[0001] 本申请是申请日为2009年12月04日和发明名称为“用于制备血小板的方法”的200980153619.3号发明专利申请的分案申请。

[0002] 本发明涉及用于由成熟巨核细胞制备血小板的方法。

[0003] 巨核细胞(MK)分化是以顺序的步骤为特征的连续过程。MK倍性通过核内有丝分裂增加，同时细胞大小平行增大。储存细胞器和质膜的合成增加，导致分隔膜的形成。胞质成熟与MK大小的显著增加相关。最后，成熟MK经历微管参与的完全细胞骨架重组，来诱导相当于前血小板(proplatelet)的伪足伸长(Patel等人，2005a；Richardson等人，2005)。血小板从这些包含所有血小板细胞器的前血小板的尖端释放。

[0004] 循环血小板通过粘附于血管壁和通过将第一层粘附血小板聚集到内皮下基质参与血栓形成(Ruggeri，2003)。血管性血友病因子(Von Willebrand factor)(VWF)是内衬于-1脉管系统中的内皮细胞的主要组分。VWF是能够在高剪切率(＞1000s )条件中抑留循环血小板的唯一蛋白。系留的血小板通过GPIb(又名CD42b)与VWF A1结构域的结合转位到固定基质VWF上(Huizinga等人，2002)。在血小板的瞬时系留过程中进行性发生的αIIbβ3整联蛋白(又名CD41a/CD61)的活化包括GPIb-介导的信号传导并使得αIIbβ3结合VWF的RGD序列。巨血小板综合症(BSS)是以严重的血小板减少和巨血小板为特征的出血性障碍(Nurden，2005)。这是由于GPIb-IX-V复合物，特别是包含VWF结合位点的GPIbα亚基，的数量上或性质上的异常。在BSS病人的骨髓中发现正常数目的MK，提示在该情况中观察到的巨血小板减少症与MK的缺陷血小板形成有关。

[0005] 由于不是经常在骨髓隙中观察到MK破碎成血小板，MK需要迁移入骨髓毛细管中(Tavassoli和Aoki，1981)。血小板与前血小板脱离已在缺少流动条件的情况下描述。有趣的是，从在促血小板生成素(TPO)存在的情况下培养的MK脱落的血小板产量远低于在最佳成熟条件中可能预期的产量(Norol等人，1998)。血小板脱落的许多步骤仍然是难以捉摸的。特别是从来没有证明剪切力对血小板形成的作用。VWF受体GPIb和αIIbβ3都是在成熟过程中在MK表面上表达(Debili等人，1990)。少数成熟MK已经在血液循环中被识别(Pedersen，1978；Tavassoli和Aoki，1981)，其中它们暴露于在内皮细胞的内腔侧上的VWF。

[0006] 而且，有趣的是，在最佳的MK培养条件下，脱落的血小板的体外产量远低于可以由体内大的血小板日产生量预期的产量。因此，非常需要制备血小板的良好体系。

[0007] 本发明涉及用于由成熟巨核细胞制备血小板的体外方法，所述方法包括使成熟巨-1核细胞的悬浮液在涂覆有血管性血友病因子的固相上经历剪切率至少为600s 的流动。

[0008] 发明详述

[0009] 定义：

[0010] 如本发明所使用的，术语“血小板”表示参与导致形成血凝块的初级止血(primary hemostasis)的细胞机制的由细胞衍生的无核胞质体。

[0011] 如本发明所使用的，术语“前血小板”表示可导致血小板形成的巨核细胞或其片段的任何结构形式，例如胞质连接的血小板样颗粒。所述结构形式包括但不限于具有长的胞质延伸、突出或伪足的细胞，所述延伸、突出或伪足包含包括在各形成阶段的血小板体的膨大，例如，节结、水泡等。

[0012] 如本发明所使用的，术语“巨核细胞”表示负责产生正常止血所需的血小板的骨髓细胞。巨核细胞源自骨髓中的造血干细胞前体细胞。巨核细胞生成的原始信号是促血小板生成素或TPO。TPO对于诱导骨髓中的祖细胞向最终巨核细胞表型的分化是必需的。用于巨核细胞分化的其他分子信号包括GM-CSF、IL-3、IL-6、IL-11和促红细胞生成素。

[0013] 如本发明所使用的，术语“成熟巨核细胞”表示以稳定方式表达GPIb和αIIbβ3表面标志物的巨核细胞的群体。如本发明所使用的，表面标志物的“稳定方式表达”表示在细胞群体中，至少70％的细胞表达这些表面标志物。

[0014] 如本发明所使用的，术语“剪切率”表示用于表征层流的参数。在管中，层流具有抛物线流速特征，相邻流动层的渐增的流速在腔轴处达到最大值。在相邻层中径向速率增加率定义为剪切率。在平行板腔中，剪切率由公式(γ)给出，并对应于流动物料中的速度-1梯度。用于剪切率的SI计量单位是s ，表示为“倒易秒”或“倒数秒”。剪切率的公式(γ)是：

[0015] γ＝f(k)6Q/ab2

[0016] 其中γ是剪切率(以s-1计)，Q是流速(ml/s)，a＝狭缝宽度(cm)，b＝狭缝高度(cm)和f(k)是该系统的物理参数的函数。例如，使用来自马斯特里赫特仪表(Maastricht -1Instrumentation)的流体室(描述在(Legendre等人，2006)中)，对于剪切率＞100s ，f(k)等于1.03。因此，可以通过控制流速和腔室的狭缝高度来调节剪切率。

