为了培养神经细胞，一直使用合成培养基，其是补充了一些神经 细胞生存所必须的因子(例如，神经生长因子和细胞因子)或者化学成分 确定的组分的基础培养基，或者含有星形胶质细胞条件培养基的培养 基。与合成培养基相比，含有星形胶质细胞条件培养基的培养基能将 神经细胞培养物稳定地维持更长的时间。
还已知，通过在含有星形胶质细胞条件培养基的培养基中使胚胎 干细胞分化，可从胚胎干细胞有效诱导出神经细胞(见，非专利文件1 和2)。
作为星形胶质细胞条件培养基，一直使用下述的条件培养基，其 是通过在营养培养基中培养从动物(例如，大鼠、小鼠、小牛、马、猪、 猴、兔或鸡)的神经组织中获得的原代星形胶质细胞所制备的培养上清 液(见，专利文件1和2)。
然而，使用原代星形胶质细胞可能导致一些问题。即，可作为星 形胶质细胞来源的活(神经)组织是有限的。从活组织中获得星形胶质细 胞花费很多的时间和努力。另外，很难在培养容器中维持原代细胞的 稳定培养物，它们的传代培养限于几代。因此，为了根据上述常规方 法制备大量星形胶质细胞条件培养基，需要巨大的努力和时间重复制 备的过程以及获得足够量的活组织。
另外，所培养的原代星形胶质细胞的特性随活体的成熟阶段或者 作为星形胶质细胞来源的活组织的区域而变化。此外，当它们是从活 体中获得时，非期望的星形胶质细胞的细胞污染不可避免。因此，一 直很难制备具有基本上均一质量的星形胶质细胞条件培养基的稳定制 剂。
已经报道了许多用于维持神经培养物(神経細胞)的培养基，包括 补充了各种细胞因子和/或生长因子的无血清培养基(见非专利文件3和 4)。然而，通常使用在所述文献中所公开的培养体系不能长时间稳定维 持神经培养物。如果这些培养基之一对维持神经生存有效，那么其常 常促进另外神经胶质增殖，这产生了神经元和神经胶质细胞的混合培 养物。因此，这种培养体系不适合制备用于，例如，检验受试化合物 对神经元的药理学效应的均一的神经元培养物。
很久以前，已知原代培养的星形胶质细胞的条件培养基可以用于 培养神经元。然而，在神经元的长期培养方面，已表明单独应用的原 代培养的星形胶质细胞条件培养基的效率要低于相关报道的情况。据 报道，仅仅通过向原代培养的星形胶质细胞的条件培养基中添加各种 添加剂(因子)，可制备适于神经元的长期稳定培养的培养基(见专利文 件1和2)。
发明公开
本发明将解决的问题
本发明的目的是提供一种制备来源于胚胎干细胞的星形胶质样细 胞的条件培养基的方法。该方法有效地达到至少下列效果之一：稳定 地提供基本上均一的星形胶质细胞样细胞的条件培养基；通过简单的 方法提供大量星形胶质样细胞的条件培养基；提供基本上不含来自非 靶动物的细胞成分的星形胶质样细胞的条件培养基(例如提供基本上不 含非人细胞成分的人星形胶质样细胞的条件培养基)；提供可用于有效 地将胚胎干细胞分化为神经细胞的星形胶质样细胞的条件培养基；提 供可用于长时间维持所分离神经元的稳定、健康的培养物的星形胶质 样细胞的条件培养基，等等。
本发明的另一个目的是提供通过上述方法所制备的星形胶质样细 胞的条件培养基，其对至少下列之一有用：有效地诱导胚胎干细胞分 化为神经细胞；长时间维持稳定、健康的神经培养物(神経細胞)，等 等。
本发明的又一个目的是提供培养神经元的方法，其可达到至少下 列之一：长时间维持稳定、健康的神经培养物；在基本上不存在来自 非靶动物的成分的条件下培养来自靶动物的神经元，等等。
本发明的再一个目的是提供一种将胚胎干细胞分化为神经细胞的 方法，其可达到至少下列之一：有效地诱导胚胎干细胞分化成神经细 胞；在基本上不存在来自非靶动物的成分的条件下，有效地诱导来自 靶动物的胚胎干细胞分化为神经细胞，等等。
此外，本发明的一个目的是提供从胚胎干细胞诱导的神经细胞。 通过使用所述的神经细胞，可达到至少下列之一：基本上无源自非靶 动物(作为靶动物例如，人)的成分污染的条件下进行细胞移植处理；提 供与靶动物(例如，人)的活体具有高度相容性的细胞，等等。
本发明的其它目的根据说明书结合常规技术显而易见。
解决问题的方法
本发明是根据上述目的完成的并且涉及下列：
[1]一种制备星形胶质细胞样细胞的条件培养基的方法，其中所述 的星形胶质细胞样细胞来源于胚胎干细胞，其特征在于，培养通过胚 胎干细胞分化所制备的星形胶质细胞样细胞；
[2][1]的方法，其中所述的胚胎干细胞是哺乳动物胚胎干细胞；
[3][2]的方法，其中所述的哺乳动物是灵长类动物；
