用于通过连续灌注和交互切向流来培养细胞的方法

本发明涉及对细胞的灌注培养(perfusion culturing)。

本发明公开了一种方法，用于通过对细胞培养物进行连续灌注培养来 培养细胞，所述细胞培养物包含细胞培养基和细胞，其中，细胞培养基被 加入到细胞培养物中，其中，细胞培养物在包含中空纤维的过滤器模块上 循环，导致液体流出物的细胞密度较细胞培养物要低，而过滤器模块内的 流是交互切向流。

我们惊奇地发现，按照本发明对动物(特别是哺乳动物)细胞或酵母 细胞进行灌注培养，可以获得极其高的存活细胞密度，而细胞培养物进一 步展示出极其高的细胞存活率(viability)。此外，还发现，本发明的灌注 方法使得培养物内细胞聚集更少，甚至能获得单个的细胞的悬浮液，而没 有可见的聚集物。这是令人惊奇的发现，因为使用低剪切条件，例如，在 灌注细胞培养中，典型地，不会使细胞不聚集。灌注细胞培养期间的细胞 聚集是不利的，因为例如细胞聚集物中细胞代谢情况不均一使得过程控制 会更难。如果细胞形成了5个或更多个细胞的聚集物，以及当聚集物总的 来说包含细胞总量中5％或更多的时候，这就尤其麻烦。

在US 6,544,424中描述了一种灌注方法。虽然，该文献提到，该方法 可以被用于对动物细胞进行灌注培养，但是其既没有公开也没有暗示本发 明中发现的高细胞密度。此外，US 6,544,424 B1中公开，该灌注过程可以 减少中空纤维膜表面上障碍物的粘附和生长，但是其既没有公开也没有暗 示细胞培养物中的细胞本身会更少地聚集。

Voisier et al.(Biotechnol.Bioeng.82(2003)，751-765)对悬浮哺乳细胞高 密度灌注培养中的多种细胞驻留技术进行了综述。其中提到的细胞驻留系 统中没有一种能够提供本发明的极其高的存活细胞密度以及极其高的细胞 存活率。

细胞灌注培养在本领域中有其传统含义，即，这意味着，在培养期 间，通过分离设备来保留细胞，其中存在较之分离前具有更低的细胞密度 的液体流出物，并且存在细胞培养基流入物。在本发明的方法中，该分离 设备是包含中空纤维的过滤器模块。

灌注培养包括但不限于，连续流和半连续流，例如，逐步流(step- wise flow)或交错流(staggered flow)。

术语“中空纤维”指管状的膜。该管的内径优选在0.3至6.0mm之 间，更优选地，在0.5至3.0mm之间，最优选地，在0.5至2.0mm之 间。优选地，膜的网孔大小被选择为：网孔中孔的大小接近细胞直径，确 保细胞能驻留下来，而细胞残骸能通过过滤器。优选地，网孔大小为3-30 μm。

包含中空纤维的过滤器模块可通过商业途径获得，例如，从General Electric(以前的Amersham)获得。

“过滤器模块内的交互切向流”指：在与中空纤维的膜表面相同的方 向上(即，与之相切的方向)存在一道流，所述的流来回流动，在与所述 过滤器表面基本垂直的方向上存在另一道流。可以根据本领域技术人员已 知的方法来获得切向流。例如，在US 6,544,424中描述过，可以用一个泵 使细胞培养物在包含中空纤维的过滤器模块上循环，用另一个泵移出细胞 密度较过滤器分离之前更低的液体，由此获得交互切向流。

在本发明的方法中，适用于培养细胞的任何类型的细胞培养基原则上 都可使用。选择细胞培养基及细胞培养条件的方针都是本领域内公知的， 并且在例如Freshney，R.I.Culture of animal cells(a manual of basic techniques)，4th edition 2000，wiley-Liss的第8章和第9章以及Doyle，A.， Griffiths，J.B.，Newell，D.G.Cell&Tissue culture：Laboratory Procedures 1993， John wiley&Sons中提供过。