[0017] 在人体血液循环中，剪切率在最大静脉中的30-40s-1到微血管循环中的5000s-1之间变化。

[0018] 如本发明所使用的，术语“血管性血友病因子”或“VWF”表示由参与止血的几种单体组成的多聚体蛋白。人血管性血友病因子的示例性氨基酸序列可以在GenPept数据库中以登录号AAB59458找到。优选本发明的血管性血友病因子是哺乳动物血管性血友病因子，更优选鼠科动物因子或灵长动物因子，更优选人血管性血友病因子。术语“VWF”包括任何哺乳动物来源的VWF，例如灵长动物VWF，优选人VWF。也可以是重组VWF。本领域技术人员可根据本领域的标准技术容易地制备重组VWF。

[0019] 根据本发明，VWF因子可以是重组VWF或天然VWF。在以其天然形式存在时，其可被纯化或可被包含在含有其他组分的组合物中(例如在细胞外基质中)。

[0020] 还包括VWF的片段、VWF的变体和VWF的类似物，其中所述片段、变体和类似物具有结合GPIb的能力。VWF的片段、变体和类似物可以包括，但不限于：VWF的52/48-kDa胰蛋白酶片段(Fujimura等人，1986)；金黄色葡萄球菌V-8蛋白酶消化的VWF(Girma等人，1986a；Girma等人，1986b)；用于治疗用途的VWF浓缩物(Federici，2005；Goudemand等人，
2005；Houdijk等人，1986)如Haemate-P/Humate-P(来自Behring)、Wilfactin(来自LFB；
参见(Goudemand等人，2005))和Immunate(Baxter，Vienna，Austria)；以及引起2N型血管性血友病的VWF突变体(其在因子VIII结合方面存在缺陷)。

[0021] 如本发明所使用的，术语“血小板计数减少障碍”表示血小板生成的问题或导致血小板的低浓度的血小板降解增加或因处于正常范围的血小板的异常功能导致的问题。如本3
发明所使用的，“血小板的低浓度”表示浓度低于150000个血小板/mm。根据本发明，血小板计数减少障碍包括但不限于自身免疫性血小板减少症、与生成减少有关的血小板减少症(中心起源)和与任何原因的破坏增加有关的血小板减少症(外周起源)。

[0022] 如本发明所使用的，术语“受试者”表示哺乳动物，例如啮齿类动物、猫科动物、犬科动物和灵长类动物。优选本发明的受试者是人。

[0023] 用于制备血小板的方法和装置：

[0024] 本发明涉及用于制备血小板的体外方法，所述方法包括使成熟巨核细胞的悬浮液-1在涂覆有血管性血友病因子的固相上经历剪切率至少为600s 的流动。

[0025] 在优选的实施方式中，该流动的剪切率至少为800s-1、优选至少为1000s-1、优选-1 -1 -1 -1至少为1200s 、优选至少为1400s 、更优选至少为1600s 、至少为1800s 或者至少为-1
2000s 。

[0026] 典型地，该流动的剪切率不超过血小板在体内可能经受的生理剪切率。典型地，所-1 -1 -1述剪切率不超过6000s 、优选不超过4000s 、更优选不超过3000s 。

[0027] 在一个实施方式中，成熟巨核细胞的悬浮液呈现0.5×106到4×106/mL，优选至少6 6 6
1×10/mL，优选至少2×10 细胞/mL，更优选至少4×10/mL的细胞浓度。

[0028] 典型地，成熟巨核细胞的悬浮液包含悬浮在适当的细胞培养基中的巨核细胞群体。在一个实施方式中，所述细胞培养基是Iscove's Modified Dulbecco's培养基(IMDM)。

[0029] 成熟巨核细胞的悬浮液可以在从血液样品或者骨髓样品分离后获得。或者，可在适当条件下使用稳定的巨核细胞细胞系(例如DAMI(Greenberg等人，1988)，Meg-01(Isakari等人，2009)，UT7/TPO(Barroga等人，2008))的悬浮液。根据本发明，成熟-1巨核细胞悬浮液经历600s 的剪切率，持续足以产生血小板的处理时间。典型地，所述处理时间可以为10分钟到2小时，典型地为15分钟到1小时，更优选地为15分钟到30分钟。
在优选的实施方式中，所述处理时间为约20分钟。

[0030] 在具体的实施方式中，固相通过与血管性血友病因子或者其片段或变体或类似物的溶液一起孵育而涂覆。

[0031] 用于涂覆固相的VWF的浓度通常为5到100μg/mL。在优选的实施方式中，VWF的浓度是20μg/mL。

[0032] 在一个实施方式中，该固相涂覆有选自下组的片段或者变体或者类似物：VWF的52/48-kDa胰蛋白酶片段、金黄色葡萄球菌V-8蛋白酶消化的VWF、用于治疗用途的VWF浓缩物和重组野生型VWF或引起2N型血管性血友病的VWF突变体。

[0033] 用于由成熟巨核细胞制备血小板的方法可以在流体室中进行，其中所述流体室包括涂覆有VWF或者其片段或变体或类似物的底壁，其中所述其片段、变体或类似物结合GPIb。

[0034] 本发明也涉及用于由成熟巨核细胞制备血小板的装置，所述装置包括流体室，所述流体室包括涂覆有VWF或者其片段或变体或类似物的底壁，其中所述其片段、变体或类似物结合GPIb。