[4][3]的方法，其中所述的灵长类动物是人；
[5]权利要求[1]-[4]中任何一项的方法，包括步骤：
(A)由胚胎干细胞制备星形胶质细胞样细胞，和
(B)培养通过所述步骤(A)制备的星形胶质细胞样细胞以产生培养 上清液；
[6][5]的方法，在该方法的步骤(A)中，通过使用星形胶质细胞的 条件培养基、初步制备的星形胶质细胞样细胞的条件培养基，或初步 制备的功能上等同于所述星形胶质细胞的条件培养基或星形胶质细胞 样细胞的条件培养基的培养基来使胚胎干细胞分化。
[7]一种来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养 基，其是通过[1]-[6]中的任何一项制备的；
[8]一种培养神经元的方法，其特征在于，在根据[7]的来源于胚胎 干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基存在下培养神经元；
[9]通过根据[8]的方法培养的神经元；
[10]一种诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的方法，其特征在于， 在根据[7]的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基存 在下，将胚胎干细胞分化为神经细胞和
[11]通过使用根据[7]的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞 的条件培养基来使胚胎干细胞分化所获得的神经细胞。
发明效果
本发明的用于制备来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基的方法可很容易地和稳定地提供大量具有基本上均一质量的 星形胶质细胞样细胞的条件培养基。另外，本发明的方法可提供基本 上不含来自非靶动物的动物成分的星形胶质细胞样细胞的条件培养 基，例如，基本上不含非人成分的人星形胶质细胞样细胞的条件培养 基。
进一步，本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基的有益性质在于其性质是基本上相同的。另外，本发明的来 源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基可有效地诱导胚 胎干细胞分化为神经细胞并且其也可长时间稳定、健康地维持神经 元。此外，通过使用本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细 胞的条件培养基，可制备神经细胞并在基本上不存在任何来自非靶动 物的成分的条件下维持。例如，可使用本发明的来源于胚胎干细胞的 星形胶质细胞样细胞的条件培养基用于制备含有基本上不存在非人细 胞成分的人神经细胞培养物(ヒト神経系細胞)(例如，神经干细胞、神 经元、星形胶质细胞，等等)。
另外，根据本发明的用于培养神经元的方法，在基本上不存在任 何来自非靶动物的动物成分的条件下可长期稳定、健康地培养神经 元。例如，根据本发明的用于培养神经元的方法，可在基本上不存在 任何非人成分的条件下维持人神经培养物(ヒト神経細胞)。
此外，根据本发明的用于将胚胎干细胞分化为神经细胞的方法， 可有效地由胚胎干细胞制备基本上不含来自非靶动物的动物成分的神 经细胞培养物。因此，通过本发明的诱导分化方法所制备的神经细胞 将可用于药物开发，例如，制备用于再生治疗的细胞移植材料，制备 用于新药开发的测定系统(例如，毒性评估、效能评估，等等)。
此外，本发明的神经细胞可用于在基本上无来自非靶动物的动物 的成分的共转染的情况下进行细胞移植。另外，本发明的神经细胞显 示与待治疗的动物(例如，人)活体的高度相容性。本发明的神经细胞可 以用于筛选新药的试验系统，以开发适于待治疗的动物(例如人)的药 物。
附图简述
图1显示了来源于小鼠胎儿皮质的原代神经元在来源于小鼠胚胎 干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基或N2培养基(DMEM：F- 12+N2添加剂)中培养2天所制备的细胞的形态照片。A和B板显示了 使用N2培养基的情况，和C和D板显示了使用来源于小鼠胚胎干细 胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基的情况。在图中，图解比例尺 表示50μm。
