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用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法
申请号	CN201310028903.6	申请日	2013-01-25	公开(公告)号	CN103041450A	公开(公告)日	2013-04-17
申请人	南通大学;			发明人	顾晓松; 丁斐; 顾芸; 薛成斌; 杨宇民; 王勇军; 龚蕾蕾;
摘要	本发明公开了一种用于修复周围神经缺损的组织工程神经移植物及制备方法，组织工程神经移植物由神经导管和细胞基质构建而成。制备方法包括含支持细胞的组织工程神经移植物的构建及细胞基质修饰的组织工程神经移植物的构建。本发明优点明显，神经导管及支架上的细胞基质是由培养的细胞形成后脱细胞获得，是完全天然的细胞基质，更利于细胞的黏附，并对轴突再生的方向性具有一定的导向作用，因而更利于加快神经再生的进程。同时去细胞后可降低或免除同种异体细胞移植的免疫原性，建立一个有利于再生轴突生长的环境，以达到神经快速生长、功能恢复的理想目标，为临床治疗提供可行方案。
权利要求	1. 一种用于修复周围神经缺损的组织工程神经移植物，由神经导管和细胞基质构建而成，其特征在于所述细胞基质是自体的或同种异体来源细胞分泌形成后脱细胞而获得。 2.如权利要求1所述的组织工程神经移植物，其特征在于所述细胞是施万细胞、皮肤来源的成纤维细胞、皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞或诱导多潜能干细胞中的一种或几种。 3.如权利要求1所述的组织工程神经移植物，其特征在于所述神经导管由生物可降解材料构成，所述的生物可降解材料为丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。 4.如权利要求1-3之一所述的组织工程神经移植物的制备方法，其特征在于制备含支持细胞的组织工程神经移植物之后进行脱细胞处理得到含细胞自身分泌的细胞基质修饰的组织工程神经移植物。 5.如权利要求4所述的组织工程神经移植物的制备方法，其特征在与于所述含支持细胞的组织工程神经移植物采用三维微重力旋转培养得到。 6.如权利要求5所述的组织工程神经移植物的制备方法，其特征在于含支持细胞的组织工程神经移植物的制备及去细胞组织工程神经移植物的构建具体为：(1)含支持细胞的组织工程神经移植物的构建：将完全培养基缓慢注入培养容器，再加入2. 5 X IO7个细胞及无菌处理过的神经导管，再将完全培养基注满整个容器，控制细胞最终密度为lX105/ml，排尽系统内空气后，开始旋转微重力循环灌注培养；旋转式生物反应器放入37°C CO2培养箱中，前24小时转速为10转/分钟，使细胞与神经导管充分接触，贴附；24小时后调整旋转式生物反应器旋转速度，使神经导管能悬浮到培养液中；继续培养2 天后更换为分化培养基培养，以促进细胞外基质分泌；培养2周后终止培养将表明贴附生长有细胞的神经导管取出；(2)含细胞自身分泌的细胞基质修饰的组织工程神经移植物的构建：将培养有细胞的组织工程神经移植物进行脱细胞处理，PBS清洗后去离子无菌水37 °C低渗10 min;加入细胞抽提液于37°C裂解细胞10-15 min ;PBS清洗3次后加入Dnase I (4 mg/ml) 37 V 消化30 min去除DNA，-80 °C保存备用。 7.如权利要求4-6之一所述的组织工程神经移植物的制备方法，其特征在于所述细胞是施万细胞、皮肤来源的成纤维细胞、皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞或诱导多潜能干细胞中的一种或几种。 8.如权利要求4-6之一所述的组织工程神经移植物的制备方法，其特征在于所述神经导管由生物可降解材料构成，所述的生物可降解材料为丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。
