利用抗原呈递自然机制的基于树突细胞的免疫疗法代表了最有 前景的非毒性癌症治疗方法。其可以作为单独治疗，或者作为其他 类型疗法(例如外科手术、放射和化疗)的辅助。该策略基于细胞 产物的体外操纵和再导入来绕过免疫功能，目的是诱导肿瘤特异性 的免疫反应。因此，这种基于树突细胞的免疫疗法的终极终极目标 是体内诱导肿瘤特异性效应细胞，近期进展集中于能够识别并杀伤 肿瘤细胞的CD8+细胞毒T淋巴细胞(CTL)。另外，感染疾病例如 HIV的治疗可以受益于基于树突细胞的接种策略。
抗原呈递
肿瘤特异性免疫反应的诱导，需要表达主要组织相容性复合物 (MHC)分子以及膜结合并分泌的共刺激分子的专业抗原呈递细胞 (APC)的参与。而且，这种APC必须能够吸收、加工并呈递与MHC 结合的抗原。
树突细胞(DC)是免疫系统的专业APC，其具有刺激幼稚T细 胞和记忆T细胞的能力。导致DC成熟的阶段与细胞的某些性质有 关。未成熟DC特别善于通过吞噬或胞饮作用吸收细胞外抗原，并 在细胞内区室例如内体和吞噬体中将抗原加工成肽。这里，肽与II 类MHC分子结合。未成熟的DC还具有将肽从外源蛋白质负载至I 类MHC分子呈递途径的独特能力，一种被称为交叉呈递的过程。
通过激活1型CD4+辅助性T细胞(Th1细胞)和CD8+细胞毒性 T细胞(CTL)而有效刺激免疫反应的能力关键依赖于成熟DC。只有 具有一系列膜结合共刺激分子和辅助分子(例如CD40，CD80，CD83， CD86和II类MHC)的完全成熟的DC才可能有效诱导抗原特异性 T淋巴细胞的繁殖和分化1。
DC的共刺激活性的重要作用由分泌的细胞因子、特别是 IL-12p70来提供。Heufler等(1996)1清楚证明了其在T细胞活化中的 作用以及其偏向Th1型反应。而且，Inoue等(2005)报道了肿瘤中表 达IL-12的成熟DC的存在与患者存活之间的良好相关性。用于接种 的成熟DC应该产生有限量的Th1细胞抑制性细胞因子IL-10。
CCR7是淋巴结中基底细胞产生的趋化因子CCL19和CCL21的 受体。表达足够水平的活化CCR7的DC响应CCL19或CCL212而 迁移至淋巴结。这里，它们遇到T淋巴细胞并可以引发免疫反应。
产生成熟DC的方案
已经描述了用于产生成熟DC的许多方案。目前用于诱导DC的 最普遍使用的“标准”方案采用由IL-1β，IL-6，TNF-α和前列腺素E2 组成的成熟鸡尾酒。尽管有归因于CCR7的迁移活性和体内免疫刺 激活性，但是由该鸡尾酒成熟的DC产生了IL12p703生成能力降低 的DC。
另一组DC成熟方案包括聚肌苷:聚胞苷酸，聚-(I:C)。其通常与 细胞因子例如TNFα、IL-1β、IFN-γ和IFN-α结合使用。该方法产生 的DC生成IL-12p70，但是它们通常表达低水平的CCR7。聚-(I:C) 存在下获得的DC的低水平CCR7表达特征，限制了它们在体内迁 移至淋巴结。
近来，公布的专利申请US2005/0003533A1公开了表达CCR7 的树突细胞的成熟方法，所述树突细胞在CD40L刺激后能够被诱导 产生IL-12p70。
因此，依然存在对开发用于产生如下成熟树突细胞的标准化方 法的未满足的要求：表达高水平的活化CCR7，并同时产生足量的 IL-12p70。
而且，尽管许多研究者的努力，但是用于癌症疗法的基于树突 细胞的疫苗一般提供了最温和临床效力的免疫反应。这些疫苗主要 通过自体DC的体外操纵和抗原负载来产生。日益增加的对患者安 全性的需求，要求高水平的重复性和符合管理内容的顺应性。因此， 强烈需要正确产生装配DC的方法，所述DC有效诱导免疫反应并特 别提供改良的临床反应。
另外，体外产生的DC还可以作为治疗疫苗应用于治疗一些慢 性感染疾病，例如HIV以及乙型和丙型肝炎，其中传统疫苗方法不 能有效地起作用。临床前和首次临床4-5研究结果表明，基于DC的免 疫疗法可能是治疗HIV以及乙型和丙型肝炎的慢性感染患者的有前 景的策略。对于癌症免疫疗法，抵抗这些胞内感染剂的有效临床反 应与产生CD8+效应细胞所需的Th1辅助反应的诱导有关5。因此， 可以预期，体外产生的树突细胞应该具有相同的用于治疗癌症和慢 性感染疾病的特征。

