光活性化受容体

本発明は生物工学の分野、特には光遺伝学の分野に属する。更に詳しくは、本発明は、例えば、新しくその特性が明らかになったLOV(light-oxygen-voltage-sensing:光・酸素・電圧感受性)ドメイン又はシアノバクテリアフィトクロム(PHY)CPH1の光感応性ドメイン等の光活性化タンパク質ドメインを含む、適切な波長の光励起によって2量化が可能なキメラ融合タンパク質に関する。当該融合タンパク質は、更には細胞表面にある受容体の細胞内部分を含んでもよい。また、本発明は、当該融合タンパク質をコード化する核酸分子、当該核酸分子によってコード化さるキメラ融合タンパク質を発現する非ヒト形質転換動物、並びに、例えばスクリーニング法におけるような、当該キメラ融合タンパク質の使用に関する。

勃興中の光遺伝学分野において、空間的時間的な精度、強度の精確なコントロールを備えており、マトリックスが十分に透明であれば刺激や応答エレメントと物理的に接続する必要性がない高等生物の細胞を調整するために、光活性化タンパク質は利用されている。天然タンパク質に触発され、あるいは感光性化学物質を基に、膜電流、Gタンパク質シグナル伝達、膜補強、遺伝子発現、及びタンパク質機能は、現在、生物細胞において光調節が受け入れている(Fenno, Yizhar et al. 2011, Tucker 2012)。

細胞は、細胞表面受容体の活性化及び細胞内多成分シグナル伝達経路によって、細胞外シグナル伝達分子と応答する。受容体チロンシンキナーゼ(RTKs)は、成長因子とホルモンを感知し、正常及び異常生理の主要調整因子である膜貫通受容体の大きなファミリーである(Lemmon and Schlessinger 2010)。RTKsの活性化は、明確な細胞内の位置、細胞のタイプ、発生の段階に、厳密に調節制御されており、異常調節はヒトの疾病と明確に結びついている (Robertson et al. 2000, Shilo 2005, Casaletto and McClatchey 2012)。RTKシグナル伝達のこのような空間的時間的な複雑さは、受容体活性化とその後の効果の精確な制御を提供する新しい研究方法を必要とする。イオンチャンネルやGタンパク質と結合した受容体と異なって——細胞や組織におけるそれらの空間的時間的制御のいくつかについては光活性化タンパク質によって提供されているが(Szobota and Isacoff 2010, Fenno et al. 2011)——、RTKsとそれらに関連したシグナル伝達経路は、現在のところ光によって制御することはできない。更には、光「遠隔」制御の非襲性は薬物評価において有利であると提案されてはいるものの(Prigge et al. 2010, Entcheva 2013)、この提案は、今日に至るまで未だ実現しておらず、疾病関連シグナル伝達経路の関係において特に望まれていると言ってもよい。

RTK活性化の最初のステップにおいて、細胞外リガンドは、受容体のホモ2量体又はヘテロ二量体を誘起又は安定化する。2量化は、リン酸基転移を生起し、かつシグナルを細胞内多成分系経路へ伝達するアロステリック相互作用によって、キナーゼドメインを活性化する(Lemmon and Schlessinger 2010, Simi and Ibanez 2010)。二価の抗体、架橋変異、化学的機能化を用いて、2量化は、いくつかのRTKのリガンド非依存性活性化をもたらすために十分であることが示された(Spaargaren et al. 1991, Burke and Stern 1998, Muthuswamy et al. 1999, Welm et al. 2002)。受容体の2量化は、RTKや他の受容体ファミリーにおける通常の分子活性化メカニズムであるが(Cochran et al. 2001)、受容体2量化の選択的で空間的時間的な精密制御の方法は、現在のところ、まだ利用できない。

Wendらは(2013)、MAPキナーゼ経路に関わっており、タンパク質クリプトクロム相互作用性basic-helix-loop-helix 1(CIBN)又はタンパク質クリプトクロム2(CRY2)のN末端領域であるタンパク質キナーゼC-RAF又はB-RAFのキメラ融合タンパク質を開示している。これらのタンパク質は青色光による励起によって2量化する。

WO 2012/116621は、光によって制御された遺伝子発現システムを開示している。 WO 2009/151948は、フィトクロムドメインに融合した第1の対象タンパク質とフィトクロムドメインと相互作用をするペプチドに融合した第2のタンパク質の組み合わせを記述している。両者のタンパク質は赤色光による励起によって2量化する。 WO 2010/006049、WO 2008/089003、WO 2008/086470、WO 2007/024391、及びUS 2010/0234273は、光活性化イオンチャンネルを開示している。

WO 2013/003557及びWO 2009/148946は、光活性化されたGタンパク質と結合した受容体ロードプシン及びGタンパク質と結合した他の受容体ファミリーの融合タンパク質を開示している。 WO 1999/036553は、化学リガンドによって2量化ができる多量化キメラタンパク質を開示している。US 2009/0233364は、ルイシンジッパーを用いて2量化ができる経路エフェクターを開示している。

GenBankエントリーNGA_0015702 (Uniprot配列K8Z861)は、Nannochloropsis gaditanaからの未同定の仮想タンパク質の配列を開示している。Uniprot配列C5NSW6は、Ochromonas danicaからの推定オーレオクロム1様のタンパク質を開示している。 Huangらは(2013)、Nannochloropsis gaditanaからのオーレオクロム1の全長のクローニングとSaccharomyces cerevisiaeにおけるその発現を記述している。 Straussらは(2005)、クロオコッカス PCC6803 (SyCP1-PHY)のシアノバクテリアフィトクロム(PHY)CPH1の2量化が、エフェクタードメイン制御において重要な役割を演じていることを示唆している。

US 2013/0116165及びMoeglich et al. Photochem. Photobiol. Sci. 9: 1286-1300 (2010)は、光感応性タンパク質であるAvena sativa LOVドメイン(AsLOV)、AsLOV-cp、ヴィヴィッドについて記述している。Pathak et al. Biol. Cell 105: 59-72 (2013)、及びMueller & Weber, Mol. Biosyst. 9: 596-608 (2013)は、一般的にはLOVドメイン、更に詳しくはAsLOVドメインを含む融合タンパク質について議論している。Schmidt et al. Nature Communications, DOI: 10.1038/ncomms4019 (August 2013)は、細胞におけるK⁺の流れを制御するために用いることができるKvチャンネルに特異的なペプチドトキシンとAsLOVとの融合について記述している。AsLOV、AsLOV-cp、ヴィヴィッドは、それぞれ、NgPA1-LOVに対して42%以下の配列が同一であり、OdPA1-LOV及びVfAU1-LOVに対して43%以下の配列が同一であり、SyCP1-PHYに対して13%以下の配列が同一であることを示している。

WO 2013/074911は、E. litoralis 222 (EL222-LOV)由来のLOVドメインを含む光応答性DNA結合タンパク質と、転写活性化ドメインと効果的に結合されているDNA結合ドメインについて開示している。EL222-LOVは、NgPA1-LOV、OdPA1-LOV、VfAU1-LOVに対して34%以下の配列が同一であり、SyCP1-PHYに対して10%以下の配列が同一であることを示している。

Stroh et al. Stem Cells 29: 78-88 (2011)は、光誘起性イオンチャンネルであるチャンネルロードプシン−2を用いて、胚幹細胞の自律的な光遺伝的刺激について記述している。これらの膜貫通イオンチャンネルタンパク質は、LOVドメインから非常に遠く離れており、光による励起で2量化せず、完全に異なった作用機序を有している。 WO 2013/133643は、受容体チロシンキナーゼのC末端と光感応性タンパク質との融合タンパク質について、例えば、CIB (クリプトクロム相互作用性 basic-helix-loop-helix)、CIBN (CIBのN末端ドメイン)、Phy(フィトクロム)、PIF(フィトクロム相互作用性因子)、FKF1 (フラビン結合性、Kelch繰り返し、F-box 1)、GIGANTEA、CRY (クリプトクロム)、及びPHR (フォトリアーゼ相同領域)について開示している。同じような名前が付けられているが、タンパク質の配列は、大きく異なっている。下記の表は、光感応性タンパク質の配列同一性(%)を示す。

又、実験上の機能と性能において相違がある。WO 2013/133643で述べられているいかなる光感応性ドメインもRTKのホモ2量化に使用することはできない。CRY及びその短い型であるPHRは、受容体2量体を作らないが、ホモオリゴマー化をするので受容体多量体を作る。ホモ二量体は明確な組成(二量体)を有するが、オリゴマーは多くの異なった可能な組成(多量体)を持つことができるので、ホモオリゴマー化は、ホモ2量化よりも“より調整不可”である。CIBNはCRY2とヘテロ2量化し、PIF1-6はPHYA又はPHYBとヘテロ2量化し、FKF1はGiganteaとヘテロ2量化する。ヘテロ2量体は、その発現に2個の遺伝子が必要であり、殆どの設定が非常に困難なことから、技術的に不利である。更に、WO 2013/133643 (Kim et al. Chem Biol. 21: 903-912 (2014))に対応する発表における「生きた細胞のイメージングと光活性化(Live Cell Imgaing and Photoactivation)」セッションにおいて、言及された光感応性ドメインに対して必要とされる活性化強度は1.30〜64.94 mW/cm²であったことが述べられている。最後に、WO 2013/133643は、赤色光によって活性化できる光感応性ドメインについて、一切触れていない。

US 2006/0110827は、SyCP1-PHYドメインとその変異体について記載しているが、光誘起2量化については記載がなく、別の物理的現象(蛍光)について記載している。 細胞におけるシグナル伝達の空間的時間的制御が可能な手段に対する技術的な要求がある。特に、新規な光制御可能な用途を可能とする、新しい光遺伝学的な手段に対する要求がある。

本発明者らは、RTKに組み込まれた光活性化タンパク質—タンパク質相互作用は、リガンド誘起2量化を模倣して、最終的に受容体活性化に至ると考えた。一つの実施の形態において、本発明者らは、巨大なlight-oxygen-voltage-sensing (LOV)ドメインのスーパーファミリーに属する青色光感応性タンパク質ドメインを、RTKの光活性化2量化の候補として選択した。光感応性LOVドメインは補欠分子族としてフラビンと結合して、細菌、菌類、植物における可逆的光スイッチとして作用する。LOVドメインを含む光受容体は、例えば、セリン/スレオニンキナーゼ(例えば顕花植物Arabidopsis thaliana において(Kinoshita et al. 2001))、あるいは緑藻Chlamydomonas reinhardtii (Huang et al. 2002)、あるいは転写制御因子(例えば菌Neurospora crassaにおいて(Heintzen et al. 2001)、あるいは黄緑藻Vaucheria frigida(Takahashi et al. 2007)のようなヘテロエフェクタードメインを機能的に制御する。LOVドメインの2量化は、エフェクタードメイン制御において重要な役割を演じていることが示唆されており、また、LOVドメインは2量化の接触面や相互作用の寿命において顕著な多様性を示す(Zoltowski and Gardner 2011)。

更に、本発明者らは、赤色光(〜660 nm)で活性化し遠赤外光(〜750 nm)で不活性化する他の融合タンパク質にも本研究を拡大した。特に、本発明者らは、赤色光に反応してホモ2量化するタンパク質ドメインを同定し(クロオコッカス PCC6803 (SyCP1-PHY)のシアノバクテリアフィトクロム(PHY)CPH1の光感応性ドメイン)、このドメインをRTK融合タンパク質に導入した。赤色光は青色光よりも動物組織に浸透するので、外部から照射することができる。この新規な手段は、発生と疾病の動物モデルにおける光遺伝学用途にとって特に魅力的である。特定のタンパク質の活性化と不活性化をin vivo で遠隔制御できることは、生物学的プロセスの理解に対するこれまでにない洞察を提供する。 本発明の融合タンパク質は、非常に光感応的である。NgPA1-LOV、OdPA1-LOV、及びVfAU1-LOVによる活性化は、0.25 mW/cm²の青色光によって既に達成可能であり、一方SyCP1-PHYによる活性化は、5.8 μW/cm² = 0.0058 mW/cm²の赤色光でさえも既に達成されている。

本発明者らは、遺伝的にその全体がコード化されており、かつヒト疾病の細胞モデルにおいてシグナルの空間的時間的制御が可能な光活性化受容体チロシンキナーゼを操作し、疾病関連シグナル伝達プロセスにおける薬物の全光型評価を実験的に実現した。 従って、少なくとも76%の配列がSEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)と同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインを含むキメラ融合タンパク質——当該キメラ融合タンパク質は、LOVドメインが適当な波長の光によって励起されると、2量化をすることができる——が開示される。当該キメラ融合タンパク質の更なる実施の形態は、以下に記載する通りであり、また特許請求の範囲で定義される通りである。

更に、少なくとも74%の配列がSEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)と同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインを含むキメラ融合タンパク質——当該キメラ融合タンパク質は、LOVドメインが適当な波長の光によって励起されると、2量化をすることができる——が開示される。当該キメラ融合タンパク質の更なる実施の形態は、以下に記載する通りであり、また特許請求の範囲で定義される通りである。

また、発色団との機能連関において、少なくとも70%の配列が全長にわたってSEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)と同一であるアミノ酸配列を有する光感応性ドメインを含むキメラ融合タンパク質——当該キメラ融合タンパク質は、光感応性ドメインが適当な波長の光によって励起されると、2量化をすることができる——が開示される。

また本開示は、ここに記載され、また特許請求の範囲で定義されるキメラ融合タンパク質をコード化する核酸分子に関する。 また本開示は、前記核酸分子によってコード化さるキメラ融合タンパク質を発現する、非ヒト形質転換動物に関する。

更に本開示は、 a) SEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)、SEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)、及びSEQ ID NO: 10 (VfAU1-LOV)から選ばれるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも70%の配列が同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインと細胞表面受容体の細胞内部分からなるキメラ融合タンパク質を発現する細胞を準備する工程であって、当該キメラ融合タンパク質は、適切な波長の光による前記LOVドメインの励起によって前記細胞表面受容体の前記細胞内部分を介して細胞応答を引き起こす2量化が可能であるキメラ融合タンパク質である工程 b) 前記細胞を候補試薬と接触させる工程 c) 前記細胞を前記適切な波長を有する光に当てる工程 d) 前記候補試薬が、c)工程で引き起こされた前記細胞応答に作用することが可能かどうかを決定する工程 からなるスクリーニング方法に関する。

更に、 a) 発色団との機能連関において、SEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも70%の配列が同一であるアミノ酸配列を有する光感応性ドメインと細胞表面受容体の細胞内部分からなるキメラ融合タンパク質を発現する細胞を準備する工程であって、当該キメラ融合タンパク質は、適切な波長の光による前記光感応性ドメインの励起によって前記細胞表面受容体の前記細胞内部分を介して細胞応答を引き起こす2量化が可能であるキメラ融合タンパク質である工程 b) 前記細胞を候補試薬と接触させる工程 c) 前記細胞を前記適切な波長を有する光に当てる工程 d) 前記候補試薬が、c)工程で引き起こされた前記細胞応答に作用することが可能かどうかを決定する工程 からなるスクリーニング方法を記載する。

上記スクリーニング方法の更なる詳細と実施の形態を、以下及び特許請求の範囲で提供する。 また、本開示はここに記載されたキメラ融合タンパク質の使用を提供する。例えば、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、研究手段として、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにするために、使用することができる。また、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、好ましくは当該キメラ融合タンパク質のアクチベーターとして、また当該スクリーニング方法の読み取りのために光を使用するスクリーニング方法においても使用することができる。また、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、パターン形成細胞培地を生産するため、あるいは関連するバイオ製品の製造を制御するためにも使用することができる。

更に、例えば、細胞成長の制御又は成長因子経路の制御におけるここに開示されたキメラ融合タンパク質の非治療的用途、好ましくは当該キメラ融合タンパク質のin vitroでの使用が開示されている。ここに開示されたキメラ融合タンパク質の別の非治療的用途は、幹細胞の分化においてなされ、前記幹細胞は、人類の生殖系細胞の遺伝的同一性を変更することを含む工程、又は、ヒトの胚を産業又は商業目的に使用する工程を用いて製造されず、好ましくは当該キメラ融合タンパク質はin vitroで使用される。

上記用途及び非治療的用途は、ここに開示されたキメラ融合タンパク質に限定されるものではない。従って、本開示は、研究手段としてここに開示された核酸分子の使用、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにすることにおける使用についても開示する。同様に、ここに開示された核酸分子のスクリーニング方法における使用が開示され、好ましくは当該スクリーニング方法は、前記キメラ融合タンパク質のアクチベーターとして、また当該スクリーニング方法の読み取りのために光を使用する。 最後に、研究手段としてここに記載された非ヒト形質転換動物の使用、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにすることにおける使用、ここに記載された非ヒト形質転換動物のスクリーニング方法での使用も開示される。 更なる詳細な説明と好ましい実施の形態は、詳細な明細書の中で、及び添付の特許請求の範囲において明確にされる。

光・酸素・電圧感受性(Light-Oxygen-Voltage-sensing:LOV)ドメインは、多くの種類の高等植物、微細藻類、菌類、細菌類によって使用される、環境条件に対するセンサーである。共通の特徴として、全てのLOVタンパク質は、タンパク質のコア部分に、隣接するシステイン残基を介してシグナル伝達状態で共有結合している青色光感応性のフラビンモノヌクレオチド発色団を含んでいる。LOVドメインは、例えば、非常に多様な生物学的プロセスを制御する青色光感応性タンパク質複合体の中に見られる。

少なくとも76%配列がSEQ ID NO: 12 (N. gaditana仮想タンパク質NGA_0015702、 Uniprot配列K8Z861の87~228残基(NgPA1-LOV))と同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインを含むキメラ融合タンパク質が開示されており、当該キメラ融合タンパク質は、LOVドメインが適切な波長の光によって励起されると2量化が可能なものである。

好ましくは、前記融合タンパク質のLOVドメインは、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも78%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である。 更には、少なくとも74%配列がSEQ ID NO: 14 (O. danicaオーレオクロム1様タンパク質、Uniprot配列C5NSW6の180~312残基(OdPA1-LOV)と同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインを含むキメラ融合タンパク質が開示されており、当該キメラ融合タンパク質は、LOVドメインが適切な波長の光によって励起されると2量化が可能なものである。

好ましくは、更なる当該融合タンパク質のLOVドメインは、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも75%、好ましくは少なくとも76%、より好ましくは78%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である。

また、発色団との機能連関において、少なくとも70%の配列が全長にわたってSEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)と同一であるアミノ酸配列を有する光感応性ドメインを含むキメラ融合タンパク質が開示されており、当該キメラ融合タンパク質は、光感応性ドメインが適当な波長の光によって励起されると、2量化が可能なものである。好ましくは、光感応性ドメインは、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも78%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である。

ここで、問題とされている配列を当該SEQ ID NO: Yと並べた場合に、並べた配列の間の配列同一性が、SEQ ID NO: Yの全長にわたって少なくともX%であるとき、アミノ酸配列が配列の全長にわたって「SEQ ID NO: YとX%同一」であると言う。アミノ酸配列の整列は、NCBIのホームページhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgiで提供され、当該ホームページに記されたデフォルトの設定を用いることによる、BLASTプログラム、blastp、のような公知のコンピュータ相同性プログラムによって行うことができる。同一残基は、例えば手で数えることによって決定され、続くパーセント同一性(PID)の計算は、同一物の数を、SEQ ID NO: Yの指定された長さで割ることによって、「X%の配列同一」を得る。もしも特定の長さが指定されていない場合には、配列同一性はSEQ ID NO: Yの全長にわたって計算される。ポリペプチドのセットの配列同一性パーセントの別の計算方法は、当業者において公知である。好ましい実施の形態において、SEQ ID NO: Yに対して少なくともX%同一であることに結びつく、例えば置換、挿入、脱離などのアミノ酸配列における変化は、あまり重要ではない。より具体的には、SEQ ID NO: Yと異なるアミノ酸配列は、好ましくは1個以上の半保存的、より好ましくは保存的なアミノ酸の置換又はそれらの組み合せからなる。ある与えられたアミノ酸残基の半保存的、保存的置換を下記の表に示す。

A、F、H、I、L、M、P、V、W、又は YのCによる置換は、新しいシステインがフリーのチオールで残っている場合には半保存的である。MのE、R 、又はK による置換は、新しい側鎖基のイオン性の先端がタンパク質表面に達することができ、メチレン基が疎水的接触をする場合には、半保存的とみなされる。PのK、R、E、又はD による置換は、側鎖基がタンパク質表面に位置する場合には半保存的である。更に、当然のことながら、立体的に要求する位置にあるグリシンは置換することはできず、又、Pはアルファ螺旋状あるいはベータシート状構造に導入すべきではない。LOVドメインの構造と活性において致命的で、それ故に置換に供してはならない残基は、例えばアラニン・スキャン変異誘発のような、当業者においてよく知られた方法によって決定することができる。

ここで使用される用語「キメラ融合タンパク質」とは、遺伝子工学的に処理された融合タンパク質であり、もしそうしなければ自然界に存在しない融合タンパク質のことを意味する。融合タンパク質は、少なくとも2個の異なった親タンパク質に由来してよく、よって、それらによって構成されてもよい。しかしながら、融合タンパク質は2個を越える親タンパク質、例えば3、4、5、あるいは更に6個の異なった親タンパク質から由来してもよい。親タンパク質は、互いに同族であってよいが、好ましくは、当該親タンパク質は互いに異族、即ち自然界にある異なった種のものでよい。融合タンパク質は、一方の親タンパク質のコード化領域(又はドメインをコード化した部分、あるいは当該親タンパク質の切り取られたもの)を、別の親タンパク質のコード化した領域(又はドメインをコード化した部分、あるいは当該別の親タンパク質の切り取られたもの)の枠の中で融合することによって作成される。しかしながら、融合タンパク質は自然界にはない方法で融合された同じタンパク質の2個以上のドメインを含むようにすることもできる。

PHYドメインの発色団は、直鎖テトラピロール、即ち直鎖分子の中で4個のピロールが共に結合し、置換基を変えたものである。好ましくは、直鎖テトラピロールは、自然界にある直鎖テトラピロールで、例えば、フィコシアノンビリン、フィコエリスロビリン、フィコウロビリン、フィコビオロビリン、フィトクロモビリン、ビリべルジン、ビリルビン、メソビリべルジン、メソビリルビン、ビラン、ビリン、ウロビリン、ステルコビリン、及びウロビリノーゲンなどである。最も好ましい発色団は、フィコシアノンビリンである。

適切な波長の光による励起によって、LOVドメイン、従って融合タンパク質は2量化する。LOVドメインは、通常、青色光、即ち、350~500 nm、好ましくは400〜500 nm、より好ましくは約420~約490 nmの波長の光で、励起可能である。しかしながら、本開示は、当該ドメインの励起に必要な光の波長をシフトさせるために変異されたLOVドメインを包含してもよい。しかしながら、当業者は、LOVドメインの励起に適切な波長を知っているか、又は慣例の方法によって、どの光がLOVドメインの励起に使用されるかを容易に決定することができる。