[0035] 在优选的实施方式中，所述流体室由矩形腔构成。

[0036] 在进一步的实施方式中，所述流体室的底部是涂覆有本发明的因子的盖玻片。

[0037] 在进一步的实施方式中，用于制备血小板的流体室是在(Mekrache等人，2002)和(Legendre等人，2006)中描述的腔室。

[0038] 在另一个实施方式中，所述流体室是微流体流动系统例如玻璃微毛细管(Kauskot等人，2007)，或微流体生物芯片和流量传感器(Robinson等人，2008；Williams等人，2002)，或任何其他类型的微流体流动系统(例如参见Conant等人，2009)。

[0039] 有利地，适合于本发明的一些流体室允许在无菌条件下工作(例如参见Williams等人，2002和Conant等人，2009)。在优选的实施方式中，所述流体室是无菌的。

[0040] 在进一步的实施方式中，剪切率由于流体室中的电泵而获得。

[0041] 血小板和药物组合物：

[0042] 作为另一目的，本发明涉及由上述方法可获得的血小板。

[0043] 作为本发明的进一步的目的，由上述方法可获得的血小板可用于制备药物组合物。

[0044] 因此，本发明也提供含有本发明的血小板的药物组合物。通常所述药物组合物可包含一种或多种药学可接受的和/或被认可的载体、添加剂、抗生素、防腐剂、佐剂、稀释剂和/或稳定剂。这种辅助物质可以是水、盐水、甘油、乙醇、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。适合的载体通常是大的、缓慢代谢的分子例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚二醇酸、聚合的氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。该药物组合物可以含有额外的添加剂，例如甘露醇、右旋糖酐、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮，或者其他的添加剂，例如抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或适于体内施用的重组蛋白(例如人血清白蛋白)。

[0045] 如本文中所使用的，术语“药学可接受的”意指当适当地施用于哺乳动物(特别是人)时，不会产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。药学可接受的载体或赋形剂意指无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂辅料。

[0046] 而且，本发明血小板和本发明药物组合物可用于治疗血小板计数减少症障碍，特别是血小板减少症和血小板病。例如，由本发明方法可获得的血小板可以以有效量输入患有血小板生成障碍的受试者中。

[0047] 在优选的实施方式中，血小板计数减少障碍可选自自身免疫性血小板减少症、与生成减少有关的血小板减少症(中心起源)或与任何原因的破坏增加有关的血小板减少症(外周起源)。

[0048] 本发明的相关方面涉及用于治疗患有血小板计数减少症障碍的受试者的方法，所述方法包括将有效量的本发明血小板(或其群体或其药物组合物)给药于受试者的步骤。

[0049] 在本发明的情况中，如本文所使用的术语“治疗”或“疗法”意指目的在于延迟或防止病理发作、在于逆转、缓解、抑制、延缓或停止病理症状的发展、加重或恶化、在于导致病理症状的改善和/或在于治愈病状的方法。

[0050] 如本文所使用的，术语“有效量”意指足以实现预定目的的本发明血小板(或其群体或其药物组合物)的任何量。

[0051] 有效剂量和给药方案可以基于受试者的病理性质通过良好的医疗实践容易地确定，并取决于许多因素，包括但不限于：病理症状的程度和所关注的组织或器官的损伤或退化程度，以及受试者的特征(例如，年龄、体重、性别、总体健康等)。

[0052] 为了治疗，本发明的血小板和药物组合物可以通过静脉内给药而全身性施用。给药剂量和次数可以由本领域技术人员以已知方式优化。

[0053] 而且，本发明的血小板可用于诊断目的。它们可作为用于血小板功能标准化的正常对照。

[0054] 血小板功能测试要求来自正常个体和感染个体的天然功能性状态下的新鲜血液血小板。血管性血友病是出血性疾病的最常见的单一原因。另外，高达50％的皮肤粘膜出血性疾病由血小板功能障碍所引起。血小板功能测试的标准化要求实验室应该对所进行的每批血小板功能测试进行正常对照。然而，通过静脉穿刺的连续常规血液采样引起几种健康担忧和伦理问题。血小板功能的实验室评估包括透光率集合度测定(light transmittance aggregation)和ATP释放试验、糖蛋白试验、电子显微术、促凝血功能测试、遗传测试(Pai和Hayward，2009)。

[0055] 因此本发明涉及用于诊断血小板障碍的方法，包括使用本发明的血小板以标准化血小板功能的步骤。

[0056] 通常，本发明的血小板可以由上述的巨核细胞细胞系获得。然后它们用于在体外诊断测试中标准化血小板功能。换言之，它们在测定血小板功能的体外诊断试验中用作阳性对照。

[0057] 通过以下实施例、附图和表格进一步说明本发明。

[0058] 图1：在高剪切率、抑制剂的作用和粘性表面下前血小板形成的定量。将悬浮在-1IMDM中的细胞以1800s 在VWF上灌流10min，然后将单独IMDM灌流10min。粘附导致大的细胞形状变化并导致前血小板形成。图A显示与未变形的MK相比(阶段1)，在前血小板和血小板释放之前的剪切条件下MK变形的两个阶段；早期变形以细胞质延伸为特征(阶段2)；阶段3包括MK的后期变形，具有细胞极或两端的细胞骨架重组，连续的“成串珠”的长细丝，然后细胞破裂成细薄的区域。进一步暴露于剪切，所产生的血小板仍然与长细胞质血小板串或血小板双联体以及圆形血小板有关。定量化显示于图B中：(a)，MK形状改变分为四类：1)转位的MK；2)早期变形的MK，丧失球形；3)晚期变形的MK和前血小板的延长；
4)前血小板破碎和血小板形成。图b-f：相对于10个区域中计数的细胞总数，各类的细胞分布，随灌流时间变化。在不存在抑制剂的情况下，在VWF上灌流的脐血MK(图b)或骨髓MK(图c)的分布的改变。在GPIb-VWF相互作用抑制剂，糖萼素(glycocalicin)的封闭抗体(图d)或抗-VWF MoAb(图e)，的存在下脐血MK在VWF上的灌流显示对MK与VWF接触以及后续步骤的重大抑制，从而破坏前血小板的形成。阻断αIIbβ3和VWF的相互作用的阿昔单抗阻止前血小板和血小板形成(图f)。代表15个实验，比例尺代表10μm。