本发明的第一方面涉及通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展 过程中采用低于37℃的温度来产生树突细胞的方法。
本发明的第二方面涉及树突细胞群，其中所述细胞通过在祖细 胞和未成熟树突细胞的发展过程中采用低于37℃的温度来树突细胞 的方法而产生。
本发明的第三方面涉及包含树突细胞群的药物组合物，其中所 述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采用低于37℃ 的温度来树突细胞的方法而产生。
本发明的第四方面涉及细胞群用于刺激和/或扩增T细胞的用 途，其中所述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采 用低于37℃的温度来树突细胞的方法而产生。
本发明的第五方面涉及细胞群用于诱导受体中免疫反应的用 途，其中所述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞的发展过程中采 用低于37℃的温度来树突细胞的方法而产生。
本发明的第六方面涉及细胞群生产用于治疗或预防癌症或感染 疾病的药剂的用途，其中所述细胞通过在祖细胞和未成熟树突细胞 的发展过程中采用低于37℃的温度来树突细胞的方法而产生。
附图说明
下面参考附图详细说明本发明，其中：
图1描述了温度对DC的重要共刺激和辅助表面分子的影响。 图1B描述了低温对CCR7表达的影响。
图2描述了温度对由培养初期DC(A)产生的IL-10、以及由未成 熟DC(B)和成熟DC(C)产生的IL-10的影响。
图3描述了温度31℃、34℃和37℃对由新方法和标准方法生 成的未成熟DC(A)和成熟DC(B)产生的IL-12p70的影响。
图4描述了低温对CCR7表达的效果。
图5描述了根据本发明(A)方法生成的未成熟和成熟DC的表 型和“标准”方法(B)的对比。
图6描述了成熟DC随时间的表型稳定性。
图7描述了DC在第7天和第10天的表型和异种刺激(MLR)活 性。
图8描述了根据本发明方法和“标准”方法产生的DC的异种 刺激活性。
图9描述了通过IFN-γ诱导测量的CMV-抗原的功能展示 (ELISPOT(酶联免疫斑点)测定)。

下面详细描述本发明。为了解释的目的，采用下述定义，并且 适当时，单数使用的术语也包括复数，反之亦然。
定义
本文使用的“分化步骤”是指其中允许细胞相应确定的分化因子 而分化的步骤。
本文使用的“成熟步骤”是指其中允许细胞相应成熟因子的存在 而成熟的步骤。
本文使用的“减小的温度”或“降低的温度”是指温度低于37℃。
用于产生树突细胞的方法是公知的J.H.Peters的方法，J.H.Peters 首次描述了单核细胞体内转化成DC样细胞的能力，首先是自发， 然后是在GM-CSF和IL-46存在下。Romani等(1994)7和Sallusto& Lanzavecchia(1994)8公布后，在这两种细胞因子存在下培养的单核 细胞广泛用于制备DC。该过程开始于从外周血液分离单核细胞，并 在GM-CSF和IL-4存在下培养5-7天。获得的细胞具有未成熟DC 的性质，特征为低水平的共刺激分子和高胞吞活性。在LPS、TNF-α 或其他成熟剂诱导的成熟过程中，细胞显著上调共刺激和辅助分子 例如CD40、CD80、CD83和CD86，并下调胞吞活性。
体内组织培养一般在37℃进行。已知朗氏细胞在29-31℃的皮 肤环境温度下是功能上活性的，并且几个研究已经记录了细胞系统 中降低的培养温度的体外生物学作用，所述细胞系统例如中国仓鼠 卵巢(CHO)细胞和猪肺泡巨噬细胞。