ここに開示されたキメラ融合タンパク質のLOVドメインは、極めて光感応的である。好ましい実施の形態において、LOVドメインは、5 μW/mm²の光、好ましくは4 μW/mm²の光、より好ましくは3 μW/mm²の光、最も好ましくは2.5 μW/mm²の光で活性化が可能である。更に、ここに開示されたLOVドメインは、2.0 μW/mm²、1.5 μW/mm²、1.0 μW/mm²、0.5 μW/mm²、及び 0.3 μW/mm²の光でも活性化が可能であることが、更に証明され得るであろう。

同様に、光感応性PHYドメイン、従って融合タンパク質は、適切な波長の光による励起によって2量化、好ましくはホモ2量化する。LOVドメインと異なって、PHYドメインは赤色光、即ち、600〜690 nm、好ましくは610〜680 nm、より好ましくは620〜670 nm、最も好ましくは約650 nmの波長の光等の 630〜660 nmの波長の光で励起が可能である。加えて、光感応性PHYドメインは、700〜750 nm、好ましくは710〜740 nm、より好ましくは720〜730 nmの波長の光によって不活性化することができる。光感応性PHYドメインは、LOVドメインよりも更により光感応的である。その目的のために、当該光感応ドメインは、0.5 μW/mm²の光、好ましくは0.4 μW/mm²の光、より好ましくは0.3 μW/mm²の光、最も好ましくは0.25 μW/mm²の光、0.2 μW/mm²、0.15 μW/mm²、0.1 μW/mm²、0.05 μW/mm²、及び 0.03 μW/mm²のような光で活性化が可能である。

融合タンパク質が2量化できるかどうかは、当業者において公知の適切なアッセイのどれによっても検証することができる。アッセイの選択は、LOVドメイン又はPHYドメインの融合パートナーに依存する。2量化によってエフェクター機能を生じる、例えばチロシンキナーゼ受容体のような公知のエフェクタータンパク質の場合、2量化の可能性は、下流のシグナル伝達分子の活性化を求めることによって検証することができる。このことは、シグナル伝達物質の機能状態を求めるというような当業者において公知の方法、例えば、フォスフォチロシンに対する抗体を用いる方法によって達成することができる。また、そのようにして生じたシグナルの具体的な最終効果を決定することもできる。即ち、細胞周期分布における変化、細胞の転写プロファイルにおける変化、細胞の中での特定のタンパク質の局在化と分布、細胞の形におけるような細胞の表現型における変化、表面又は3次元構造における細胞の分布における変化、細胞の代謝活性における変化のような細胞応答を決定することができる。また、細胞のパーセント生存率又は死亡率の決定、細胞の分化状態の決定及び/又は細胞の代謝物の組成変化の決定によって、細胞応答を決定することができる。

このようなエフェクター機能の決定に関わるアッセイは、更に以下に記載する。また、レポーター遺伝子がキメラ融合タンパク質の2量化の際に発現されるレポーター遺伝子構成を設計することもできる。融合タンパク質の特性がまだ未確定の場合には、細胞のモック感染対照細胞と比較した、ここに記載されたキメラ融合タンパク質を発現する表現型変化を決定するか、あるいは、融合パートナーに依存しない2量化を求める技術、例えば蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)又は当業者において公知の他の適切な方法のようなものを使用することができる。FRETは、二つの蛍光発色団の間のエネルギー移動を記述する機構である。ドナー発色団は、励起された状態のエネルギーをアクセプター発色団に移動することができる。このエネルギー移動の効率はドナーとアクセプターの間の距離に反比例するので、FRETは短い距離に極めて敏感である。従って、当業者であれば、キメラ融合蛋白質が2量化できるかどうかについて決定する適切な方法を、容易に認識するであろう。しかしながら、「励起による2量化の可能性」という表現は、前もって励起することなしになされる構造上の2量化が除外されるということの示唆をも意図する。

好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、受容体チロシンキナーゼ(RTK)の細胞内部分を更に含む。RTKは、多くのポリペプチド成長因子、サイトカイン、及びホルモンに対する高親和性細胞表面受容体である。RTKは、正常な細胞プロセスの主要調整因子であり、また、多くのタイプの癌の発達と進行において決定的な役割をもつことが示されてきた。それぞれのRTKモノマーは、25〜38個のアミノ酸残基と、細胞内C-末端領域と、細胞外N-末端領域から構成された単一疎水性膜貫通ドメインを持つ。更に好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、更に、融合タンパク質を細胞膜に組み込ませる当該RTKの膜貫通ドメインからなってもよい。当業者であれば、RTKのアミノ酸配列から膜貫通ドメインを容易に決定することできる。

細胞外N-末端領域は、ホルモンや成長因子のような細胞外リガンドを結合するリガンド結合部位を主として含む。細胞内C-末端領域は、保存の最高レベルを示すもので、シグナル伝達を担う触媒ドメインを含む。細胞外リガンド結合は、典型的には受容体の2量化を誘起又は安定化して受容体の自動リン酸化及び/又はその特定の基質——例えばMAPキナーゼシグナル伝達経路のメンバー——のチロシンリン酸化へと導く。

キメラ融合タンパク質を含むLOVドメインに関しては、チロシンキナーゼは、好ましくは、EGF受容体(例えば、EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3、又はErbB4)、FGF受容体、RET 受容体、インシュリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、HGF受容体、Trk受容体、Eph受容体、AXL受容体、LTK受容体、TIE受容体、ROR受容体、DDR受容体、KLG受容体、RYK受容体、及びMuSK受容体からなる群から選ばれるRTKであり、より好ましくは、EGF受容体、FGF受容体、及びRET受容体から選ばれるRTKであり、最も好ましくは、EGFR、FGFR1、及びRETから選ばれるるRTKである。

融合タンパク質がPHYドメインを含む場合には、チロシンキナーゼは、好ましくは、FGF受容体、Trk受容体、EGF受容体(例えば、EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3、又はErbB4)、RET 受容体、インシュリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、HGF受容体、Eph受容体、AXL受容体、LTK受容体、TIE受容体、ROR受容体、DDR受容体、KLG受容体、RYK受容体、及びMuSK受容体からなる群から選ばれるRTKであり、より好ましくは、FGF受容体及びTrK受容体から選ばれ、更に好ましくは、FGFR1及びTrkBから選ばれるRTKである。

最も好ましい実施の形態において、融合タンパク質はredOpto-mFGFR1 (SEQ ID NO: 66) 又はredOpto-rtrkB (SEQ ID NO: 67)であり、特には、更に以下に記載される。赤色光は青色光に比べて明確に改善された組織浸透性を提供するので、redOpto-mFGFR1及びredOpto-rtrkBは、光遺伝学的な手段の高い価値のあるグループの典型である。例えば、5 mmの厚さを持つ骨/頭蓋骨は青色光(460 nm)の〜2%を透過するが、赤色光(640 nm)は〜10%を透過する(Wan, Parrish et al. 1981)。又は、1 cmの厚さを持つ筋肉組織は青色光の〜20%を透過するが、赤色光は〜80%を透過する(Marquez, Wang et al. 1998)。従って、赤色光で制御されたRTKは、細胞におけるMAPKシグナル伝達経路の非侵襲性活性化を可能とする。

特に、受容体ファミリーを含むPHYドメインとLOVドメインの組み合わせは2色活性化による実験を可能とする。従って、異なった光感応性ドメイン(PHYドメインとLOVドメイン)を含むキメラ融合タンパク質は、ここに開示された全ての用途と方法において組み合わされることができる。

これらのRTKの配列、細胞内部分、及び膜貫通ドメインは公的配列データベースで公開されており、当業者においてよく知られたもので、通常の方法を用いて当業者において容易に決定することができる。従って、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、そのリガンドに依存せずに2量化によって活性化された全ての受容体を始動させる。従って、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、いわゆるオーファン受容体の特性を明確にするなど、非常に有効な研究手段である。従って、別の好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質はオーファン受容体の細胞内部分を含む。

また、ここに開示されたキメラ融合タンパク質——ここにおいて、当該キメラ融合タンパク質は転写因子である——を開示するもので、それは更にDNA結合ドメインと転写制御ドメインからなり、その2量体型の転写因子は、機能連関において当該DNA結合ドメインの認識配列を含むターゲット遺伝子の転写を促進又は抑制をすることができる。DNA結合ドメインは認識して、それらが制御する遺伝子に隣接するDNAの特定の配列に付着する。転写制御ドメインによって、転写因子は、遺伝子転写のアクチベーター又はリプレッサーになることができる。転写因子は、遺伝子発現の制御のために、種々の機構を利用する。これらの機構は、RNAポリメラーゼのDNAへの結合の阻止又は安定化、ヒストンのアセチル化又は脱アセチル化、又は、プロモーター又はエンハンサー領域へコアクチベーター又はコリプレッサータンパク質の持ち込みを含む。

好ましい実施の形態において、LOVドメイン又はPHYドメインは、その融合パートナーからC-末端の方に位置する。別の好ましい実施の形態において、LOVドメイン又はPHYドメインは、融合タンパク質のC-末端又はN-末端に位置し、より好ましくは、LOVドメイン又はPHYドメインは、融合タンパク質のC-末端に位置する。

キメラ融合タンパク質は、キメラ融合タンパク質が細胞内で発現したかどうか、また、当該細胞内での位置決定を可能にする蛍光タンパク質を更に含む。ここで使用される好ましい蛍光タンパク質は、GFP、EGFP、mCherry、又はmVenusである。しかしながら、ここに開示されたキメラ融合タンパク質に適した、いかなる蛍光タンパク質も使用することができる。FRETの文脈の中で、ここの別の場所で記述されているように、適切な波長の光による励起によってキメラ融合タンパク質が2量化が可能かどうかを決定するために、蛍光タンパク質を用いることができる。

好ましい実施の形態において、LOVドメイン又はPHYドメインが適切な波長の光による励起された時に、キメラ融合タンパク質はホモ2量化する。しかしながら、適切な波長の光による励起によってLOVドメイン又はPHYドメイン(好ましくは同一のもの)を介してヘテロ2量化する2個の非同一のここに開示された融合タンパク質を用意するように意図される。 ここに記載され、特許請求の範囲で定義されているキメラ融合タンパク質をコード化する核酸分子を更に開示する。

ここで使用される用語の「核酸分子」は、当業者において知られており、DNA、RNA、cDNA、又はそれらのハイブリッド、あるいはそれらの全ての修飾を指す。ここに記載された核酸を含む核酸残基は、天然に存在する核酸残基又は人工的に作られた核酸残基でよく、例えば、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、ウラシル(U)、キサンチン(X)、ヒポキサンチン(HX)が挙げられる。チミン(T)とウラシル(U)は、DNAの中のチミン(T)は転写されたmRNAにおけるウラシル(U)と対応するので、ポリヌクレオチドのそれぞれのタイプに応じて、交換可能に使用することができる。ここに提供され記載される核酸分子は、一重又は二重螺旋、直鎖又は環状、天然又は合成でよく、また、大きさにおいていかなる制限もない。核酸は、機能連関において、プロモーターのような転写制御配列、及び転写と翻訳の開始と停止シグナルを更に含んでもよい。一つの特別な実施の形態において、核酸分子はベクターの形であってもよい。ここで使用される用語「ベクター」とは、プラスミド、コスミド、ウイルス、バクテリオファージ、トランスポゾン、及び遺伝子工学で普通に使用される他のベクター類を特に指す。好ましい実施の形態において、ベクターは、菌細胞、酵母細胞、又は原核細胞を始めとする微生物細胞のような細胞の形質転換に適している。ここに開示されたキメラ融合タンパク質を発現するために、ベクターは真核細胞の安定な形質転換に好適に使用することができる。より好ましくは、開示されたベクターは当業者において一般的に公知の発現ベクターである。好ましくは、核酸分子又はベクターは、核酸分子又はベクターによって形質転換された細胞の選択を可能とする選択マーカーを含む。また、核酸分子又はベクターは、例えば相同再結合のような、核酸分子又はベクターをホスト細胞のゲノムに統合する統合素子を含んでもよい。

加えて、あるいは別法として、核酸分子又はベクターは、ホスト細胞のゲノムに統合されることを必要とせずに核酸分子を細胞内に維持することを可能とする複製物の起源を含んでもよい。核酸分子と組み合わせた使用のために有利な又は必要な他の手段、並びにそれらを結びつける方法は、当業者において一般的に公知である。一つの好ましい実施の形態において、核酸分子は、SEQ ID NO: 54の核酸配列を含む、あるいはより好ましくは、SEQ ID NO: 54の核酸配列から構成される。別の好ましい実施形態において、核酸分子は、SEQ ID NO: 55の核酸配列を含む、あるいはより好ましくは、SEQ ID NO: 55の核酸配列から構成される。更に好ましい別の実施形態において、核酸分子はSEQ ID NO: 65 (SyCP1-PHY)の核酸配列を含み、より好ましくは、核酸分子はSEQ ID NO: 68 (redOpto-mFGFR1)又はSEQ ID NO: 69 (redOpto-rtrkB)の核酸配列を含む。最も好ましい実施の形態において、核酸分子はSEQ ID NO: 68 (redOpto-mFGFR1)又はSEQ ID NO: 69 (redOpto-rtrkB)の核酸配列から構成される。

このような背景のもと、本開示は、単離された細胞のような細胞、又は単離された組織の中の細胞のような細胞であって、該細胞はここに開示されたキメラ融合タンパク質を発現する及び/又はここに記載された核酸分子を含んでいる細胞を提供する。ホスト細胞は、原核細胞又は真核細胞でよく、それらはそのような細胞由来の核酸分子又はベクター又は細胞からなり、また、ここに開示された核酸分子又はベクターを含む。好ましい実施の形態において、ホスト細胞は、ゲノムへ統合された核酸分子を含むような方法で核酸分子又はベクターを含み、又はかかる核酸分子又はベクターによって遺伝的に変更がなされている。ホスト細胞は、細菌、酵母菌、真菌、又は哺乳類の細胞又は昆虫類の細胞のような真核細胞であってよい。ここに開示された核酸分子又はベクターによるホスト細胞の形質転換又は遺伝子工学は、当業者において公知の標準的な方法で行うことができる。

更に、ここに開示されたキメラ融合タンパク質を発現する及び/又はここに記載された核酸分子によってコード化さる、非ヒト形質転換動物が開示される。「形質転換非ヒト動物」とは、ヒト以外のいかなる動物であってもよい。好ましい実施の形態において、形質転換非ヒト動物は、脊椎動物であり、好ましくは哺乳動物、更に好ましくは、マウス又はラットのような齧歯動物;又は、非ヒト霊長類、即ちホモ属のメンバーでない霊長類——例えば、アカゲサル、チンパンジー、ヒヒ、マーモセット、ミドリサル——である。用語の「非ヒト形質転換動物」は、良く知られたモデル生物で、以下のもの——モルモット(Cavia porcellus)、ハムスター、マウス(Mus musculus)、ラット(Rattus norvegicus)、コットンラット(Sigmodon hispidus)、犬(Canis lupus familiaris)、猫(Felis cattus)、ニワトリ(Gallus gallus domesticus)、キンカチョウ(Taeniopygia guttata)、アフリカツメガエル(Xenopus laevis)、二ホンメダカ(Oryzias latipes)、フグ(Takifugu rubripres)、ヤツメウナギ、 ゼブラフィッシュ(Danio rerio)、 エレガンス線虫、アスナロウニ(Arbacia punctulata)、カタユウレイボヤ(Ciona intestinalis)、キイロショウジョウバエのようなショウジョウバエ、ダンゴイカ(Euprymna scolopes)、ヒドラ(Hydra)、ケンサキイカ(Loligo pealei)、Pristionchus pacificus、 Strongylocentrotus purpuratus、Symsagittifera roscoffensis、及びコクヌストモドキ(Tribolium castaneum)——を含むが、これらに限定されるものではない。形質転換非ヒト動物は核酸分子に対してヘテロ接合であってもよいが、好ましい実施の形態においては、形質転換非ヒト動物は核酸分子に対してホモ接合である。なお、人間又は動物に対して実質的に便益をもたらさず、従って関係する特許法又は司法権の元で特許性がないような動物は除外される。人間又は動物に対する便益が動物の苦難よりも実質的に勝ることを確実にするために、当業者は、例えば、動物福祉に関する国際的なガイドラインに制定されたような適切な対策を講じるであろう。

ここに記載されたキメラ融合タンパク質は、スクリーニング方法において特に有用である。例えば、キメラ融合タンパク質は、新しい受容体の特性を明らかにし、高価なリガンドに対する要請を廃し、また受容体シグナル伝達の空間的時間的制御を可能にする。

従って、更に本開示は、 a) SEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)、SEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)、及びSEQ ID NO: 10 (VfAU1-LOV)から選ばれるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも70%の配列が同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインと細胞表面受容体の細胞内部分からなるキメラ融合タンパク質を発現する細胞を準備する工程であって、当該キメラ融合タンパク質は、適切な波長の光による前記LOVドメインの励起によって前記細胞表面受容体の前記細胞内部分を介して細胞応答を引き起こす2量化が可能であるキメラ融合タンパク質である工程 b) 前記細胞を候補試薬と接触させる工程 c) 前記細胞を前記適切な波長を有する光に当てる工程 d) 前記候補試薬が、c)工程で引き起こされた前記細胞応答に作用することが可能かどうかを決定する工程 からなるスクリーニング方法を提供する。

同様に、 a) 発色団との機能連関において、SEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも70%の配列が同一であるアミノ酸配列を有する光感応性ドメインと細胞表面受容体の細胞内部分からなるキメラ融合タンパク質を発現する細胞を準備する工程であって、当該キメラ融合タンパク質は、適切な波長の光による前記光感応性ドメインの励起によって前記細胞表面受容体の前記細胞内部分を介して細胞応答を引き起こす2量化が可能であるキメラ融合タンパク質であり、 b) 前記細胞を候補試薬と接触させる工程 c) 前記細胞を前記適切な波長を有する光に当てる工程 d) 前記候補試薬が、c)工程で引き起こされた前記細胞応答に作用することが可能かどうかを決定する工程 からなるスクリーニング方法を提供する。

上記スクリーニング方法は、前に記載されたように更に定義することができる。従って、好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、SEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも70%の配列が同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインを含む。より好ましい実施の形態において、LOVドメインは、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である。

別の好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも70%が同一であるLOVドメインを含む。

より好ましい実施の形態において、LOVドメインは、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である。

更に別の好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 10 (VfAU1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも70%が同一であるLOVドメインを含む。より好ましい実施の形態において、LOVドメインは、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 10 (VfAU1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である。

別の好ましい実施の形態において、光感応性ドメインは、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である、及び/又は発色団が、直鎖テトラピロール、好ましくは、フィコシアノンビリン、フィコエリスロビリン、フィコウロビリン、フィコビオロビリン、フィトクロモビリン、ビリべルジン、ビリルビン、メソビリべルジン、メソビリルビン、ビラン、ビリン、ウロビリン、ステルコビリン、及びウロビリノーゲンから選択され、好ましくは、発色団がフィコシアノンビリンである。

好ましい実施の形態において、LOVドメインが適切な波長の光によって励起されると、キメラ融合タンパク質はホモ2量化する。しかしながら、適切な波長の光による励起によって、LOVドメイン(好ましくは同一のもの)を介して、ヘテロ2量化する2個の非同一のここに開示された融合タンパク質を用意するように意図される。

好ましくは、LOVドメインは、青色光、即ち、350〜500 nm、好ましくは400〜500 nm、より好ましくは約420〜約490 nmの波長の光によって、励起可能である。しかしながら、本開示は、当該ドメインの励起に必要な光の波長をシフトさせるために変異されたLOVドメインを包含してもよい。また、好ましくはLOVドメインは、5 μW/mm²の光、好ましくは4 μW/mm²の光、より好ましくは3 μW/mm²の光、最も好ましくは2.5 μW/mm²の光で活性化が可能である。更に、ここに開示されたLOVドメインは、2.0 μW/mm²、1.5 μW/mm²、1.0 μW/mm²、0.5 μW/mm²、及び 0.3 μW/mm²の光でも活性化が可能であることが、更に証明され得るであろう。

前で注目したように、PHYドメインは、赤色光、即ち、600〜690 nm、好ましくは610〜680 nm、より好ましくは620〜670 nm、最も好ましくは650 nmの波長のような 630〜660 nmの波長の光で励起が可能である。加えて、光感応性PHYドメインは、700〜750 nm、好ましくは710〜740 nm、より好ましくは720〜730 nmの波長の光によって不活性化することができる。光感応ドメインは、0.5 μW/mm²の光、好ましくは0.4 μW/mm²の光、より好ましくは0.3 μW/mm²の光、最も好ましくは0.25 μW/mm²の光、0.2 μW/mm²、0.15 μW/mm²、0.1 μW/mm²、0.05 μW/mm²、及び 0.03 μW/mm²のような光で活性化が可能である。

好ましい実施の形態において、LOVドメイン又はPHYドメインは、その融合パートナーからC-末端の方に位置する。別の好ましい実施の形態において、LOVドメイン又はPHYドメインは、融合タンパク質のC-末端又はN-末端に位置する。最も好ましい実施の形態において、LOVドメイン又はPHYドメインは、融合タンパク質のC-末端に位置する。

スクリーニング方法の好ましい実施の形態において、当該受容体の細胞内部分は、更に上記したように、受容体チロシンキナーゼ(RTK)の細胞内部分である。当該融合タンパク質は、好ましくは、当該RTKの膜貫通ドメインを更に含んでもよい。LOVドメインについて前に議論したように、適切なRTKは、EGF受容体(例えば、EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3、又はErbB4)、FGF受容体、インシュリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、HGF受容体、Trk受容体、Eph受容体、AXL受容体、LTK受容体、TIE受容体、ROR受容体、DDR受容体、RET 受容体、KLG受容体、RYK受容体、及びMuSK受容体が例示される。好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、EGF受容体、FGF受容体、又はRET 受容体の細胞内部分を含む。より好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、EGFR、 FGFR1、又はRETの細胞内部分を含む。最も好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、SEQ ID NO: 58 (mFGFR1-VfAU1-LOV)、SEQ ID NO: 59 (p75-hEGFR-VfAU1-LOV)、又はSEQ ID NO: 60 (hRET-VfAU1-LOV)を含む。更に最も好ましい実施の形態において、キメラ融合タンパク質は、SEQ ID NO: 58 (mFGFR1-VfAU1-LOV), SEQ ID NO: 59 (p75-hEGFR-VfAU1-LOV)、又は SEQ ID NO: 60 (hRET-VfAU1-LOV)を含む。