图2显示了免疫染色分别检测GFAP(胶质原纤维酸性蛋白)和 MAP2(微管相关蛋白2)表达的结果。A板显示了使用N2培养基的情 况，和B板显示了使用来源于小鼠胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞 的条件培养基的情况。MAP2的表达通过绿色荧光检测到，GFAP的表 达通过红色荧光探测到。在图中，图解比例尺表示50μm。
图3显示了在来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培 养基或含B-27的NeurobasalTM培养基中培养8天的细胞的照片。A和 B板显示了在含B-27的NeurobasalTM培养基中培养的细胞，和C和D 板显示了在来源于小鼠胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养 基中培养的细胞。在图中，图解比例尺表示50μm。
图4显示了在来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培 养基或含B-27的NeurobasalTM培养基中培养10天的细胞的照片。A 和B板显示了在含B-27的NeurobasalTM培养基中培养的细胞，和C 和D板显示了在来源于小鼠胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件 培养基中培养的细胞。在图中，图解比例尺表示50μm。
图5显示了从猴胚胎干细胞制备的星形胶质细胞样细胞。图中显 示用抗GFAP抗体或抗MAP2抗体免疫染色；A板显示了GFAP的表 达(绿色荧光)，B板显示了MAP2的表达(红色荧光)和C板显示了A和 B板的融合图像。在图中，图解比例尺表示100μm。
图6显示了使用来源于猴胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基，从猴胚胎干细胞分化的神经元(神经细胞)的照片。A和D板 显示了免疫染色细胞(绿色荧光表示hrGFP的组成型表达，以及实验中 使用的猴胚胎干细胞(CMK6-G4细胞系)和由它们分化的细胞的定 位)，和B和E板分别显示了βIII微管蛋白(红色荧光，与A板相当) 和MAP2(红色荧光，与D板相当)的表达，和C和F板分别显示了A 和B板、D和E板的融合图像。在图中，图解比例尺表示100μm。
图7显示了从人胚胎干细胞制备的星形胶质细胞样细胞的照片。 板中显示了用抗GFAP抗体或抗MAP2抗体免疫染色，A板显示了 GFAP的表达(绿色荧光)，B板显示了MAP2的表达(红色荧光)，和C 板显示了A和B板的融合图像。在图中，图解比例尺表示100μm。
图8显示了使用来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基，从人胚胎干细胞分化的神经元(神经细胞)的照片。A和D板 显示了免疫染色细胞(绿色荧光表示hrGFP的组成型表达，以及实验中 使用的人胚胎干细胞(SA181hrG2细胞系)和来源于它们的细胞的定位) 的照片，和B和E板分别显示了βIII微管蛋白(红色荧光，与A板相 当)和MAP2(红色荧光，与D板相当)的表达，和C和F板分别显示了 A和B板、D和E板的融合图像。在图中，图解比例尺表示100μm。
图9显示了在细胞群中通过免疫染色检测到的III类β微管蛋白- 免疫阳性细胞，细胞群是人神经祖细胞在来源于人胚胎干细胞的星形 胶质细胞样细胞的条件培养基或N2培养基中培养14天而制备的。A 板表示使用N2培养基(N2)的情况和B板表示使用来源于人胚胎干细胞 的星形胶质细胞样细胞的条件培养基(hES-ACM)的情况。当使用N2培 养基时，在如A板所示的培养容器中稀稀拉拉地显示出如B板中观察 到的区域，使用hES-ACM时，如B板中观察到的，在培养容器整个 表面都可以看到神经元。在图中，图解比例尺表示100μm。
发明的最佳实施方式
本发明是基于以下出乎意料的现象：通过培养来源于胚胎干细胞 的星形胶质细胞样细胞所制备的条件培养基，可以用于神经细胞培养 或使胚胎干细胞分化为神经细胞，以及该培养基维持神经细胞培养或 诱导神经分化的能力等于或大于原代培养的星形胶质细胞的条件培养 基的能力。
