행하여, 단량체 공급물 중의 AA 몰퍼센트가 증가함에 따라 산소 함량의 증가가 관찰되었다.
| 샘플 | O (at. %) | N (at. %) | C (at. %) | O/C | N/C |
| Si-ALAPP | 15.6 | 12.6 | 71.8 | 0.22 | 0.18 |
| 0 몰% AA-co-AAM (즉, AAM) | 16.6 | 19.3 | 64.1 | 0.26 | 0.30 |
| 10 몰% AA-co-AAM | 18.8 | 17.0 | 64.1 | 0.29 | 0.27 |
| 20 몰% AA-co-AAM | 21.2 | 14.7 | 64.1 | 0.33 | 0.23 |
| 30 몰% AA-co-AAM | 23.3 | 12.4 | 64.3 | 0.36 | 0.19 |
| 40 몰% AA-co-AAM | 25.9 | 10.2 | 63.8 | 0.41 | 0.16 |
| 50 몰% AA-co-AAM | 27.5 | 8.8 | 63.8 | 0.43 | 0.14 |
| 60 몰% AA-co-AAM | 27.8 | 8.2 | 63.9 | 0.44 | 0.13 |
| 70 몰% AA-co-AAM | 31.1 | 5.2 | 63.8 | 0.49 | 0.08 |
| 80 몰% AA-co-AAM | 32.4 | 3.7 | 63.8 | 0.51 | 0.06 |
| 90 몰% AA-co-AAM | 34.1 | 2.0 | 63.5 | 0.54 | 0.03 |
| 100 몰% AA-co-AAM (즉, AA) | 35.7 | 0.5 | 63.8 | 0.56 | 0.01 |
형성된 그라프트 중합체 코팅의 두께를 추산하기 위하여 타원편광반사법을 사용하였다. 각각의 각도에서 20초간 4개 각도(60, 65, 70 및 75 도)에서 상 데이터를 수집하였다. Tauc-Lorentz 일반 진동자 모델을 사용하여 데이터를 적합시켰다. 타원편광반사법 실험 결과를 표 20에 나타내었다. 얻어진 데이터를 분석한 결과, 단량체 공급물의 조성(즉, AA 및 AAM 단량체의 몰퍼센트)에 따라 두께에 있어서의 작은 차이가 명백히 나타났고, AA가 20 몰% 초과인 AA 및 AAM의 조합에서 가장 두꺼운 코팅을 얻은 반면 단일중합체 코팅은 약간 더 얇은 것으로 나타남을 알 수 있었다.
| 샘플 | 두께* (nm) |
| Si-ALAPP | 27.5 |
| 0 몰% AA-co-AAM(즉, AAM) | 125.2 |
| 10 몰% AA-co-AAM | 178.9 |
| 20 몰% AA-co-AAM | 200.0 |
| 30 몰% AA-co-AAM | 231.4 |
| 40 몰% AA-co-AAM | 248.0 |
| 50 몰% AA-co-AAM | 221.3 |
| 60 몰% AA-co-AAM | 228.4 |
| 70 몰% AA-co-AAM | 228.2 |
| 80 몰% AA-co-AAM | 243.5 |
| 90 몰% AA-co-AAM | 215.2 |
| 100 몰% AA-co-AAM(즉, AA) | 206.6 |
* 당해 층의 두께(즉, 밑에 있는 ALAPP 층을 포함하지 않음)
이 데이터 세트는 코팅이 질소 기체 뿐아니라 아르곤의 존재하에서 제조될 수 있음을 명백히 입증한다.