与Basu等(2003)9考察发热样温度对DC活化和成熟的影响的研 究相反，在几个案例中测试了减小的温度对哺乳动物细胞生长的影 响。Dexter等(1977)建议使用33℃用于培养造血干细胞9。 Athanasas-Platsis等(1995)发现，与在37℃相比较，朗氏细胞标志物 CD1a在单核细胞上的表达在34℃培养24小时过程中被上调10。
据我们了解，还没有人公开如何使用减小的温度来产生未成熟 或成熟的树突细胞。
本发明一个实施方案涉及在祖细胞发展为未成熟树突细胞过程 中采用低于37℃的温度来产生树突细胞的方法。
IL-10是DC发展的负调节剂，并且在GM-CSF存在下的单核细 胞系活化过程中产生11。Kirkley等(2003)报道，对应于培养温度从 37℃至31℃的下降，LPS刺激的巨噬细胞系产生IL-10显著减少12。 因此，本发明方法中涉及的降低的温度可以借助例如低IL-10浓度来 为DC产生提供改良的条件。
已经测试了在GM-CSF和IL-4存在下于不同温度(31℃、34℃ 和37℃)培养单核细胞对未成熟DC的CD1a表达水平的影响，CD1a 是对IL-10的抑制性作用极度敏感的分子。我们发现，更低温下产生 的DC具有更高的表达水平。所有进一步实验在34℃下进行。下一 个原理发现是，在更低温度培养后，培养物上清液中检测到的IL-10 水平实际上明显更低。
本发明的一个实施方案涉及一种方法，其中生成的树突细胞为 成熟的树突细胞。
本发明的一个实施方案涉及一种方法，其中祖细胞和成熟的树 突细胞的发展包括所述细胞的分化。
本发明的一个实施方案涉及一种方法，其中分化步骤温度低于 37℃的方法。
本发明的一个实施方案涉及一种方法，其中温度为31℃至37℃ 的方法。该温度可以是31℃、32℃、33℃、34℃、35℃或36℃中 的任何温度。
本发明的一个实施方案涉及其中温度为34℃的方法。
本发明的一个实施方案涉及其中祖细胞是自体祖细胞的方法。
本发明的一个实施方案涉及其中祖细胞选自髓样祖细胞或干细 胞的方法。
本发明的一个实施方案涉及其中髓样祖细胞是单核细胞的方 法。
本发明的另一个实施方案涉及通过本发明方法产生的树突细胞 群。
本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，其中所述细胞表达 CCR7和/或IL-12p70。
本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，其中所述细胞表达 CD1a、CD14低、CD83、CD86和IL-10低。
本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，进一步包括与细胞表 面的MHC分子结合呈递的至少一种抗原。
本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，其中所述至少一种抗 原是肿瘤抗原。
本发明的一个实施方案涉及树突细胞群，其中所述肿瘤抗原选 自：癌症/睾丸抗原、家族特异性分化抗原、肿瘤过表达抗原、突变 或异常表达抗原以及病毒抗原。
本发明另一实施方案涉及上述树突细胞群用于刺激和/或扩增T 细胞的用途。
本发明另一实施方案涉及树突细胞群用于刺激和/或扩增T细胞 的用途，其中所述T细胞是自体T细胞。
本发明另一实施方案涉及树突细胞群用于刺激和/或扩增T细胞 的用途，其中所述用途是体外用途。
本发明另一实施方案涉及树突细胞群用于诱导受体中免疫反应 的用途。
本发明另一实施方案涉及包含树突细胞群的药物组合物，其中 所述群如上所定义。
本发明一个实施方案涉及药物组合物作为药剂的用途。
本发明另一实施方案涉及包含树突细胞群的药物组合物，进一 步包含常规的佐剂和赋形剂。
本发明替代实施方案涉及树突细胞生产用于治疗或预防癌症或 感染疾病的药剂的用途。