通常，用于哺乳动物细胞的细胞培养基包含盐、氨基酸、维生素、脂 类、去垢剂、缓冲液、生长因子、激素、细胞因子、微量元素和碳水化合 物。盐的例子包括镁盐，例如MgCl2·6H2O、MgSO4和MgSO4·7H2O； 铁盐，例如FeSO4·7H2O；钾盐，例如KH2PO4、KCl；钠盐，例如 NaH2PO4、Na2HPO4和钙盐，例如CaCl2·2H2O。氨基酸的例子是全部20 种已知的蛋白质源氨基酸，例如，组氨酸、谷氨酰胺、苏氨酸、丝氨酸、 甲硫氨酸。维生素的例子包括：抗坏血酸、生物素、胆碱Cl、肌醇、D-泛 酸、核黄素。脂类的例子包括：脂肪酸，例如亚油酸和油酸；大豆蛋白胨 和乙醇胺。去垢剂的例子包括Tween 80和Pluronic F68。缓冲液的例子是 HEPES。生长因子/激素/细胞因子包括IGF、氢化可的松和(重组)胰岛 素。微量元素的例子是本领域技术人员已知的，其包括Zn、Mg和Se。碳 水化合物的例子包括葡萄糖、果糖、半乳糖和丙酮酸盐/酯。

细胞培养基的pH、温度、溶解氧浓度和渗透压摩尔浓度 (osmolarity)原则上并不重要，其取决于所选用细胞的种类。优选地， pH、温度、溶解氧浓度和渗透压摩尔浓度被选择为：其对于细胞的生长和 生产率来说是最优的。本领域技术人员知道如何找到对灌注培养来说最优 的pH、温度、溶解氧浓度和渗透压摩尔浓度。通常，最优pH介于6.6和 7.6之间，最优温度介于30至39℃之间，最优渗透压摩尔浓度介于260至 400mOsm/kg之间。

可有利地用本发明方法处理的细胞可以是从本发明的方法获得好处 (即培养至极其高的存活细胞密度以及极其高的细胞存活率)的任何种类 的细胞。

根据本发明的方法，极其高的存活细胞密度是每mL至少80×106个 细胞的密度，优选地，每mL至少100×106个细胞，更优选地，每mL至 少110×106个细胞，更优选地，每mL至少120×106个细胞，更优选地， 每mL至少130×106个细胞，最优选地，每mL至少140×106个细胞。典 型地，细胞密度的合适上限可以是每mL大约500×106个细胞。

令人惊奇地，本发明的极其高的细胞密度还伴随着极其高的细胞存活 率。极其高的细胞存活率是至少为90％的存活率，优选为至少95％，更优 选为至少97％，最优选为至少99％。

应当理解，非常高的存活细胞密度和非常高的细胞存活率是在灌注培 养进行一段时间之后达到的，通常是当细胞达到稳定状态后，对哺乳动物 细胞而言，典型的是灌注培养初始化之后12至25天。

本发明的方法适合用于培养动物细胞或酵母细胞，尤其适合用于培养 哺乳动物细胞。

本发明的方法还尤其适合用于对培养期间(尤其是灌注培养期间)容 易形成或固有地会形成聚集物的细胞(所谓的聚集细胞)进行培养。令人 惊奇地，本发明的方法不仅能减少过滤器膜上的聚集物分布，还能减少灌 注培养期间细胞的聚集，甚至是减少固有地趋向于形成聚集物的细胞的聚 集。根据本发明对聚集细胞的培养能使得培养物中至少5个细胞的聚集物 仅包含细胞总数的至多5％，优选地，至多4％，更优选地，至多3％，进 一步更优选地，细胞总数的至多2％。尤其优选地，根据本发明对聚集细 胞的培养使得培养物是真正的单个的细胞的悬浮液。