说明书全文	用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法技术领域[0001] 本发明属于可植入人体中的医用生物材料技术领域，涉及一种用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法。背景技术[0002] 随着社会现代化进程和人们生活节奏的加快，不可避免的会出现更多的交通事故、工伤事故、运动意外等事件，同时频繁的局部战争和暴力事件及地震等自然灾害，均会造成周围神经损伤，临床上当中长距离的神经缺损不能依靠端对端的缝合来弥补神经缺失时，就不得不依靠移植物来桥接修复。寻找和研制较为合适的移植物问题虽然已有一百多年的历史了，但除了自体神经成为首选的神经缺损桥接移植物外，至今在人类仍在寻找理想的，能够在临床上广泛应用的神经移植替代物。就自体神经移植中，因为供移植用的神经来源有限、组织结构和尺寸难以匹配、移植供区长期失神经支配等原因，未能在临床上广泛使用。[0003] 随着组织工程学的出现和发展，为构建自体神经移植替代品提供了一条新的出路。目前已有的人工神经移植物主要有两大类，一类是脱细胞处理的同种异体神经即脱细胞神经基质（acellular nerve graft,ANG),利用原来神经的管道,将异体细胞去掉。脱细胞神经基质具有作为周围神经组织工程支架的基本要求，可以成为细胞外基质替代物应用于组织工程研究。如文献《脱细胞神经基质诱导大鼠骨髓间充质细胞向Schwann细胞分化的形态学研究》（何红云，邓仪昊，佟晓杰等，神经解剖学杂志，2007年第23卷第6期）探讨脱细胞神经基质移植物（ANA)体外诱导成年大鼠骨髓问充质细胞（BMSCs)向Schwann细胞分化的可行性，研究结果提示ANA可诱导成年大鼠骨髓问充质细胞分化为Schwann细胞。如文献《脱细胞异体神经基质移植物对脊髓前角运动神经元的保护作用》（刘金超，林晓萍，佟晓杰等，解剖科学进展，2005 (3) : 206-209)探讨脱细胞神经基质移植物异体移植对脊髓前角运动神经元的保护作用。研究结果提示脱细胞异体神经基质移植物桥接周围神经缺损对运动神经元胞体的存活具有良好的保护作用。虽然目前对脱细胞神经基质制备技术的研究甚多，进展较快，但是其制备处理方法程序复杂，而且在处理过程会损伤支架材料的微细结构和受力特性。[0004] 另外一类是利用适当的模具制备神经导管，将细胞基质或者细胞包覆在神经导管的内外表面，如文献《大鼠坐骨神经缺损后组织工程人工神经对外周靶器官及脊髓神经元的保护作用》（游华，矫树生，冯帅南等，中华创伤杂志，2010 Vol. 26 No. 3 P. 265-269) 公开了一种使用嗅球成鞘细胞（olfactory ensheathing cell, 0EC)-雪旺细胞（Schwann cell, SC)-细胞外基质成分(extracellular matrix, ECM)-聚乳酸-聚轻基乙酸共聚物 [poly (DLlactide-co-glycolid e acid), PLGA]桥接体保护大鼠坐骨神经缺损后外周革巴器官及脊髓神经元。又如申请号为CN03134541. 7，申请公布号为CN1589913的中国专利“用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经及制备方法”公开了一种用于修复周围神经缺损的组织工程化周围神经，使用神经胶质细胞或向神经胶质细胞分化的干细胞作为种子细胞，采用生物可降解材料构成的神经导管，同时应用复合有神经营养因子的控制释放微球，并含有细胞外基质。[0005]目前组织工程化周围神经中所用的支持细胞有施万细胞及各种干细胞等。这些细胞多数是同种异体来源，移植过程中可能会导致免疫原性不利于临床推广。另一方面，细胞移植入体内后具体的归属及生物学效应如何并不完全清楚，可能会由于体内的环境而失活，达不到所期望的生物学效应。