本文使用的“星形胶质细胞样细胞”定义为从胚胎干细胞分化而 来的表达胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的细胞群。另一方面，“原代培 养的星形胶质细胞”是指表达GFAP的细胞群，它是通过用解离剂如 胰蛋白酶处理从活体提取的组织后，解离单个细胞获得的。因此，组 成该组织的各种类型细胞污染于这种原代培养的星形胶质细胞中。
除非另作说明，本文使用的“星形胶质细胞的条件培养基”是指 上述原代培养的星形胶质细胞的细胞培养上清液。
本发明的通过使胚胎干细胞分化制备的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基在本文中表述为“星形胶质细胞样细胞的条件培养基”或“来 源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基”。
有时，上述“星形胶质细胞的条件培养基”、本发明的“星形胶 质细胞样细胞的条件培养基”和本发明的“来源于胚胎干细胞的星形 胶质细胞样细胞的条件培养基”一般称作“条件培养基”或“本发明 的条件培养基”。
另外，本文使用的术语“神经细胞”包括神经干细胞、神经元(神 経細胞(ニュ一ロン))、神经胶质细胞(例如星形胶质细胞、少突神经胶 质细胞)等等。神经胶质细胞是指所有支撑神经元的细胞。
本发明的一个方面是提供一种制备来源于胚胎干细胞的星形胶质 细胞的条件培养基的方法，其特征在于培养通过胚胎干细胞分化所制 备的星形胶质细胞样细胞。根据本发明的方法，可以以简单方法稳定、 大量提供具有高效诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的有益性质的条件 培养基。根据本发明的方法，可以以简单方法长时间稳定、大量提供 具有有益健康地维持神经培养的有益性质的条件培养基。
本发明方法的一个特征是由胚胎干细胞分化的星形胶质细胞样细 胞在制备该条件培养基中的用途。本发明方法制备的条件培养基诱导 胚胎干细胞分化为神经细胞的能力，类似于或大于使用原代培养的星 形胶质细胞制备的条件培养基的能力。此外，使用本发明制备的条件 培养基，该技术可以避免使用原代培养的星形胶质细胞可能引起的问 题，即，由于星形胶质细胞所来源的活体的部分或年龄，不可避免的 除星形胶质细胞之外的细胞污染而引起的培养基性质或条件的变异， 并且可以制备具有基本上均质的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样 细胞的条件培养基。
本发明方法中使用的星形胶质细胞样细胞是通过使在某种条件下 具有不确定增殖潜力的胚胎干细胞分化而制备的，因此具有优越的生 产能力和质量稳定性。因此，本发明的方法允许大量提供稳定条件培 养基，并且与使用原代培养的星形胶质细胞的方法相比，在条件培养 基的制备中使用更有效。
还有，因为本发明的方法不使用原代培养的来源于活体的星形胶 质细胞，根据本发明的方法可以提供基本上不含来源于除靶动物外的 动物的细胞成分的、来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件 培养基。例如，根据本发明的方法提供的基本上不含非人细胞成分、 来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基。因此，例如， 使用来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞的条件培养基，可以用基本 上不存在非人细胞成分的方法从人胚胎干细胞制备人神经细胞。本发 明的方法可以应用于制备用于细胞移植治疗的更新再生医疗用药物和 利用灵长类动物细胞，尤其是人细胞开发新药。本发明的方法能够提 供基本上纯的灵长类动物，尤其是人的神经培养物，以及长时间稳定 培养纯神经细胞。
本发明方法中，根据目的不同使用的胚胎干细胞可以来源于任何 动物。具体而言，优选使用来源于哺乳动物的胚胎干细胞。更具体地 说，哺乳动物的实例可以包括小鼠、大鼠、貂、仓鼠、猪、猴(例如狨、 恒河猴、猕猴等等)和人。根据本发明的方法，为了制备用于制备或维 持待用于细胞移植治疗的神经元的条件培养基，从组织相容性的角度 而言，该方法中使用的胚胎干细胞可以优选来源于移植受体的细胞。 也就是说，当为制备或维持用于向人患者移植的神经细胞的目的制备 条件培养基时，优选在该方法中使用来源于受体的胚胎干细胞制备条 件培养基。
在本发明方法的一个实施方案中包含下述方法，其包括步骤：