실시예 17
광범위한 화학 분류로부터의 단량체를 사용한 중합체 그라프팅
파트 A: 코팅의 제조
표 21에 열거된 단량체들을 사용하여 0.4 내지 1.0 M 범위의 농도로 50% 이하의 DMSO(v/v)를 함유하는 수용액들을 글로브 박스 안에서 질소 분위기하에 제조하였다. 소량(40 - 300 ㎕)의 용액을 다중웰 플레이트(96 웰)의 웰에 첨가하였다. 단량체 용액을 함유하는 웰의 열 사이에 적어도 한 열의 비어있는 웰을 남겨 중합체 코팅의 교차-오염을 피하였다. 여전히 글로브 박스 안에서, 단량체 용액을 함유하는 플레이트를 폴리머백(Sunbeam FoodSaver) 내로 진공 밀봉하고 글로브 박스에서 빼내었다. 그 후, 플레이트를 UV 램프(Fusion UV Systems LH6, 9 mm D-bulb) 하에 컨베이어 벨트(Fusion UV Systems DRS 10/12 Conveyor) 위에서 60회 이하로 통과시켰다. 그 후, 플레이트를 그 안에서 중합체 코팅이 형성된 용액을 사용하여 적어도 3회 철저히 세척하고 Milli-Q TM 물로 적어도 3회 세척한 다음, 다량의 Milli-Q TM 물에서 72 시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 임의의 남아있는 단량체 또는 비-공유적으로 결합된 중합체를 제거하였다. 추가 및 마지막 세척 후, 샘플을 공기 건조시키고, 이중 백에 넣고 15 KGy의 선량에서 감마 조사를 이용하여 멸균한 다음 X-선 광전자 분광법(XPS)을 사용하여 특성조사하였다.
파트 B: 코팅의 특성조사
제조된 코팅의 XPS 분석을 수행하고, 얻어진 결과를 표 21에 나타내었다. 비교를 위하여 기초 기판의 전형적인 표면 조성인 조직 배양 처리된 폴리스티렌(TCPS)을 포함시켰다. 용이하게 관찰할 수 있는 바와 같이, 표 21에 열거된 단량체로부터 형성된 코팅의 표면 조성은 모두 뚜렷하게 TCPS 기판과 상이하며, 이는 코팅이 각 경우에 형성되었음을 시사한다. TCPS 기판의 표면은 탄소 및 산소만을 함유한다. 일부 경우에, 조성은 TCPS 조성 및 관심의 대상인 중합체 코팅에 대한 이론적 조성의 중간이다. 이 경우에, 형성된 코팅 두께는 XPS 샘플링 깊이 미만이며, 표면 조성은 밑에 있는 기판으로부터의 기여를 포함하였다. 많은 경우에, TCPS 기판의 상부에 형성된 코팅의 표면 조성은 이론적 조성과 매우 유사하며, 이는 코팅이 적어도 XPS 샘플링 깊이(10 nm) 만큼 두꺼움을 나타낸다.
| 단량체/샘플 명칭 | 조성(원자 %) | ||||||||
| C | O | N | S | Ca | Na | Cl | K | Si | |
| TCPS | 82.0 | 18.0 | |||||||
| N-이소프로필아크릴아미드 | 75.6 | 12.2 | 12.2 | ||||||
| 메틸 메타크릴레이트 | 71.6 | 27.6 | 0.8 | ||||||
| 2-카복시에틸 아크릴레이트 | 63.0 | 37.0 | |||||||
| 3-설포프로필 아크릴레이트, 칼륨염 | 49.2 | 38.5 | 0.6 | 7.4 | 0.9 | 3.5 | |||
| 모노-2-(메타크릴로일옥시)에틸 석시네이트 | 64.3 | 35.7 | |||||||
| N-(3-아미노프로필)메타크릴아미드 하이드로클로라이드 | 71.2 | 14.2 | 13.5 | 0.6 | 0.6 | ||||
| 2-아미노에틸 메타크릴레이트 하이드로클로라이드 | 62.3 | 27.7 | 8.7 | 0.3 | 0.4 | ||||
| 2-하이드록시에틸메타크릴레이트 | 67.6 | 32.4 | |||||||
| 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트[MW 475] | 68.8 | 31.2 | |||||||
| 메틸 아크릴레이트 | 74.8 | 25.1 | 0.1 | ||||||
| 폴리(프로필렌 글리콜) 메틸 에테르 아크릴레이트[MW202] | 72.2 | 27.8 | |||||||
| 4-하이드록시부틸 아크릴레이트 | 71.8 | 26.2 | 2.0 | ||||||