[0059] 图2：在剪切或静态条件下粘附于VWF涂覆的盖玻片的脐血MK的光学显微外观。从流动体室中取出盖玻片并用PBS冲洗，然后在冰冷的甲醇中固定，随后进行罗曼诺夫斯基(Romanovsky)染色。在暴露于高剪切率下20min后，许多MK显示长和薄的前血小板延伸，其方向与流动方向平行。单一的单极的、长的前血小板从在其末端具有出芽(budding)的细胞核心并沿着轴延伸(左图)。作为高剪切率作用的对照，将MK沉积在VWF上并在静态条件下孵育20min，除去非粘附细胞并用IMDM冲洗盖玻片。细胞显示球形形状，无任何前血小板延伸(右图)。放大倍率×500。

[0060] 图3：微管在剪切诱导的前血小板形成中的作用。图A：用抗微管蛋白抗体标记间-1接免疫荧光显示前血小板和血小板形成。将在涂覆有VWF的表面上暴露于1800s 的剪切率的MK固定，并用鬼笔环肽(左图)和抗微管蛋白抗体(右图)染色。用共焦显微镜分析图像。没有看到肌动蛋白和微管蛋白之间的共定位。图B：血小板脱落的MK延伸长和薄的前血小板，其具有血小板大小的膨胀末端。整个前血小板轴以及其尖端对微管蛋白进行标记。两个脱离的细胞片段显示特征性的微管蛋白标记：其勾勒出哑铃形的前血小板及其中心窄化，而血小板大小的片段显示圆形的标记模式。图C：微管抑制剂对前血小板的作用。
前血小板延伸的逆转通过微管蛋白的解体表征。

[0061] 图4：暴露于导致血小板形成的高剪切率的MK超微结构。流出的细胞悬浮液直接从灌流室出口收获在固定剂中，并如方法部分中描述的进行处理以用于电子显微镜检查。使成熟MK伸长，从而延伸包围平行的纵向微管(插入物)的长的细胞质丝状伪足。这些前血小板显示包含胞质细胞器的规则膨大。大的球形细胞质碎片，也许是脱离的前血小板(pp)位于附近(图a)。含有致密染色质的核叶(nuclear lobe)(N)延长并位于细胞的一极。在流出物中收集通常不存在于MK培养基中的具有椭圆形的裸核和含有致密染色质的紧密核叶(图b)。填充有胞质细胞器的前血小板(PP)表现为大的细胞质碎片，无核，大致上是球形、哑铃形或伸长有细长的末端(图c和d)。观察到几个分离的血小板大小的片段(P)(图e)。比例尺代表2μm。

[0062] 图5：VWF和高剪切率对前血小板形成的特异性。图A：在静态条件(上图)和在高剪切率(下图)下形成前血小板的MK在VWF涂覆的盖玻片上的相衬图像。在静态条件中前血小板在14h后形成并在16h后最大，但在流动下仅需要10min。图B：甚至在没有活化的情况下HUVEC单层支持MK粘附(上图)，而HUVEC活化后观察到前血小板形成(下图)。图C：在剪切条件下在非VWF上的MK变形和前血小板的形成最少，如纤维蛋白原、纤维连接蛋白和胶原蛋白所示的。

[0063] 图6：暴露于高剪切率的MK获得的血小板可被凝血酶激活。在静态条件下在纤维蛋白原粘附试验中分析暴露于高剪切率的MK流通(flow-through)中的细胞流出物，然后用共焦显微术分析，用鬼笔环肽-Alexa546为细胞染色以可视化肌动蛋白以及用Alexa488为细胞染色以可视化αIIbβ3。由剪切暴露产生的MK源的血小板(上图)在不存在凝血酶(左图)的情况下或存在凝血酶(右图)的情况下粘附到纤维蛋白原上。非激活细胞显示弥漫性肌动蛋白染色和αIIbβ3膜定位。在凝血酶活化后，肌动蛋白丝组织为应力纤维。它们显示与在未暴露于剪切的独立试验中制备的洗涤血小板相似的细胞骨架组织(下图)。比例尺代表10μm。

[0064] 图7：由凝血酶激活的释放的血小板表达P-选择蛋白。由如图6的图例中所描述的由凝血酶激活或不激活细胞流出物并用流式细胞仪试验进行分析。用抗-CD62P-FITC(FL1，P-选择蛋白)和抗-CD41-PE(FL2，αIIb)标记样品。洗涤的血小板的FSC-SSC特征的设置用于分析流通细胞(左上图MK：暴露于剪切；左下图：洗涤的血小板)。R1、R2和R3区域中的CD62P和CD41a双阳性细胞的柱状图由不存在凝血酶(开放柱)或存在凝血酶(填充柱)的情况下的点图获得。仅凝血酶激活的样品含有CD62P-阳性细胞，而所有样品对CD41a都是阳性的(右上图)。流通中的激活血小板(R1)的柱状图，在存在凝血酶的情况下，用非免疫IgG(细线，灰色背景)、抗CD62P或抗-CD41a(粗线)标记后(右下图)。