(A)由胚胎干细胞制备星形胶质细胞样细胞，和
(B)培养由步骤(A)制备的所述星形胶质细胞样细胞，以提供培养 上清液。
更具体地说，所述步骤(A)可以包括但不限于下述步骤：
1)使用星形胶质细胞-条件培养基使胚胎干细胞分化为神经干细 胞，
2)使所述神经干细胞增殖，和
3)诱导所述增殖的神经干细胞选择性分化为星形胶质细胞样细 胞。
上述步骤1)中，胚胎干细胞分化为神经干细胞可以同时伴有例如 在星形胶质细胞-条件培养基中培养胚胎干细胞。任选，上述步骤1)中， 包含补充一些因子，如生长因素和细胞因子或化学性质上确定的组分 的基础培养基的合成培养基可以与所述星形胶质细胞-条件培养基或等 同于所述星形胶质细胞-条件培养基的培养基混合。
在本发明的方法中，一旦建立了来源于胚胎干细胞的星形胶质细 胞样细胞，通过培养所述来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞所 制备的星形胶质细胞样细胞-条件培养基就可以代替星形胶质细胞-条 件培养基来使用。本发明的星形胶质细胞样细胞-条件培养基可以使用 如此获得的本发明的星形胶质细胞样细胞-条件培养基连续制备。在本 发明的优选实施方案中，用步骤1’)替代步骤1)：
1′)使用来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞条件培养基使胚 胎干细胞分化为神经干细胞。
所述步骤1)和1′)中的分化可以通过例如，在悬浮培养基中培养该 细胞来诱导。
更具体地说，在所述步骤1)或1′)中，在悬液中培养胚胎干细胞的 整个未分化菌落以产生细胞球(所谓的“神经干球”；NSS)，其中优选 许多神经干细胞位于所述NSS表面上。本文使用的“神经干细胞”是 指分化为星形胶质细胞样细胞并且可被鉴定为表达例如nestin和 musashi等神经干细胞标记，以及例如A2B5等神经胶质细胞前体标记 的阳性细胞的前体细胞。
具有以细胞球(即NSS)不粘附于培养容器底部的方式维持稳定连 续悬浮培养物的适当形状和大小的任何培养容器均可以用在这个步骤 中。这种培养容器的实例包括用于悬浮培养的皿和用于细菌培养的平 皿。任选，所述培养容器可以涂布0.5重量％的琼脂，防止细胞球粘附 于底部。
悬浮培养的时间可以根据胚胎干细胞的类型决定。例如，可以根 据NSS表面上出现作为星形胶质细胞前体细胞的神经干细胞的出现决 定悬浮培养的时间。可以例如根据神经干细胞标记如nestin和musashi 或神经胶质细胞前体标记如A2B5的表达检测所述神经干细胞。此外， 可以通过使用免疫组织化学技术检测不成熟神经标记，如βIII微管蛋 白的表达来研究在悬浮培养基中诱导分化为神经细胞的效力。培养时 间的典型实例如下：对于小鼠胚胎干细胞，通常1-10天，优选大约4 天(例如3-5天)，对于灵长类动物(包括猴、人)胚胎干细胞，通常1-15 天，优选大约7天(例如5-8天)。
下一步是神经干细胞的增殖[步骤2]。在所述步骤2)中，在贴壁培 养体系中培养由上述步骤1)制备的神经干细胞本身或包括所述神经干 细胞的NSS。实施所述步骤2)使神经干细胞增殖。此外，当以如上方 式培养包括神经干细胞的NSS时，神经干细胞从所粘附的NSS迁移并 围绕NSS增殖。因此，通过实施所述步骤2)使大量神经干细胞增殖， 和从而在下列步骤3)中可以制备大量星形胶质细胞样细胞。
适于在上述步骤2)中的NSS贴壁培养中使神经干细胞增殖的培养 基例如，包括补充B27添加剂[Brewer，G.J.，Focus，16，6-9(1994)； Brewer，G.J.，J.Neurosci.Res.，35，567-576(1993)][Invitrogen Corporation，Catalog No：17504-044]和增殖/生长因子如碱性成纤维细 胞生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的DMEM∶F-12(1∶1)和的 neurobasalTM培养基(Invitogen Corporation)。具体而言，可以在贴壁 培养体系中使用含有B27添加剂、bFGF以及任选EGF的Neurobasal 培养基或含有N2添加剂、bFGF以及任选EGF的DMEM∶F-12(1∶1) 使神经干细胞增殖。