本发明替代实施方案涉及树突细胞生产用于治疗或预防癌症或 感染疾病的药剂的用途，其中所述癌症选自黑素瘤、乳腺癌、结肠 癌和肺癌，或者可以是任何类型的癌症。
本发明替代实施方案涉及树突细胞生产用于治疗或预防癌症或 感染疾病的药剂的用途，其中所述感染疾病选自：HIV和肝炎或者 其他慢性感染疾病。
实施例
现在通过下述并非以任何方式限制的实施例描述本发明。
实施例1：降低温度下树突细胞的生成
树突细胞通常从血库获得的暗黄覆盖层生成。60mL暗黄覆盖 层用60mL无钙且无镁的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS，产品号 BE17-512F，Cambrex，Belgium)稀释，并应用至四个50-mL管，每个 管含有15mL淋巴细胞分离剂(产品号1053980，AXIS-SHIELD PoC AS，Norway)。离心(460g，30min，20℃)后，将10-20mL上部血浆层 转移至单独的管。估计这是大约40％的血浆(稀释的血浆)。血浆的最 终制备包括添加肝素(25IU/mL)并离心(1500g，15min，4℃)。从界面 收集单核细胞，用含有EDTA的DPBS稀释两倍，并通过4-5次离 心来洗涤，第一次以250g、第二次以200g，接下来以150g离心， 所有离心在4℃，12min。最后一次离心之前，使用Coulter计数仪 (Beckman Coulter，model Z2)计数细胞，单核细胞的量估计为平均尺 寸约9m的细胞数目)。细胞保存在-80℃(于10％DMSO稀释的 血浆中，每管107个单核细胞)，或者立即用于实验。
细胞以2×106单核细胞/mL的浓度重悬于吸附介质(添加了2 mM L-谷氨酰胺和2％血浆的RPMI 1640(Cambrex))。5mL的细胞混 悬液置于T25非TC处理的Falcon瓶中。37℃吸附1小时后，除去 非粘附细胞，粘附细胞用温的RPMI 1640冲洗两次，然后每个瓶中 添加7mL的培养介质(添加了2mM L-谷氨酰胺和1％血浆的RPMI 1640)。
所述瓶置于不同的温度的单独CO2-培养箱中：31℃、34℃和 37℃。在第1、3和5天添加终浓度分别为100ng/mL和50ng/mL 的分化因子GM-CSF和IL-4。
在第6天添加终浓度为10ng/mL的TNF-α以诱导成熟，温度升 至37℃持续培养最后24小时。
在第7天，收集细胞，并通过FACS分析来确定它们的表型。 使用直接轭合的抗体CD1a-藻红蛋白(PE)、CD14-异硫氰酸荧光素 (FITC)、CD83-PE、CD86-PE、HLA-DR、-P，-Q-FITC(全部来自 Pharmingen，Beckton Dickinson，Denmark)和CCR7-FITC (R&D Systems Europe，Abington，UK)对细胞染色。使用适当的同种型 对照。使用FACSCalibur流式细胞仪(Beckton Dickinson)和 CELLQuest软件(Beckton Dickinson)分析样品。
代表性实验的结果示于图1。与37℃培养的细胞相比，降低温 度下培养的细胞更多表达CD1a，而在更低温度下培养的细胞群中观 察到更少的CD83和CD86阳性细胞。31℃和34℃培养后的CD1a 的平均荧光指数(MFI)两倍于37℃培养。通过表达CD83和CD86的 DC的百分比判断的成熟度在31-34℃更低。这反映了对降低温度下 培养的细胞对成熟因子更低的敏感度，或者成熟过程本身需要37℃ 的温度。
实施例2：降低的温度对IL-10生成的影响。