融合タンパク質がPHYドメインを含む場合には、チロシンキナーゼは、好ましくは、FGF受容体、Trk受容体、EGF受容体(例えば、EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3、又はErbB4)、RET 受容体、インシュリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、HGF受容体、Eph受容体、AXL受容体、LTK受容体、TIE受容体、ROR受容体、DDR受容体、KLG受容体、RYK受容体、及びMuSK受容体からなる群から選ばれるRTKであり、より好ましくは、FGF受容体及びTrK受容体から選ばれ、更に好ましくは、FGFR1及びTrkBから選ばれる。最も好ましい実施の形態において、融合タンパク質は、その配列が、redOpto-mFGFR1 (SEQ ID NO: 66)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である。別の最も好ましい実施の形態において、融合タンパク質は、その配列が、redOpto-rtrkB (SEQ ID NO: 67)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも70%、より好ましくは少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である。更に最も好ましい実施の形態において、融合タンパク質は、redOpto-mFGFR1 (SEQ ID NO: 66)から構成される。更に別の最も好ましい実施の形態において、融合タンパク質は、redOpto-rtrkB (SEQ ID NO: 67)から構成される。

また、前に更に詳しく開示したように、キメラ融合タンパク質は、オーファン受容体の細胞内部分を更に含んでもよい。

限定されない「候補試薬」の例として、小型分子、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド様のもの、抗体分子、更には、糖系、脂質系、核酸系の化合物が挙げられる。これらの小型分子は、天然資源から導入されてもよいし、あるいは、コンビナトリアル化学のようなものから合成的に開発されてきたものでもよい。しかしながら、当然のこととして、候補試薬は、貴重な資源に求めるものではない。一般的に、当該小型分子の分子量は、250〜800 Da、 より好ましくは350〜700 Da又は400〜650 Da等の300〜750 Daである。合成化合物ライブラリー、及び細菌、菌類、植物、及び動物の抽出物の形での天然化合物のライブラリーが市販されている。別法として、かかるライブラリーは、当業者においてよく知られた方法に準拠して作ることもできる。

d)工程は、当該候補試薬が、c)工程で引き起こされた細胞応答に作用することが可能かどうかを判断する工程である。一般的に、d)工程においては、いかなる適切な方法又は手段も使用してよい。より具体的には、それらの方法又は手段の選択は、c)工程で引き起こされた細胞応答に依存するであろう。しかしながら、d)工程が細胞応答における変化の読み取りのために光を用いることは特に好ましい。即ち、細胞応答は、蛍光シグナルの強度と分布を求めるために適切に使用することができる光センサーによって決定することができる。

例えば、d)工程は細胞の遺伝子転写プロファイルの決定を含んでもよい。遺伝子転写プロファイル決定の方法は、当業者においてよく知られたものである。好ましい実施の形態において、細胞応答に応じて、遺伝子はスイッチon又はoffとなる。より好ましい実施の形態において、遺伝子転写プロファイルは、制御配列によるコントロールのもとにあるレポーター遺伝子を用いて決定してもよい。かかる制御配列はキメラ融合タンパク質の2量化によって転写を開始する。レポーターアッセイの例は、以下に示す資料と方法の項において記載される通りであり、それらはルシフラーゼレポーター遺伝子を用いた市販のCignal Reporter Assay及びPath Detect Elk1 trans Reporting Systemを含む。別の例として、ガラクトシダーゼ又はエステラーゼのような他の酵素を用いるレポーター遺伝子アッセイが挙げられる。別法として、細胞応答に対して特異的及び/又は特徴的なプライマーとプローブを使用する、RNA又はcDNAマイクロアッセイ、反定量PCR、定量PCR、又はリアルタイムPCRに、細胞を供する。そのために、同様に適用できるWestern Blotも資料と方法の項において記載されている。

また、工程 d) は、細胞周期分布の決定を含むことができる。細胞周期分布決定の方法は当業者において公知である。細胞周期分布決定の方法は、資料と方法の項における「細胞周期分布」という題目の中でより詳しく記載されている。更なる細胞周期分布決定の方法は、以下に記載する発現プロファイルの解析を含む。

また、工程 d) は、細胞の中でのタンパク質の位置決定を含むことができる。例えば、活性化受容体タンパク質の内在化、又は転写因子のような特徴的な核酸タンパク質の偏在化を測定することができる。タンパク質の細胞内における偏在化決定の方法は、当業者において公知である。これは、(i) これらのタンパク質を蛍光タンパク質と融合させるか、あるいは (ii) これらのタンパク質を蛍光マーカーによってラベルすることによって行うことができる。融合タンパク質又はラベルされたタンパク質は、例えば蛍光顕微鏡又は電子顕微鏡のような顕微鏡を用いた広い範囲の技術によって、位置が決定される。さらに、光学的性質の変化に伴うpHの変化に応じることができ、従ってタンパク質が存在する細胞の区画を検知できる蛍光タンパク質及び蛍光分子を使用することができる。ラベル化は、抗体、酵素(例えば「SNAP-tag」)、又は化学反応性基との反応によって行うことができる。

さらに別の実施の形態において、工程 d) は、細胞内におけるタンパク質の機能状態を、例えば、c)工程で引き起こされた細胞応答に特徴的なシグナル伝達分子のリン酸化を決定する方法などによって、決定することを含んでもよい。タンパク質の機能状態を決定する方法は、当業者において公知である。タンパク質の機能状態の決定は、細胞から特定又は全てのタンパク質を抽出し、特に他ではなく一つの機能状態にあるタンパク質をラベル化することによって達成することができる。ラベル化は機能タンパク質状態に特異的な抗体を用いることによって行うことができる。別の方法においては、先に記載したように、機能状態はタンパク質の位置を解析することによって特定することができる。別の方法においては、タンパク質は1個以上の蛍光タンパク質と、光学的性質の変化に伴う機能状態の変化に応じるRET部分において融合することができる。別の方法においては、タンパク質の別のタンパク質との会合は検知可能であり、機能状態の尺度として用いることができる。

同様に、工程 d) は、細胞の形を決定することを含んでもよい。細胞の形を決定する方法は、当業者において公知である。このことは光又は蛍光顕微鏡によって達成することができる。後者においては、細胞は適切な染色を施してもよく、又は、細胞は蛍光タンパク質を発現するか、あるいは適切な蛍光分子又はタンパク質によってラベルされてもよい。細胞形態の決定のためのアッセイは、後に記す資料と方法の項の「細胞形態」の題目の中で更に記載される。

別法として、工程 d) は、細胞の分布、又は細胞の2D表面もしくは3D構造における移動挙動を決定することによって実施してもよい。細胞の分布、又は細胞の移動挙動の決定方法は、当業者において公知である。分布又は移動挙動は、光又は蛍光顕微鏡によって決定することができる。細胞は、2D表面もしくは3D構造に置いてもよい。それぞれの細胞の位置が記録され、それは時間の関数としても記録される。それぞれの細胞の位置から、細胞分布(例えば最も近隣にあるもの、一定の領域にある近隣の数)、又は移動挙動(例えば、細胞の動作、又は一定時間の間の移動距離)のパラメーターを抽出することができる。

工程 d)の別の実施の形態は、細胞の代謝活性の決定、又は、細胞の代謝物構成の決定を含む。細胞の代謝活性の決定方法は、当業者において公知である。代謝活性は、例えば、資料と方法の項の「細胞増殖」という題目のもとに後で述べるように、細胞増殖の観点から決定されてもよい。また、代謝活性は、例えば質量分析又はクロマトグラフィー法のような、細胞化学組成の分析によって決定されてもよい。また、代謝活性は、細胞によって処理され該処理は代謝活性に依存する化学試薬(例えばテトラゾリウム染料)——によって決定されてもよい。

さらに別の実施の形態において、工程 d)は、細胞の生存又は死亡に関する決定を含む。細胞の生存又は死亡の決定方法は、当業者において公知であり、それらは、アポトーシス促進マーカー(例えば、アネキシンV,又はカスパーゼ)の検知、染料のアポトーシス細胞への取り込み(例えば、ヨウ化プロピジウム)、又は基質利用の決定(例えば、[³H]-チミジンの取り込み)を含む。細胞の生存率及び/又は細胞培地中あるいはサンプル中のアポトーシス細胞の割合を決定するためのキットが市販されている。

別法として、工程 d)は、細胞の分化状態の決定を含んでもよい。細胞の分化状態の決定方法は、当業者において公知である。細胞の分化状態の決定方法は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡、又は免疫ヒストケミストリーによるような、特定の細胞マーカーの分化状態の決定を含んでもよい。前に記載したように、分化のタイプに従って、細胞は、細胞形態及び/又は発現プロファイルの変化を起こし得る。

さらに別の実施の形態において、工程 d)は、細胞によるヌクレオチド類似体の取り込みの決定を含むことができる。細胞によるヌクレオチド類似体の取り込みの決定方法は、当業者において公知である。ヌクレオチド類似体は、細胞応答のモニタリングが可能な適切なヌクレオチド類似体であればいずれでもよい。例えば、前記ヌクレオチド類似体として、5−エチニル−2’−デオキシウリジン又はブロモデオキシウリジンが挙げられる。これらの類似物の検知は、市販の抗体、又はアジド基で特徴づけられる蛍光によってラベルされた蛍光ラベルを用いて達成してもよい。

以上で証明されたように、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、種々の用途に有利に取り込むことができる。例えば、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、研究手段として、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにするために用いることができる。

以上で記載されたように、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、スクリーニング方法において使用することができる。その結果、当該キメラ融合タンパク質のアクチベーターとして、また当該スクリーニング方法の読み取りのために光を用いることができるスクリーニング方法が提供される。このことは、高価なリガンドを添加する必要性を廃し、従って、自動化された高生産性スクリーニングに本スクリーニング方法を適用することを可能にする。

さらに、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、細胞成長の制御に対する非治療的な応用において使用することができ、そこにおいて、当該キメラ融合タンパク質は、好ましくはin vitroで使用される。例えば、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、成長因子経路の制御に対して非治療的に使用することができ、そこにおいて、当該キメラ融合タンパク質は、好ましくはin vitroで使用される。

ここに開示されたキメラ融合タンパク質の別の用途として、パターン形成細胞培地の生産、又はパターン形成組織の生産さえも挙げられる。パターン形成細胞培地は、当該細胞培地の一定の細胞が刺激を受け、他の細胞は受けないことを特徴とする。パターン形成細胞培地を生産するためには、活性化の高度な空間的制御が必要とされるが、、全ての細胞に対して同じ培養液を使用する場合には通常困難である。光による制御可能な励起の故に、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、パターン形成細胞培地を生産するために使用することができ、このことは、実施例においても証明される。

高度な空間的制御の他に、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、高度な時間的制御も可能にする。受容体シグナル伝達経路の高度な時間的制御は、例えば、幹細胞の分化において必要とされる。そこでは、特定の成長因子シグナル伝達経路が、ある特定の分化時点において、細胞に適用されなければならない。従って、ここに開示されたキメラ融合タンパク質は、幹細胞の分化において非治療的な方法で有利に使用することができ、そこでは、当該キメラ融合タンパク質は、好ましくはin vitroで使用される。かかる幹細胞は、ヒトの生殖系遺伝的固有性を変更することに関わるプロセス、又は産業的もしくは商業的目的のためにヒト胚の使用に関わるプロセスを用いることなく、得ることができる。

受容体活性化の高度な空間的時間的制御は、対象とするバイオ製品製造の制御において、ここに開示されたキメラ融合タンパク質を特に有用なものとする。

上記用途(非治療的)は、ここに開示されたキメラ融合タンパク質それ自体に限られるものではない。同様に、ここに開示された核酸分子、又は、ここに開示された非ヒト形質転換動物の研究手段としての用途は、好ましくは、オーファン受容体の特性を明らかにする意図のために使用される。更に、ここに開示された核酸分子は、スクリーニング方法において使用することができる。かかるスクリーニング方法は、光を、好ましくは、当該核酸分子によってコード化さるキメラ融合タンパク質のアクチベーターとして、また、当該スクリーニング方法の読み取りのために、用いる。最後にまた、ここに開示された非ヒト形質転換動物をスクリーニング方法において使用されることが意図される。

当該方法は、以下の実施の形態によってさらに記載される。 1.a) SEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)、SEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)、及びSEQ ID NO: 10 (VfAU1-LOV)から選ばれるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも70%の配列が同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインと細胞表面受容体の細胞内部分からなるキメラ融合タンパク質を発現する細胞を準備する工程であって、当該キメラ融合タンパク質は、適切な波長の光による前記LOVドメインの励起によって前記細胞表面受容体の前記細胞内部分を介して細胞応答を引き起こす2量化が可能であるキメラ融合タンパク質である工程

b) 前記細胞を候補試薬と接触させる工程 c) 前記細胞を前記適切な波長を有する光に当てる工程 d) 前記候補試薬が、c)工程で引き起こされた前記細胞応答に作用することが可能かどうかを決定する工程 からなるスクリーニング方法。

2. 前記LOVドメインが、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である、実施の形態1に記載された方法。

3. 前記LOVドメインが、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である、実施の形態1又は2に記載された方法。

4. 前記LOVドメインが、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 10 (VfAU1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である、実施の形態1乃至3のいずれか一つに記載された方法。

5. 前記LOVドメインが適切な波長の前記光によって励起されて、前記キメラ融合タンパク質がホモ2量化する、実施の形態1乃至4のいずれか一つに記載された方法。 6. 前記LOVドメインを活性化させるための前記光の波長が350乃至500 nmの範囲にある、実施の形態1乃至5のいずれか一つに記載された方法。 7. 前記LOVドメインが前記キメラ融合タンパク質のC−末端に位置する、実施の形態1乃至6のいずれか一つに記載された方法。

8. 前記LOVドメインが、5 μW/mm²の光、好ましくは4 μW/mm²の光、より好ましくは3 μW/mm²の光、最も好ましくは2.5 μW/mm²の光で活性化が可能であり、2.0 μW/mm²、1.5 μW/mm²、1.0 μW/mm²、0.5 μW/mm²、及び 0.3 μW/mm²等の光でも活性化が可能である、実施の形態1乃至7のいずれか一つに記載された方法。 9. 前記細胞内部分が受容体チロシンキナーゼ(RTK)の細胞内部分である、実施の形態1乃至8のいずれか一つに記載された方法。 10. 前記融合タンパク質が前記RTKの膜貫通ドメインから更に有する、実施の形態9に記載された方法。

11. 前記チロシンキナーゼが、EGF受容体(例えば、EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3、又はErbB4)、FGF受容体、RET 受容体、インシュリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、HGF受容体、Trk受容体、Eph受容体、AXL受容体、LTK受容体、TIE受容体、ROR受容体、DDR受容体、KLG受容体、RYK受容体、及びMuSK受容体、好ましくは、EGF受容体、FGF受容体、及びRET 受容体、より好ましくはEGFR、 FGFR1、及びRETからなる群から選ばれるRTKであり、最も好ましくは前記融合タンパク質が、SEQ ID NO: 58 (mFGFR1-VfAU1-LOV)、SEQ ID NO: 59 (p75-hEGFR-VfAU1-LOV)、及びSEQ ID NO: 60 (hRET-VfAU1-LOV)から選ばれる、実施の形態9又は10に記載された方法。 12. 前記融合タンパク質が、オーファン受容体の細胞内部分を更に有する、実施の形態1乃至10のいずれか一つに記載された方法。 13. 工程d)が細胞応答における変化の出力として光を使用する、実施の形態1乃至12のいずれか一つに記載された方法。

14. 工程d)が (i) 細胞周期分布の決定、及び/又は (ii) 細胞の遺伝子転写プロファイルの決定、及び/又は (iii) 細胞内におけるタンパク質の偏在化の決定、及び/又は (iv) 細胞内における機能状態の決定、及び/又は (v) 細胞の形の決定、及び/又は (vi) 表面上又は3D構造における細胞分布の決定、及び/又は (vii) 表面上又は3D構造における細胞の移動挙動の決定、及び/又は (viii) 細胞の代謝活性の決定、及び/又は (ix) 細胞の生存又は死亡の決定、及び/又は (x) 細胞の分化状態の決定、及び/又は (xi) 細胞の代謝物の組成の決定、及び/又は (xii) ヌクレオチド類似体の細胞による取り込みの決定であり、好ましくは、前記ヌクレオチド類似体が5−エチニル−2’−デオキシウリジン又はブロモデオキシウリジンであり、より好ましくは、ヌクレオチド類似体が蛍光によってラベルされているか、又は、ヌクレオチド類似体が抗体によって検知されるかであり、最も好ましくは、蛍光分子が蛍光性アジドである、実施の形態1乃至13のいずれか一つに記載された方法。

15. 工程d)が、細胞による蛍光ヌクレオチド類似体の取り込みを決定することからなり、好ましくは、前記蛍光ヌクレオチド類似体が5−エチニル−2’−デオキシウリジンである、実施の形態1乃至14のいずれか一つに記載された方法。 16. 少なくとも76%の配列がSEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)と同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインからなるキメラ融合タンパク質であって、前記キメラ融合タンパク質は、前記LOVドメインが適当な波長の光によって励起されると、2量化をすることができるキメラ融合タンパク質。

17. 前記LOVドメインが、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 12 (NgPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも78%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である、実施の形態16に記載されたキメラ融合タンパク質。

18. 少なくとも74%の配列がSEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)と同一であるアミノ酸配列を有するLOVドメインからなるキメラ融合タンパク質であって、前記キメラ融合タンパク質は、前記LOVドメインが適当な波長の光によって励起されると、2量化をすることができるキメラ融合タンパク質。 19. 前記LOVドメインが、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 14 (OdPA1-LOV)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも76%、より好ましくは78%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である、実施の形態18に記載されたキメラ融合タンパク質。 20. 前記キメラ融合タンパク質が、前記LOVドメインが適当な波長の光によって励起されると、ホモ2量化する、実施の形態16乃至19のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。

21. 前記LOVドメインが、5 μW/mm²の光、好ましくは4 μW/mm²の光、より好ましくは3 μW/mm²の光、最も好ましくは2.5 μW/mm²の光で活性化が可能であり、2.0 μW/mm²、1.5 μW/mm²、1.0 μW/mm²、0.5 μW/mm²、及び 0.3 μW/mm²等の光でも活性化が可能である、実施の形態16乃至20のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 22. 前記LOVドメインを活性化させるための前記光の波長が350乃至500 nmの範囲にある、実施の形態16乃至21のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 23. 前記LOVドメインが前記キメラ融合タンパク質のC−末端に位置する、実施の形態16乃至22のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 24. 前記キメラ融合タンパク質が受容体チロシンキナーゼ(RTK)の細胞内部分からなる、実施の形態16乃至23のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。

25. 前記融合タンパク質が前記RTKの膜貫通ドメインを更に有する、実施の形態24に記載されたキメラ融合タンパク質。 26. 前記チロシンキナーゼが、EGF受容体(例えば、EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3、又はErbB4)、FGF受容体、RET 受容体、インシュリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、HGF受容体、Trk受容体、Eph受容体、AXL受容体、LTK受容体、TIE受容体、ROR受容体、DDR受容体、KLG受容体、RYK受容体、及びMuSK受容体、より好ましくは、EGF受容体、FGF受容体、及びRET 受容体、最も好ましくはEGFR、 FGFR1、及びRETからなる群から選ばれるRTKである、実施の形態23又は24に記載されたキメラタンパク質。 27. 前記キメラ融合タンパク質がオーファン受容体の細胞内部分を更に有する、実施の形態16乃至25のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。

28. 前記キメラ融合タンパク質が転写因子であり、更にDNA結合ドメインと転写制御ドメインからなり、その2量体型の転写因子は、機能連関において当該DNA結合ドメインの認識配列からなるターゲット遺伝子の転写を促進又は抑制をすることができる、実施の形態16乃至23のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 29. 前記キメラ融合タンパク質が蛍光タンパク質、好ましくは、GFP、EGFP、mCherry、又はmVenusからなる、実施の形態16乃至28のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 30. 実施の形態16乃至29のいずれか一つで定義された前記キメラ融合タンパク質をコード化する核酸分子。 31. SEQ ID NO: 54の核酸配列を有する、実施の形態30に記載された核酸分子。

32. SEQ ID NO: 55の核酸配列を有する、実施の形態30に記載された核酸分子。 33. 実施の形態30乃至32のいずれか一つに記載された核酸分子によってコード化さる前記キメラ融合タンパク質を発現させる非ヒト形質転換動物。 34. 実施の形態16乃至29のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の研究手段としての用途であって、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにするための用途。 35. 実施の形態16乃至29のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質のスクリーニング方法での用途であって、好ましくは前記スクリーニング方法が、前記キメラ融合タンパク質のアクチベーターとして及び前記スクリーニング方法の読み取りのために、光を使用する用途。 36. 実施の形態16乃至29のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の、細胞成長を制御するための非治療的用途であって、好ましくは前記キメラ融合タンパク質がin vitroで使用される用途。

37. 実施の形態16乃至29のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質のパターン形成細胞培地を生産するための用途。 38. 実施の形態16乃至29のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の成長因子経路を制御するための非治療的用途であって、好ましくは前記キメラ融合タンパク質がin vitroで使用される用途。 39. 実施の形態16乃至29のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の、対象とするバイオ製品製造の制御するための用途。 40. 実施の形態16乃至29のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の幹細胞の分化における非治療的用途であって、前記幹細胞は、人類の生殖系細胞の遺伝的同一性を変更することを含む工程、又は、ヒトの胚を産業又は商業目的に使用する工程を用いて製造されず、好ましくは当該キメラ融合タンパク質がin vitroで使用される用途。

41. 実施の形態30乃至32のいずれか一つに記載された前記核酸分子の研究手段としての用途であって、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにするための用途。 42. 実施の形態29に記載された前記核酸分子のスクリーニング方法における用途であって、好ましくは、前記スクリーニング方法が、前記キメラ融合タンパク質のアクチベーターとして、また、前記スクリーニング方法の読み取りのために、光を使用する用途。 43. 実施の形態30乃至32のいずれか一つに記載された非ヒト形質転換動物の研究手段としての用途であって、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにするための用途。 44. 実施の形態30乃至32のいずれか一つに記載された非ヒト形質転換動物のスクリーニング方法における用途。

45. a) 発色団との機能連関において、SEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも70%の配列が同一であるアミノ酸配列を有する光感応性ドメインと細胞表面受容体の細胞内部分からなるキメラ融合タンパク質を発現する細胞を準備する工程であって、当該キメラ融合タンパク質は、適切な波長の光による前記光感応性ドメインの励起によって前記細胞表面受容体の前記細胞内部分を介して細胞応答を引き起こす2量化が可能であるキメラ融合タンパク質である工程 b) 前記細胞を候補試薬と接触させる工程 c) 前記細胞を前記適切な波長を有する光に当てる工程 d) 前記候補試薬が、c)工程で引き起こされた前記細胞応答に作用することが可能かどうかを決定する工程 からなるスクリーニング方法 46. 前記光感応性ドメインが、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも73%、好ましくは少なくとも75%、より好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である、実施の形態45に記載された方法。