[0065] 图8：MK源的血小板在凝血酶活化后的超微结构改变。通过凝血酶激活或不激活细胞流出物，并通过电子显微镜进行研究。不存在凝血酶的情况下，血小板大小的碎片显示平滑表面并含有若干分散于整个细胞质的α颗粒(A)以及离散的SCCS潴泡(图a)。存在凝血酶的情况下，血小板大小的碎片显示激活的血小板特征性的形态变化，即球形形状、表面伪足(p)、SCCS扩大潴泡内的致密材料、细胞质中没有粒形成以及微纤丝的中心束，暗示激活的血小板(图b)。比例尺代表2μm。实施例

[0066] 材料和方法

[0067] 蛋白质

[0068] VWF 由 Laboratoire francais du Fractionnement etdes Biotechnologies(Lille，法 国 ) 赠 送。 纤 维 蛋 白 原 来 自 Hyphen BioMed(Neuville-sur-Oise，法国)。人VWF和纤维蛋白原经纯化，且分别耗竭杂质纤维连接蛋白及纤维蛋白原和VWF(Legendre等人，2006)。马腱胶原蛋白来自Nycomed(Munich，Germany)，且人纤维连接蛋白来自VWR(Fontenay-sous-Bois，法国)。野生型和突变的(V1316M2B型)重组VWF(rVWF)如另外(Ajzenberg等人，2000)所描述的获得。

[0069] 抗体

[0070] 单克隆抗体(MoAb)713，其在瑞斯托菌素的存在下阻断VWF与GPIbα的结合，由JP Girma博士(INSERM Unit770，Le 法国)惠赠(Ajzenberg等人，2000)。多克隆抗糖萼素抗体，包含VWF结合位点的GPIbα胞外域，由MC Berndt博士(Monash University，Melboume，Australia)惠赠(Cramer等人，1991)。藻红蛋白(PE)偶联的抗-CD62P(P-选择蛋白)、异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的抗-CD41a(αIIb)、抗-CD42b(GPIbα)和非免疫抗体来自Beckman Coulter(Villepinte，法国)。抗-α和β-微管 蛋白MoAb来 自Amersham(Orsay，法 国)。抗-β3整 联蛋 白P37MoAb由 Gonzalez-Rodriguez 博 士 (CSIC，Madrid，Spain) 赠 送 (Calvete 等 人，1991)。
抗-αIIbβ3Fab(C7E3)阿昔单抗 来自Lilly(Suresnes，法国)。

[0071] 人巨核细胞

[0072] 用于该研究的人MK由从脐带血或骨髓分离的前体细胞培养。人骨髓样品(在臀部手术期间收获)和脐带血样品在经我们的学院伦理委员会(Assistance Publique des de Paris)同意后并按照赫尔辛基宣言(Declaration ofHelsinki)声明获得。人脐带血和骨髓CD34+细胞通过免疫磁性技术(StemCell Technologies，Grenoble，法国)如先前所述(Fichelson等人，1999)进行分离。细胞在补充有15％BIT9500血清替代物(StemCell Technologies)和20nmol/L TPO肽激动剂AF13948(Genosys-Sigma，Saint Quentin Fallavier，法国)的Iscove′s Modified Dulbecco′s培养基(IMDM)(Gibco-Invitrogen，Cergy-Pontoise，法国)中生长。在培养的第一天一次性加入10ng/mL干细胞因子(SCF)(Amgen，Neuilly-sur-Seine，法国)。在TPO存在下培养10到16天的MK完全成熟，并且准备用于血小板生物发生(Patel等人，2005a)。通过流式细胞计显示细胞表达GPIb和αIIbβ3(60-70％阳性细胞)。对于剪切实验，在第10天和第16天之间使用细胞。

[0073] 人血小板

[0074] 从在之前的两周时间内没有摄取任何药物的健康个体中获得血液。将血液吸入pH5.8的15％(v/v)的酸性柠檬酸葡萄糖(acid citrate dextrose)(ACD)中。在三磷酸腺苷双磷酸酶(1U/mL)(Sigma)和ACD(1mL用于40mL)存在下从分离的富含血小板的血浆(PRP)制备经洗涤的血小板(Ajzenberg等人，2000)。简言之，在洗涤后，血小板再悬浮在含有0.15％牛血清蛋白(BSA)的pH7.5的Hepes缓冲液(10mmol/L Hepes(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[乙磺酸])、136mmol/L NaCl、2.7mmol/L KCl和2mmol/L MgCl2)中。用电子颗粒计数器(Model Z1，Coulter Electronics，Margency，法国)计数血小板，且浓度调节到8
1.5×10 血小板/mI。

[0075] 小鼠巨核细胞和血小板

[0076] 使用7-10周大的野生型C57BL/6J小鼠。动物饲养和处置遵循制度规定。巨核细胞扩增并从冲洗骨髓中分离。简言之，免疫磁性纯化的Lin细胞在存在TPO-肽的情况下在适当的巨核细胞分化培养基中生长。培养6天后，将成熟巨核细胞引入小型化流体室(Conant等人，2009)中并在固定的小鼠重组VWF(Marx等人，2008)上以高剪切率灌流。