| 2-메타크릴로일옥시 에틸 아세토아세테이트 | 67.1 | 32.9 | |||||||
| 아크릴산 | 62.8 | 37.2 | |||||||
| 메타크릴산 | 69.6 | 30.4 | |||||||
| 하이드록시에틸아크릴레이트 석시네이트 | 60.7 | 35.4 | 3.9 | ||||||
| 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산 | 55.7 | 27.8 | 6.9 | 6.1 | 3.6 | ||||
| [3-(메타크릴로일아미노)프로필] 트리메틸암모늄 클로라이드 | 73.3 | 13.5 | 10.1 | 0.7 | 2.4 | ||||
| [3-(메타크릴로일옥시)에틸]-트리메틸암모늄 클로라이드 | 72.0 | 19.2 | 5.8 | 0.5 | 2.6 | ||||
| 2-하이드록시에틸아크릴레이트 | 64.6 | 35.4 | |||||||
| 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트[MW 360] | 67.5 | 32.5 | |||||||
| 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트[MW 1100] | 70.7 | 29.3 | |||||||
| 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트[MW 2080] | 70.6 | 29.4 | |||||||
| 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트 [MW 526] | 68.3 | 31.8 | |||||||
| 아크릴아미드 | 64.0 | 18.6 | 17.5 | ||||||
| 1-비닐-2-피롤리돈 | 76.9 | 12.9 | 10.2 | ||||||
| N,N,-디메틸아크릴아미드 | 72.7 | 14.1 | 13.2 | ||||||
| N-[3-(디메틸아미노)프로필] 메타크릴아미드 | 72.4 | 16.3 | 11.0 | 0.4 | |||||
| 메타크릴아미드 | 70.5 | 16.7 | 12.8 | ||||||
| (2-디메틸아미노에틸) 메타크릴레이트 | 73.2 | 19.2 | 7.3 | ||||||
| N-(2-하이드록시프로필) 메타크릴아미드 | 70.3 | 19.9 | 9.8 | ||||||
| [2-(메타크릴로일옥시)에틸]디메틸-(3-설포프로필)암모늄 하이드록사이드 | 63.9 | 26.8 | 4.7 | 4.6 | |||||
| [3-(메타크릴로일아미노)프로필] 디메틸(3-설포프로필)암모늄 하이드록사이드 | 65.1 | 21.9 | 8.7 | 4.3 | |||||
| 4-아크릴로일몰폴린 | 70.2 | 21.0 | 8.5 | 0.5 | |||||
| N-(하이드록시메틸)아크릴아미드 | 62.6 | 24.4 | 12.8 | 0.2 | |||||
| N-2-하이드록시에틸 아크릴아미드 | 64.5 | 23.6 | 11.3 | 0.5 | |||||
| N-메타크릴로일 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄 | 64.7 | 27.1 | 7.4 | 0.7 | |||||
| 설포프로필메타크릴레이트 칼륨염 | 54.9 | 33.4 | 1.1 | 6.2 | 0.9 | 3.5 | |||
| 디아세톤 아크릴아미드 | 75.3 | 16.5 | 8.2 | ||||||
| N,N-디에틸 아크릴아미드 | 78.2 | 11.1 | 10.7 | ||||||
| N-에틸 아크릴아미드 | 70.2 | 16.6 | 13.2 | ||||||
| N-(n-프로필)아크릴아미드 | 74.8 | 13.7 | 11.5 | ||||||
| 하이드록시프로필 아크릴레이트 | 67.4 | 31.7 | 0.9 | ||||||
| N-tert-부틸 메타크릴아미드 | 75.0 | 18.8 | 6.2 | ||||||
| N-tert-부틸 아크릴아미드 | 75.8 | 15.9 | 8.3 | ||||||
| N-(n-부틸)메타크릴아미드 | 77.9 | 13.3 | 8.7 | ||||||
