미세중력을 이용한 세포내 ＡＭＰ 활성화 단백질 키나아제의 활성화 방법{Method for activation of AMP dependent protein kinase using microgravity}
본 발명은 세포내 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK)의 활성화 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 중력이 거의 존재하지 않는 미세중력 상태에서 세포를 배양하여 세포내 AMP 활성화 단백질 키나아제(AMPK)를 활성화시키는 방법에 관한 것이다.
현대사회에서는 비만, 당뇨병, 고지혈증 및 심혈관계 질환 등으로 나타나는 복합적 원인으로 대사 장애가 급격히 증가하고 있다. 그 중에서도 특히 에너지 항상성의 불균형은 근육, 간, 그리고 지방 세포의 기능 이상을 초래하고, 그로 인해 대사성 질환이 발생된다. 에너지 대사 조절의 이상은 인슐린 저항성에 기인하며, 이는 대사 장애의 다양한 병리생리학적인 요인으로 작용할 것으로 생각되지만, 이에 대한 자세한 조절 메커니즘은 밝혀져 있지 않은 상황이다.
최근 연구 결과들은 AMPK(AMP-activated protein kinase)를 중심으로 생체 내의 에너지 인식 및 항상성 조절이 이루어지며, 당과 지방의 대사에 있어서 중요한 역할을 한다는 사실이 밝혀지고 있으며, 이러한 에너지 센서의 이상은 대사성 질환을 비롯한 심혈관계 질환, 암 발생과도 연관성이 높은 것으로 나타나고 있다.
AMP 활성화 단백질 키나제(AMPK)는 AMP (adenosine monophosphate)에 의해서 활성화되는 효소로서, 세포 내의 에너지 항상성 유지에 센서 역할을 하는 효소이다. AMPK는 대사성 스트레스나 운동에 의해 세포 내의 에너지가 감소하는 경우, 즉 ATP가 고갈되어 AMP/ATP 비율이 증가하는 경우에 활성화되어 ATP를 소비하는 과정(예를 들어, 지방산 합성과 콜레스테롤 합성)을 억제하고 ATP를 생산하는 과정(예를 들어, 지방산 산화와 해당과정)을 촉진한다.
AMPK의 활성화에 대한 효과는 에너지 대사 조절과 밀접하게 연관되어 있는 표적장기(간, 근육, 지방, 췌장 등)에 관여되어 있다. 간에서 AMPK가 활성화가 되면 지방산과 콜레스테롤의 합성을 억제하고, 지방산의 산화를 촉진한다. 골격근에서 AMPK가 활성화되면 지방산의 산화와 당 흡수를 촉진하며 지방세포에서는 지방분해와 지방생성을 억제한다. 또한 췌장 β세포에서 AMPK의 활성화는 인슐린 분비를 촉진시킨다. 이러한 AMPK의 역할과 관련하여 대사성 질환의 약물 타겟으로 많은 연구가 이루어져 왔다. 이러한 관점에서 볼 때, AMPK는 대사성 질환의 발생에 있어 중추적인 역할을 담당하고 있으며, AMPK의 활성화는 비만, 제2형 당뇨병, 고지혈증 그리고 심혈관계 질환 등과 같은 대사성 질환의 발생을 예방하고, 치료를 하는 데 중요한 역할을 할 수 있다.
이와 같이, AMPK를 활성화시킴으로써, 대사성 질환의 치료에 많은 연구가 시행되어 왔다. 특히, 대한민국 등록특허 제10-1062670호에서는 2,5-비스-아릴-3,4-디메틸테트라하이드로퓨란 리그난을 유효성분으로 포함하는 AMPK의 활성화에 의해 매개되는 비만 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개시하고 있고, 또한, 대한민국 등록특허 제10-1063895호에서는 Pro-Gly을 포함하는 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 골격근 세포의 AMPK 활성을 에너지 대사를 촉진함으로써 항비만 및 항당뇨 효과를 갖고 있음을 개시하고 있다.
그러나, 상기와 같은 화합물 또는 재조합 단백질, 즉, 펩타이드를 사용하는 경우, AMPK 활성을 증가시킬 수는 있으나, 화합물 또는 펩타이드의 독성의 문제점을 해결하기 어려운 문제점이 있을 뿐만 아니라, AMPK 활성화 외에 다른 작용기전에 의해 부작용을 일으킬 수 있는 문제점이 있다.