47. 前記発色団が、直鎖テトラピロール、好ましくは、フィコシアノンビリン、フィコエリスロビリン、フィコウロビリン、フィコビオロビリン、フィトクロモビリン、ビリべルジン、ビリルビン、メソビリべルジン、メソビリルビン、ビラン、ビリン、ウロビリン、ステルコビリン、及びウロビリノーゲンから選択され、好ましくは、発色団がフィコシアノンビリンである、実施の形態45又は46に記載された方法。 48. 適切な波長の前記光による前記光感応性ドメインの励起によって、前記キメラ融合タンパク質がホモ2量化する、実施の形態45乃至47のいずれか一つに記載された方法。 49. 前記光感応性ドメインを活性化する前記光が600〜690 nmの波長を有する、実施の形態45乃至48のいずれか一つに記載された方法。 50. 前記光感応性ドメインを不活性化する前記光が700〜750 nmの波長を有する、実施の形態45乃至49のいずれか一つに記載された方法。 51. 前記光感応性ドメインが前記キメラ融合タンパク質のC-末端に位置する、実施の形態45乃至50のいずれか一つに記載された方法。

52. 前記光感応性ドメインが0.5 μW/mm²の光、好ましくは0.4 μW/mm²の光、より好ましくは0.3 μW/mm²の光、最も好ましくは0.25 μW/mm²の光、0.2 μW/mm²、0.15 μW/mm²、0.1 μW/mm²、0.05 μW/mm²、及び 0.03 μW/mm²等の光で活性化が可能である、実施の形態45乃至51のいずれか一つに記載された方法。 53. 受容体の前記細胞内部分が受容体チロシンキナーゼ(RTK)の細胞内部分である、実施の形態45乃至52のいずれか一つに記載された方法。 54. 前記融合タンパク質が前記RTKの膜貫通ドメインを更に有する、実施の形態53に記載された方法。

55. 前記チロシンキナーゼが、FGF受容体、Trk受容体、EGF受容体(例えば、EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3、又はErbB4)、RET 受容体、インシュリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、HGF受容体、Eph受容体、AXL受容体、LTK受容体、TIE受容体、ROR受容体、DDR受容体、KLG受容体、RYK受容体、及びMuSK受容体、好ましくはFGF受容体及びTrK受容体、より好ましくはFGFR1及びTrkBからなる群から選ばれるRTKであり、最も好ましくは、前記融合タンパク質がredOpto-mFGFR1 (SEQ ID NO: 66)、又はredOpto-rtrkB (SEQ ID NO: 67)である、実施の形態53又は54に記載された方法。 56. 前記キメラ融合タンパク質がオーファン受容体の細胞内部分を更に有する、実施の形態45乃至54のいずれか一つに記載された方法。

57. 工程d)が、細胞応答における変化の出力として光を用いる、実施の形態45乃至56のいずれか一つに記載された方法。 58. 工程d)が、 (i) 細胞周期分布の決定、及び/又は (ii) 細胞の遺伝子転写プロファイルの決定、及び/又は (iii) 細胞内におけるタンパク質の偏在化の決定、及び/又は (iv) 細胞内における機能状態の決定、及び/又は (v) 細胞の形の決定、及び/又は (vi) 表面上又は3D構造における細胞分布の決定、及び/又は (vii) 表面上又は3D構造における細胞の移動挙動の決定、及び/又は (viii) 細胞の代謝活性の決定、及び/又は (ix) 細胞の生存又は死亡の決定、及び/又は (x) 細胞の分化状態の決定、及び/又は (xi) 細胞の代謝物の組成の決定、及び/又は (xii) ヌクレオチド類似体の細胞による取り込みの決定であり、好ましくは、前記ヌクレオチド類似体が5−エチニル−2’−デオキシウリジン又はブロモデオキシウリジンであり、より好ましくは、ヌクレオチド類似体が蛍光によってラベルされているか、又は、ヌクレオチド類似体が抗体によって検知されるかであり、最も好ましくは、蛍光分子が蛍光性アジドである、実施の形態45乃至57のいずれか一つに記載された方法。 59. 工程d)が、細胞の遺伝子転写プロファイルの決定からなり、より好ましくはレポーター遺伝子アッセイを用いるものであり、最も好ましくはルシフラーゼレポーター遺伝子アッセイを用いるものである、実施の形態45乃至58のいずれか一つに記載された方法。 60. 工程d)が、細胞による蛍光ヌクレオチド類似体の取り込みを決定することからなり、好ましくは、前記蛍光ヌクレオチド類似体が5−エチニル−2’−デオキシウリジンである、実施の形態45乃至58のいずれか一つに記載された方法。

61. 発色団との機能連関において、SEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)のアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも70%の配列が同一であるアミノ酸配列を有する光感応性ドメインからなるキメラ融合タンパク質であって、前記キメラ融合タンパク質は、光感応性ドメインが適当な波長の光によって励起されると、2量化をすることができる、キメラ融合タンパク質。 62. 前記光感応性ドメインが、アミノ酸配列がSEQ ID NO: 64 (SyCP1-PHY)のアミノ酸配列の全長にわたって、少なくとも78%、好ましくは80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、より好ましくは少なくとも96%、より好ましくは少なくとも97%、より好ましくは少なくとも98%、より好ましくは少なくとも99%、最も好ましくは100%が、同一である、実施の形態61に記載されたキメラ融合タンパク質。 63. 前記発色団が、直鎖テトラピロール、好ましくは、フィコシアノンビリン、フィコエリスロビリン、フィコウロビリン、フィコビオロビリン、フィトクロモビリン、ビリべルジン、ビリルビン、メソビリべルジン、メソビリルビン、ビラン、ビリン、ウロビリン、ステルコビリン、及びウロビリノーゲンから選択され、最も好ましくは、発色団がフィコシアノンビリンである、実施の形態61又は62に記載されたキメラ融合タンパク質。 64. 適切な波長の光による前記光感応性ドメインの励起によって、前記キメラ融合タンパク質がホモ2量化する、実施の形態61乃至63のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 65. 前記光感応性ドメインが、0.5 μW/mm²の光、好ましくは0.4 μW/mm²の光、より好ましくは0.3 μW/mm²の光、最も好ましくは0.25 μW/mm²の光、0.2 μW/mm²、0.15 μW/mm²、0.1 μW/mm²、0.05 μW/mm²、及び 0.03 μW/mm²等の光で活性化が可能である、実施の形態61乃至64のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。

66. 前記光感応性ドメインを活性化する前記光が600〜690 nmの波長を有する、実施の形態61乃至65のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 67. 前記光感応性ドメインを不活性化する前記光が700〜750 nmの波長を有する、実施の形態61乃至66のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 68. 前記光感応性ドメインが前記キメラ融合タンパク質のC-末端に位置する、実施の形態61乃至67のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 69. 前記キメラ融合タンパク質が受容体チロシンキナーゼ(RTK)の細胞内部分を更に有する、実施の形態61乃至68のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 70. 前記融合タンパク質が前記RTKの膜貫通ドメインを更に有する、実施の形態69に記載されたキメラ融合タンパク質。 71. 前記チロシンキナーゼが、FGF受容体、Trk受容体、EGF受容体(例えば、EGFR/ErbB1、ErbB2、ErbB3、又はErbB4)、RET 受容体、インシュリン受容体、PDGF受容体、VEGF受容体、HGF受容体、Eph受容体、AXL受容体、LTK受容体、TIE受容体、ROR受容体、DDR受容体、KLG受容体、RYK受容体、及びMuSK受容体、より好ましくはFGF受容体及びTrK受容体、更により好ましくはFGFR1及びTrkBからなる群から選ばれるRTKであり、最も好ましくは、前記融合タンパク質がredOpto-mFGFR1 (SEQ ID NO: 66)、又はredOpto-rtrkB (SEQ ID NO: 67)である、実施の形態69又は70に記載されたキメラ融合タンパク質。

72. 前記キメラ融合タンパク質がオーファン受容体の細胞内部分を更に有する、実施の形態61乃至70のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 73. 前記キメラ融合タンパク質が転写因子であり、更にDNA結合ドメインと転写制御ドメインからなり、その2量体型の転写因子は、機能連関において当該DNA結合ドメインの認識配列からなるターゲット遺伝子の転写を促進又は抑制をすることができる、実施の形態61乃至68のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 74. 前記キメラ融合タンパク質が蛍光タンパク質、好ましくは、GFP、EGFP、mCherry、又はmVenusからなる、実施の形態61乃至73のいずれか一つに記載されたキメラ融合タンパク質。 75. 実施の形態61乃至74のいずれか一つで定義された前記キメラ融合タンパク質をコード化する核酸分子。 76. SEQ ID NO: 65 (SyCP1-PHY)の前記核酸配列を有する、実施の形態75に記載された核酸分子。 77. SEQ ID NO: 68 (redOpto-mFGFR1)又はSEQ ID NO: 69 (redOpto-rtrkB)の前記核酸配列を有する、実施の形態76に記載された核酸分子。 78. 実施の形態74乃至77のいずれか一つに記載された核酸分子によってコード化される前記キメラ融合タンパク質を発現する非ヒト形質転換動物。 79. 研究手段として、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにするための、実施の形態61乃至74のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の用途。 80. 実施の形態61乃至74のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質のスクリーニング方法における用途であって、好ましくは、前記スクリーニング方法が、前記キメラ融合タンパク質のアクチベーターとして、また、前記スクリーニング方法の読み取りのために、光を使用する用途。

81. 実施の形態61乃至74のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の細胞成長を制御するための非治療的用途であって、好ましくは前記キメラ融合タンパク質がin vitroで使用される用途。 82. 実施の形態61乃至74のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質のパターン形成細胞培地を生産するための用途。 83. 実施の形態61乃至74のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の成長因子経路を制御するための非治療的用途であって、好ましくは前記キメラ融合タンパク質がin vitroで使用される用途。 84. 実施の形態61乃至74のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の、対象とするバイオ製品製造の制御するための用途。 85. 実施の形態61乃至74のいずれか一つに記載された前記キメラ融合タンパク質の幹細胞の分化における非治療的用途であって、前記幹細胞は、人類の生殖系細胞の遺伝的同一性を変更することを含む工程、又は、ヒトの胚を産業又は商業目的に使用する工程を用いて製造されず、好ましくは当該キメラ融合タンパク質がin vitroで使用される用途。

86. 実施の形態75乃至77のいずれか一つに記載された前記核酸分子の研究手段としての用途であって、好ましくはオーファン受容体の特性を明らかにするための用途。 87. 実施の形態74に記載された前記核酸分子のスクリーニング方法における用途であって、好ましくは、前記スクリーニング方法が、前記キメラ融合タンパク質のアクチベーターとして、また、前記スクリーニング方法の読み取りのために、光を使用する用途。 88. 実施の形態75乃至77のいずれか一つに記載された非ヒト形質転換動物の研究手段としての用途であって、好ましくは、オーファン受容体の特性を明らかにするための用途。 89. 実施の形態75乃至77のいずれか一つに記載された非ヒト形質転換動物のスクリーニング方法における用途。 以下に、本発明を、図及び実施例によって更に説明するが、それらは本発明のスコープを制限することを意図するものではない。ここで引用される文献は、引用によって、明確に包含される。

LOVドメインの選択と哺乳類細胞での発現(a)LOVドメイン(星印で強調されている)が切り出された光感応性タンパク質のドメイン構造(AtPH1及びAtPH2: A. thalianaフォトトロピン1及び2、CrPH: C. rheinhardtiiフォトトロピン、NcVV: N. crassaヴィヴィッド、VfAU1: V. frigida オーレオクロム1)。これらのタンパク質において、LOVドメインは、多種のエフェクタードメインを制御する(STK: Ser/Thrキナーゼ、DB: DNA-結合ドメイン)。哺乳類細胞における発現及び細胞の生存に対する影響を検証するために、LOVドメインは蛍光タンパク質mVenus (mV)に融合された。(b及びd) mVenus-LOVドメイン融合を移入されたヒト胎児由来腎臓293(HEK293)細胞 (b)及びチャイニーズハムスター卵巣(CHO)K1細胞 (d)の蛍光強度測定。(c及びe) mVenus-LOVドメイン融合を移入されたHEK293細胞 (c) 及びCHO K1細胞(e)の生存能力。b〜eにおいて、データは、小さく確実に畳まれたFK506結合タンパク質(FKBP)に融合されたmVに正規化されている。

HEK293細胞におけるmFGFR1-LOVドメイン融合タンパク質の設計と機能(a)mFGFR1等のRTKは、細胞外リガンド結合ドメイン(LDB)、単スパン膜貫通ドメイン(TMD)、及び細胞内ドメイン(ICD)(キナーゼドメイン(KD)及びC-末端尾ドメイン(CTD))から構成される。mFGFR1-LOVドメイン融合タンパク質においては、タンパク質を内在性リガンドに対して不感にするためICDのみが保持されている。ICDはミリストイル化ドメイン(MYR)を用いて膜に付着しており、LOVドメインはICDのC-末端に組み込まれている。(b)mFGFR1-ICDとLOVドメインのキメラタンパク質を発現する細胞に対する青色光に反応したMAPK経路活性化。imFGFR1(本文を参照)は、小さな分子2量化剤AP20187によって活性化される。(c)imFGFR1、Opto-mFGFR1 (mFGFR1-VfAU1-LOV)、又はキナーゼ欠損Opto-mFGFR1 (Y271F, Y272F)を発現する細胞に対する青色、緑色、赤色光に反応するMAPK経路活性化。

HEK293細胞におけるOpto-mFGFR1による青色光に反応する経路活性化活性化はルシフラーゼレポーター遺伝子の導入(Induction)として示される(照射された細胞のRLUを暗所に置かれたRLUで除す)。光強度は約3 μW/mm

²であった。

Opto-mFGFR1及びVfAU1-LOVの2量化(a)R195E変異の導入はimFGFR1及びOpto-mFGFR1に対するMAPK経路の活性化を不要とするので、2量化はOpto-mFGFR1の活性化のために必要である。(b) 哺乳類細胞ではVfAU1-LOVは2量化する。活性化のために2量化を必要とする転写因子へのVfAU1-LOVの取り込みは(GA-VfAU1-LOV-P)、光活性化転写応答をもたらす。遺伝子設計とポジティブコントロール(pGAVPO)が「資料と方法」の項で記載されている。光強度は約3 μW/mm

²であった。

hEGFR、hRET、及び代替LOVドメインの融合タンパク質(a)mFGFR1及びNgPA1-LOVのキメラタンパク質、又はOdPA1-LOVは、MAPK経路活性化を伴って青色光に反応する。(b)hEGFR1-ICD又はhRET-ICDのキメラタンパク質、及びVfAU1-LOVは、MAPK経路活性化を伴って青色光に反応する。(c)VfAU1-LOV励起状態寿命低下後の青色光によるOpto-mFGFR1の低下した活性化。a〜cにおいて、光強度は約3 μW/mm

²であった。

ガン細胞挙動の光制御(a)ヒト悪性胸膜中皮腫細胞(M38K及びSPC212)における、青色光に反応したOpto-mFGFR1及びERK1/2のリン酸化。(b)SPC212細胞における青色光に反応したAKT及びPLCy1のリン酸化。(c)増殖の増加を伴ってM38K細胞は青色光に反応する。(d)S-相における細胞の割合増加を伴ってM38K細胞は青色光に反応する。(e)形態の伸長を伴ってM38K細胞は青色光とFGF2に反応する。

(f)(e)の典型的な画像。(g)M38K細胞における表層アクチンの減少と長いアクチンを多く含む糸状偽足の出現を伴ってM38K細胞は青色光に反応する。(h)上皮マーカーE-カドヘリン発現の減少と間葉マーカービメンチン及びEMT関連転写因子SNAIL1とZEB1発現の増加を伴ってM38K細胞は青色光に反応する。a〜hにおいて、光強度は約3 μW/mm

²であった。

血液上皮細胞挙動の光制御(a)青色光に反応したmFGFR1-VfAU1-LOV及びERK1/2のリン酸化。(b)発芽を伴ってhBE細胞球状体は青色光に反応する。コントロール細胞はmCherryを発現する。(c)(b)の典型的な画像。a〜cにおいて、光強度は約3 μW/mm

²であった。

パターン形成照射(a)SPC212細胞における空間的に限定されたERK1/2リン酸化。スケールバーは2 mmである。(b)hBE細胞における空間的に限定されたERK1/2リン酸化。スケールバーは5 mmである。(c)HEK293細胞における空間的に限定されたMAPK-依存性遺伝子転写。スケールバーは10 mmである。a〜cにおいて、全ての画像は修正なしのそのままの画像である。1個の円領域がaとbにおいて記されている。a〜cにおいて、光強度は約3 μW/mm

²であった。

M38K細胞における薬理化合物の全光型評価。評価された化合物はPD166866 (PD)、AZD6244/セルメチニブ(SEL)、BIBF1120 (BIBF)、UO126 (UO)、AP24534/ポナチニブ(PON)、MK2206 (MK)、及びand LY294002 (LY)である。光強度は約3 μW/mm

²であった。

mFGFR1-PHYドメインキメラ受容体の設計と機能(a)mFGFR1等のRTKは、細胞外リガンド結合ドメイン(LDB)、単スパン膜貫通ドメイン(TMD)、及び細胞内ドメイン(ICD)(キナーゼドメイン(KD)及びC-末端尾ドメイン(CTD))から構成される。mFGFR1-PHYドメイン融合タンパク質においては、タンパク質を内在性リガンドに対して不感にするためICDのみが保持されている。ICDはミリストイル化ドメイン(MYR)を用いて膜に付着しており、PHYドメインはICDのC-末端に組み込まれている。(b)mFGFR1-SyCP1-PHY、キナーゼ欠損mFGFR1-SyCP1-PHY (Y271F, Y272F)、又は2量化不全mFGFR1-SyCP1-PHY (R195E)を移入されたHEK293細胞に対する赤色光に反応したMAPK経路活性化。活性化はルシフラーゼレポーター遺伝子の導入(Induction)として示される。光強度は約0.05 μW/mm

²であった。

rtrkBの融合タンパク質。rtrkB-ICDとSyCP1-PHYのキメラタンパク質はMAPK経路活性化を伴って赤色光に反応する。光強度は約0.05 μW/mm

²であった。図12 Opto-rtrkBを発現するHEK293細胞における薬理化合物の全光型評価。評価された化合物は、UO126 (UO)、AZD6244/セルメチニブ(SEL)、PD166866 (PD)、イマチニブ(IMA)、及びベムラフェニブ/PLX4032 (VEM)である。化合物とコントロール(CON)に対して、赤色光に反応したMAPK経路活性化が測定され、導入(Induction)として示された。光強度は約0.05 μW/mm

²であった。

(配列の説明) 光受容体とLOVドメインの全長にわたるタンパク質配列。Uniprotと配列識別記号はカッコ内に示されている。

AtPH1 (O48963; SEQ ID NO: 1) MEPTEKPSTKPSSRTLPRDTRGSLEVFNPSTQLTRPDNPVFRPEPPAWQNLSDPRGTSPQPRPQQEPAPSNPVRSDQEIAVTTSWMALKDPSPETISKKTITAEKPQKSAVAAEQRAAEWGLVLKTDTKTGKPQGVGVRNSGGTENDPNGKKTTSQRNSQNSCRSSGEMSDGDVPGGRSGIPRVSEDLKDALSTFQQTFVVSDATKPDYPIMYASAGFFNMTGYTSKEVVGRNCRFLQGSGTDADELAKIRETLAAGNNYCGRILNYKKDGTSFWNLLTIAPIKDESGKVLKFIGMQVEVSKHTEGAKEKALRPNGLPESLIRYDARQKDMATNSVTELVEAVKRPRALSESTNLHPFMTKSESDELPKKPARRMSENVVPSGRRNSGGGRRNSMQRINEIPEKKSRKSSLSFMGIKKKSESLDESIDDGFIEYGEEDDEISDRDERPESVDDKVRQKEMRKGIDLATTLERIEKNFVITDPRLPDNPIIFASDSFLELTEYSREEILGRNCRFLQGPETDLTTVKKIRNAIDNQTEVTVQLINYTKSGKKFWNIFHLQPMRDQKGEVQYFIGVQLDGSKHVEPVRNVIEETAVKEGEDLVKKTAVNIDEAVRELPDANMTPEDLWANHSKVVHCKPHRKDSPPWIAIQKVLESGEPIGLKHFKPVKPLGSGDTGSVHLVELVGTDQLFAMKAMDKAVMLNRNKVHRARAEREILDLLDHPFLPALYASFQTKTHICLITDYYPGGELFMLLDRQPRKVLKEDAVRFYAAQVVVALEYLHCQGIIYRDLKPENVLIQGNGDISLSDFDLSCLTSCKPQLLIPSIDEKKKKKQQKSQQTPIFMAEPMRASNSFVGTEEYIAPEIISGAGHTSAVDWWALGILMYEMLYGYTPFRGKTRQKTFTNVLQKDLKFPASIPASLQVKQLIFRLLQRDPKKRLGCFEGANEVKQHSFFKGINWALIRCTNPPELETPIFSGEAENGEKVVDPELEDLQTNVF

AtPH1-LOV2 (SEQ ID NO: 2) ESVDDKVRQKEMRKGIDLATTLERIEKNFVITDPRLPDNPIIFASDSFLELTEYSREEILGRNCRFLQGPETDLTTVKKIRNAIDNQTEVTVQLINYTKSGKKFWNIFHLQPMRDQKGEVQYFIGVQLDGSKHVEPVR

AtPH2 (P93025; SEQ ID NO: 3) MERPRAPPSPLNDAESLSERRSLEIFNPSSGKETHGSTSSSSKPPLDGNNKGSSSKWMEFQDSAKITERTAEWGLSAVKPDSGDDGISFKLSSEVERSKNMSRRSSEESTSSESGAFPRVSQELKTALSTLQQTFVVSDATQPHCPIVYASSGFFTMTGYSSKEIVGRNCRFLQGPDTDKNEVAKIRDCVKNGKSYCGRLLNYKKDGTPFWNLLTVTPIKDDQGNTIKFIGMQVEVSKYTEGVNDKALRPNGLSKSLIRYDARQKEKALDSITEVVQTIRHRKSQVQESVSNDTMVKPDSSTTPTPGRQTRQSDEASKSFRTPGRVSTPTGSKLKSSNNRHEDLLRMEPEELMLSTEVIGQRDSWDLSDRERDIRQGIDLATTLERIEKNFVISDPRLPDNPIIFASDSFLELTEYSREEILGRNCRFLQGPETDQATVQKIRDAIRDQREITVQLINYTKSGKKFWNLFHLQPMRDQKGELQYFIGVQLDGSDHVEPLQNRLSERTEMQSSKLVKATATNVDEAVRELPDANTRPEDLWAAHSKPVYPLPHNKESTSWKAIKKIQASGETVGLHHFKPIKPLGSGDTGSVHLVELKGTGELYAMKAMEKTMMLNRNKAHRACIEREIISLLDHPFLPTLYASFQTSTHVCLITDFCPGGELFALLDRQPMKILTEDSARFYAAEVVIGLEYLHCLGIVYRDLKPENILLKKDGHIVLADFDLSFMTTCTPQLIIPAAPSKRRRSKSQPLPTFVAEPSTQSNSFVGTEEYIAPEIITGAGHTSAIDWWALGILLYEMLYGRTPFRGKNRQKTFANILHKDLTFPSSIPVSLVGRQLINTLLNRDPSSRLGSKGGANEIKQHAFFRGINWPLIRGMSPPPLDAPLSIIEKDPNAKDIKWEDDGVLVNSTDLDIDLF