这些都制约了组织工程神经移植物的发展。发明内容[0006] 本发明针对现有技术不足提供了一种利于细胞的黏附，能够促进神经轴突的再生的用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法。本发明结合组织工程方法，利用旋转细胞培养反应器将支持细胞培养于神经导管及支架上，然后利用体外脱细胞技术将支持细胞脱去，形成只含支持细胞分泌的细胞基质的组织工程神经移植物，以修复周围神经缺损。本发明可以克服自体神经移植缺点，同时可以避免同种异体细胞移植的免疫原性，提供利于神经细胞黏附的细胞外基质，建立一个有利于再生轴突生长的环境，以达到神经快速生长、功能恢复的理想目标，为临床治疗提供可行方案。[0007] 本发明具体技术方案如下：一种用于修复周围神经缺损的组织工程神经移植物，由神经导管和细胞基质构建而成，所述细胞基质是自体的或同种异体来源细胞分泌形成后脱细胞而获得。所述细胞是施万细胞、皮肤来源的成纤维细胞、皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞或诱导多潜能干细胞中的一种或几种。所述神经导管由生物可降解材料构成，优选丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。[0008] 上述神经导管可以为本领域技术人员常用的组织工程神经移植物，优选表面多孔的壳聚糖导管，如50-90%、孔径50-300Mm的具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管，管状本体内径为O. 5-8mm，壁厚O. 1-3_。具体可参照专利申请号为CN201110324474. 8，名为“组织工程神经移植物及其用途”中所述的方法制得。或者优选纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管，具体可参照专利申请号为CN200910034583. 9，公开号为CN101664346，名为“静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置”中所述的方法制得。或者优选使用表面多孔的壳聚糖导管外壳或纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管外壳，导管内部充填入丝素蛋白纤维的复合型神经导管，丝素蛋白纤维的制备可参照专利申请号为CN200910034583. 9，公开号为 CN101664346，名为“静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置”中所述的方法制得，优选每个导管中含有120根丝素蛋白单丝。[0009] 本发明还提供了上述用于修复周围神经缺损的经天然细胞基质修饰的组织工程神经移植物的制备方法，在于制备含支持细胞的组织工程神经移植物之后进行脱细胞处理得到去细胞的组织工程神经移植物。上述含支持细胞的组织工程神经移植物可以采用本领域技术人员熟知的神经移植物和细胞通过细胞培养的方式使细胞贴附于移植物内外表面生长，优选采用三维微重力细胞培养的方法。本发明使用型号为RCMW的Synthecon微重力灌入式三维培养系统。[0010] 本发明含支持细胞的组织工程神经移植物的制备及去细胞组织工程神经移植物的构建优选的技术方案如下：(I)含支持细胞的组织工程神经移植物的构建：将IOOml完全培养基缓慢注入培养容器，再加入2. 