이에, 본 발명자들은 약물 등을 사용하지 않고, 미세중력을 이용하여 AMPK를 활성화시키는 방법을 연구하였으며, 이러한 AMPK가 활성화됨에 따라, 세포의 대사 문제를 해결하는 데 유용하게 응용될 수 있음을 확인하였다. 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 미세중력 상태에서 세포를 배양하여 세포 내 AMPK를 활성화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 미세중력(microgravity) 상태에서 세포를 배양하여 세포내 AMPK를 활성화시키는 단계를 포함하는 세포내 AMPK의 활성화 방법을 제공한다. 상기 미세중력상태에서 세포 배양시 세포내 AMPK 단백질의 172번째 트레오닌 아미노산(T172)이 인산화되는 것을 특징으로 하고, 세포내 AMPK 단백질의 485번째 세린 아미노산(S485)이 탈인산화되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 미세중력 상태는 세포를 배양하는 배지를 클리노스텟(clinostat)에 설치한 후, 삼차원적으로 회전시켜서 형성될 수 있다. 상기 '미세중력 상태'라 함은 인위적으로 형성한 중력이 거의 없는 상태로서, 약 지구 중력(1G)의 10만분의 1정도인 상태를 의미하고, 이러한 상태를 형성하기 위하여 본 발명에서는 '클리노스텟'을 이용하였다. 또한, 본 발명은 상기 과제를 해결하기 위하여, 상기 세포내 AMPK의 활성화 방법에 따라 AMPK가 활성화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면 미세중력 상태에서 세포를 배양함으로써, 세포 내 AMPK를 활성화시켜서 대사를 개선할 수 있을 뿐만 아니라, 단백질 생산을 위한 대량의 세포 배양시에도 AMPK를 유용하게 활성화시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 AMPK의 활성화에 의해서 지방산 혹은 콜레스테롤 합성을 억제하여 세포의 대사(metabolism)를 개선시키는 세포치료제 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세중력 형성 장치인 클리노스텟(clinostat)을 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세중력 조건에 따른 MuRF-1 및 유비퀴틴 단백질 발현결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 미세중력 조건에 따른 자가포식소체화 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 미세중력 조건에 따른 AMPK 및 mTOR 인산화 결과를 나타내는 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 AMPK 활성화 저해제인 화합물 C에 의한 AMPK 인산화 결과를 나타내는 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 siRNA 형질 주입에 의한 AMPK 발현 결과를 나타내는 도면이다.
이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 미세중력(microgravity) 상태에서 세포를 배양하여 세포내 AMPK를 활성화시키는 단계를 포함하는 세포내 AMPK의 활성화 방법으로서, 구체적으로, 세포를 1차 배양한 후, 상기 1차 배양된 세포를 미세중력상태에서 2차 배양하는 단계를 포함한다. 상기 2차 배양 단계에서는 미세중력 상태를 형성하기 위하여 하기 도 1에 나타나 있는 3차원적 회전이 가능한 클리노스텟(clinosatat)을 이용한다. 상기 클리노스텟에 1차 배양된 세포 배지를 설치한 후 3차원적으로 회전시켜주면 미세중력이 형성되고, 이러한 미세중력 상태에서 2차 배양한다. 상기 AMPK를 포함하는 세포는 인간으로부터 유래된 것으로써, 바람직하게는 사람의 신장에서 유래한 HEK293 세포 또는 근육에서 유래한 C2C12 세포일 수 있다.
AMPK(AMP-activated protein kinase)는 촉매적 α 서브유닛 및 ATP 대 AMP의 비율을 모니터링 함으로써 낮은 에너지 상태를 감지하는 조절적 β/γ 서브유닛을 포함하는 헤테로트라이머성(heterotrimeric) 복합체로서, 근육수축 및 운동시 LKB1 및 CaMKK (Ca 2 + /calmodulin-dependent kinase kinase)에 의한 트레오닌 172의 인산화에 의해서 활성화되고, 세린 485의 탈인산화에 의해서 활성화된다. 본 발명은 하기 실시예에서 기술하는 바와 같이, 클리노스텟에서 미세중력을 생성하여, HEK293 세포 세포를 1 일 혹은 3 일 배양시 AMPK 단백질의 인산화 정도가 변화하는 것을 확인하였다 구체적으로, 본 발명에 따라 미세중력 상태에서 세포 배양시(clinorotation), AMPK 단백질의 172 번째의 트레오닌 아미노산(T172)는 인산화(phosphorylation)가 되고, 485 번째의 세린 아미노산(S485)은 탈인산화(dephosphorylation)가 되는 데, 이것은 모두 세포내 AMPK의 활성을 강화시켜주는 인산화 조절이다. 