聚集细胞是形成至少5个细胞的聚集物的细胞，所述聚集物占到细胞 总数的至少5％。优选地，聚集物由至少6个，更优选至少7个，进一步 更优选至少8个，进一步更优选至少9个，进一步更优选至少10个细胞组 成。优选地，聚集物总的来说包含细胞总数的至少7％，更优选至少 10％，最优选15％。

哺乳动物细胞的例子包括：CHO(中国仓鼠卵巢)细胞、杂交瘤、 BHK(幼仓鼠肾)细胞、骨髓瘤细胞、人类细胞(例如HEK-293细胞、 人成淋巴细胞、PER.C6细胞)、小鼠细胞(例如，NS0细胞)。酵母细 胞的例子包括Saccharomyces cerevisiae、Phaffia rhodozyma、 Kluyveromyces lactis或来自Pichia属的酵母细胞。

优选地，使用哺乳动物细胞，更优选地，CHO、NS0、PER.C6细 胞。还优选地，可以使用已知在培养期间会发生聚集的细胞(聚集细 胞)。最优选地，使用PER.C6细胞。

例如，可在显微镜下对细胞聚集进行测定。

将细胞培养基加入到培养物中的速率(流入速率或灌注速率)会影响 细胞的存活率和密度。

在本发明的一种实施方式中，按照下述公式1的灌注速率，将细胞培 养基加入：

灌注速率＝SPR*细胞培养物总体积*存活细胞密度    (1)

其中，灌注速率以每天多少升来表示，其中，SPR是比灌注速率， 即，细胞培养基被加入到细胞培养物中的速率，其被表示为每时间单位每 存活细胞中加入的培养基的体积，并且，其中，存活细胞密度是每单位体 积中存活细胞的数量。本领域技术人员可以测定得到存活细胞的数量，例 如，通过台盼蓝排除方法来测定。

比灌注速率优选被选择为0.01至0.3nL/细胞/天之间，更优选地，0.01 至0.2nL/细胞/天之间。

当调节灌注速率时，可以有利地考虑其它参数，例如被加入到培养物 中的葡萄糖的量和/或氧气浓度。例如，对PER.C6而言，作为培养基灌 注速率的一部分，葡萄糖灌注速率优选被选用为3至20毫摩尔/L之间， 更优选地，5至15毫摩尔/L之间。

本领域技术人员知道如何确定流出速率。液体的流出速率是通过灌注 速率来确定的，其通常被选用为相等的值。

在本发明的一种实施方式中，流出的液体基本上没有存活细胞。

在本发明的另一种实施方式中，从细胞培养物中至少移出一次生物质 (biomass)(即，细胞培养物中的细胞)，并将额外的细胞培养基加入到 细胞培养物中，以补偿移出的生物质。移出生物质可以获得更高的细胞密 度。可以连续或逐步地移出生物质。

在逐步方法中，在给定的时间段内将生物质连续移出。如果使用逐步 方法，优选在细胞达到稳定状态的恰好之前或之后立即开始移出生物质。

如果使用逐步方法，对每个生物质移出步骤而言，优选地，每天移出 的生物质体积为工作体积的2至40％，更优选地，每天为工作体积的5至 30％，进一步更优选地，每天为工作体积的10至25％。

“工作体积”指细胞培养物的总体积。

“生物质移出步骤”指从开始移出生物质到结束之间的时间。如果使 用连续方法，那么连续移出生物质，直到细胞培养结束。优选地，连续移 出生物质起始自细胞达到稳定状态的恰好之前或之后。优选地，移出的生 物质体积每天为工作体积的2至40％，更优选地，每天为工作体积的3至 30％，进一步更优选地，每天为工作体积的4至15％。

额外加入细胞培养基用于补偿生物质的移出。其中将额外的细胞培养 基加入到细胞培养物中的加料可以与灌注加料合并，但是其也可以采用单 独加料的形式。本领域技术人员知道需要加入多少额外的细胞培养基来补 偿生物质的移出。通常，向细胞培养物中加入额外细胞培养基的速率与生 物质移出速率相同。