AtPH2-LOV2 (SEQ ID NO: 4) DSWDLSDRERDIRQGIDLATTLERIEKNFVISDPRLPDNPIIFASDSFLELTEYSREEILGRNCRFLQGPETDQATVQKIRDAIRDQREITVQLINYTKSGKKFWNLFHLQPMRDQKGELQYFIGVQLDGSDHVEPLQ

CrPH (A8IXU7; SEQ ID NO: 5) MAGVPAPASQLTKVLAGLRHTFVVADATLPDCPLVYASEGFYAMTGYGPDEVLGHNCRFLQGEGTDPKEVQKIRDAIKKGEACSVRLLNYRKDGTPFWNLLTVTPIKTPDGRVSKFVGVQVDVTSKTEGKALADNSGVPLLVKYDHRLRDNVARTIVDDVTIAVEKAEGVEPGQASAVAAAAPLGAKGPRGTAPKSFPRVALDLATTVERIQQNFCISDPTLPDCPIVFASDAFLELTGYSREEVLGRNCRFLQGAGTDRGTVDQIRAAIKEGSELTVRILNYTKAGKAFWNMFTLAPMRDQDGHARFFVGVQVDVTAQSTSPDKAPVWNKTPEEEVAKAKMGAEAASLISSALQGMAAPTTANPWAAISGVIMRRKPHKADDKAYQALLQLQERDGKMKLMHFRRVKQLGAGDVGLVDLVQLQGSELKFAMKTLDKFEMQERNKVARVLTESAILAAVDHPFLATLYCTIQTDTHLHFVMEYCDGGELYGLLNSQPKKRLKEEHVRFYASEVLTALQYLHLLGYVYRDLKPENILLHHTGHVLLTDFDLSYSKGSTTPRIEKIGGAGAAGGSAPKSPKKSSSKSGGSSSGSALQLENYLLLAEPSARANSFVGTEEYLAPEVINAAGHGPAAVDWWSLGILIFELLYGTTPFRGARRDETFENIIKSPLKFPSKPAVSEECRDLIEKLLVKDVGARLGSRTGANEIKSHPWFKGINWALLRHQQPPYVPRRASKAAGGSSTGGAAFDNY

CrPH-LOV1 (SEQ ID NO: 6) AGLRHTFVVADATLPDCPLVYASEGFYAMTGYGPDEVLGHNCRFLQGEGTDPKEVQKIRDAIKKGEACSVRLLNYRKDGTPFWNLLTVTPIKTPDGRVSKFVGVQVDVTSKTEGKALA NcVV (Q9C3Y6; SEQ ID NO: 7) MSHTVNSSTMNPWEVEAYQQYHYDPRTAPTANPLFFHTLYAPGGYDIMGYLIQIMNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCE TE

NcVV-LOV (SEQ ID NO: 8) HTLYAPGGYDIMGWLIQIMNRPNPQVELGPVDTSCALILCDLKQKDTPIVYASEAFLYMTGYSNAEVLGRNCRFLQSPDGMVKPKSTRKYVDSNTINTMRKAIDRNAEVQVEVVNFKKNGQRFVNFLTMIPVRDETGEYRYSMGFQCETE VfAU1 (A8QW55; SEQ ID NO: 9) MNGLTPPLMFCSRSDDPSSTSNINLDDVFADVFFNSNGELLDIDEIDDFGDNTCPKSSMSVDDDASSQVFQGHLFGNALSSIALSDSGDLSTGIYESQGNASRGKSLRTKSSGSISSELTEAQKVERRERNREHAKRSRVRKKFLLESLQQSVNELNHENNCLKESIREHLGPRGDSLIAQCSPEADTLLTDNPSKANRILEDPDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRK

VfAU1-LOV (SEQ ID NO: 10) PDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRK NgPA1 (K8Z861; SEQ ID NO: 11) MTEEQKVERRERNREHAKRSRVRKKFLLESLQKSVNALQEENDKLRGAIRSHLKEGADDLLKTCEVEVDESILASDPCSATKILDDPDYTLVKALQTAQQNFVITDPTLPDNPIVYASGGFLSLTGYQMDQILGRNCRFLQGPDTDPAAVDKIRRAIEDGTDGSVCLLNYRADGSTFWNQFFIAALRGADGNIVNYVGVQCKVSEEYASEVLKKEATSSTVAEASSKR NgPA1-LOV (SEQ ID NO: 12) PDYTLVKALQTAQQNFVITDPTLPDNPIVYASGGFLSLTGYQMDQILGRNCRFLQGPDTDPAAVDKIRRAIEDGTDGSVCLLNYRADGSTFWNQFFIAALRGADGNIVNYVGVQCKVSEEYASEVLKKEATSSTVAEASSKR

OdPA1 (C5NSW6; SEQ ID NO: 13) MTSKQQLPPPPIFGVLGDEKQVARNGIISLVDIFDDFLFSGDRNQPSNTASSSSHAQESESVGKDEENDYDSNDDEGDSDDGKRRKRSRTLPRNMTEEQKIERRERNREHAKRSRVRKKFLLESLQHSVRALEEENEKLRNAIRENLQGEAEQLLTRCSCGGPSVIASDPNTATRTLDDPDYSLVKALQTAQQNFVISDPSIPDNPIVYASQGFLTLTGYALSEVLGRNCRFLQGPETDPKAVEKVRKGLERGEDTTVVLLNYRKDGSTFWNQLFIAALRDGEGNVVNYLGVQCKVSEDYAKAFLKNEENEK

OdPA1-LOV (SEQ ID NO: 14) PDYSLVKALQTAQQNFVISDPSIPDNPIVYASQGFLTLTGYALSEVLGRNCRFLQGPETDPKAVEKVRKGLERGEDTTVVLLNYRKDGSTFWNQLFIAALRDGEGNVVNYLGVQCKVSEDYAKAFLKNEENEK 遺伝子構築において利用したオリゴヌクレオチド。制限部位には、下線を引いている。 (1) imFGFR1_XhoI_Kozak_F (SEQ ID NO: 15) CAGAGCTCGAGACCATGTGGAGCTGGAAGTGCCTCC (2) imFGFR1_BamHI_R (SEQ ID NO: 16) CAGAAGGATCCTCAGCGGCGTTTGAGTCCGCC (3) imFGFR1_inverse_R (SEQ ID NO: 17) TGAGACCGGTCTCGACGCGCCGTTTGAG (4) imFGFR1_inverse1_F (SEQ ID NO: 18) CAAGACCGGTGGATCCGGAGTCGACTATC (5) imFGFR1_inverse2_F (SEQ ID NO: 19) CAAGACCGGTAAACTGGAAGTCGAGGGAGTGC (6) FKBP_AgeI_F (SEQ ID NO: 20) GATCACCGGTAAACTGGAAGTCGAGGGAGTGC (7) FKBP_XmaI_R (SEQ ID NO: 21) GATCCCCGGGACCGCCAGATTCCAGTTTTAGAAG (8) AtPH1-LOV2_AgeI_F (SEQ ID NO: 22) GATCACCGGTGAAAGCGTTGATGATAAGGTCAGACAGAAGG (9) AtPH1-LOV2_XmaI_R (SEQ ID NO: 23) GATCCCCGGGCCGCACGGGCTCAACGTGCT (10) AtPH2-LOV2_AgeI_F (SEQ ID NO: 24) GATCACCGGTGATTCTTGGGATCTGAGTGATAGGGAAAGG (11) AtPH2-LOV2_XmaI_R (SEQ ID NO: 25) GATCCCCGGGCTGGAGTGGCTCGACATGATCTGAC (12) CrPH1-LOV1_AgeI_F (SEQ ID NO: 26) GATCACCGGTGCAGGACTCAGACATACATTTGTGGTGG (13) CrPH1-LOV1_XmaI_R (SEQ ID NO: 27) GATCCCCGGGGGCCAGGGCTTTCCCTTCAGTC (14) NcVV-LOV_XmaI_F (SEQ ID NO: 28) GATCCCCGGGCACACTCTCTACGCCCCAGGCG (15) NcVV-LOV_XmaI_R (SEQ ID NO: 29) GATCCCCGGGTTCGGTTTCGCACTGAAAACCCATGCT (16) VfAU1-LOV_AgeI_F (SEQ ID NO: 30) GATCACCGGTCCTGACTACAGTCTCGTGAAGG (17) VfAU1-LOV_XmaI_R (SEQ ID NO: 31) GATCCCCGGGCTTTCTGCGCAGCATGTTACTGG (18) Opto-mFGFR1_YY271/2FF_F (SEQ ID NO: 32) GAGACATTCATCATATCGACTTCTTCAAGAAAACCACCAACGGCC (19) Opto-mFGFR1_YY271/2FF_R (SEQ ID NO: 33) GGCCGTTGGTGGTTTTCTTGAAGAAGTCGATATGATGAATGTCTC (20) Opto-mFGFR1_R195E_F (SEQ ID NO: 34) TACAGGCCCGGGAGCCTCCTGGGCTGGAGTACTGCTATAA (21) Opto-mFGFR1_R195E_R (SEQ ID NO: 35) TTATAGCAGTACTCCAGCCCAGGAGGCTCCCGGGCCTGTA (22) Opto-mFGFR1_I472V_F (SEQ ID NO: 36) CTCCCAGACAACCCTGTCGTCTACGCCAGTAG (23) Opto-mFGFR1_I472V_R (SEQ ID NO: 37) CTACTGGCGTAGACGACAGGGTTGTCTGGGAG (24) VfAU1-LOV_BgIII_F (SEQ ID NO: 38) CTTTAGATCTCCTGACTACAGTCTCGTGAAGG (25) VfAU1-LOV_EcoRI_R (SEQ ID NO: 39) CTTTGAATTCCTTTCTGCGCAGCATGTTACTG (26) mFGFR1_inverse_R (SEQ ID NO: 40) GATCCACCGGTGACGTCGAGGCGCTGGCTGG (27) Opto-mFGFR1_inverse_F (SEQ ID NO: 41) GATCCACCGGTGGACCTGACTACAGTCTCGTGAAG (28) imFGFR1_inverse_F (SEQ ID NO: 42) GATCCACCGGTGGAAAACTGGAAGTCGAGGGAGTG (29) hEGFR_AgeI_AscI_F (SEQ ID NO: 43) GATCACCGGTGGCGCGCCCGAAGGCGCCACATCGTTC (30) hEGFR_ICD_BspEI_R (SEQ ID NO: 44) GATCTCCGGATGCTCCAATAAATTCACTGCTTTG (31) hRET_ICD_AgeI_F (SEQ ID NO: 45) GATCACCGGTCACTGCTACCACAAGTTTGCC (32) hRET_ICD_AgeI_R (SEQ ID NO: 46) GATCACCGGTGAATCTAGTAAATGCATG (33) LNGFR_ECD_NotI_F (SEQ ID NO: 47) GATCGCGGCCGCACCATGGGGGCAGGTGCCACC (34) LNGFR_ECD_AscI_R (SEQ ID NO: 48) GATCGGCGCGCCCCCTCTTGAAGGCTATGTAGGCC (35) SyCP1-PHY_F_XmaI (SEQ ID NO: 61) GATCCCCGGGGCAACTACTGTTCAACTGTCTGATCAATCTCTG (36) SyCP1-PHY _R_XmaI (SEQ ID NO: 62) GATCCCCGGGTTCTTCAGCTTGGCGCAGAATCAGGTT (37) redOpto-mFGFR1_inverse_F (SEQ ID NO: 70) GATCCACCGGTGGAGCAACTACTGTTCAACTGTCTG (38) rtrkB_ICD_BspEI_F (SEQ ID NO: 71) GATCTCCGGAAAGTTTGGCATGAAAG (39) rtrkB_ICD_AgeI_R (SEQ ID NO: 72) CAGAAACCGGTGCCTAGGATGTCCAG

コドン最適化LOVドメインのDNA配列 AtPH1-LOV2 (SEQ ID NO: 49) GAAAGCGTTGATGATAAGGTCAGACAGAAGGAAATGAGAAAGGGAATCGATCTCGCAACAACACTCGAAAGAATAGAAAAGAACTTTGTGATTACTGACCCTAGGCTCCCCGATAATCCCATAATCTTCGCTTCAGACAGTTTCCTGGAGCTGACAGAGTATAGCCGGGAAGAGATCCTGGGTAGAAATTGCAGATTCCTGCAGGGACCCGAGACAGACCTGACCACCGTGAAGAAGATTCGCAATGCTATCGATAATCAAACCGAGGTTACCGTGCAACTGATAAACTACACTAAAAGCGGCAAGAAGTTCTGGAACATTTTCCACCTGCAGCCTATGCGGGACCAGAAGGGTGAGGTCCAATATTTCATCGGGGTGCAGCTGGATGGCAGCAAGCACGTTGAGCCCGTGCGG

AtPH2-LOV2 (SEQ ID NO: 50) GATTCTTGGGATCTGAGTGATAGGGAAAGGGATATTAGACAGGGAATAGACCTCGCCACCACCCTGGAAAGAATTGAAAAGAATTTCGTGATCAGCGACCCTAGACTGCCCGACAATCCAATCATTTTCGCCTCTGACTCTTTTCTGGAGCTGACCGAATACTCACGCGAAGAAATCCTGGGAAGGAACTGTAGGTTCCTGCAAGGACCCGAAACCGACCAGGCCACTGTCCAGAAGATTCGCGATGCCATCCGCGACCAGCGGGAAATTACCGTTCAACTGATCAACTATACCAAATCTGGTAAGAAGTTTTGGAACCTGTTCCACCTCCAGCCTATGCGGGACCAAAAGGGCGAACTGCAATATTTCATCGGGGTGCAGCTGGACGGGTCAGATCATGTCGAGCCACTCCAG

CrPH-LOV1 (SEQ ID NO: 51) GCAGGACTCAGACATACATTTGTGGTGGCTGATGCAACACTCCCTGATTGCCCACTGGTCTATGCAAGTGAGGGCTTCTACGCAATGACCGGATATGGACCTGACGAAGTGCTGGGTCACAACTGTAGGTTTCTGCAGGGTGAGGGAACTGACCCCAAGGAAGTGCAGAAAATTCGCGACGCCATCAAGAAGGGTGAGGCTTGTAGTGTGCGCCTCCTGAACTATCGGAAGGACGGCACTCCCTTCTGGAACCTGCTGACAGTCACCCCAATTAAAACCCCTGATGGCCGCGTGTCCAAGTTTGTCGGCGTGCAGGTGGATGTTACCTCCAAGACTGAAGGGAAAGCCCTGGCC

NcVV-LOV (SEQ ID NO: 52) CACACTCTCTACGCCCCAGGCGGGTACGATATTATGGGCTGGCTGATCCAGATCATGAACAGGCCCAATCCCCAGGTCGAGCTGGGACCCGTGGATACTTCATGTGCACTGATACTGTGCGACCTGAAGCAGAAGGATACACCTATAGTTTACGCTTCAGAAGCCTTTCTGTACATGACAGGGTATTCTAACGCCGAGGTGCTGGGGAGGAACTGTAGGTTCCTCCAGAGTCCCGATGGTATGGTGAAACCTAAGAGTACTCGCAAATATGTGGATAGCAATACTATTAACACCATGAGGAAAGCCATCGACAGAAACGCAGAAGTTCAGGTGGAAGTGGTGAACTTTAAGAAGAACGGCCAGCGGTTCGTGAACTTTCTCACAATGATTCCAGTGCGGGACGAAACCGGGGAGTACCGGTACAGCATGGGTTTTCAGTGCGAAACCGAA

VfAU1-LOV (SEQ ID NO: 53) CCTGACTACAGTCTCGTGAAGGCTCTGCAAATGGCACAACAGAATTTTGTCATTACAGACGCCTCCCTCCCAGACAACCCTATCGTCTACGCCAGTAGAGGGTTTCTGACACTGACAGGCTATTCTCTCGACCAGATCCTGGGCAGGAACTGCAGGTTTCTGCAAGGGCCAGAAACAGACCCAAGAGCTGTGGATAAGATCAGGAATGCCATCACCAAAGGCGTTGATACCAGTGTCTGTCTGCTGAATTATAGACAGGATGGCACAACCTTCTGGAATCTCTTCTTCGTGGCTGGACTCAGAGATTCTAAGGGCAATATTGTCAACTACGTCGGAGTGCAGTCAAAGGTGAGCGAAGATTATGCCAAGCTGCTGGTCAACGAGCAGAACATTGAGTACAAAGGTGTGCGCACCAGTAACATGCTGCGCAGAAAG

NgPA1-LOV (SEQ ID NO: 54) CCAGATTATACACTCGTTAAAGCACTGCAAACTGCTCAGCAGAATTTTGTGATCACCGACCCTACTCTGCCAGACAACCCCATTGTCTATGCTTCAGGAGGATTTCTCAGTCTCACAGGTTACCAGATGGATCAGATCCTGGGAAGAAATTGCAGATTTCTGCAAGGACCTGATACTGACCCAGCTGCCGTGGACAAGATCAGAAGGGCTATCGAAGATGGTACAGACGGCAGTGTCTGTCTGCTGAACTACAGAGCAGATGGATCTACCTTTTGGAATCAATTCTTCATTGCTGCTCTCAGAGGCGCTGACGGAAATATCGTCAACTATGTCGGAGTGCAGTGTAAAGTGTCAGAGGAGTATGCTTCAGAAGTCCTCAAGAAGGAGGCTACTTCATCCACTGTGGCTGAAGCAAGTAGCAAAAGA

OdPA1-LOV (SEQ ID NO: 55) CCTGACTACAGTCTGGTTAAAGCACTCCAAACAGCACAGCAGAATTTCGTTATCTCTGACCCTAGCATTCCTGATAATCCCATTGTGTATGCTAGTCAGGGATTTCTGACACTCACCGGATACGCACTGAGCGAGGTTCTCGGACGGAACTGCCGGTTCCTCCAAGGACCAGAAACAGACCCTAAAGCCGTCGAGAAAGTGAGAAAGGGTCTGGAGAGAGGTGAAGATACCACCGTGGTGCTCCTGAATTATAGGAAAGATGGAAGCACCTTCTGGAACCAACTGTTCATTGCTGCCCTGCGGGATGGTGAGGGCAATGTGGTTAACTACCTCGGAGTTCAGTGCAAAGTCTCCGAGGACTACGCCAAAGCCTTTCTGAAGAATGAAGAGAACGAGAAA

mFGFR1変異体のタンパク質配列 miFGFR1 (SEQ ID NO: 56) MGSSKSKPKDPSQRLDMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLKRRVETGKLEVEGVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLESGGGSGVDYPYDVPDYALD

miFGFR1-ΔFKBP (SEQ ID NO: 57) MGSSKSKPKDPSQRLDMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLKRRVETGGSGVDYPYDVPDYALD

mFGFR1-VfAU1-LOV (SEQ ID NO: 58) MGSSKSKPKDPSQRLDMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLKRRVETGPDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRKTGGSGVDYPYDVPDYALD

p75-hEGFR-VfAU1-LOV (SEQ ID NO: 59) MGAGATGRAMDGPRLLLLLLLGVSLGGAKEACPTGLYTHSGECCKACNLGEGVAQPCGANQTVCEPCLDSVTFSDVVSATEPCKPCTECVGLQSMSAPCVEADDAVCRCAYGYYQDETTGRCEACRVCEAGSGLVFSCQDKQNTVCEECPDGTYSDEANHVDPCLPCTVCEDTERQLRECTRWADAECEEIPGRWITRSTPPEGSDSTAPSTQEPEAPPEQDLIASTVAGVVTTVMGSSQPVVTRGTTDNLIPVYCSILAAVVVGLVAYIAFKRGRARRRHIVRKRTLRRLLQERELVEPLTPSGEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKIPVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTSTVQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYLEDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGLAKLLGAEEKEYHAEGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKPYDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPKFRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEEDMDDVVDADEYLIPQQGFFSSPSTSRTPLLSSLSATSNNSTVACIDRNGLQSCPIKEDSFLQRYSSDPTGALTEDSIDDTFLPVPEYINQSVPKRPAGSVQNPVYHNQPLNPAPSRDPHYQDPHSTAVGNPEYLNTVQPTCVNSTFDSPAHWAQKGSHQISLDNPDYQQDFFPKEAKPNGIFKGSTAENAEYLRVAPQSSEFIGASGGPDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRKPGGSGVDYPYDVPDYALD

hRET-VfAU1-LOV (SEQ ID NO: 60) MGSSKSKPKDPSQRLDVTGHCYHKFAHKPPISSAEMTFRRPAQAFPVSYSSSSARRPSLDSMENQVSVDAFKILEDPKWEFPRKNLVLGKTLGEGEFGKVVKATAFHLKGRAGYTTVAVKMLKENASPSELRDLLSEFNVLKQVNHPHVIKLYGACSQDGPLLLIVEYAKYGSLRGFLRESRKVGPGYLGSGGSRNSSSLDHPDERALTMGDLISFAWQISQGMQYLAEMKLVHRDLAARNILVAEGRKMKISDFGLSRDVYEEDSYVKRSQGRIPVKWMAIESLFDHIYTTQSDVWSFGVLLWEIVTLGGNPYPGIPPERLFNLLKTGHRMERPDNCSEEMYRLMLQCWKQEPDKRPVFADISKDLEKMMVKRRDYLDLAASTPSDSLIYDDGLSEEETPLVDCNNAPLPRALPSTWIENKLYGRISHAFTRFTGGPDYSLVKALQMAQQNFVITDASLPDNPIVYASRGFLTLTGYSLDQILGRNCRFLQGPETDPRAVDKIRNAITKGVDTSVCLLNYRQDGTTFWNLFFVAGLRDSKGNIVNYVGVQSKVSEDYAKLLVNEQNIEYKGVRTSNMLRRKPGGSGVDYPYDVPDYALD

全長タンパク質とPHYドメインのタンパク質配列。Uniprot 識別記号をカッコ内に記す。 SyCP1 (Q55168) (SEQ ID NO: 63): MATTVQLSDQSLRQLETLAIHTAHLIQPHGLVVVLQEPDLTISQISANCTGILGRSPEDLLGRTLGEVFDSFQIDPIQSRLTAGQISSLNPSKLWARVMGDDFVIFDGVFHRNSDGLLVCELEPAYTSDNLPFLGFYHMANAALNRLRQQANLRDFYDVIVEEVRRMTGFDRVMLYRFDENNHGDVIAEDKRDDMEPYLGLHYPESDIPQPARRLFIHNPIRVIPDVYGVAVPLTPAVNPSTNRAVDLTESILRSAYHCHLTYLKNMGVGASLTISLIKDGHLWGLIACHHQTPKVIPFELRKACEFFGRVVFSNISAQEDTETFDYRVQLAEHEAVLLDKMTTAADFVEGLTNHPDRLLGLTGSQGAAICFGEKLILVGETPDEKAVQYLLQWLENREVQDVFFTSSLSQIYPDAVNFKSVASGLLAIPIARHNFLLWFRPEVLQTVNWGGDPNHAYEATQEDGKIELHPRQSFDLWKEIVRLQSLPWQSVEIQSALALKKAIVNLILRQAEELAQLARNLERSNADLKKFAYIASHDLQEPLNQVSNYVQLLEMRYSEALDEDAKDFIDFAVTGVSLMQTLIDDILTYAKVDTQYAQLTFTDVQEVVDKALANLKQRIEESGAEIEVGSMPAVMADQIQLMQVFQNLIANGIKFAGDKSPKIKIWGDRQEDAWVFAVQDNGIGIDPQFFERIFVIFQRLHTRDEYKGTGMGLAICKKIIEGHQGQIWLESNPGEGSTFYFSIPIGN