在单核细胞分化为树突细胞过程中考察了作为DC负调节剂的 IL-10的产生。测量了其在第1、3和5天于培养上清液中的浓度。 通过包括捕获抗体(Ab)、标准品或样品、生物素化的检测Ab和HRP- 链霉抗生物素的夹心ELISA测量IL-10的产生，使用了eBioscience 的“Ready-Set-Go”试剂盒，基本根据生产商推荐并做了一些调整。捕 获Ab与Nunc maxisorp 96孔板结合过夜并洗涤后，室温下延长封闭 步骤至少3小时。通过开始于200pg/mL IL-10的七个连续的标准品 稀释液来产生标准曲线。标准品和样品在室温下保持2小时，随后 在4℃保持过夜。接下来的步骤根据生产商方案进行。来自相同试 剂盒的四甲基联苯胺基质溶液用于HRP的酶反应，终止反应后，测 量光密度，由于490nm和620nm读数之间的差异而进行波长校正。 这类实验的一个的结果示于图2A。单核细胞在第一天自发产生的 IL-10是低的，而在第一天添加了GM-CSF和IL-4之后显著上调。 34℃培养至5天的细胞一般产生比37℃培养的细胞显著更低量的 IL-10。在第5天对几种DC培养物的测试显示相似的模式(图2B)。 甚至在第5天洗涤细胞、将它们置于37℃、第6天添加成熟剂并在 第8天收集上清液之后，34℃与37℃相比降低的IL-10产生依然持 续(图2C)。这些结果表明，在低于37℃的温度下培养的细胞需要低 IL-10产生的稳定表型。
实施例3：降低的温度对IL-12p70生成的影响。
我们还考察了温度对IL-12p70产生的影响。通过包括捕获抗体 (Ab)、标准品或样品、生物素化的检测Ab和HRP-链霉抗生物素的 夹心ELISA测量IL-12p70的产生。使用了针对IL-12p70的试剂盒 “DuoSet ELISA生成系统”(R&D Systems)，基本根据生产商推荐并 做了一些调整。捕获Ab与Nunc maxisorp 96孔板结合过夜并洗涤后， 室温下延长封闭步骤至少3小时。通过开始于500pg/mL IL-12p70 的七个连续的标准品稀释液来产生标准曲线。标准品和样品在室温 下保持2小时，随后在4℃保持过夜。接下来的步骤根据生产商方 案进行。使用过氧化氢-四甲基联苯胺混合物作为HRP的基质溶液， 在终止反应后测量光密度，由于490nm和620nm读数之间的差异 而进行波长校正。
表1.在培养开始的5天里，温度对MCM模拟物诱导的成熟 过程中产生IL-12p70的影响。
  DC培养   直至第5天的培养温度   成熟过程中IL-12p70的产生，   pg/ml   36/04-3-3   34℃   35,1   36/04-3-4   37℃   14,1   17/05-2-1   34℃   55,2   17/05-2-3   37℃   35,7   18/05-2-1   34℃   19,0   18/05-2-3   37℃   3,7
可以看到(表1)，34℃产生的细胞产生明显更高水平的IL-12p70。
实施例4：组织培养塑料的选择
我们比较了两种组织培养塑料：非组织培养聚苯乙烯(PS)(产品 号353813，T25 BD-Bioscience，USA)和PrimariaTM塑料(产品号 353813，T25BD-Bioscience，USA)。实验设计与实施例1中描述的过 程类似，使用2％自体血浆预处理15-45min的塑料表面作为组分来 源，例如额外细胞组分，象纤维蛋白素原和纤维结合素，再不含血 清的AIM-V介质中34℃直至第5天，随后将培养物置于37℃。在 第6天添加成熟剂TNFα，IL-1β，1L-6和前列腺素E2，在第8天收 集培养物。
根据培养条件，祖细胞选择发展成巨噬细胞或DC。培养几天后， 本该发展成巨噬细胞的细胞形成附着细胞培养物，而本该发展成DC 的细胞形成松散附着的细胞培养物。最初，相等数目的细胞被接种 并附着至不同的组织培养塑料。从第6天对DC培养物光学显微镜 检查，显示PrimariaTM塑料上附着的细胞数目明显少于另一种塑料上 生长的细胞。通常，PrimariaTM塑料上生长的细胞还表现为更“清洁”， 即更少碎屑，反映了在成熟过程中更小程度的细胞死亡。