하기 도 4a에 나타나 있는 바와 같이, HEK293 세포를 클리노스텟에 설치한 후, 1일 혹은 3일 동안 세포를 배양한(clinorotation) 결과, 비교군 세포에 비해서 AMPK 단백질의 인산화가 활성화됨을 확인할 수 있다. 즉, 172번째의 트레오닌 아미노산(T172)이 인산화(phosphorylation)가 될 경우, AMPK 단백질의 기능이 활성화되는 것이며, 485 번째의 세린 아미노산(S485)이 탈인산화(dephosphorylation)가 될 경우 AMPK 단백질이 활성화 되는 것이다. 또한, 하기 도 5에 나타나 있는 바와 같이, 미세중력상태에서 AMPK단백질의 T172의 인산화 정도를 측정하였고, 그 결과 미세중력에 의해서 인산화 정도가 비교군(control) 세포에 비해 많이 증가되어 세포 내 AMPK 단백질이 활성화된 것을 알 수 있다. 또한, 본 발명은 AMPK의 활성화가 필요한 질환의 예방 및 치료용 세포치료제 조성물로서, 상기 AMPK의 활성화 방법에 따라 AMPK가 활성화된 세포를 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포치료제 조성물을 제공한다. 상기 “AMPK의 활성화가 필요한 질환”이라 함은 AMPK가 활성화되면, 인슐린-저항적 조건에서 독립적 경로를 통해 글루코스 섭취를 자극하는 데, 이러한 AMPK의 활성화로 인한 글루코스의 세포내 섭취를 필요로 하는 질환을 의미한다. 그 예로서는 제2형 당뇨병, 대사증후군, 고혈압, 심혈관질환 및 비만을 포함하는 군으로부터 선택되는 하나 이상을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않고, 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
< 실시예 1> 미세중력 조건에 따른 AMPK 활성화 (1) 세포 배양 및 현미경 관찰 HEK293 세포를 10% 소 태아 혈청(Gibco, Grand Island, NY, USA)을 함유하는 라이보비츠 L-15(Welgene, Korea) 배지에서 세포를 배양하였다. C2Cl2 세포는 DMEM 배지에서 배양하였다. AMPK 활성화 저해제인 화합물 C는 시그마사로부터 구입하였다. 현미경 관찰을 위해 GFP-LC3 세포는 4% 파라포름알데하이드로 고정된 35 mm 커버 글라스보텀 디쉬(cover glassbottom dish)(SPL Life Science, Korea)에서 배양하였다. 그 다음 상기 슬라이드를 PBS로 세척하고, 마운팅 배지(Vector, Burlingame, CA, USA)로 고정시켰다. 이미지는 레이카 SP5 공초점 현미경(Leica, Germany)으로 얻었다.
(2) 3차원 클리노로테이션( clinorotation ) 3차원 클리노스텟(clinostat)은 지상에서 미세중력을 형성하는데 유용한 장비로써, 클리노로테이션 하루 전에, GFP-LC3 세포는 T-25 플라스크 또는 35 mm 커버 글라스보텀 디쉬에 파종시켰다. 24 시간 후, 상기 배지를 새로운 배지로 바꾸고, 파종된 세포는 24 시간 또는 72 시간 동안 배지 교환 없이 클리노로테이션을 수행하였다. 상기 회전 주기는 외부 컴퓨터로 조절하였고, 상기 시료는 2 rpm의 속도로 두개의 독립적인 축을 회전시켰다. 상기 시스템 전체는 37 ℃로 설정된 배양기 내에서 수행되었다. 대조군 세포는 클리노로테이션 없이 배양기 내에서 수행되었다.
(3) 재료 AMPKα 뉴클레오티드 배열은 GCU UGA UGC ACA CAU GAAU이다. AMPK siRNA 및 불특정(NS) siRNA는 ST Pharm(Seoul, Korea)에서 구입하였다. siRNA의 형질주입은 제조사의 지침에 따라, 올리고펙타민 시약(Invitrogen, 6 Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 형질주입 24시간 후, 상기 세포는 클리노로테이션을 수행하였다. LC3 및 p62 항체는 Sigma에서 구입하였고, AMPK, 인산화-AMPK(T172), 인산화-AMPK(S485), mTOR 및 인산화-mTOR 항체는 Cell Signaling Technology(Danvers, MA, USA)로부터 구입하였다.
< 실험예 1> 미세중력 조건에 따른 AMPK 활성화 측정 상기 실시예 1의 세포는 0.1 mM Na 2 CO 3 , 1 mM NaF 및 단백질 분해효소 저해제 혼합물(Roche, Germany)을 포함하는 용해 완충용액(150 mM NaCl, 50 mM HEPES [pH 8.0], 0.5% NP-40)에서 추출 및 용해되었다. 단백질 면역 블롯을 위해, 모든 세포 용해물 내 폴리펩타이드를 SDS-PAGE를 통해 재용해시키고, 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 통해 전사하였다. 면역 검출(Immunodetection)은 향상된 화학발광(ECL) 시스템을 사용하여 주요항체의 1:2000 희석하여 수행하였다. 상기 이미지는 케미독-킷 410(Chemidoc it 410) 이미징 시스템(UVP, Upland, CA, USA)을 이용하여 얻었다.