SyCP1-PHY (SEQ ID NO: 64): ATTVQLSDQSLRQLETLAIHTAHLIQPHGLVVVLQEPDLTISQISANCTGILGRSPEDLLGRTLGEVFDSFQIDPIQSRLTAGQISSLNPSKLWARVMGDDFVIFDGVFHRNSDGLLVCELEPAYTSDNLPFLGFYHMANAALNRLRQQANLRDFYDVIVEEVRRMTGFDRVMLYRFDENNHGDVIAEDKRDDMEPYLGLHYPESDIPQPARRLFIHNPIRVIPDVYGVAVPLTPAVNPSTNRAVDLTESILRSAYHCHLTYLKNMGVGASLTISLIKDGHLWGLIACHHQTPKVIPFELRKACEFFGRVVFSNISAQEDTETFDYRVQLAEHEAVLLDKMTTAADFVEGLTNHPDRLLGLTGSQGAAICFGEKLILVGETPDEKAVQYLLQWLENREVQDVFFTSSLSQIYPDAVNFKSVASGLLAIPIARHNFLLWFRPEVLQTVNWGGDPNHAYEATQEDGKIELHPRQSFDLWKEIVRLQSLPWQSVEIQSALALKKAIVNLILRQAEE コドン最適化PHYドメインのDNA配列 SyCP1-PHY (SEQ ID NO: 65): GCAACTACTGTTCAACTGTCTGATCAATCTCTGCGTCAACTGGAAACTCTGGCTATCCACACCGCGCATCTGATCCAGCCGCACGGTCTGGTAGTCGTCCTGCAAGAACCGGACCTGACCATCAGCCAGATCTCTGCGAACTGTACCGGTATCCTGGGCCGTAGCCCGGAAGATCTGCTGGGTCGTACTCTGGGCGAGGTATTCGATTCTTTTCAGATTGATCCGATCCAGTCTCGTCTGACCGCAGGTCAGATTTCCAGCCTGAACCCGTCCAAGCTGTGGGCGCGTGTTATGGGTGACGACTTTGTTATTTTCGACGGCGTATTTCATCGTAACTCTGATGGCCTGCTGGTTTGCGAGCTGGAGCCGGCCTACACTAGCGACAACCTGCCTTTCCTGGGTTTCTACCATATGGCAAACGCGGCACTGAACCGTCTGCGTCAGCAAGCTAACCTGCGCGACTTCTACGACGTTATCGTTGAGGAAGTGCGCCGCATGACGGGTTTCGACCGCGTCATGCTGTACCGTTTTGATGAAAACAACCACGGTGACGTAATCGCGGAGGATAAGCGTGACGACATGGAGCCGTATCTGGGTCTGCACTACCCGGAAAGCGACATTCCTCAGCCGGCACGTCGCCTGTTCATTCACAACCCGATCCGTGTTATTCCGGACGTTTACGGCGTTGCTGTTCCGCTGACTCCGGCCGTTAATCCGTCTACTAACCGTGCAGTTGACCTGACCGAATCCATCCTGCGTTCCGCATACCATTGCCACCTGACCTATCTGAAGAACATGGGCGTTGGTGCTAGCCTGACGATCTCTCTGATTAAAGATGGTCACCTGTGGGGTCTGATCGCTTGCCATCACCAGACCCCGAAAGTAATCCCTTTCGAACTGCGTAAAGCCTGCGAATTCTTCGGTCGTGTGGTGTTCTCTAATATCTCCGCGCAAGAAGACACCGAGACTTTTGACTACCGCGTACAGCTGGCGGAGCATGAAGCGGTTCTGCTGGACAAAATGACCACCGCGGCAGACTTCGTGGAGGGCCTGACTAACCACCCAGACCGTCTGCTGGGCCTGACCGGCAGCCAAGGCGCTGCGATTTGTTTCGGCGAGAAACTGATTCTGGTGGGCGAAACCCCAGACGAAAAGGCGGTGCAATACCTGCTGCAATGGCTGGAGAATCGCGAAGTGCAGGACGTTTTCTTCACTAGCTCTCTGTCTCAGATCTATCCGGATGCGGTTAACTTCAAAAGCGTGGCGTCCGGCCTGCTGGCTATCCCGATCGCCCGTCATAACTTTCTGCTGTGGTTCCGCCCGGAGGTTCTGCAGACCGTTAATTGGGGTGGTGATCCGAATCACGCATACGAAGCAACCCAAGAAGATGGTAAGATCGAACTGCATCCGCGTCAGTCCTTCGATCTGTGGAAAGAAATTGTTCGCCTGCAGAGCCTGCCGTGGCAGAGCGTTGAGATCCAGTCTGCCCTGGCTCTGAAGAAAGCAATCGTGAACCTGATTCTGCGCCAAGCTGAAGAA

全長融合タンパク質のタンパク質配列 redOpto-mFGFR1 (SEQ ID NO: 66) MGSSKSKPKDPSQRLDMKSGTKKSDFHSQMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSEYELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALFDRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSIPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPTQLANSGLKRRVETGATTVQLSDQSLRQLETLAIHTAHLIQPHGLVVVLQEPDLTISQISANCTGILGRSPEDLLGRTLGEVFDSFQIDPIQSRLTAGQISSLNPSKLWARVMGDDFVIFDGVFHRNSDGLLVCELEPAYTSDNLPFLGFYHMANAALNRLRQQANLRDFYDVIVEEVRRMTGFDRVMLYRFDENNHGDVIAEDKRDDMEPYLGLHYPESDIPQPARRLFIHNPIRVIPDVYGVAVPLTPAVNPSTNRAVDLTESILRSAYHCHLTYLKNMGVGASLTISLIKDGHLWGLIACHHQTPKVIPFELRKACEFFGRVVFSNISAQEDTETFDYRVQLAEHEAVLLDKMTTAADFVEGLTNHPDRLLGLTGSQGAAICFGEKLILVGETPDEKAVQYLLQWLENREVQDVFFTSSLSQIYPDAVNFKSVASGLLAIPIARHNFLLWFRPEVLQTVNWGGDPNHAYEATQEDGKIELHPRQSFDLWKEIVRLQSLPWQSVEIQSALALKKAIVNLILRQAEETGGSGVDYPYDVPDYALD

redOpto-rtrkB (SEQ ID NO: 67) MGSSKSKPKDPSQRLDVTGKLARHSKFGMKGPASVISNDDDSASPLHHISNGSNTPSSSEGGPDAVIIGMTKIPVIENPQYFGITNSQLKPDTFVQHIKRHNIVLKRELGEGAFGKVFLAECYNLCPEQDKILVAVKTLKDASDNARKDFHREAELLTNLQHEHIVKFYGVCVEGDPLIMVFEYMKHGDLNKFLRAHGPDAVLMAEGNPPTELTQSQMLHIAQQIAAGMVYLASQHFVHRDLATRNCLVGENLLVKIGDFGMSRDVYSTDYYRVGGHTMLPIRWMPPESIMYRKFTTESDVWSLGVVLWEIFTYGKQPWYQLSNNEVIECITQGRVLQRPRTCPQEVYELMLGCWQREPHTRKNIKNIHTLLQNLAKASPVYLDILGTGGATTVQLSDQSLRQLETLAIHTAHLIQPHGLVVVLQEPDLTISQISANCTGILGRSPEDLLGRTLGEVFDSFQIDPIQSRLTAGQISSLNPSKLWARVMGDDFVIFDGVFHRNSDGLLVCELEPAYTSDNLPFLGFYHMANAALNRLRQQANLRDFYDVIVEEVRRMTGFDRVMLYRFDENNHGDVIAEDKRDDMEPYLGLHYPESDIPQPARRLFIHNPIRVIPDVYGVAVPLTPAVNPSTNRAVDLTESILRSAYHCHLTYLKNMGVGASLTISLIKDGHLWGLIACHHQTPKVIPFELRKACEFFGRVVFSNISAQEDTETFDYRVQLAEHEAVLLDKMTTAADFVEGLTNHPDRLLGLTGSQGAAICFGEKLILVGETPDEKAVQYLLQWLENREVQDVFFTSSLSQIYPDAVNFKSVASGLLAIPIARHNFLLWFRPEVLQTVNWGGDPNHAYEATQEDGKIELHPRQSFDLWKEIVRLQSLPWQSVEIQSALALKKAIVNLILRQAEEPGGSGVDYPYDVPDYALD

全長融合タンパク質のDNA配列 redOpto-mFGFR1 (SEQ ID NO: 68) ATGGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCTAAGGACCCCAGCCAGCGCCTCGACATGAAGAGCGGCACCAAGAAGAGCGACTTCCATAGCCAGATGGCTGTGCACAAGCTGGCCAAGAGCATCCCTCTGCGCAGACAGGTAACAGTGTCAGCTGACTCCAGTGCATCCATGAACTCTGGGGTTCTCCTGGTTCGGCCCTCACGGCTCTCCTCCAGCGGGACCCCCATGCTGGCTGGAGTCTCCGAATATGAGCTCCCTGAGGATCCCCGCTGGGAGCTGCCACGAGACAGACTGGTCTTAGGCAAACCACTTGGCGAGGGCTGCTTCGGGCAGGTGGTGTTGGCTGAGGCCATCGGGCTGGATAAGGACAAACCCAACCGTGTGACCAAAGTGGCCGTGAAGATGTTGAAGTCCGACGCAACGGAGAAGGACCTGTCGGATCTGATCTCGGAGATGGAGATGATGAAAATGATTGGGAAGCACAAGAATATCATCAACCTTCTGGGAGCGTGCACACAGGATGGTCCTCTTTATGTCATTGTGGAGTACGCCTCCAAAGGCAATCTCCGGGAGTATCTACAGGCCCGGAGGCCTCCTGGGCTGGAGTACTGCTATAACCCCAGCCACAACCCCGAGGAACAGCTGTCTTCCAAAGATCTGGTATCCTGTGCCTATCAGGTGGCTCGGGGCATGGAGTATCTTGCCTCTAAGAAGTGTATACACCGAGACCTGGCTGCTAGGAACGTCCTGGTGACCGAGGATAACGTAATGAAGATCGCAGACTTTGGCTTAGCTCGAGACATTCATCATATCGACTACTACAAGAAAACCACCAACGGCCGGCTGCCTGTGAAGTGGATGGCCCCTGAGGCGTTGTTTGACCGGATCTACACACACCAGAGCGATGTGTGGTCTTTTGGAGTGCTCTTGTGGGAGATCTTCACTCTGGGTGGCTCCCCATACCCCGGTGTGCCTGTGGAGGAACTTTTCAAGCTGCTGAAGGAGGGTCATCGAATGGACAAGCCCAGTAACTGTACCAATGAGCTGTACATGATGATGCGGGACTGCTGGCATGCAGTGCCCTCTCAGAGACCTACGTTCAAGCAGTTGGTGGAAGACCTGGACCGCATTGTGGCCTTGACCTCCAACCAGGAGTATCTGGACCTGTCCATACCGCTGGACCAGTACTCACCCAGCTTTCCCGACACACGGAGCTCCACCTGCTCCTCAGGGGAGGACTCTGTCTTCTCTCATGAGCCGTTACCTGAGGAGCCCTGTCTGCCTCGACACCCCACCCAGCTTGCCAACAGTGGACTCAAACGGCGCGTCGAGACCGGgGCAACTACTGTTCAACTGTCTGATCAATCTCTGCGTCAACTGGAAACTCTGGCTATCCACACCGCGCATCTGATCCAGCCGCACGGTCTGGTAGTCGTCCTGCAAGAACCGGACCTGACCATCAGCCAGATCTCTGCGAACTGTACCGGTATCCTGGGCCGTAGCCCGGAAGATCTGCTGGGTCGTACTCTGGGCGAGGTATTCGATTCTTTTCAGATTGATCCGATCCAGTCTCGTCTGACCGCAGGTCAGATTTCCAGCCTGAACCCGTCCAAGCTGTGGGCGCGTGTTATGGGTGACGACTTTGTTATTTTCGACGGCGTATTTCATCGTAACTCTGATGGCCTGCTGGTTTGCGAGCTGGAGCCGGCCTACACTAGCGACAACCTGCCTTTCCTGGGTTTCTACCATATGGCAAACGCGGCACTGAACCGTCTGCGTCAGCAAGCTAACCTGCGCGACTTCTACGACGTTATCGTTGAGGAAGTGCGCCGCATGACGGGTTTCGACCGCGTCATGCTGTACCGTTTTGATGAAAACAACCACGGTGACGTAATCGCGGAGGATAAGCGTGACGACATGGAGCCGTATCTGGGTCTGCACTACCCGGAAAGCGACATTCCTCAGCCGGCACGTCGCCTGTTCATTCACAACCCGATCCGTGTTATTCCGGACGTTTACGGCGTTGCTGTTCCGCTGACTCCGGCCGTTAATCCGTCTACTAACCGTGCAGTTGACCTGACCGAATCCATCCTGCGTTCCGCATACCATTGCCACCTGACCTATCTGAAGAACATGGGCGTTGGTGCTAGCCTGACGATCTCTCTGATTAAAGATGGTCACCTGTGGGGTCTGATCGCTTGCCATCACCAGACCCCGAAAGTAATCCCTTTCGAACTGCGTAAAGCCTGCGAATTCTTCGGTCGTGTGGTGTTCTCTAATATCTCCGCGCAAGAAGACACCGAGACTTTTGACTACCGCGTACAGCTGGCGGAGCATGAAGCGGTTCTGCTGGACAAAATGACCACCGCGGCAGACTTCGTGGAGGGCCTGACTAACCACCCAGACCGTCTGCTGGGCCTGACCGGCAGCCAAGGCGCTGCGATTTGTTTCGGCGAGAAACTGATTCTGGTGGGCGAAACCCCAGACGAAAAGGCGGTGCAATACCTGCTGCAATGGCTGGAGAATCGCGAAGTGCAGGACGTTTTCTTCACTAGCTCTCTGTCTCAGATCTATCCGGATGCGGTTAACTTCAAAAGCGTGGCGTCCGGCCTGCTGGCTATCCCGATCGCCCGTCATAACTTTCTGCTGTGGTTCCGCCCGGAGGTTCTGCAGACCGTTAATTGGGGTGGTGATCCGAATCACGCATACGAAGCAACCCAAGAAGATGGTAAGATCGAACTGCATCCGCGTCAGTCCTTCGATCTGTGGAAAGAAATTGTTCGCCTGCAGAGCCTGCCGTGGCAGAGCGTTGAGATCCAGTCTGCCCTGGCTCTGAAGAAAGCAATCGTGAACCTGATTCTGCGCCAAGCTGAAGAAcCCGGTGGATCCGGAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA

redOpto-rtrkB (SEQ ID NO: 69) ATGGGGAGTAGCAAGAGCAAGCCTAAGGACCCCAGCCAGCGCCTCGACGTCACCGGAAAGTTGGCGAGACATTCCAAGTTTGGCATGAAAGGCCCAGCTTCCGTCATCAGCAACGACGATGACTCTGCCAGCCCTCTCCACCACATCTCCAACGGGAGCAACACTCCGTCTTCTTCGGAGGGCGGGCCCGATGCTGTCATCATTGGGATGACCAAGATCCCTGTCATTGAAAACCCCCAGTACTTCGGTATCACCAACAGCCAGCTCAAGCCGGACACATTTGTTCAGCACATCAAGAGACACAACATCGTTCTGAAGAGGGAGCTTGGAGAAGGAGCCTTTGGGAAAGTTTTCCTAGCGGAGTGCTATAACCTCTGCCCCGAGCAGGATAAGATCCTGGTGGCCGTGAAGACGCTGAAGGACGCCAGCGACAATGCTCGCAAGGACTTTCATCGCGAAGCCGAGCTGCTGACCAACCTCCAGCACGAGCACATTGTCAAGTTCTACGGTGTCTGTGTGGAGGGCGACCCACTCATCATGGTCTTTGAGTACATGAAGCACGGGGACCTCAACAAGTTCCTTAGGGCACACGGGCCAGATGCAGTGCTGATGGCAGAGGGTAACCCGCCCACCGAGCTGACGCAGTCGCAGATGCTGCACATCGCTCAGCAAATCGCAGCAGGCATGGTCTACCTGGCATCCCAACACTTCGTGCACCGAGACCTGGCCACCCGGAACTGCTTGGTAGGAGAGAACCTGCTGGTGAAAATTGGGGACTTCGGGATGTCCCGGGATGTATACAGCACCGACTACTACCGGGTTGGTGGCCACACAATGTTGCCCATCCGATGGATGCCTCCAGAGAGCATCATGTACAGGAAATTCACCACCGAGAGTGACGTCTGGAGCCTGGGAGTTGTGTTGTGGGAGATCTTCACCTACGGCAAGCAGCCCTGGTATCAGCTATCAAACAACGAGGTGATAGAATGCATCACCCAGGGCAGAGTCCTTCAGCGGCCTCGCACGTGTCCCCAGGAGGTGTACGAGCTGATGCTGGGATGCTGGCAGCGGGAACCACACACAAGGAAGAACATCAAGAACATCCACACACTCCTTCAGAACTTGGCGAAGGCGTCGCCCGTCTACCTGGACATCCTAGGCACCGGTGGAGCAACTACTGTTCAACTGTCTGATCAATCTCTGCGTCAACTGGAAACTCTGGCTATCCACACCGCGCATCTGATCCAGCCGCACGGTCTGGTAGTCGTCCTGCAAGAACCGGACCTGACCATCAGCCAGATCTCTGCGAACTGTACCGGTATCCTGGGCCGTAGCCCGGAAGATCTGCTGGGTCGTACTCTGGGCGAGGTATTCGATTCTTTTCAGATTGATCCGATCCAGTCTCGTCTGACCGCAGGTCAGATTTCCAGCCTGAACCCGTCCAAGCTGTGGGCGCGTGTTATGGGTGACGACTTTGTTATTTTCGACGGCGTATTTCATCGTAACTCTGATGGCCTGCTGGTTTGCGAGCTGGAGCCGGCCTACACTAGCGACAACCTGCCTTTCCTGGGTTTCTACCATATGGCAAACGCGGCACTGAACCGTCTGCGTCAGCAAGCTAACCTGCGCGACTTCTACGACGTTATCGTTGAGGAAGTGCGCCGCATGACGGGTTTCGACCGCGTCATGCTGTACCGTTTTGATGAAAACAACCACGGTGACGTAATCGCGGAGGATAAGCGTGACGACATGGAGCCGTATCTGGGTCTGCACTACCCGGAAAGCGACATTCCTCAGCCGGCACGTCGCCTGTTCATTCACAACCCGATCCGTGTTATTCCGGACGTTTACGGCGTTGCTGTTCCGCTGACTCCGGCCGTTAATCCGTCTACTAACCGTGCAGTTGACCTGACCGAATCCATCCTGCGTTCCGCATACCATTGCCACCTGACCTATCTGAAGAACATGGGCGTTGGTGCTAGCCTGACGATCTCTCTGATTAAAGATGGTCACCTGTGGGGTCTGATCGCTTGCCATCACCAGACCCCGAAAGTAATCCCTTTCGAACTGCGTAAAGCCTGCGAATTCTTCGGTCGTGTGGTGTTCTCTAATATCTCCGCGCAAGAAGACACCGAGACTTTTGACTACCGCGTACAGCTGGCGGAGCATGAAGCGGTTCTGCTGGACAAAATGACCACCGCGGCAGACTTCGTGGAGGGCCTGACTAACCACCCAGACCGTCTGCTGGGCCTGACCGGCAGCCAAGGCGCTGCGATTTGTTTCGGCGAGAAACTGATTCTGGTGGGCGAAACCCCAGACGAAAAGGCGGTGCAATACCTGCTGCAATGGCTGGAGAATCGCGAAGTGCAGGACGTTTTCTTCACTAGCTCTCTGTCTCAGATCTATCCGGATGCGGTTAACTTCAAAAGCGTGGCGTCCGGCCTGCTGGCTATCCCGATCGCCCGTCATAACTTTCTGCTGTGGTTCCGCCCGGAGGTTCTGCAGACCGTTAATTGGGGTGGTGATCCGAATCACGCATACGAAGCAACCCAAGAAGATGGTAAGATCGAACTGCATCCGCGTCAGTCCTTCGATCTGTGGAAAGAAATTGTTCGCCTGCAGAGCCTGCCGTGGCAGAGCGTTGAGATCCAGTCTGCCCTGGCTCTGAAGAAAGCAATCGTGAACCTGATTCTGCGCCAAGCTGAAGAAcCCGGTGGATCCGGAGTCGACTATCCGTACGACGTACCAGACTACGCACTCGACTAA

資料と方法 mFGFR1受容体の構築体 pSH1/M-FGFR1-Fv-Fvls-E (D.M. Spencer, Baylor College of Medicine; (Welm, Freeman et al. 2002))は、Addgene (Cambridge, MA) から購入した。ミリストイル化ドメインが隣接して置かれたmFGFR1の細胞内フラグメント、2個のFKBPドメイン、及びヘマグルチニンエピトープ(hemagglutinin epitope)が、 pSH1/M-FGFR1-Fv-Fvls-EからpcDNA3.1(-) (Invitrogen/LifeTech, Vienna, Austria) へと、PCR、XhoI、及び BamHI 制限酵素(オリゴヌクレオチド(1)及び(2), SEQ ID NOs: 15 and 16) を用いて、転移された。逆PCRを用いて、一方又は両方のFKBPドメインが除かれて、miFGFR1とmiFGFR1-ΔFKBPを構築した。この反応において、オリゴヌクレオチド3と4又は3と5 (それぞれSEQ ID NOs: 17、 18、及び19)を用いた増幅によって、両方又は一方のFKBPドメインが末端AgeI制限部位によって置き換えられた直鎖状DNAフラグメントが得られた。直鎖状産物はAgeIによって消化され、結合され、そして生産のために、直接 E. coli バクテリアの中に移された。また、本反応は、LOVドメイン挿入のために使用されるmiFGFR1-ΔFKBPの中に、AgeI制限部位を導入した(以下を参照)。追加的コントロールとして、PCRとAgeIとXmaI制限酵素(オリゴヌクレオチド6及び7; SEQ ID NOs: 20及び21)を用いて、1個のFKBPドメインがmiFGFR1-ΔFKBPの中に再挿入された。miFGFR1及びmiFGFR1-ΔFKBP-FKBPは、MAPK活性化アッセイにおいて同様の結果をもたらして、交換可能に使用された。全ての構築体はDNAシーケンスによって確認された。