[0077] 灌流研究

[0078] 使用由Maastricht Instrumentation获得的先前公开的流体室进行灌流研究(Legendre等人，2006)。流体室由雕刻在有机玻璃(plexiglas)块中的0.05mm高、29mm长和5mm宽的矩形空腔组成。该室的底部内衬有盖玻片，该盖玻片在4℃下用在Tris-缓冲盐水(TBS，25mmol/L Tris-HCl，pH7.4，150mmol/L NaCl)中稀释的VWF(20μg/mL)涂覆过夜。在一些实验中，测试另一种纯化的蛋白(纤维连接蛋白、纤维蛋白原、胶原蛋白或6
2B型-rVWF)。将在IMDM悬浮液(2mL)中的浓度为0.8-1×10 细胞/mL的MK吸入5mL气密的玻璃微量注射器(Exmine，Ito Corporation，Fuji，日本)中，所述微量注射器通过延伸装置(extension set)(Steritex，Codan，Lensahn，德国)与室连接。通过电动泵施加-1
225μL/min的流速，从而产生1800s 的剪切率。细胞灌流10min，然后在相同剪切率下IMDM灌流10min。所有的实验在利用Minitüb加热系统(Minitüb Abfüll und Labortechnik，Tiefenbach，德国)维持的37℃下进行。在一些实验中，细胞或盖玻片在灌流前用抗体预孵育10min。在灌流结束时，用冰冷的甲醇固定盖玻片5min，用蒸馏水洗涤，干燥并染色。在室的出口处收集流出物用于进一步的研究，包括凝血酶活化。

[0079] 视频显微镜系统

[0080] 灌流室置于倒置显微镜(Axiovert135，Zeiss，德国)的夹片台上。用CCD照相机(Sony，Tokyo，日本)显现细胞，使用20×Hoffman调制对比度物镜。用连接到视频定时器(video timer)(VTG， Tokyo，日本)上的数字图像记录仪(Replay Software，Microvision Instruments，Evry，法国)进行连续记录。用Histolab或Videomet量化软件(Microvision Instruments)分析图像帧。

[0081] 细胞活化研究和流式细胞分析。

[0082] 收集流出细胞悬浮液，并在0.5mmol/L的EDTA存在下以1800rpm离心12min，沉淀再悬浮在IMDM中。等分试样在不存在或存在凝血酶(0.5U/mL)的情况下在37℃下孵育10min。悬浮液(100μL)中的细胞在室温下与FITC-抗-CD62P和PE-抗-CD41a(各5μL)或非免疫偶联的对照抗体一起孵育20min，然后加入300uL PBS。然后用FACSorr流式细胞计(Becton-Dickinson，Le Pont-de-Claix，法国)分析细胞；用血小板区域上的设置获得10000个结果，所述设置通过其在由未刺激的洗涤血小板在独立实验中确定的直角散射(right-angle scatter)(SSC)和前向角散射(FSC)图上的特征曲线确认。

[0083] 共焦免疫荧光

[0084] 将未激活的和凝血酶激活的细胞的等分试样(150μL)加入在静态条件下孵育30min的纤维蛋白原涂覆的玻璃Lab-Tek室载玻片上(Nunc，Rochester，NY)。除去非粘附细胞，并用PBS洗涤载玻片三次，然后用在PBS中的2％仲甲醛(Carlo Erba，Val de Reuil，法国)固定30分钟，并在4℃储存。对于免疫荧光染色，用0.1％Triton X-100的PBS溶液渗透细胞5min，然后用抗-β3P37MoAb(10μg/mL的PBS溶液)孵育30min，洗涤并用20μg/mL的与AlexaFluor488(Molecular Probes，Eugene，OR)偶联的二级抗体一起孵育。阴性对照使用来自小鼠腹水的相同蛋白浓度的纯化IgG。对于肌动蛋白标记，渗透的细胞在室温下用含有3％BSA的50μL的30nmol/L AlexaFluor546鬼笔环肽(Molecular Probes)的PBS溶液孵育30min。然后洗涤盖玻片两次并封固在含有TOTO3和Vectashield(Vector Laboratories，Peterborough，UK)的封片溶液(mounting solution)中。用Leica TCS SP2AOBS共焦显微镜分析AlexaFluor488/AlexaFluor546染色。

[0085] 电子显微镜检查

[0086] 流出细胞悬浮液直接在灌流室的出口处收集在戊二醛固定液(在0.1M、pH7.4的磷酸盐缓冲液中的最终浓度为1.5％)中，在通过各种基质后，然后如先前描述(Cramer等人，1997)的进行处理以用于电子显微镜检查。一些样品首先如上由凝血酶激活并进一步处理用于电子显微镜检查。在Jeol10-11电子显微镜(Jeol Ltd，Tokyo，日本)上进行检测。

[0087] 统计学分析

[0088] 我们使用Student's不配对t检验进行统计分析；P值＜0.05被认为显著。误差棒代表平均值的标准误差(SEM)。

[0089] 结果

[0090] MK与VWF的动力学相互作用

[0091] 脐血成熟MK以不同的切变率在涂覆有纯化VWF的表面上灌流。在1800s-1下，MK形成与VWF的瞬时相互作用，从而减慢在VWF上滚动的MK的速度并逐渐导致深刻的形态变化，其最终导致血小板从MK脱落。血小板形成的不同阶段概述于图1A中。该过程从大致球形的MK开始，然后细胞外缘变形和伪足在粘附的MK上变得可见(阶段2)。然后在细胞体后面和/或前面发生沿着流动组织化的细胞质延伸(阶段3)。具有成串珠外观特征的中间膨大开始显现。延伸以21μm/min的速度迅速发生，从而比在静态条件下报告的高25倍(Patel等人，2005b)。有趣的是，破碎不仅发生在这些延伸的末端，还发生在膨大之间，特别在较薄的收缩段中，从而释放不同大小的碎片，且最经常是几个珠仍然连在一起，但是没有主细胞体(图1A)。最后，这些碎片进一步破碎成在稍后时间点期间清晰可见的更小的颗粒，为血小板的大小(图1A)。前血小板破碎在高剪切率条件下在15-20min内迅速发生。使用脐血源的MK或骨髓源的MK获得了相似的结果。相反，在不存在流动或在较低剪-1切率(＜1000s )的情况下，在MK与VWF接触的20min时间内没有观察到前血小板和血小板释放。未成熟MK(培养少于9天)的剪切暴露不会发生转位和破碎。