5 X IO7个细胞及无菌处理过的神经导管，再以蠕动泵缓慢注满整个容器，细胞最终密度为lX105/ml，排尽系统内空气后，开始旋转微重力循环灌注培养；旋转式生物反应器放入37°C CO2培养箱中，前24小时转速为10转/分钟，使细胞与神经导管充分接触，贴附；24小时后调整旋转式生物反应器旋转速度，使神经导管能悬浮到培养液中；继续培养2 天后更换为分化培养基培养，以促进细胞外基质分泌；培养2周后终止培养将表明贴附生长有细胞的神经导管取出，其中分化培养基优选配方为H-DMEM+15%FBS+50ng/ml HRG+2PM forsklin+50M-g/ml Vc0[0011] (2)含细胞自身分泌的细胞基质修饰的组织工程神经移植物的构建：将培养有细胞的组织工程神经移植物进行脱细胞处理，PBS清洗后去离子无菌水37 °C低渗10 min；加入细胞抽提液于37°C裂解细胞10-15 min ;PBS清洗3次后加入Dnase I (4 mg/ml) 37 °C消化30 min去除DNA，-80 1：保存备用，其中细胞抽提液配方优选为含O. 5% Triton X-100 和 20 mM 氨水的 PBS。[0012] 上述制备方法中所述细胞优选施万细胞、皮肤来源的成纤维细胞、皮肤干细胞、骨髓间充质干细胞或诱导多潜能干细胞中的一种或几种；神经导管由生物可降解材料构成，优选丝素蛋白、壳聚糖、胶原、聚乳酸或聚羟基乙酸中的一种或几种。[0013] 上述神经导管可以为本领域技术人员常用的组织工程神经移植物，优选表面多孔的壳聚糖导管，如50-90%、孔径50-300Mm的具有多孔结构、抗拉强度高的神经导管，管状本体内径为O. 5-8_，壁厚O.1-3mmο具体可参照专利申请号为CN201110324474. 8，名为“组织工程神经移植物及其用途”中所述的方法制得。或者优选纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管，具体可参照专利申请号为CN200910034583. 9，公开号为CN101664346，名为“静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置”中所述的方法制得。或者优选使用表面多孔的壳聚糖导管外壳或纳米纤维蚕丝丝素蛋白导管外壳，导管内部充填入丝素蛋白纤维的复合型神经导管，丝素蛋白纤维的制备可参照专利申请号为CN200910034583. 9，公开号为 CN101664346，名为“静电纺丝制备的人工神经移植物及其制备方法和专用装置”中所述的方法制得，优选每个导管中含有120根丝素蛋白单丝。[0014] 本发明技术方案具有如下优点：(I)神经细胞外基质（ECM)，大体上分化为胶原（Col)、层粘连蛋白（LN)、纤维粘连蛋白 (FN)、透明质酸和蛋白多糖（如硫酸软骨素、硫酸肝素蛋白多糖）等。ECM是一种为组织器官甚至整个机体的完整性提供力学支持和物理强度的物质，研究发现，LN、FN和Col等，能为神经生长提供适当的“粘着性”，使轴突沿着基质桥生长，引导神经纤维定向生长。现有技术多采用一种或几种细胞外基质的成分，如层粘连蛋白（LN)、纤维粘连蛋白（FN)等用于组织工程移植物，这些商品化的人工合成的ECM价格高昂，且成分相对单一。本发明通过培养细胞后脱细胞获得的天然的细胞外基质，保留了细胞外基质的各种重要的成分以及框架，更利于神经细胞的黏附，并对轴突再生的方向性具有一定的导向作用，因而更利于加快神经再生的进程。且与人工合成的细胞外基质相比，价格相对低廉，更容易被临床病人接受。[0015] (2)目前组织工程化周围神经中所用的支持细胞有施万细胞及各种干细胞等。这些细胞多数是同种异体来源，移植过程中可能会导致免疫原性。本发明使用的组织工程神经移植物中的细胞基质是培养的细胞形成后脱细胞获得，移植后降低或没有免疫原性，适宜大规模人群的使用。[0016] (3)本发明所述的组织工程神经移植物采用三维微重力细胞培养的方法，使支持细胞能够均匀的粘附于移植物的内外表面，脱细胞后得到的细胞外基质也均匀的分布于移植物的内外表面，有利于神经的再生。[0017] (4)本发明使用移植物不含有由于制备工艺带入的外源性毒、副作用物质，具有良好生物相容性和生物可降解性，还具有良好的力学性能。使用的神经导管管壁具有丰富微孔的三维结构，为神经细胞生长过程所需的营养物质的输送提供了必须的途径；使用的丝素蛋白丝是静电纺丝产物，拥有很大的比表面积，为神经细胞的生长提供了必要的诱导作用和必须的生长空间，使用效果好。