LOVドメインとキメラmFGFR1受容体 A.thaliana フォトトロピン1 (AtPH1-LOV2、Uniprot配列O48963の残基449〜586)、A. thaliana フォトトロピン2 (AtPH2-LOV2、Uniprot配列P93025の残基363〜500)、C. reinhardtii フォトトロピン(CrPH-LOV1、Uniprot配列A8IXU7の残基16〜133)、N. crassa ヴィヴィッド(NcVV-LOV、Uniprot配列Q9C3Y6のY50W変異残基37〜186)、V. frigida オーレオクロム1 (VfAU1-LOV、Uniprot配列A8QW55の残基204〜348)、N. gaditana 仮想タンパク質 NGA_0015702 (NgPA1-LOV、Uniprot配列K8Z861の残基87〜228)、及びO. danica オーレオクロム1-様タンパク質 (OdPA1-LOV、Uniprot配列C5NSW6の残基180〜312)のLOVドメインをコードした遺伝子が、サプライヤーの推奨に準拠した哺乳類コドン最適化によって合成された(Epoch Life Science, Inc., Missouri City, Texas, USA) (SEQ ID NOs: 49〜55も参照のこと)。NgPA1-LOV及びOdPA1- LOVは、National Center for Biotechnology Informationの簡潔なタンパク質データベースからのVfAU1と同様にして、タンパク質を捜すデータベースを用いて同定された。LOVドメインは、PCRとAgeIとXmaI制限酵素(オリゴヌクレオチド8〜17, SEQ ID NOs: 22〜31; NgPA1-LOV及びOdPA1-LOVは制限部位で合成され、PCRを使用せずに挿入された)を用いて、miFGFR1-ΔFKBPの中に挿入された。全ての構築体はDNAシーケンスによって確認された。

修飾されたOpto-mFGFR1受容体 部位特異的変異(QuickChangeII Site-Directed Mutagenesis Kit, Agilent, Vienna, Austria; オリゴヌクレオチド18〜23) (SEQ ID NOs: 32〜37)を用いて、点置換(YY271FF, R192E及びI472V; Opto-mFGFR1の開始メチオニンに対して番号がつけられている)が、Opto-mFGFR1又はredOpto-mFGFR1に導入された。全ての構築体はDNAシーケンスによって確認された。

光活性化VfAU1-LOV転写因子 プラスミドpGAVPO (Y. Yang, East China University of Science and Technology)は、Gal4 DNA結合ドメイン、NcVV-LOV、及び転写促進ドメインを含む(Wang et al. 2012) (図4b)。pGAVPOの青色光活性化は、MAPK経路アッセイにおいて適用されたルシフラーゼレポータープラスミドによって検知された(上記参照のこと;このプラスミドはマルチUAS配列を含む)。VfAU1-LOVは、PCRとオリゴヌクレオチド24と25(それぞれSEQ ID NO: 38と39)によって増幅され、BgIII及びEcoRI制限酵素を用いてpGAVPOに挿入される。構築体はDNAシーケンスによって確認された。ルシフラーゼ活性化実験は、mFGFR1プラスミドが1個の穴当り50 ngのpGAVPOによって置換されたことを除いて、上に記載したように行われた。

Opto-hEGFR1及びOpto-hRET mFGFR1 ICDがSgrAI-制限部位(オリゴヌクレオチド26〜28, SEQ ID NOs: 40〜42)によって置換されたimFGFR1-DFKBP-FKBP及びmFGFR1-VfAU1-LOVに基づいて、逆PCRを用いて発現プラスミドが得られた。この単一制限部位は、他のRTKのICDを挿入することを可能とする。PCRとAgeIとBspEI制限酵素(オリゴヌクレオチド29〜32, SEQ ID NOs: 43〜46)を用いて、hEGFR ICD及びhRET ICDがこのプラスミドに挿入された。PCRとNotIとAscI制限酵素(オリゴヌクレオチド33と34, SEQ ID NOs: 47と48)を用いて、p75のLBDとTMDを含むことによって、EGFR構築体が更に修飾された。全ての構築体は、DNAシーケンスによって確認された。

PHYドメインとキメラmFGFR1受容体 クロオコッカス PCC6803 CPH1 (SyCP1-PHY, Uniprot配列Q55168の残基2〜514)のPHYドメインをコードした遺伝子が、サプライヤーの推奨に準拠した哺乳類コドン最適化によって合成された(Epoch Life Science, Inc., Missouri City, Texas, USA) (SEQ ID NOs: 63〜65)。PCRとXmaI制限酵素(オリゴヌクレオチド35と36; SEQ ID NO: 61と62)を用いて、PHYドメインがimFGFR1-DFKBPの中に挿入された。当該構築体は、DNAシーケンスによって確認され、redOpto-mFGFR1と命名された。

redOpto-rtrkB mFGFR1 ICDがSgrAI-制限部位(オリゴヌクレオチド26と37, SEQ ID NOs: 40と70)によって置換されたredOpto-mFGFR1に基づいて、逆PCRを用いて、発現プラスミドが得られた。この単一制限部位は、他のRTKのICDを挿入することを可能とする。PCRとAgeIとBspEI制限酵素(オリゴヌクレオチド38と39, SEQ ID NOs: 71と72)を用いて、このプラスミドの中に、rtrkB ICDが挿入された。

光による細胞刺激のための慣例のインキュベーター 細胞の光刺激のために、300個の発光ダイオード(JS-CON-004コントローラーを備えたJS-FS5050RGB-W30, Komerci, Ebern, Germany; λ_max 〜 630nm (red), λ_max 〜 530 nm (green), λ_max 〜 470 nm (blue), バンド幅 〜 ±5 nm)が、インキュベーター(PT2499, ExoTerra/HAGEN, Holm, Germany)に取り付けられた。光強度は、アナログ調光器によって制御され、デジタル電力計(PM120VA, Thorlabs, Munich, Germany)によって測定された。最高出力の強度は、2.3 (赤色光)、2.6 (緑色光)、及び3.3 (青色光) W/m²であった。長時間にわたる刺激のために(>8h)、アルミ製の箱に同じ発光ダイオードとコントローラーが取り付けられ、標準的な組織培養条件の下に(下記を参照)、インキュベーターの中に置かれた。

組織培地とトランスフェクション(HEK293及びCHO-K1 cells) 10% FBSで補強され、100 U/mlのペニシリンと0.1 mg/mlのストレプトマイシンが添加されたDMEMの中に入れた、HEK293細胞とCHO-K1 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA)細胞を、5% CO2雰囲気の下、加湿されたインキュベーターの中に保持した。トリプシン処理の後、ポリ-L-オルニチン(Sigma, Vienna, Austria)が塗布された98穴プレート(3から4個の穴がそれぞれの構造体にある)のそれぞれの穴に5x10⁴の細胞を植え付けた。透明なプレート又は黒くて澄んだ底面を持つプレートが使用された。細胞は、Lipofectamine 2000(Invitrogen/LifeTech)を用いて移入された。

フィコシアノビリンインキュベーション 暗室において、フィコシアノビリン(PCB; Livchem Logistics GmbH, Frankfurt a.M., Germany)を保存濃度10 mMでDMSOの中に溶解した。分取したものを-20°Cの暗所に保管した。実験の前に、細胞は、減じた血清欠乏媒体中37°Cで、50 μM PCBによって一夜インキュベートした。PCBは多量の服用でも毒性がないので(食品中0.17%、又は10 mg/kg) (McCarty (2007)、そのままで生きた動物に適用することも可能であろう。

LOVドメインの発現と細胞増殖測定(HEK293及びCHO-K1細胞) BspEI-制限部位が蛍光タンパク質mVenus (Nagai et al. 2002)とグリシン及びセリンが多いインフレームリンカーに続いている、pcDNA3.1(-)に基づいた発現プラスミドが準備された。PCRを用いて、このプラスミドの中にLOVドメインが挿入された(上記参照)。全ての構築体はDNAシーケンスによって確認された。細胞は、それぞれの96穴プレート(それぞれの構造物に対して4穴)のそれぞれの穴に100 ngの発現を伴って移入された。移入の16〜18時間後に、プレート読み取り機(BioTek Synergy H1, Bad Friedrichshall, Germany)において、mVenusの蛍光を測定することによって、発現は評価された。pcDNA3.1(-)又はFKBP-mVenus融合タンパク質による移入がコントロールとして使用された。細胞毒性の測定は、サプライヤーのプロトコル(EZ4U Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay, Biomedica, Vienna, Austria)に従って、テトラゾリウム染料を用いて行った。620 nmを参照とする450 nmにおける吸光度の測定は、蛍光測定と同じプレート読み取り機の中で行った。

MAPKシグナル伝達の刺激と検知(HEK293細胞) MAPK経路の活性化は、Elk1リン酸化依存性トランスアクチベーターとルシフラーゼ系トランスレポーターとで構成されるPathDetect Elk1 trans-Reporting System (Agilent)によって評価した。Lipofectamine 2000を用いて、細胞に、1穴当り213.3 ngの全DNAが移入された(レポーター、トランスアクチベーター、トランスレポーターの割合は、1:3:60又は1:30:600)。移入の6時間後に、37°Cで18時間、媒体を、CO2-非依存性の減じた血清欠乏媒体(Gibco/Life Technologies; 0.5% FBS、2mM L-グルタミン、100 U/mlペニシリン、及び0.1 mg/ml のストレプトマイシンで補強)で置き換えた。細胞を移して、8時間の間一定の照射のもとに保持するか、光から遮断された。imFGFR1の化学的な刺激は、刺激インキュベーターに移す前に10 nMの AP20187 ((Clackson 1998); ARIAD Pharmaceuticals, Cambridge, MA)を添加することを除いて、同じ手続きに従って行った。インキュベーションの後に、プレートをPBSによって一度洗い、ルシフラーゼを標準的な既成の試薬によって検知した。ここにおいて、Luciferase 1000 Assay System (Promega, Mannheim, Germany)と注入器を備えたマイクロプレートリーダー(Tecan Infinite 200 Pro, Maennedorf, Switzerland)の組み合わせ、又は、ONE-Glo Assay System (Promega)と注入器を備えていないマイクロプレートリーダー(BioTek Synergy H1)の組み合わせのいずれかがある。これらのアッセイ系は、同等の結果を与える。

更なるシグナル伝達経路の検知(HEK293細胞) 更なるmFGFR1-関連シグナル伝達経路の活性化は、誘導経路集中転写因子反応性ホタルルシフラーゼ構築体と構造的発現ウミシイタケルシフラーゼ構築体の混合物から構成されるシグナルレポータアッセイ(Cignal Reporter assays) (Qiagen, Hilden, Germany)によって評価された。細胞は、Lipofectamine 2000 を用いて、1穴当り100.3 ngの全DNAと共に移入され(受容体とレポーターの割合は1:300)、その後、MAPKシグナル伝達の検知のために、前述したように、処理された。細胞はDual- Glo(登録商標) Luciferase Assay System (Promega)によって処理され、シグナルはマイクロプレート読み取り機で検知された。

安定化Opto-mFGFR1細胞株とウイルス構築体の生成 二つの悪性胸膜中皮腫細胞であるM38KとSPC212を10% FBSで補強したRPMI1640の中に保持した。テロメラーゼ不死化微小血管性hBE細胞を、5% FBSで補強したClonetics EGM2 MV内皮成長媒体(Lonza, Wakersville, MD)の中に保持した。レトロウイルス生成のために、EcoRI及びNotI 制限酵素を用いて、コントロールとしてOpto-mFGFR1又はmCherryをpQCXIP (Clontech, Mountain View, CA)の中にサブクローンした。ヘルパープラスミドpVSV-G及びp-gag-pol-gpによる共トランスフェクションによって、ウイルス粒子がHEK293細胞の中に生成した。M38K、SPC212、又はhBE細胞を、6穴プレートの中で50%の密集度に成長させるために、上澄を使用した。細胞を、0.8μg/mlのピューロマイシンで10日間選択し、遺伝子導入発現を免疫ブロットによって確認した。

刺激とWestern Blot (M38K、SPC212、及びhBE細胞) 免疫ブロットのために、6穴プレートのそれぞれの穴に5x10⁵の細胞を接種した。25時間後に、減じた血清媒体(M38K及びSPC212)で媒体を置換した。更に20時間後に、細胞を刺激インキュベーターに移して、1、5、又は15分間照射し、あるいは光から遮断した。その後直ちに、又は5、15、30分間暗所に置いた後に、細胞を洗浄し、氷の上で1穴当り50 μlの溶解バッファーの中で溶解した。溶解物を超音波処理し、遠心分離した(12000 g、5分間、4°C)。1レーン当り15 μgのタンパク質がSDS-PAGEによって分離され、PVDF膜の上に電子ブロットされた。ブロットを、一夜4°Cで、一次抗体(FGFR1、#9740;Erk1/2、#9102;pERK、#9101;PLCγ1 #2822;pPLCγ1 #2821;Akt #9272;pAkt #4058S、Cell Signaling Technology, Danvers, MA; 溶解1:1000;FGFRpY653/654, Thermo Scientific, Vienna, Austria、溶解1:1000;β-アクチン、Sigma, 溶解1:8000)と共に、ブロッキング液(TBST 中、3% BSA又は5%スキムミルク)の中でインキュベートした。二次抗体(HRP結合α-ラビット又はα-抗マウスIgG、Dako, Glostrup, Denmark)で、1:10000の溶解、室温、2時間、処理した。WesternC試薬(Biorad, Hercules, CA)でケミルミネッセンスを現像し、シグナルをX-線フィルム(GE Healthcare)上に記録した。

空間的に限定された照射実験におけるERKリン酸化(SPC212及びhBE細胞) 細胞の単層における偏在的ERKリン酸化の検知のために、SPC212及びhBE細胞を、6-cmのペトリ皿(SPC212)又は12穴プレート(hBE細胞)の中で、密集するまで成長させた。血清を含まない媒体の中で、照射の前の24時間、SPC212を飢餓状態においた。5分間の偏在照射のために、直径が2 mm (SPC212)又は5mm (hBE細胞)のピンホールをもった型を使用した。その後、細胞を冷PBSで洗浄し、Histofix (Lactan, Graz, Austria)で10分間固定した。PBSで洗浄、Triton X100 (PBST中0.25%)に浸漬、PBST中1% BSAでブロック後、皿をpERK (#9101, Cell Signaling Technology, SPC212に対して1:500、hBE細胞に対して1:100)と共に1時間インキュベートした。UltraVision LP検知システム(Thermo Scientific)と、色素源として3,30-ジアミノベンジジンを用いて、シグナルを現像した。細胞核のカウンター染色としてヘマトキシリンを使用した。

空間的に限定された照射実験における生存細胞のルミネッセンス(HEK293細胞) 3x10⁶ の細胞を10 cmの皿の中で、接種と移入を同時におこなった。細胞の移入は、Lipofectamine 2000と皿当り24 μgの全DNAを用いて行った(受容体、トランスアクチベーター、トランスレポーターの割合は1:3:60)。16時間後、MAPKシグナル伝達の検知で記載したように、細胞を処理し、照射した。0.15 mg/ml D-ルシフェリン(PEQlab, Erlangen, Germany) を含むPBSを添加して、生存細胞を処理し、その後、37°Cで10分間インキュベートした。PEQLab Fusion SL 画像システム(PEQLab, Erlangen, Germany)を用いて、ルミネッセンスを検知した。

細胞増殖(M38K細胞) 2x10⁴のM38K細胞を96穴プレートのそれぞれの穴に接種した。24時間後に、細胞を1時間刺激するか、暗所に保持した。示された通りに、FGF2 (Sigma, St. Louis, MO)を添加した。24時間後、細胞を10 μM EdUと共に2時間インキュベートした。続いて、新しく合成されたDNAを、製造者のプロトコルに従ってClick-iT EdU (Life Technologies)で染色し、5 μg/ml のヘキスト染料でカウンター染色した。細胞はNikon Ti300倒立顕微鏡を用いて写真撮影をした。新しく合成されたDNAを含む細胞の割合を決定するために、ヘキストポジティブ核とEduポジティブ核の数をカウントした。

細胞周期(M38K細胞) 細胞周期は、フローサイトメトリーを用いて解析した。5x10⁵ のM38K細胞を25 cm² の組織培養フラスコの中に接種した。24時間後に、細胞をエタノール中(70%)で固定し、50 μg/mlのRNAse Aと50 μg/mlのヨウ化プロピジウム (PI)で処理した。フローサイトメトリーは、FACSCalibur (BD Biosciences, Schwechat, Austria)を用いて行い、細胞周期分布は、ModFit LTソフトウェア(Verity Software House, Topsham, ME)を用いて計算した。

細胞形態(M38K細胞) 10⁵のM38K細胞を6穴プレートのそれぞれの穴に接種した。24時間後に、細胞を1時間刺激するか、暗所に保持した。指示された通りに、FGF2 (Sigma) 又は PD166866 (Pfizer Global Research and Development, New London, CT)を添加した。更に24時間後に、細胞をNikon Ti300顕微鏡の上で写真撮影した。フェースコントラスト画像の任意に選択した区域にある全ての細胞の外周をトレースして、ImageJソフトウェア(National Institute of Health)を用いて、アスペクト比(適した楕円形の長軸の長さを短軸の長さで除したものとして定義)を計算した。50を超える個別の値から、それぞれの平均を求めた。自動解析によって比較可能な結果が得られた。

遺伝子発現解析(M38K細胞) 5x10⁴ のM38K細胞を6穴プレートのそれぞれの穴に接種した。24時間後に、細胞を5分間明所、15分間暗所のサイクルで48時間照射した。コントロール細胞は、暗所に保持した。全てのRNAをTRIZOL (LifeTechnologies)で抽出し、MMLV リバーストランスクリプターゼ (Thermo Scientific)で逆転写した。公知のプライマーを用いて、サンプル当り50 ngのRNAに相当するcDNAを、Abi Prism 7500 Sequence Detection System上のSYBR緑色qPCRにかけた(cf. Sakuma, 2012; #2508)。GAPDHを用いて正規化し、発現レベルの比を、照射対非照射細胞の2-ddCtとして計算した。

アクチン染色(M38K細胞) 5x10⁵ のM38K細胞を6穴プレートのカバーガラスの上に接種した。24時間後に、細胞を5分間明所、15分間暗所のサイクルで48時間照射した。コントロール細胞は、暗所に保持した。細胞を固定し(3.8%ホルムアルデヒド)、透過可能とし(0.5% Triton X100を含むPBS)、TRITC-ファロイジン(1:100, 1% BSAを含む、一夜4°C)で染色し、そして、DAPIを含むVectashield封入剤に封入した。Leica蛍光顕微鏡を用いて、顕微鏡写真を撮った。

In vitro血管新生(発芽)アッセイ(hBE細胞) 球状体生成のために、標準的な組織培養インキュベーターの中で一夜、10% FBS、L-グルタミン、2.2 g/l NaHCO₃、及び20%メチルセルロース(Sigma)で補強されたM199媒体(Sigma)の中に、hBE細胞を懸滴として懸濁させた(25 μlの懸滴の中に450個の細胞) 。翌日、球状体を10% FBSを含むPBS中で洗浄し、遠心分離し、Methocel/20% FBSの中に再懸濁し、中和されたラット尾コラーゲンと混合し(1:1)、そして非被着性24穴プレート(Greiner Bio-one, Kremsmuenster, Austria)の中に接種した。コラーゲンを固化した後、VEGFA (30 ng/ml)又はPD166866 (10 μM)を添加した。プレートを20分毎に5分間、光で10時間にわたって刺激、又は暗所に保持した。刺激を与えたあと、1 mlの8%パラホルムアルデヒドをそれぞれの穴に添加し、球状体をNikon顕微鏡で撮影した。少なくとも群当り8個の球状体から、球当りの積算された発芽長を測定した(ImageJ)。

薬理化合物の全光型評価(M38K及び HEK293細胞) 試験化合物は、以下から求め、示された最終濃度で使用した:PD166866 (PD、5 μM; Pfizer Global Research and Development, Groton CT)、BIBF1120 (BIBF、0.5 μM; ニンテダニブ、 Vargatef, Selleck Chemicals, Houston, TX)、AP24534 (PON、1 μM; ポナチニブ、Selleck Chemicals)、AZD6244 (SE、0.5 μM; セルメチニブ、Selleck Chemicals)、UO126 (UO、10 μM; LC Laboratories, Woburn, MA)、MK2206 (MK、10 μM; Selleck Chemicals)、LY294002 (LY、 20 μM; LC Laboratories)、イマチニブ(IMA、0.5 μM; Selleck Chemicals)、ベムラフェニブ(VEM, 0.5 μM; Selleck Chemicals)。濃度は刊行された報告書に従って調整されたが、使用したインキュベーション時間内では、細胞毒性はなかった。

M38K細胞については、細胞形態は前記の通りに評価したが、自動画像解析に従った。相コントラスト画像(典型的には、2穴から3画像)を自動的に解析し、画像は無彩色スケールに変換され、局所閾値補正のために再切断してセグメントに分けられた(閾値は、最確強度に対して定数因子0.85を掛けたものとして定義された;Igor Pro, Wavemetrics, Lake Oswego, OR)。細胞は、FIJI/ImageJ (Max Planck Society/National Institutes of Health; size limit: 40〜600 pixel^2, circularity limit: 0.01〜1.00)によって同定され測定された。時々起こる異常値は、手動操作によって除外した。典型的には200〜1800の個別の値から図9の平均を求めた。HEK293細胞に対して、MAPK経路活性化は、先に述べたルシフラーゼを用いて測定した。

実施例1 当初、どのLOVドメインが哺乳類RTKの活性化に適しているのか不明なので、本発明者らは、広い範囲のLOVドメイン候補の偏見のないパネルを集めた(菌類から1個、藻類から2個、植物から2個)(図1a及びSEQ ID NO: 1〜14)。

¹ 寿命が20〜800秒の3組の指数的減衰が観察された。 ² LOVドメインは、本研究のVfAU1-LOVと比べて、C-及びN-末端延長を含んでいた。 ³ 必要に応じて、発表された半減期値(t1/2)を、一次反応と仮定した寿命(τ=t1/2/ln(2))に変換した。

これらのドメインに対して、オリゴマー化状態における光依存性変化は、以前に報告されている(Katsura, 2009; Kaiserli, 2009; Kutta, 2008; Zoltowski, 2008; Toyooka, 2011)。これらドメインの大部分は、哺乳類細胞においてまだ研究されていないので、本発明者らは、これらの候補LOVドメインが、二つの哺乳類細胞株において(チャイニーズハムスター卵巣細胞及びヒト胎児由来腎臓293 (HEK293)細胞)、コドン最適化遺伝子から異種的に発現され得るかどうか、また、発現が細胞毒性を引き起こすかどうかについて、まず探索した。LOVドメインは両方の細胞株から効率的に作られており(蛍光蛋白符号の検知による評価)、検知されるほどの細胞毒性もないことが判った(テトラゾリウム染料の細胞減少による評価)(図1)。更に、これらの細胞において、タンパク質の凝集は見られなかった(データで示さず)。これらは、正常な発現を更に支持する。