[0092] 与MK受体相互作用的VWF在血小板形成中的特异性

[0093] 定义四个细胞种类以量化剪切暴露期间的形态变化：1)转位的MK；2)早期变形MK，丧失球形；3)晚期变形MK，具有前血小板延伸；和4)前血小板破碎和血小板释放(图1B，图a)。延伸细胞和前血小板和血小板的比例逐渐增加，在20min时达到细胞的27.6±4.9％。这种增加反映转位的细胞从5min时的28.2±6.5％降低到20min的3.6±1.6％，以及早期变形MK的降低(图1B，图b)。当测定暴露于高剪切率的骨髓MK的分布时，获得类似于用脐血MK描述的结果(图1B，图c)。在存在针对糖萼素或VWF的GPIb结合域的抗体的情况下，MK转位和后续步骤(包括前血小板形成和血小板释放)完全停止(图1B，图d和e)，说明VWF-GPIb相互作用的至关重要。在αIIbβ3抑制剂阿昔单抗存在下，不具有前血小板的细胞(未变形和早期变形的MK)的比例随时间保持恒定，而前血小板延伸强烈减少，且血小板的形成几乎完全消除(图1B，图f)。这种前血小板形成的无效是由于与VWF表面的接触不良(数据未示出)。

[0094] 由MK暴露于高剪切率诱导的血小板形成的表征

[0095] 和在静态条件下在VWF上孵育细胞20min得到的对照(其中MK的形态相对于与VWF接触前的细胞保持不变)相比，施加于成熟MK的剪切力诱导特异性的形态变化(图2)。相反，MK灌流20min后涂覆有VWF的盖玻片的固定后染色显示，MK在其尖端延伸长的线状伪足，且沿轴形成珠状血小板样尖突起以及较大细胞质碎片(图2)。前血小板延伸需要对于α和β1微管蛋白染色的重叠微管的滑动(Patel等人，2005b)。我们发现MK延伸在与肌动蛋白不同的区域中由抗微管蛋白抗体染色，证实这些延伸显示与由Italiano等人(Italiano等人，2003；Italiano等人，1999；Patel等人，2005a；Patel等人，2005b)的工作在前血小板形成MK中确认的类似的染色；微管蛋白标记跟随延伸的MK中的前血小板轴并在球形MK上、前血小板上和血小板上显示环形图案(图3B)。微管在剪切诱导的前血小板形成中的重要性由诺考达唑(nocodazole)(微管装配抑制剂)的预孵育证实，其完全阻止流动条件下的MK延伸和前血小板形成(数据未显示)。为证明诺考达唑不是作用于细胞悬浮液中的预形成的血小板，在延伸后加入微管抑制剂；实时可见的效应显示，当在该过程发生之后添加时，诺考达唑可以逆转剪切诱导的延伸。逆转的特异性由微管蛋白染色证实。有趣的是，加入诺考达唑25min后，在前血小板和血小板中观察到微管蛋白不再组织化，从而表明延伸过程不同于系留(图3C)。事实上，膜系留是在流动影响下从小的、局部化粘附接触延伸的动态结构，其由VWF-GP Ib相互作用诱导，但它们不显示任何微管蛋白染色(Dopheide等人，2002)。

[0096] 电子显微镜检查显示从细胞核心延伸的、含有平行微管束的长的细胞质轴，且有时被胞质细胞器充满(图4，图a)。具有致密异染色质的核叶位于细胞的一极，偶尔观察到裸核(图4，图b)。没有细胞核的大的细胞质碎片大致是球状、哑铃状或延伸有细长的末端(图4，图c和d)。也可见血小板样碎片(图4，图e)。

[0097] 高剪切率和VWF加速前血小板形成

[0098] 最近表明，粘性蛋白参与前血小板形成的调节，特别是在静态条件下将MK平铺在VWF上后16小时发生的前血小板形成(Balduini等人，2008)。如图5A所示，我们获得了类似的发现。相反，在高剪切率存在下，该过程非常迅速地发生，因为在20min内，70％的脐-1血MK和80％的骨髓MK形成前血小板。该作用取决于剪切率的水平(600-2400s )以及细
6
胞浓度(0.5-2×10/mL)。内皮细胞含有高分子量的VWF多聚体，其以低速率组成型释放并在炎性状态下增加(Rondaij等人，2006)。因此我们评估从内皮细胞基质中释放的VWF是否支持MK粘附和前血小板形成。MK滚动并粘附在未激活HUVEC上，但前血小板形成发生在激活的HUVEC上(图5B)。血小板形成也发生在位于内皮细胞层之下且在去除这些内皮细胞时呈现的内皮细胞基质上。另外，我们研究了在涂覆有突变型2B-rVWF的表面上灌流的MK的前血小板形成。我们选择V1316M置换(一个明确的突变)，其特征在于VWF与血小板GPIb的结合增强，具有温和的血小板减少症和巨血小板(Ajzenberg等人，2000；Miura等人，2000)。我们发现在2B型-rVWF上MK转位的平均速度(4.6±0.3μm/s)远远低于在野生型(wt)-rVWF上的平均速度(33.6±2.5μm/s，p＜0.0001)。通过MK暴露于高剪切率而形成前血小板的所有步骤在2B-rVWF上比在wt-rVWF上慢，导致血小板生成减少以及前血小板集聚增加(未显示数据)。最后，为进一步确立粘性表面在调节前血小板形成中的特异性，我们调查了在高剪切率下由MK在纤维蛋白原、胶原蛋白或纤维连接蛋白上灌流的前血小板形成水平。在这些表面上没有形成前血小板；唯一的变化是在纤维蛋白原上轻微的早期MK变形(图5C)。