在本发明的另一种实施方式中，细胞要生产生物物质(biological substances)。适合在对细胞的灌注培养中生产的生物物质原则上是可以通 过动物(尤其是哺乳动物)和酵母细胞生产的所有生物物质，例如，治疗 和诊断用的蛋白质，例如，单克隆抗体，生长因子或肽激素，酶，多核苷 酸，例如用于基因疗法的病毒载体，疫苗等。

在本发明的灌注培养方法中，流出液体较之分离之前的液体，具有更 低的细胞密度，但是生物物质的浓度相同。

优选地，本发明的方法用于生产生物制药产品，生物制药产品是具有 医药应用的生物物质。生物制药产品的例子如下(括号之间是相应生物制 药产品的商品名的例子)：替奈替普酶(Tenecteplase)(TN KaseTM)、 (重组)抗出血因子(ReFactoTM)、成淋巴细胞干扰素α-n1 (WellferonTM)、(重组)凝血因子(NovoSevenTM)、依那西普 (Etanercept)(EnbrelTM)、曲妥珠单抗(Trastuzumab) (HerceptinTM)、英利昔单抗(Infliximab)(RemicadeTM)、巴利昔单抗 (Basiliximab)(SimulectTM)、达克珠单抗(Daclizumab) (ZenapazTM)、(重组)凝血因子IX(BenefixTM)、促红细胞生成素 alpha(Epogen)、G-CSF(NeupogenFilgrastim)、干扰素alpha-2b (Infergen)、重组胰岛素(Humulin)、干扰素beta 1a (Avonex)、因子VIII(KoGENate)、葡糖脑苷脂酶 (CerezymeTM)、干扰素beta 1b(Betaseron)、TNF alpha受体 (Enbrel)、囊泡刺激激素(Gonal-F)、Mab阿昔单抗(Synagis、 ReoPro)、Mab ritiximab(Rituxan)、组织血纤蛋白溶解酶原激活因 子(Activase、Actilyase)、人生长激素(Protropin、Norditropin、 GenoTropinTM)。具有可能的医药应用的多核苷酸的例子是基因治疗用的 质粒DNA。目前在临床试验中针对医药应用对一些基因治疗用DNA进行 了检验。疫苗的例子是肝、口腔四价轮状病毒疫苗(RotaShieldTM)、狂 犬病疫苗(RanAvertTM)、乙型肝炎疫苗(RECOMBIVAX HB、 Engerix)和灭活甲型肝炎疫苗(VAQTATM)。

可在所谓的下游加工中对流出物中的生物物质进行进一步纯化。下游 加工通常包括若干纯化步骤，其组合和顺序可以变动。下游加工过程中纯 化步骤的例子是：分离步骤(例如，通过亲和色谱和/或离子交换色谱)、 用于浓缩生物物质的步骤(例如，通过超滤或渗滤)、交换缓冲液的步骤 和/或去除或灭活病毒的步骤(例如，通过病毒过滤、pH改变或溶剂去垢 剂处理)。

下面将通过下述实施例来阐述本发明，但是下述实施例对本发明没有 限制。

实施例1：对人细胞系PER.C6进行工艺优化，用于生产生物药物 导论

目前有大量的表达平台用于生产生物药物。新产品中的大多数必须选 择哺乳动物体系，这主要是由于这些细胞含有而其它细胞缺乏的糖基化机 制。但是目前，这些细胞的细胞质量和得到的生产率都比相应的微生物体 系要低10-100倍，如果这些微生物细胞有生产上述产物的机制的话。

针对PER.C6细胞系(拥有大量特征，使其有利于生产生物药物的人 细胞系)开发了一种灌注培养系统及方法。灌注方法包括对培养物中多种 组分的分离，使得细胞可被保留，收获物被获取，培养基的更新得以进 行。对PER.C6细胞系进行的连续灌注培养中，旋转过滤器 (spinfilter)、声学设备(acoustic device)和交互切向流(ATF)单元的 性能被评测。