[0018] 下面结合附图和实例对本发明作进一步说明。附图说明[0019] 图1为施万细胞（A.施万细胞光镜图；B.施万细胞免疫组化鉴定图，灰色长形代表SlOO免疫阳性，灰色点状为H0echst33342标记的细胞核)。[0020] 图2为成纤维细胞(A.成纤维细胞光镜图（100X) ;B.成纤维细胞免疫组化鉴定图（100 X )，灰色为Fibronectin免疫阳性，白色亮点为Hoechst33342标记的细胞核)。[0021] 图3为皮肤干细胞(A.皮肤干细胞球光镜图（100X );B.皮肤干细胞球免疫组化鉴定图(100X )，a代表Versican免疫阳性，b代表Nestin免疫阳性，c为Hoechst33342标记的细胞核，d为a，b，c三图的合并；C.皮肤干细胞球免疫组化鉴定图（100 X )，a代表 Vimentin免疫阳性，b代表Nestin免疫阳性，c为Hoechst33342标记的细胞核，d为a，b， c三图的合并)。[0022] 图4为皮肤干细胞定向诱导分化为施万细胞（A.皮肤干细胞定向诱导分化成的施万细胞集落光镜图（100X ) ；B.挑取皮肤干细胞球定向诱导分化成的施万细胞集落后细胞扩增光镜图）。[0023] 图5为皮肤干细胞球定向诱导分化成的施万细胞集落后细胞免疫组化鉴定图 (100X) (A代表SlOO免疫阳性.；B.为Hoechst33342标记的细胞核；C.为A，B两图的合并)。[0024] 图6为骨髓间充质干细胞及流式细胞术CD分子鉴定图。[0025] 图7为细胞基质免疫化学图（A.脱细胞后材料表面细胞基质光镜图；B.表示细胞基质FN免疫阳性；C.表示细胞基质LN免疫阳性；D.为B和C的合并图）。[0026] 图8为细胞基质对神经元生长的影响（A.将神经元培养于细胞基质上NF免疫化学图，其中ECM组是指培养在购买的ECM上的神经元；N-ECM组是指培养在支持细胞脱细胞后的细胞基质上的神经元；B.神经元的活力检测结果；C. Western Blotting检测神经黏附分子（NCAM)与轴突生长相关因子（GAP43)的表达)。[0027]图9为天然细胞基质修饰的组织工程神经移植物扫描电镜图（A.含支持细胞的组织工程神经移植物神经导管内表面，可见支持细胞均匀分布其表面脱细胞的组织工程神经移植物神经导管内表面，可见细胞外基质；C.含支持细胞的组织工程神经移植物的丝素蛋白支架；D.脱细胞的组织工程神经移植物的丝素蛋白支架)。[0028] 图10为脱细胞后丝素支架表面细胞基质免疫化学图（A.表示细胞基质FN免疫阳性；B.表示细胞基质LN免疫阳性；C.为丝素蛋白支架；D.为A，B和C的合并图）。[0029] 图11为NF免疫组化显示神经再生速度（Bar = 200Mm)，图中竖划线代表再生神经生长的最如端（A为I周后材料组，B为I周后细胞基质组，C为2周后材料组，D为2周后细胞基质组)。[0030] 图12为再生神经纤维数据统计结果图。[0031] 图13为再生神经中段横切面电镜图(标尺=5 μ m)(A为材料组；B为细胞基质组)。具体实施方式[0032] 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。[0033] 下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。[0034] 在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。[0035] 实施例1施万细胞的培养及纯化取新生一天SD大鼠，处死后酒精消毒，取双侧坐骨神经，置于冰浴操作台去除神经外膜及黏连组织，胶原酶/胰酶混合消化完全后离心弃上清液，完全培养基重悬细胞，接种到 PDL事先包被好的培养皿中培养。24小时更换成含有阿糖胞苷（10 μΜ)的完全培养基培养48小时，更换为含有HRG (50 ng/ml)和Forsklin (2 μΜ)的完全培养基继续培养，每3 天换液，直到细胞融合。