[0099] 由MK剪切暴露产生的血小板是功能性的

[0100] αIIbβ3整联蛋白介导的血小板对纤维蛋白原的粘附在不存在活化的情况下发生，并在凝血酶激活该受体时增强。为证实由MK剪切暴露产生的血小板在结构上和功能上类似于血液血小板，在对于纤维蛋白原的静态粘附试验中比较流通中收集的细胞和分离的血液血小板(Mazharian等人，2007)。在不存在凝血酶的情况下细胞牢固地粘附于纤维蛋白原，说明αIIbβ3在剪切诱导的血小板和前血小板中是功能性的。非激活成分显示弥漫的肌动蛋白染色和αIIbβ3膜定化。凝血酶活化后，肌动蛋白微丝在有核和无核成分中重新组织化，显示板状伪足(lamellipod)和丝状伪足形成，以及整联蛋白膜染色(图6)。这些由剪切暴露产生的MK源的血小板显示与在未暴露于剪切的分离试验中制备的洗涤血液血小板类似的细胞骨架组织(图6)。

[0101] 剪切暴露细胞的流式细胞计分析根据其大小显示三种CD41阳性细胞群。较小尺寸的群体与血小板重叠，而中间群体对应于较大的成分，包括前血小板和裸核(图7)。因此，与从外周血液分离的血小板比较，由暴露于剪切生成的血小板群体包括较高比例的中间尺寸的血小板。剪切的MK属于与未剪切的MK相同的大尺寸群体。响应于凝血酶刺激，在剪切产生的血小板的表面上观察到P-选择蛋白(CD62P)的上调(11.8±1.8％，与未活化血小板的6.2±0.9％比较，p＝0.0005)。与分离血液血小板的相似性由超结构数据证实(图8)。不存在凝血酶时，血小板样碎片显示平滑表面、若干分散在细胞质中的α粒以及离散的表面连接微管系统(SCCS)(图8)。凝血酶活化后，这些细胞显示典型的激活血小板的形态变化，即球形、表面伪足、SCCS的集中的和扩大的潴泡内的致密材料、无细胞质粒形成以及中央的微纤丝束(图8)。最后，为证实血小板大小的成分由剪切暴露产生，且不是简单地在成熟MK的悬浮液中产生，通过裸核的存在比较在流体室中灌流前和后的流出物。暴露于剪切的细胞的非粘附流通比在静态条件下的细胞(缺乏裸核)包含更多的裸核(未显示数据)。

[0102] 小鼠巨核细胞和血小板

[0103] 使小鼠成熟巨核细胞在小鼠VWF上暴露于高剪切率导致有效的血小板形成。在一6
系列实验中，从6-8只动物中提取骨髓源的细胞使得生成至少6-12×10 个成熟巨核细胞。
-1
这些细胞在90分钟内暴露于1800s 的剪切率，并完全转化为与血小板尺寸相当的小成分。
由共焦免疫荧光表征小鼠血小板显示了血小板尺寸的成分中特定的微管蛋白环。在凝集计中通过标准技术确认响应于这些血小板的激动剂的聚集特性。

[0104] 将本发明血小板注射给血小板减少症小鼠挽救出血表型

[0105] 该实验旨在通过灌注如上所述通过高剪切力产生的供体小鼠血小板挽救血小板减少症受体小鼠的出血表型。

[0106] 受体小鼠经由尾部静脉注射通过来自汇集的供体小鼠的骨髓成熟巨核细胞的剪切暴露获得的血小板。血小板减少症小鼠通过施用低浓度的抗GPIIb-IIIa抗体(Nieswandt等人，2000)获得。在典型实验中，我们通过注射2-3次抗-GPIIb抗体使得循环血小板减少80％。在给血小板减少症小鼠注射前，荧光标记这些血小板以用于检测和清除研究。测定输注小鼠的血小板计数、自发出血和出血时间的改正。这些循环的碎片是活性血小板，因为它们增加血小板数目并在诱导出血的体内模型中改正失血。我们使用导致限于炎症区域的大出血的刺激性接触性皮炎模型(Goerge等人，2008)。在施用剪切产生的血小板之前和之后比较血小板减少症小鼠的皮肤出血。也通过体内荧光显微术利用氯化铁损伤的血栓症模型体内评估新形成血小板的功能(Denis等人，1998)。该方法提供血栓形成过程的不同阶段的详细信息，包括单血小板粘附、血栓生长的速率、血栓稳定性、栓子尺寸和堵塞血管的时间(Denis and Wagner，2007)。我们比较了对血小板减少症小鼠施用血小板之前和之后的实时血栓形成和血小板在血栓中的结合。

[0107] 结论

[0108] 综上所述，在流动条件下成熟MK与VWF的相互作用促进人/小鼠前血小板形成的发现代表了了解血小板形成方面的重大突破，因此这可以发生在毛细血管或小动脉中。具有血小板生成减少的疾病的调查将极大地有利于更好地理解血小板从巨核细胞的脱落。最后，本发明人的结果提供了一种用于诊断或治疗目的的制备血小板的方法。

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