材料和方法

细胞系及其保持：将产生人IgG的PER.C6细胞系用于本研究。细胞 被保持在不含血清的商业培养基(EX-CELLTM VPRO培养基，JRH Biosciences)中，其中补充有6mM L-谷氨酰胺(Gibco)。PER.C6细胞 系是人的红细胞系，其上带有使用磷酸甘油酸酯激酶启动子的腺病毒5型 (ad5)E1基因。

生物反应器设置：在该研究中，使用1L和4L工作体积的反应器 (Applikon，荷兰和B.Braun，德国)。Braun DCU3控制器(B.Braun， 德国)被用于按照给定的设置来执行工艺。温度保持为36.5℃(范围为 35.5-37.5℃)。通过靠顶部空间对入口气体组合物进行自动调节，以及通 过微孔喷头进行间歇式喷射，将溶解氧浓度控制为空气饱和的50％(范围 40-60％)。pH的设置点为7.1(范围为6.7-7.5)，通过顶部空间的CO2流 对其进行控制。用存活细胞密度在0.2-0.5*106个细胞/mL范围内的接种 体将细胞接种到发酵罐中。灌注开始于存活细胞密度在1-3*106个细胞 /mL的范围内的时候。

细胞驻留：用三种不同的设备将细胞保持在反应器中。首先，使用孔 径为10μm的旋转过滤器(GKD，Düren，德国)。第二种，使用Biosep BDI1015细胞驻留系统和控制器(AppliSens，荷兰)。最后来评测ATF-4 控制单元，其装有相关的中空纤维膜模块(Refine Technology，美国)。 所用的中空纤维过滤器是CFP-2-E-8SIP型号(0.2微米，面积：4600 cm2，Amersham Bioscience，从Magellan instruments，美国获得)。为保持 恒定的培养物体积，使用水平传感器控制回路。

分析方法：用台盼蓝排除方法，对生物反应器的细胞进行计数。按照 下述方法来测定存活细胞的数量：将大量用台盼蓝染色过的细胞转移到 Fuchs Rosenthal血球计数器中。将血球计数器的腔室放到显微镜下，对合 适数量的小格进行计数。使用下述公式来计算存活细胞密度：

存活细胞密度(×105个细胞/ml)＝(A+B)×E/320    (2)

其中，

A＝方框A中未染色细胞的数量

B＝方框B中未染色细胞的数量

E＝稀释因子

通过用带有UV280nm吸收检测装置的HPLC，使用分析蛋白质A柱 来测定抗体浓度；基于IgG1参考标准校正曲线来确定实际浓度。

结果

灌注培养

图1-6显示了用上述材料和方法获得的结果。

附图说明：

图1：针对两种不同的连续灌注发酵的存活细胞密度(×106个细胞 /ml)对培养时间(天)的示意图，所述发酵是对产生IgG1的PER.C6克 隆来进行得，其中使用旋转过滤器分离设备。1L Applikon发酵罐的搅拌器 速率被设定为100-150rpm。灌注按照1L的工作体积进行。对两种灌注运 行模式而言，比灌注速率(SPR)都是0.1-0.3nL/细胞/天。在两种情况 下，由于旋转过滤器堵塞，灌注的运行都不得不终止。

图2：在用声学设备作为细胞驻留系统的连续灌注系统中对产生IgG1 的PER.C6细胞进行培养。1L Applikon发酵罐的搅拌器速率被设定为 100-150rpm。用于运行/停止循环的设置为300s向前(forward)和4.5s向 后(backwards)。在运行期间，这被改为300s/3s循环(第15天)。用于 灌注运行的比灌注速率在0.1-0.3nL/细胞/天之间。