优选地，用于神经干细胞贴壁培养的培养容器涂布了MatrigelTM (BD Bioscience生产)、聚L-赖氨酸、层粘连蛋白等等，以便促进NSS 或在容器上移动和增殖的神经干细胞贴壁，以及维持神经干细胞的条 件稳定。
当使用MatrigelTM时，可以根据厂家的指导实施所述培养容器的 涂布。当使用另一种胞外基质时，可以用常规方法施行涂布。例如， 含有胞外基层的溶液可以应用于容器，以便培养容器底部被很好覆 盖，然后使容器放置一段时间或在37℃孵育。
在使用所述增殖/生长因子如bFGF和EGF的情况下，可以根据胚 胎干细胞的类型等适当地决定该因子的浓度。在bFGF的情况下，期 望的浓度是1-200ng/ml，优选20-40ng/ml。在EGF的情况下，期望的 浓度是10-50ng/ml，优选10-20ng/ml。可供选择地，在bFGF和EGF 混合使用的情况下，它们可以以10-20ng/ml bFGF和10-20ng/ml EGF 混合。
上述贴壁培养的时间可以根据胚胎干细胞所来源的动物种类、分 化程度等等来决定。
在上述步骤2)中，神经干细胞的进一步增殖可以通过以下方法来 完成，从培养容器分离移动和增殖的神经干细胞，使用细胞分散剂， 例如酶如胰蛋白酶、分散酶、胶原酶木瓜蛋白酶等等，EDTA或细胞 消化液[Gibco-Invitrogen]逐一解离细胞，然后在新鲜制备的培养体系 中传代培养解离的细胞。具体地说，例如，可以使用0.05-0.35重量％ 的胰蛋白酶分离移动和分化的神经干细胞并将其逐一解离。由此，可 以进一步传代培养和增殖解离细胞。
在该步骤中，可以任选从培养中除去位于细胞群中心的未分化胚 胎干细胞，以减少除神经干细胞以外的细胞，如未分化胚胎干细胞的 细胞污染，增加神经干细胞的丰度比。
接下来是诱导步骤2)中增殖的神经干细胞选择性分化为星形胶质 细胞样细胞的步骤[步骤3]。
选择性分化为星形胶质细胞样细胞的诱导条件可以根据起始胚胎 干细胞的类型确定。例如，可以用不含如bFGF和EGF的增殖/生长因 子的培养基替换所述步骤2)中使用的培养基来完成。
来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞可以通过实施上述步骤 (A)的步骤1)-3)被制备成包括表达GFAP的细胞的细胞群。
下一步是培养由步骤(A)制备的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞 样细胞的步骤，获得培养上清液[步骤(B)]。
在步骤(B)中，培养来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件没有限制，只要所述星形胶质细胞样细胞能够生存并且各种因子可 以从所述星形胶质细胞样细胞释放即可。当制备过程需要防止来源于 其他动物的细胞成分污染时，优选使用无血清培养基。具体地说，例 如，使用含N2添加剂(×1：5μg/ml胰岛素、10μg/ml转铁蛋白、63ng/ml 孕酮、16.11μg/ml腐胺和2ng/ml亚硒酸盐)的DMEM∶F-12培养基和在 37℃、5％CO2下培养细胞。
为了将星形胶质细胞样细胞产生的各种因子充分释放到培养基， 步骤(B)的培养时间可以根据动物种类、细胞数量等等决定。通常例如 可以是大约1天。
培养后，收获获得的培养上清液以得到条件培养基。具体地说， 离心全部培养物或培养上清液的一部分，然后使它通过具有适当孔径 大小的过滤器以除去细胞，可以获得无细胞的培养上清液形式的星形 胶质细胞样细胞的条件培养基。
当回收全部培养物且除去星形胶质细胞样细胞从而得到条件培养 基时，通过将步骤(B)使用的培养基和添加剂应用于从培养物中除去的 星形胶质细胞样细胞，和重复相同条件下的一系列步骤，可以重复制 备来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基。可供选择 地，当从培养物中回收一部分培养上清液时，通过将步骤(B)使用的培 养基和添加剂应用于培养残余物，和重复相同条件下的一系列步骤， 可以重复制备来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养 基。本发明的方法还包括如上所述的具体实施方案。
本发明方法制备的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞条件 培养基可有效用于诱导胚胎干细胞分化为神经细胞。此外，本发明方 法制备的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基可以 长时间稳定、健康地维持神经培养物。