결과 (1) 미세중력 조건에 따른 MuRF -1 및 유비퀴틴 단백질 발현 MuRF-1은 근육 위축에 있어서, 중요한 E3 유비퀴틴 리가아제로써, MuRF-1의 발현과 유비퀴틴화된 단백질을 조사하여 미세중력 조건의 단백질 발현 여부를 확인하기 위하여 세포 내 MuRF-1 농도를 측정한 결과, 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, C2C12 세포에서 MuRF-1 레벨은 클리노로테이션 24 시간 후에 약간 증가되었고, 293a 세포에서 유비퀴틴화된 단백질 수준은 클리노로테이션 24 시간 이후 감소되었다. 이로부터 클리노스텟 장치가 적절한 미세중력을 형성함을 알 수 있다.
(2) 미세중력 조건에 따른 자가포식소체화 클리노로테이션 후, 세포를 고정하고, 공초점 현미경으로 확인한 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이, 72 시간 동안 미세중력에 노출된 GFP-LC3 세포는 세포질의 GFP-LC3 평형을 나타내고, 자가포식소체의 반사가 일어나지 않았다. 따라서, 미세중력에서 세포 배양시 자가포식소체의 형성을 조절할 수 있다.
(3) 미세중력 조건에 따른 마커 LC3 및 p62 발현 미세중력 조건에서 자가포식 유도여부를 분석하기 위하여 종래 이용되고 있는 액포의 마커로 사용되는 LC3 및 p62의 발현 패턴을 조사한 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 클리노로테이션을 72 시간 수행한 경우에서 GFP-LC3-II 농도가 증가하는 것이 확인되었고, 클리노로테이션 24 시간 수행한 군 및 대조군에서는 큰 변화는 확인되지 않았다. 또한, 항-p62 항체의 웨스턴 블롯 분석결과, 72 시간 동안 클리노로테이션을 수행한 군에서 내성을 나타내는 것을 확인하였다. 이와 같이, 상기 웨스턴 블롯 결과는 도 3b 현미경 데이터와 일치하는 것으로 확인되었고, 이러한 결과에 따라 클리노로테이션이 자가포식을 유도하는 것으로 판단된다.
(4) 미세중력 조건에 따른 AMPK 및 mTOR 인산화 자가포식 저해제로 자명하게 알려진 mTOR 인산화 여부를 측정한 결과, 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, 24 시간 및 72 시간 동안 클리노로테이션을 수행한 군에서는 T172에서 AMPK의 인산화가 증가됨을 확인하였다. 한편, 24 시간 동안 미세중력을 저해한 경우에서 S485에서 AMPK의 인산화가 나타났으나, 72 시간 동안 클리노로테이션을 수행한 경우는 무처리군과 비교한 결과, 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 또한, 클리노로테이션은 mTOR 세린 2448에서 인산화를 감소시키는 것으로 확인되었다. 이 결과, 미세중력 상태에서 세포를 배양함에 따라, 세포 내 AMPK을 활성화시키고, mTOR을 억제시키는 것으로 판단되며, 이는 자가포식 조절에 관여하고 있음을 알 수 있다.
(5) 화합물 C에 의한 AMPK 인산화 확인 도 5a에 나타낸 바와 같이, GFP-LC3 세포에 AMPK 활성화 저해제인 화합물 C 처리 유무에 따라, 72 시간 동안 미세중력을 수행한 후, 웨스턴 블롯 결과 화합물 C를 처리한 경우에는 AMPK(T172)의 인산화를 완전히 차단하고, GFP-LC3-II의 농도를 증가시키는 것으로 확인되었다.
(5) siRNA 형질 주입에 의한 AMPK 발현 도 6A 및 6B에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 AMPK 발현 정도는 AMPK siRNA 형질주입에 의해 효과적으로 억제되는 것이 확인되었다. 대조군 siRNA 세포는 클리노로테이션에 의해 자가포식을 유도하는 동안 AMPK-감소된 세포는 아무것도 일어나지 않았다. AMPK-감소된 세포는 자가포식소체 형태를 나타내지 않고, 세포질 내 자가포식소체 마커인 GFP-LC-II 및 p62의 발현을 변화시키는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 의하면, 미세중력 상태에서 세포를 배양함으로써, 세포 내 AMPK를 효과적으로 활성화시킬 수 있다.
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