图3：在用ATF-4单元作为细胞驻留系统的连续灌注系统中对产生 IgG1的PER.C6细胞进行培养。该实验在4L的Applikon发酵罐中进行。 搅拌器速度被设置为125rpm。ATF-4在每天0.5至3倍之间的工作体积下 运行。SPR被设定为0.03-0.08nL/细胞/天。插入图片显示出：培养物具有 高细胞密度，并且完全没有聚集细胞。

图4：对两种不同的灌注发酵而言，IgG1的生产率对培养时间(天) 的图，所述发酵是用旋转过滤器分离设备对产生IgG1的PER.C6克隆进 行的。

图5：在用声学设备作为细胞驻留系统的连续灌注系统中，产生IgG1 的PER.C6细胞的生产率。

图6：在用ATF单元作为细胞驻留系统的连续灌注系统中，产生IgG1 的PER.C6细胞的生产率。

概括

关于针对不同类型的灌注获得的数据的总结，参见表1。

表1.对使用三种不同的驻留设备进行的灌注中存活细胞密度、体积产 率(基于反应器体积)和产量提高的总结。加入了分批和补料分批的结果 用于比较(数据未示出)。   方法   最大存活细胞密   度(106个细胞   /mL)   生产率  产量(生产的产  品的总量)提高  因数   分批   8-10   0.5g/L  1   补料分批   8-10   1.2g/L  2.4   连续灌注   旋转过滤器驻留   设备   20-30   0.1-0.2g/L/天  2.8-5.6   声学驻留设备   20   0.6g/L/天  16.8   ATF驻留设备   100   0.9g/L/天  25.2

可以得出结论，使用ATF单元进行的连续灌注实验显示出了明显的获 得非常高的细胞密度和产品浓度的潜力(100×106个细胞/mL和0.9g/L/ 天)，而且没有观察到PER.C6细胞的聚集。

            实施例2通过灌注来培养PER.C6细胞

设备：B.Braun发酵罐控制单元(Braun，德国)，7L Braun容器和具 有相关pH、溶解氧(DO)和水平传感器探针(Braun，德国)的磁头板 (headplate)，ATF-4控制单元，装有相关的中空纤维膜模块(Refine Technology，美国)。

过滤器

过滤器型号：CFP-2-E-8SIP

种类：0.2微米

面积：4600cm2

Amersham Bioscience

工作体积：

设置点：4.1L

范围：3.8-4.7L

ATF设置  参数   设置点   范围  压升设置点(psi)   可变   2-4  压升流(L/min)   3.2   2.5-4.0  排出流(L/min)   3.2   2.5-4.0  排出时间(s)   可变   3-8  前压力(pre-pressure)(psi)   可变   5-9

排出速率

该方法中没有应用生物质的去除过程。

材料：Ex-CELLTM VPRO培养基(JRH Bioscience，美国)中6mM (最终体积)的L-谷氨酰胺(Gibco)，12％的Na2CO3被用于控制pH。

细胞系和培养条件

在本研究中对表达模型IgG的PER.C6细胞系进行研究。PER.C6细 胞系从由视网膜获得的初级人类细胞产生。PER.C6细胞系能产生完整的 人单克隆抗体(包括聚糖)(参考文献1)(参考文献2)。

在Erlenymer摇瓶中于110rpm和36.5℃下培养细胞。用5％CO2/空 气混和物对这些瓶子的顶部空间加以控制。

参考文献1：Jones，D.H.，van Berkel，P.H.C.，Logtenberg，T.and Bout， A.，2002，‘PER.C6 cell line for human antibody production’，Gen.Eng.News 22， 50-54。

参考文献2：Jones，D.et al.，2003，‘High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6’，Biotechnol.Prog.19，163-168。