本发明方法制备的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基可以通过测定维持神经培养物的能力和诱导胚胎干细胞分化 为神经细胞的能力来评价。
所述维持培养神经培养物的能力可以例如通过培养从活体获得的 原代神经元或从胚胎干细胞分化的神经元，然后随着时间的推移或每 隔一定间隔分析所培养神经元的情况(例如存活率和形态)来研究。所述 神经培养物可以在例如Neuroscience labomanual″The method for neuronal cell culture″，editorial supervisor：Hachiro Nakagawa，editor： Hiroshi Hatanaka，publisher，Springer-Verlag Tokyo，page 347(35) (1997.4.24)描述的条件下制备。
为了评价维持神经培养物的能力，可以在适当条件下在待评价的 条件培养基存在下培养神经元。根据细胞体、树突、轴突、生长锥等 等的存在或不存在评价神经元的形态。此外，例如，使用免疫组织化 学的探测来研究包括神经递质的受体、神经丝、酪氨酸羟化酶、谷氨 酸脱羧酶、胆碱乙酰转移酶的标记表达。如果检测到那些标记的表达 和观察到特定形态，则可以将所述条件培养基评价为能够维持健康神 经元的培养基。
本发明的另一个方面涉及根据本发明的方法制备的来源于胚胎干 细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基。本发明的来源于胚胎干细 胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基是从胚胎干细胞分化所制备的 星形胶质细胞样细胞的培养上清液获得的，因此，与原代培养的星形 胶质细胞的条件培养基相比，质量可能更稳定。此外，通过使用来源 于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基连同胚胎干细胞， 可以以基本上没有来自非靶动物的成分污染的方法制备神经细胞。因 此，通过使用本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基，可以提供基本上不含来自非靶动物的成分的仍是高质量的 神经细胞培养。由此提供的神经细胞培养物可以用于药物开发过程中 的筛选或细胞毒性评价。此外，它还可以用于制备再生治疗中用于移 植的高度相容细胞。
此外，使用本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞的条件培 养基，可以将胚胎干细胞高效分化为神经细胞。它还可以长时间维持 稳定、健康的神经培养物。
本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基 可以含有添加剂，包括N2添加剂[胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸盐、孕 酮；参见例如Bottenstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，76：514 (1979)]、白蛋白、上述抗氧化剂等等。本发明的来源于胚胎干细胞的 星形胶质细胞样细胞的条件培养基中所含添加剂的量可以根据使用目 的、待培养的细胞类型如胚胎干细胞或神经细胞，以及获得细胞的动 物种类来决定。上述N2添加剂中所含成分的浓度可以是，但不限于胰 岛素终浓度1-100μg/ml，优选3-20μg/ml，转铁蛋白终浓度1-100μg/ml， 优选3-20μg/ml，亚硒酸盐终浓度1-100nM，优选3-50nM，孕酮终浓 度1-100nM，优选20nM。
本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基 还可以含有适于细胞培养的一些因子，并且可根据使用目的、待培养 的细胞类型、获得细胞的动物种类等诱导所期望的分化。