待细胞融合后，胰酶消化后离心得到细胞沉淀，用I ml含Thyl.1 的完全培养基（1:1000)重悬细胞，冰上孵育2小时；离心弃上清，用DMEM和补体的混合物 (3:1)重悬细胞，37°C孵育I小时，离心后完全培养基清洗2次，重新接种于培养皿中，隔天换液，细胞长满后即可以使用（细胞培养及鉴定结果见附图1)。[0036] 实施例2皮肤来源的成纤维细胞的培养取新生I天的SD大鼠，处死后酒精消毒，取出背部皮肤置于预冷的解剖液中小心地剔除皮下组织(脂肪和皮下筋膜层、血管等）；PBS清洗3次后，用手术刀片切成小块 (基础培养液冲洗骨髓腔，收集骨髓。注射器反复抽吸收获的骨髓，制成单细胞悬液。 200目筛网过滤，置水平离心机中离心，1000rpmX5min，弃上清。以4X105/ cm2的密度接种于MDM完全培养液(含有胎牛血清10%)，置于37°C培养。24 h后全量换液，去除未贴壁细胞，以后每3 d半量换液。倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况。当细胞铺满皿底达90 %融合，传代培养(细胞培养及鉴定结果见附图6 )。[0039] 实施例5支持细胞的脱细胞方法建立将支持细胞(例如施万细胞)培养于皿中，当细胞铺满皿底达90%融合后以分化培养基 (H-DMEM+15%FBS+50ng/ml HRG+2PM forsklin+5(^g/ml Vc)培养2周刺激细胞外基质分泌。然后进行脱细胞处理，PBS清洗后去离子无菌水37°C低渗10 min;加入细胞抽提液（含 0.5% Triton X-100 和 20 mM 氨水的 PBS)于 37°C裂解细胞 10-15 min ;PBS 清洗 3 次后加入Dnase I (4 mg/ml) 37°C消化30 min去除DNA。所得的细胞外基质如(见附图7. A) 所示。通过LN及FN免疫化学鉴定该基质的部分成分：将所得的细胞外基质以4%多聚甲醒室温固定 30 min, 0. 01MPBS 洗漆 3 次后一抗：mouse anti laminin (LN), rabbit anti fibronectin (FN) 4°C孵育过夜，PBS 洗漆 3 次后加入二抗：FITC-conjugated-goat-an t1-rabbit-1gG (1:200)及 TRITC-conjugated-goat-ant1-mouse-1gG (1:200),室温孵育 2h 后荧光共聚焦显微镜（DMR，Leica)检测(见附图7. B，C和D)。[0040] 实施例6天然的细胞外基质有利于神经元轴突的生长将背根节神经元分别种到实施例5制备的含有支持细胞脱细胞后的细胞外基质和包被有购买的细胞外基质(货号：E0282 ;公司：SIGMA)的皿中，同样条件培养48小时后，MTT 法检测神经元的活力，免疫细胞化学观察神经元轴突生长情况，Western Blotting检测轴突生长相关因子GAP43及神经粘附蛋白NCAM的表达。结果如附图8所不,在两种细胞外基质上神经元的细胞活力在统计学上没有差异，但是免疫细胞化学结果显示培养于支持细胞脱细胞后的细胞外基质上的神经元的突起明显比生长于购买的细胞外基质上的神经元的突起要长，WB结果显示培养于支持细胞脱细胞后的细胞外基质上的神经元的轴突生长相关因子GAP43及神经粘附蛋白NCAM的表达高于生长于购买的细胞外基质上的神经元（附图 8)。实施例7含支持细胞的组织工程神经移植物的构建首先进行组织工程神经移植物的组装，即将壳聚糖神经导管与丝素蛋白纤维无菌处理后，在每一根神经导管内置入120根丝素蛋白单丝作为支架制成神经导管。然后将IOOml 完全培养基（DMEM+10%FBS+50ng/ml HRG+2PM forsklin)通过蠕动泵缓慢注入培养容器，再加入2. 