我们测试了使用不同浓度的血浆来预处理塑料。2％，10％，20％ 或40％血浆预处理PrimariaTM塑料后没有发现DC性质上的显著差异 (数据未显示)。但是，我们发现，污染淋巴细胞的量随着血浆浓度增 加至10％而减少。因此，我们在随后实验中在实施例1中所述方法 中加入了使用10％血浆处理PrimariaTM塑料的步骤。
在随后实验中，我们比较了本发明方法与“标准方法”，除非另 有说明，其如下所述进行。
树突细胞通常从获自血库的暗黄覆盖层产生。60ml暗黄覆盖层 用60mL无Ca和无Mg的Dulbecco磷酸缓冲盐水(DPBS，产品号 BE17-512F，Cambrex，Belgium)稀释，并应用至4个50-mL管，每个 管含有15mL淋巴细胞分离剂(产品号1053980，AXIS-SHIELD PoC AS，Norway)。离心后(460g，30min，20℃)，10-20mL上部血浆层转 移至单独的管。从界面收集单核细胞，用无钙和镁的PBS EDTA稀 释两次，3次离心洗涤，首次250g，第二次175g，最后一次110g， 所有离心在4℃，12min。最后一次离心之前，使用Coulter计数仪 (Beckman Coulter，model Z2)计数细胞，单核细胞的量估计为平均大 小约9μm的细胞数目。
细胞以2×106单核细胞/mL的浓度重悬于吸附介质(RPMI 1640 (Cambrex)，添加有2mM L-谷氨酰胺和1％热失活自体血浆)。5mL 的细胞混悬液置于T25无处理的PrimariaTM瓶中。37℃吸附1小时 后，除去非吸附的细胞，向每个瓶添加5mL培养介质(RPMI 1640， 添加有2mM L-谷氨酰胺和1％血浆)。
第1天，培养基更换为新鲜培养基。第3天，添加2ml培养基。 第5天，收集所有非吸附细胞并置于含有新鲜培养基的T25 PrimariaTM瓶中。
所述瓶置于37℃的CO2-培养箱中。在第1、3和5天添加浓度 分别为100ng/mL和50ng/mL的分化因子GM-CSF和IL-4。
在第6天添加TNF-α或细胞因子鸡尾酒(IL-1，IL-6，TNF-α和 PGE-2)以诱导成熟。
在第7天，收集细胞，并通过FACS分析确定其表型。
实施例5：IL-12p70的产生。
图3显示了IL-12p70产生经过两天后(第7天和第8天)的测量， 我们能够显示，新方法产生的树突细胞比标准方法产生的树突细胞 产生了更高量的IL-12p70。
实施例6：CCR7的表达。
为考察低温对CCR7表达的影响，我们采用了由IL-1β、IL-6、 TNF-α和前列腺素E2组成的成熟鸡尾酒来替代仅使用TNF-α。图1B 中所示实验结果比较了新方法和标准方法的3个不同温度。可以看 到，新方法的CCR7表达高于标准方法。
我们还在标准迁移实验中测试了新方法产生的树突细胞的 CCR7受体表达的功能性(Chemotx Disposable Chemotaxis System (116-5型)，来自Neuro Probe，Gaithersburg，MD，USA)。这里，我们 看到树突细胞向趋化因子CCL19迁移，且新方法产生的DC(数据未 显示)证实了功能性CCR7受体的表达。
实施例7：细胞产量。
本文描述的新方法还显示了比标准方法提高的细胞产量。在三 个不同运行中，我们发现在所有测试温度(31℃、34℃和37℃)下， 新方法具有比标准方法更高的细胞产量，参见表2。
表2
  温度/方法   31℃   34℃   37℃   新方法   1)   2)   3)   2,2×106   2,6×106   1,7×106   2,0×106   1,8×106   2,0×106   2,6×106   1,3×106   1,6×106   标准方法   1)   2)   3)   1,7×106   1,3×106   0,8×106   1,1×106   1,6×106   1,0×106   0,9×106   0,6×106   0,6×106