フィブロブラスト成長因子(FGF)受容体1 (FGFR1)は、進化的に保存されたRTKであり、また、胎児の分化、大人の神経発生、及び腫瘍形成における細胞挙動の重要な制御者である(Deng et al. 1994, Zhao et al. 2007, Yang et al. 2013)。本発明者らは、LOVドメインが、マウスのフィブロブラスト成長因子受容体1 (FGFR1)の細胞内ドメインと結合しているキメラ受容体を構築した。mFGFR1の細胞外リガンド結合モジュールは、野生型リガンドに反応しないタンパク質を得るために、融合タンパク質において除かれている(図2a)。以上のように考えると、融合タンパク質を発現する細胞は、mFGFR1に特徴的なシグナル伝達経路の活性化を伴う青色光に対して反応すべきである。本発明者らは、決められた強度の青色光を哺乳類細胞に照射させる特別仕様のインキュベーターの中で、細胞のシグナル伝達実験を行った(資料と方法の項を参照のこと)。本発明者らは、FGFR1を経てFGFsによって活性化される中心的なシグナル伝達経路であるMAPK経路(Ma et al. 2009)について、まず最初に検討した。本発明者らは、ポジティブコントロールとして、修飾された化学的に誘起可能なmFGFR1 (imFGFR1; (Welm, Freeman et al. 2002))——それは又、リガンド結合モジュールを欠いており、小さい化学リガンドAP20187が単一の操作されたFK506結合ドメイン(FKBP)と結合することによって活性化される——を用いた。これらの実験は、V. frigida (VfAU1-LOV-mFGFR1)からのオーレオクロム1のLOVドメインを取り込んだ融合タンパク質が、imFGFR1と同様にMAPK経路を活性化したことを明らかにした。特に、拡張された基本経路の活性化は光を欠いた中では観察されず、光による経路の誘起は、リガンドによる経路活性化と同程度の大きさであった(図2b)。他のどの融合タンパク質も、活性あるいは構造的な活性を示さなかった(図2b)。コントロール実験は、(i)青色光は、imFGFR1を発現する細胞に対して全く影響を与えない、(ii)青色光は、キナーゼ活性を失った後、VfAU1-LOV-mFGFR1を発現する細胞に対して全く影響を与えない、(iii)緑色光又は赤色光は、VfAU1-LOV-mFGFR1を発現する細胞に対して全く影響を与えないということを示した(図2c)。まとめると、これらの結果は、哺乳類RTKの触媒ドメインと藻類LOVドメインから構成されるキメラ受容体であるVfAU1-LOV-mFGFR1は、青色光に反応して、基準のMAPKシグナル伝達経路と(図2)、mFGFR1と結合した追加的経路(図3)を活性化することを示唆する。本発明者らは、この受容体を「Opto-mFGFR1」と命名した。

次に、本発明者らは2量化がOpto-mFGFR1の活性化の基礎をなしているかどうかを検討した。単一電荷逆変異体(全長FGFR1の中のR557E; Opto-FGFR1又はmiFGFR1中のR195E)は、FGFR1における機能的に不可欠な不斉キナーゼドメイン2量体の生成を防止し(Bae et al. 2010)、また、imFGFR1によるMAPK活性化を阻止する(図4a)。本発明者らは、活性化の間の2量体生成のプローブとして、この変異体をOpto-mFGFR1に導入した。Opto-mFGFR1-R195Eを発現する細胞中において、青色光に反応するいかなるMAPK経路活性化も検出されなかった(図4a)。このことは、受容体の活性化には受容体の2量化が必要であることを示す。この結果は、哺乳類細胞において、VfAU1-LOVが青色光に反応して2量化するという観察(図4b)と合わさって、Opto-mFGFR1活性化を基礎とする機序としての2量化を示唆する。

本発明者らは、VfAU1-LOV に類似したLOVドメインが、mFGFR1を活性化できるかどうかを、更に検証した。データベース検索を使用して、本発明者らは、eustigmatophyte Nannochloropsis gaditana (N. gaditana仮想タンパク質 (NgPA1))の中、及び黄金色藻Ochromonas danica (O. Danica 推定オーレオクロム1(OdPA1))の中における、VfAU1様タンパク質を同定した。また、NgPA1及びOdPA1のLOVドメインを取り込んだmFGFR1融合タンパク質(NgPA1-LOV及びOdPA1-LOV)に対して、本発明者らは、オリジナルOpto-mFGFR1の活性化と同程度の、青色光によって誘起されたMAPKシグナル伝達の活性化を観測した(図5a)。従って、多数のオーレオクロム様タンパク質のLOVドメインは、mFGFR1の活性化をすることができる。

VfAU1-LOVが、他のRTKを活性化できるかどうかを検証するために、本発明者らは、それを、ヒト表皮成長因子受容体(hEGFR)及びヒトRET (hRET)の触媒ドメインと組み合わせた。本発明者らは、Opto-mFGFR1において確立された設計に従った。それらの既知のシグナル伝達能と合致して、光によるMAPK経路の明確な活性化が、hEGFR及びhRETの融合タンパク質を発現する細胞において観測された(図5b)。これらの融合タンパク質は、「Opto-hEGFR」及び「Opto-hRET」と名付けられた。

最初の光活性化RTKの合理的な設計において、本発明者らは、リガンド誘起2量化を光活性化タンパク質‐タンパク質相互作用で置き換えた。光制御哺乳類受容体2量化の先行例がなく、また、天然にある光受容体の構造的な多様性(Moglich et al. 2010, Zoltowski and Gardner 2011)の故に、当初、本発明者らは、偏見のないアプローチに従い、異なった4つの非動物種起源の5つのLOVドメインを評価した。VfAU1-LOVの同定に成功したことは、自然は、光活性化分子手段において獲得できる広い範囲の光感応性分子の機能性を提供しているという考えを支持するものである(Chow et al. 2010)。VfAU1-LOVの取り込みは、Opto-mFGFR1にいくつかの有益な特質を与える。

光感応性素子として、VfAU1-LOVは、全部とは言わないまでも大部分の動物細胞の中に豊富に存在しているオキシドリダクターゼの補欠分子族であるフラビンモノヌクレオチド(FMN)を取り込んでいる。従って、Opto-mFGFR1は、in vivoにおける光遺伝学実験の重要な特質である外因性のコファクターの添加を必要とせずに、多くの細胞型において機能することが期待され、本発明者らは、FMNによる補強がない3つの細胞型における機能を証明した。第2に、Opto-mFGFR1は、低強度の青色光(例えば、約3 μW/mm²、図2)——これは、透明な動物モデルにおいて、及び経皮的に齧歯動物において容易に達成される(Janovjak et al. 2010, Ye et al. 2011)——によって、効率的に活性化される。

最初に評価された5個のLOVドメインの比較は、Opto-mFGFR1における機能に貢献するVfAU1-LOVのそれらの性質の提案と実験的な確認を可能とする。第1に、他の4個の光受容体ではなく、VfAU1においてのみ、LOVドメインがエフェクタードメインのC-末端に位置している(図1)。更に、光受容体の全長においてエフェクタードメインのC-末端に同じように位置している未だ特性が明らかになっていないLOVドメインは、機能的にVfAU1-LOVを置き換えることができる(OdPA1-LOV及びNgPA1-LOV;図5a)。従って、天然に存在する光受容体のドメインの順番を維持することは、組み換えタンパク質の機能のために有益であるように思われる。同様に、本発明者らは、全長の受容体OdPA1及びNgPA1が、VfAU1と同様な機序によって機能することを提案し、従って、光活性化タンパク質の組み換えが、天然に存在するタンパク質の機能と発見に対する洞察を可能にするという見解を補強するものである(Janovjak, Szobota et al. 2010, Janovjak et al. 2011)。

第2に、暗所状態における2量化が、全部とは言わなくても大部分の特性が明らかにされているLOVドメインにおいて観察されるものの、それは、VfAU1-LOVにおいて、他のドメインよりも一桁から二桁高いオーダーの濃度で起こっている(上記表1)。従って、濃度が<100 μMで、暗所2量化が殆ど無い又は無いドメインを取り込むことは、組み換えタンパク質の機能にとって有益なように思われる。

第3に、VfAU1-LOVの光励起状態は、受容体の2量化並びに受容体の2量体の安定化のために、十分に長い寿命を有しているに違いないと合理的に仮定できる。リガンドは、機能的なFGFR1二量体を30〜100秒で達成する(Powell et al. 2002)。これらの時間は、VfAU1-LOVの光励起状態の寿命よりも短いが、いくつかの他のドメインに対してはそうではない(上記表1)。このモデルと合致して、変異によってVfAU1-LOVの寿命を約8倍短くすることは、Opto-mFGFR1の活性化を低下させる(図5c)。上記の特性、ドメインの順番、暗所2量化、及び光励起状態の寿命の組み合わせが、LOVドメインによるmFGFR1の活性化には必要とされているように思われる。

以上より、これらの結果は、LOVドメイン(NgPA1-LOV、OdPA1-LOV、及びVfAU1-LOV)と哺乳類RTK (mFGFR1、hEGFR、及びhRET)の触媒ドメインから構成される融合タンパク質は、青色光に反応した、RTKに結合した細胞シグナル伝達経路を活性化することを示唆するものである。

実施例2 ガンの発生と進展は、RTKにおける変異又はRTKの過剰発現としばしば結び付けられている。多くのガン細胞は、増加した増殖、移動、及び上皮‐間葉転換(EMT)を伴って成長因子に反応する(Metzner et al. 2011, Sakuma et al. 2012)。FGF/FGFRシグナル伝達に関連するヒトのガンの細胞モデルを確立するために、本発明者らは、異なった腫瘍エンティティからの細胞に関して、良く知られたFGFRリガンドであるFGF2の効果を検証した。本発明者らは、悪性胸膜中皮腫由来のM38K細胞(Kahlos et al. 1998)が、細胞挙動における特徴的な変化を伴ってFGFに反応することを見出した。Opto-FGFR1がこれらのヒト腫瘍細胞の光による制御を可能にするかどうかを研究するため、本発明者らは、ウイルスによってOpto-mFGFR1をこれらの細胞に送り込み、安定なOpto-mFGFR1発現を有する細胞を増殖させた。青色光による刺激は、Opto-mFGFR1及びERK1/2の急速なリン酸化をもたらし、光停止後数分間の内に刺激を与える前のレベルに戻った(図6a)。同様に、Opto-mFGFR1やERK1/2ばかりではなく、FGFで制御される別のシグナル伝達分子であるAKTやホスホリパーゼCy (PLCy) の急速なリン酸化が(Ma, Ponnusamy et al. 2009, Coutu et al. 2011)、悪性胸膜中皮由来の第2FGF2-反応性細胞株において観察された(SPC212; (Schmitter et al. 1992))(図6a及び6b)。さらに、光刺激は、増殖の増加(5−エチニル−2’−デオキシウリジンを取り込んだ核の%で評価)、細胞周期分布のS-相へのシフト、EMT様形態の変更、及びFGF2処理細胞の発現に匹敵するEMT様遺伝子発現の変化を引き起こした(図6c〜6g)。形態の光誘起変化は、選択的FGFR1インヒビターであるPD166866による前処理で阻止された(図6e及び6f)。さらに、ガンと無関係なモデル系である血液内皮細胞においても、青色光による刺激は、Opto-mFGFR1やERK1/2の急速なリン酸化をもたらした(図7a)。また、この系において、青色光の照射は、形態変更を誘起した(図7b及び7c)。

Opto-mFGFR1に対して、時間的に制約された光刺激は、他の広く使用されている光遺伝学的な手段(Kennedy et al. 2010)に匹敵する時間スケールで受容体活性化を制御する能力——生理学や発生に関連したものよりもより速い——を証明し(図6a及び6b、図7a)、他方、空間的に制約された光刺激は、偏在化した受容体活性化を証明した(図8)。

光活性化タンパク質による、薬理物質評価の新規なアプローチの可能性が最近提案された(Prigge, Rosler et al. 2010, Entcheva 2013)。これらの考え方は、光をアクチベーターと細胞シグナル出力の両者として使用するということを基礎としており、このことは、単純化とコストの削減を可能にする。多分子に対するこのアプローチの概念実証は、現在まだ得られていない。本発明者らは、Opto-mFGFR1による疾病関連細胞シグナル伝達の光活性化及びM38K細胞の形態変化に基づく、小型分子の「全光型」評価を実験的に実現した。本発明者らは、モデル系としてM38K細胞を使用することによって、FGFR1に特異的なインヒビターが同定され、それはまた、形態変化に関与している下流の経路が同定できるということを期待して、FGFR1及び他のキナーゼに対するインヒビターに焦点を合わせた。本発明者らは、形態変化が、FGFRインヒビターPD166866、BIBF1120、及びPonatinib、並びにMEKインヒビターUO126及びセルメチニブによる処理によって、無くすことができることを見出した。PI3KインヒビターLY294002及びAktインヒビターMK2206は、無効であった。

これらの結果は、(i)M38K細胞において、形態変化はMAPK経路に依存しているが、PI3K/Akt経路からのシグナルは無くてもよいこと、そして(ii)全光型薬理評価が、特定の受容体と経路の活性化を阻害するインヒビターを同定するためであることを証明する。

光遺伝学的な手段が細胞活性と神経回路の貴重で確立された推進力である神経系細胞と対照的に、ガン細胞挙動の光制御は、今日まで認識されていなかった。本発明者らは、悪性胸膜中皮腫の細胞モデルにおける細胞増殖、細胞形態、細胞移動等の悪性細胞の挙動特性を制御するためにOpto-mFGFR1を採用する。単一成分Opto-mFGFR1の活性化は、これらの挙動変化を引き起こすために十分である。RTKは発生と細胞運命決定において主要な役割を演じていることから、本発明者らは、光活性化RTKが、例えば、空間的時間的活性化パターンにおいて、これらのプロセスについての新規な研究を可能にすることを期待する。特に、FGFR1は、明確な経路を経て、間葉及びニューロン幹細胞の自己新生と差別化を制御することが示された(Ma, Ponnusamy et al. 2009, Coutu, Francois et al. 2011)——これらの全てはOpto-mFGFR1によって制御することができる。

大きな可能性があるにもかかわらず、光遺伝学の生物工学における応用は稀である。イオンチャンネルに対して、光制御の非侵襲的性質は、膜電流に影響を与える分子のより速い非接触評価において、有利に働くかもしれないことが提案された(Prigge, Rosler et al. 2010, Entcheva 2013)。本発明者らは、Opto-mFGFR1に基づいた、高生産性と両立できるフォーマットにおける「全光型」スクリーニング方法を確立した。本方法は、刺激として、また活性化と細胞シグナル伝達の読み取りとして、その両者において光を採用するものである。これらの検証実験において、FGFR1のインヒビター並びに下流ターゲットのインヒビターである化合物を同定することができ、M38K細胞挙動における変化の原因となっている経路を同定することができた。この実験の設計は、むしろシグナル伝達経路の阻害及び経路の所定の構成要素の阻害——いくつかの構成要素は標的にし易いか、あるいは他よりも高い特異性を有しているかもしれないので——を目的とした薬理計画と一致する。光による化学アクチベーターの置換は、活性化の時間的コントロールと活性化強度の調整を維持しながら、作業の単純化とコスト削減をもたらすことができる。さらに、組み換えられた受容体の光活性化は、組み込まれた受容体型に特異的で、受容体ファミリー又は亜型に対する亜型特異的なリガンドがないことに起因する潜在的な複雑化を避ける。しかしながら、種々の受容体/シグナル伝達経路は、光を単一で普遍的な入力として用いることによって活性化されているので、並列化の可能性は維持されている。

実施例3 本発明者らはまず最初に、赤色光に反応してホモ2量化するタンパク質ドメインを同定した(クロオコッカス PCC6803 (SyCP1-PHY)のシアノバクテリアフィトクロム(PHY)CPH1の光感応性ドメイン)。本発明者らは次に、SyCP1-PHYが、マウスFGFR1(mFGFR1)又はラットtrkB (rtrkB)の細胞内触媒ドメインと結合している融合タンパク質を調製した(図10及び11)。野生型リガンドに反応しない融合タンパク質を得るために、mFGFR1/rtrkBの細胞外リガンド結合モジュールは除外した。融合タンパク質を発現する細胞は、mFGFR1/rtrkBに特徴的なシグナル伝達経路の活性化と共に、赤色光に反応しなけらばならない。本発明者らは、特定の強度と色の光によって細胞や組織に照射できる特別仕様のインキュベーターの中で、細胞シグナル伝達の実験を行った(資料と方法)。実施例1のように、まずマイトゼン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)経路を検討した。

融合タンパク質が低強度赤色光照射に反応してMAPK経路を活性化することが見出された(図10及び11)。コントロール実験は、2量化ができないキナーゼ欠損mFGFR1-SyCP1-PHY又はmFGFR1-SyCP1-PHYを移入された細胞に対して、赤色光が影響を与えないことを示した(図10)。これらの結果は、哺乳類RTKの触媒ドメインとシアノバクテリアPHYドメインから構成されるキメラ受容体であるmFGFR1-SyCP1-PHYとrtrkB-SyCP1-PHYが、標準的MAPK経路を赤色光に反応して活性化することを証明する。本発明者らは、これらの受容体を「redOpto-mFGFR1」及び「redOpto-rtrkB」と命名した。

実施例4 光活性化タンパク質による、薬理物質評価の新規なアプローチの可能性が最近提案された(Prigge, Rosler et al. 2010, Entcheva 2013)。これらの考え方は、光をアクチベーターと細胞シグナル出力の両者として使用するということを基礎としており、このことは、単純化とコストの削減を可能にする。多分子に対するこのアプローチの概念実証は、現在まだ得られていない。本発明者らは、redOpto-rtrkB による疾病関連細胞シグナル伝達の光活性化及びHEK293細胞のルシフラーゼシグナルに基づく、小型分子の「全光型」評価を実験的に実現した。本発明者らは、MAPK 経路に特異的なインヒビターが同定されるということを期待して、MAPK 経路及び他のキナーゼに対するインヒビターに焦点を合わせた(図12)。本発明者らは、赤色光に反応するMAPK経路誘起を、MEKインヒビターUO126及びセルメチニブによる処理によって、無くすことができることを見出した。FGFRインヒビターPD166866、CKITインヒビターイマチニブ、及びBRAFインヒビターベムラフェニブは、無効であった。

これらの結果は、さらに、全光型薬理評価が、特定の受容体と経路の活性化を阻害するインヒビターを同定するためであることを証明する。 赤色光は青色光に比べて明確に改善された組織浸透性を提供するので、redOpto-mFGFR1及びredOpto-rtrkBは、光遺伝学的な手段の高い価値のあるグループの典型である。例えば、5 mmの厚さを持つ骨/頭蓋骨は青色光(460 nm)の〜2%を透過するが、赤色光(640 nm)は〜10%を透過する(Wan, Parrish et al. 1981)。又は、1 cmの厚さを持つ筋肉組織は青色光の〜20%を透過するが、赤色光は〜80%を透過する(Marquez, Wang et al. 1998)。 さらに、受容体ファミリーを含むPHYドメインとLOVドメインの組み合わせは2色活性化による実験を可能とする

WO 2013/133643 WO 2013/074911 WO 2013/003557 WO 2012/116621 WO 2010/006049 WO 2009/151948 WO 2009/148946 WO 2008/089003 WO 2008/086470 WO 2007/024391 WO 1999/036553 US 2013/0116165 US 2010/0234273 US 2009/0233364 US 2006/0110827

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SEQUENCE LISTING <110> IST Austria <120> Optically Activated Receptors <130> 30A-127 228 <150> EP 13197174.9 <151> 2013-12-13 <150> EP 14168286.4 <151> 2014-05-14 <160> 72 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 996 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Glu Pro Thr Glu Lys Pro Ser Thr Lys Pro Ser Ser Arg Thr Leu 1 5 10 15 Pro Arg Asp Thr Arg Gly Ser Leu Glu Val Phe Asn Pro Ser Thr Gln 20 25 30 Leu Thr Arg Pro Asp Asn Pro Val Phe Arg Pro Glu Pro Pro Ala Trp 35 40 45 Gln Asn Leu Ser Asp Pro Arg Gly Thr Ser Pro Gln Pro Arg Pro Gln 50 55 60 Gln Glu Pro Ala Pro Ser Asn Pro Val Arg Ser Asp Gln Glu Ile Ala 65 70 75 80 Val Thr Thr Ser Trp Met Ala Leu Lys Asp Pro Ser Pro Glu Thr Ile 85 90 95 Ser Lys Lys Thr Ile Thr Ala Glu Lys Pro Gln Lys Ser Ala Val Ala 100 105 110 Ala Glu Gln Arg Ala Ala Glu Trp Gly Leu Val Leu Lys Thr Asp Thr 115 120 125 Lys Thr Gly Lys Pro Gln Gly Val Gly Val Arg Asn Ser Gly Gly Thr 130 135 140 Glu Asn Asp Pro Asn Gly Lys Lys Thr Thr Ser Gln Arg Asn Ser Gln 145 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255 Leu Ile Arg Tyr Asp Ala Arg Gln Lys Glu Lys Ala Leu Asp Ser Ile 260 265 270 Thr Glu Val Val Gln Thr Ile Arg His Arg Lys Ser Gln Val Gln Glu 275 280 285 Ser Val Ser Asn Asp Thr Met Val Lys Pro Asp Ser Ser Thr Thr Pro 290 295 300 Thr Pro Gly Arg Gln Thr Arg Gln Ser Asp Glu Ala Ser Lys Ser Phe 305 310 315 320 Arg Thr Pro Gly Arg Val Ser Thr Pro Thr Gly Ser Lys Leu Lys Ser 325 330 335 Ser Asn Asn Arg His Glu Asp Leu Leu Arg Met Glu Pro Glu Glu Leu 340 345 350 Met Leu Ser Thr Glu Val Ile Gly Gln Arg Asp Ser Trp Asp Leu Ser 355 360 365 Asp Arg Glu Arg Asp Ile Arg Gln Gly Ile Asp Leu Ala Thr Thr Leu 370 375 380 Glu Arg Ile Glu Lys Asn Phe Val Ile Ser Asp Pro Arg Leu Pro Asp 385 390 395 400 Asn Pro Ile Ile Phe Ala Ser Asp Ser Phe Leu Glu Leu Thr Glu Tyr 405 410 415 Ser Arg Glu Glu Ile Leu Gly Arg Asn Cys Arg Phe Leu Gln Gly Pro 420 425 430 Glu Thr Asp Gln Ala Thr Val Gln Lys Ile Arg Asp Ala Ile Arg Asp 435 440 445 Gln Arg Glu Ile Thr Val Gln Leu Ile Asn Tyr Thr Lys Ser Gly Lys 450 455 460 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