发酵罐操作

细胞被培养于发酵罐中，其中，溶解氧压力、pH、温度和搅动速率按 照下面详述的内容来控制。   参数  设置点  范围   温度  36.5℃  35.5-37.5   pH  ＞6.7  7.5-6.7  如果pH＜6.7，用12％Na2CO3进行主动的pH控制   DO  50％  40-60％   搅动  100-300  随着存活细胞密度(VCD)的增加逐步增加  VCD(×106个细胞/ml)   搅动(rpm)  0.3-10   120  10-30   150  30-50   170  50-80   200  80-100   230  100-120   260  ＞120   300

方法描述：

用细胞接种发酵罐，其中接种体的存活细胞密度范围为0.2-0.5×106 个细胞/ml，设置点为0.3×106个细胞/ml。当存活细胞密度＞2×106个细 胞/ml或在培养的第5天(取先到达的时间)开始进行灌注。

灌注速率取决于培养物的细胞密度，所用的速率如下表所示。随着发 酵罐内细胞密度增加，对流速和稀释速率加以调节。

用于培养PER.C6细胞的灌注速率 存活细胞密度(×106个 细胞/ml)   比灌注速率(nl/细胞/天)   比灌注速率的设置点   (nl/细胞/天)  灌注第1天   0.15-0.25   0.2  3-50   0.03-0.06   0.04  50-80   0.025-0.035   0.03  ＞80   0.01-0.03   0.02

下表2和图7和图8中展示了来自该实施例的实际数据和结果(除此 之外，还包括本实施例中所用的流速和比灌注速率)。

图7：对于使用灌注方法培养的PER.C6细胞而言，培养时间(天) 对流速(L/天)和比灌注速率(SPR，以nl/细胞/天表示)的图。

图8：使用实施例2的流程，得到的存活细胞密度和细胞存活率

表2.从实施例2获得的原始数据   时   间   流速   (FR)   稀释速率   (D)   比灌注速率   (SPR)   存活数   (VC)   存活   率   产物浓   度   IgG1的   比产率   体积   产率   天   L/天   工作体积/   天   nL/细胞.天   106/mL   ％   g/L   pg/(细   胞.天)   g/L.天   0   0.00   0.00   0.00   0.6   90   0.012   NA   NA   1   0.00   0.00   0.00   0.3   77   0.008   NA   0.000   2   0.00   0.00   0.00   0.3   73   0.008   0.0   0.000   3   0.00   0.00   0.00   0.5   80   0.013   12.1   0.000   4   0.00   0.00   0.00   0.9   87   0.019   9.3   0.000   5   0.00   0.00   0.00   1.4   92   0.033   12.0   0.000   6   2.39   0.52   0.20   2.6   95   0.035   5.5   0.009   7   1.06   0.24   0.05   4.9   95   0.054   9.5   0.017   8   2.70   0.57   0.08   7.3   97   0.073   7.2   0.026   9   2.60   0.57   0.05   12.3   97   0.067   3.5   0.040   10   4.29   0.95   0.05   18.6   97   0.115   7.8   0.069   11   5.40   1.20   0.04   26.9   97   0.140   7.0   0.137   12   6.80   1.48   0.05   31.8   96   0.127   5.6   0.179   13   7.39   1.68   0.04   41.4   99   0.129   5.6   0.202   14   8.28   1.88   0.04   44.3   98   0.139   5.8   0.238   15   10.26   2.33   0.03   68.3   98   0.116   4.4   0.269   16   10.70   2.43   0.03   86.1   99   0.151   4.6   0.318   17   12.10   2.63   0.03   80.3   98   0.163   4.9   0.397   18   11.83   2.57   0.02   112.3   98   0.292   7.6   0.592   19   12.50   2.78   0.02   123.0   99   0.291   6.6   0.780   20   12.09   2.57   0.02   126.0   99   0.293   6.3   0.781   21   11.91   2.59   0.02   135.0   98   0.332   6.5   0.806   22   13.70   2.98   0.02   127.5   97   0.395   8.2   1.012   23   10.00   2.17   0.02   128.5   95   0.470   9.3   1.114