5X IO7个已经纯化的施万细胞及组织工程神经移植物，再以蠕动泵缓慢注满整个容器，细胞最终密度为lX105/ml，排尽系统内空气后，开始旋转微重力循环灌注培养。旋转式生物反应器放入37° C CO2培养箱中，前24小时转速为10转/分钟，使细胞与移植物充分接触，贴附。24小时后调整旋转式生物反应器旋转速度，使载体能悬浮到培养液中。继续培养 2 天后更换为分化培养基（H-DMEM+15%FBS+50ng/ml HRG+2PM forsklin+5(^g/ml Vc)培养，培养期间每三天换液，更换500ml储液瓶。培养2周后终止培养将移植物取出，这样含支持细胞的组织工程神经移植物的构建完成。扫描电镜结果显示其神经导管的表面及丝素蛋白支架上均匀分布了支持细胞(见附图9. A和C)。扫描电镜实验具体方法如下：将组织工程神经移植物以4%戊二醛4° C固定后以PBS清洗3次；1%饿酸室温固定2小时后再用PBS清洗2次；乙醇梯度脱水（30%，50%，70%，80%，95%，100%)各IOmin后以无水乙醇：叔丁醇（1:1)置换IOmin ;再以叔丁醇置换2次，每次IOmin ;冷冻干燥后喷钼，扫描电镜（TCS SP2, Leica)观察。[0041] 实施例8经天然细胞基质修饰的组织工程神经移植物的构建将实施例7制得的构建好的培养有支持细胞的组织工程神经移植物进行脱细胞处理， PBS清洗后去离子无菌水37°C低渗10 min;加入细胞抽提液（含O. 5% Triton X-100和 20 mM氨水的PBS)于37°C裂解细胞10-15 min ;PBS清洗3次后加入Dnase I (4 mg/ml) 37°C消化30 min去除DNA，扫描电镜结果显示其神经导管的表面及丝素蛋白支架上均匀分布了支持细胞分泌的细胞外基质成分(见附图9. B和D)。已制成的经天然细胞基质修饰的组织工程神经移植物可在_80°C保存备用。分别用扫描电镜及免疫化学方法检测脱细胞后留下的细胞外基质成分，其扫描电镜方法同上述实施例7，免疫化学的具体方法同实施例 5，结果见附图10。[0042] 实施例9用天然细胞基质修饰的组织工程神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损用天然细胞基质修饰的组织工程神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损，通过免疫组化、透射电镜、电生理、肌肉湿重比等方法检测神经再生速度及坐骨神经恢复状况。[0043] 建立大鼠坐骨神经IOmm缺损模型并随机分为2组：一组用天然细胞基质修饰的组织工程神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损，称为细胞基质组，另一组用未经细胞基质修饰的组织工程神经移植物修复大鼠坐骨神经缺损，称为材料组。分别于术后I周，2周后灌注取再生神经行冰冻切片，NF免疫组化结果显示细胞基质组的神经生长速度快于材料组，并且细胞基质组NF阳性神经纤维相对密集，分布较均匀（图11，A为I周后材料组，B为I 周后细胞基质组，C为2周后材料组，D为2周后细胞基质组）；对再生神经纤维计数后统计结果如（图12);术后3个月，所有动物在适度麻醉下暴露术坐骨神经，行神经电生理学检测。材料组、细胞基质组CMAP平均波幅分别为：4. 63 ±O. 13mV，6. 89 ±2. 85mV，两组比较有统计学差异（P〈0. 05);术后3个月，取再生神经中断切片行透射电镜检测，电镜下，细胞基质组和材料组的再生神经横切面上均可见散在分布的再生的有髓神经纤`维，还可见少量无髓神经纤维（图13，A为材料组；B为细胞基质组)。材料组、细胞基质组神经髓鞘厚度分别为：0. 63±0· 27μπι、0· 82±0· 39 μ m，两组之间有统计学差异(Ρ〈0· 05)。

用于修复周围神经损伤的细胞基质修饰的组织工程神经移植物及其制备方法

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