实施例8：根据本发明方法产生的DC的批间标志物变化
为符合对生产医疗目的的树突细胞的GMP要求，树突细胞性质 的批间差异应该小。为此目的，我们从8个不同供体的血液在3周 时段内进行树突细胞的制备，使用了相同批次的所有采用的试剂和 0.5％自体血浆添加至AIM-V介质。为了比较，使用“标准”方法(37℃) 进行DC生产。实验在融化的PBMC上进行。表3概括了这些实验 中产生的DC的性质。与通过“标准”方法产生的DC性质的高差 异相反，发现通过新方法获得的DC性质差异度非常低。
表3.通过标准方法或新方法产生的树突细胞的不同标志物表 达百分比

S：标准方法，N：本发明方法，ND：未测定，X：平均值
最后，图4A表示了通过新方法产生的未成熟(第5天)和成熟(第 8天)树突细胞的表型。这里，我们还测量了CD80、甘露糖受体(MR) 和两种朗氏细胞标志物-CD207(langerin)和E-钙黏着蛋白的表达。 可以看到，通过本发明方法产生的细胞不是朗氏细胞。
图5B表示通过新方法和标准方法产生的未成熟(第5天)和成熟 (第8天)树突细胞的表型。这里，我们针对标准DC标志物的表达 而对细胞进行染色。对于未成熟(第5天)，我们具有更清洁的CD1a 群。成熟群(第8天)显示了与标准方法相比，新方法产生的细胞中的 高且均一的HLA D、CD83和CD86表达。而且，通过新方法，CCR7 表达更均一表达。
实施例9.通过本发明方法产生的树突细胞的稳定性。
在注射入有机体后，树突细胞应该迁移并达到淋巴结，以刺激T 细胞。因此，DC保持其表型几天是非常重要的。进行稳定性测试的 普遍方式是收集第8天的细胞，洗出细胞因子后继续在缺乏刺激性 细胞因子下培养细胞。我们已经通过不用细胞因子培养细胞两天而 进行了这种实验。图5表示了第8天和额外两天培养后收集的DC 的FACS分析结果。显然，测量参数CD1a、CD14、CD83、HLA-D 和CCR7的表达很大程度上保持不变，因此表型保持稳定。
在类似实验中，在第8天没有洗出细胞因子，我们测试了第7 天和第10天的树突细胞的表型和异种刺激活性。图6A和6B分别 显示了表型和异种刺激活性。结果显示，异种刺激作用在培养10天 后依然高，第10天的表型特征类似于第7天测量的特征，证实了所 产生的树突细胞的高稳定性。
实施例10.由新方法生成的树突细胞的异种刺激。
我们比较了通过“标准”方法和本发明方法获得的DC的异种 刺激能力。细胞在含有5％AB人血清的RPMI 1640介质中培养。响 应细胞是通过外周血液暗黄覆盖层密度分离从健康供体获得的单核 细胞。刺激细胞是暴露于成熟细胞因子鸡尾酒2天后获得的经辐射 的成熟树突细胞，如实施例4所述。刺激细胞，0.1×106个细胞/100μl， 与图7所示滴定数目的刺激细胞(100μl)混合，并在U底96孔微滴定 板中培养5天。最后18个小时添加3H-胸腺嘧啶核苷(0.1μ居里/mL)。 随后，收集细胞用于闪烁计数。数据给出为四个平行培养的平均cpm 值。使用Wilcoxon测试来估计用于产生DC的两种方法之间的差异。 可以看到，通过本发明方法获得的树突细胞具有3-10倍的异种刺激 活性。
实施例11.由新方法生成的树突细胞的抗原呈递
为了说明DC呈递抗原至T细胞的潜力，对通过裸露的或CMV 肽脉冲的DC刺激的T细胞进行INFγELISPOT测定。选择INFγ ELISPOT测定是因为该测定提供了单细胞水平上的清晰结果，并且 T细胞遇到APC呈递的抗原之后释放INF。使用的CMV肽限于 HLA-A2，并且供体材料已知为HLA-A2阳性，因为该群的80％具有 CMV反应，所以选择该病毒模型。图9描述了ELISPOT测定结果， 显示了用载有CMV肽的DC刺激的T细胞存在强反应，表明这些 DC能够将抗原呈递至T细胞。
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