此外，为了长时间维持细胞，如神经细胞的稳定培养，以及诱导 高效分化，所述本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的 条件培养基可以包含用于培养胚胎干细胞、神经干细胞等细胞的常规 基础培养基。所述来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培 养基和基础培养基之间的比例可以根据使用目的、待培养的细胞类 型、获得所述细胞的动物种类来决定。
来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基可以以冰 冻或冷藏保存。为了长时间储存本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶 质细胞样细胞的条件培养基，优选将其在-10℃--80℃冰冻保存。当冰 冻保存本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养 基时，应避免反复冻融，以防止负责所述培养基功能的各种蛋白因子 的活性降低。此外，还优选在冰箱中4-8℃保存培养基。
本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基 可以单独使用或作为试剂盒提供，该试剂盒包括该培养基，和例如， 用于培养胚胎干细胞、神经细胞或各动物种类细胞的合适因子或试 剂、用于诱导细胞分化的合适因子或试剂、涂有细胞粘附分子的培养 容器、适于悬浮培养的培养容器等等。
可以使用从本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的 条件培养基中鉴定和分离的各种功能活性物质(下文称作“功能成分”) 制备与本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养 基具有类似效果的培养基，以致该培养基含有有效量的功能成分。因 此，本发明的一个实施方案包括通过混合功能成分制备与本发明的来 源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基相比，具有类似 的培养神经细胞和诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的能力的功能培养 基。在该方法中，可以逐一提供功能成分并在使用前逐一混合。本发 明包括混合所述功能成分所制备的培养基。此外，所述功能成分包括 单独具有促进神经细胞培养和胚胎干细胞分化为神经细胞的能力的成 分。功能成分的这种单独用途也包括在本发明范围内。所述功能成分 可以单独或以它们中的至少2类的组合作为能够培养和/或维持神经细 胞和/或诱导胚胎干细胞分化为神经细胞的试剂提供。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种培养神经元的方法，其 特征在于使用来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基 进行培养。具体地说，在来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的 条件培养基存在下培养神经元。本发明的培养神经元的方法可以维持 基本上不含非来源于靶动物成分的成分的稳定、健康的神经培养物。
在本发明的培养方法中，用作神经元来源的动物种类可以包括但 不限于哺乳动物，如小鼠、大鼠、貂、仓鼠、猪、狗、绵羊、山羊、 猴和人。
根据本发明的培养方法，在所产生的神经元细胞培养物用于细胞 移植治疗的情况下，考虑到好的相容性，优选从来源于与待治疗动物 相同物种的胚胎干细胞制备来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞 的条件培养基。
本发明的培养方法可以应用于培养神经元的任何方法。
可以在神经元培养的合适条件下，在本发明的来源于胚胎干细胞 的星形胶质细胞样细胞的条件培养基存在下培养神经元。除使用来源 于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基之外的培养条件没 有特别的限制，可以在来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞的条件培养 基存在下，以含1×N2添加剂[5μg/ml胰岛素、100μg/ml转铁蛋白、 63ng/ml孕酮、16.11μg/ml腐胺和2ng/ml亚硒酸盐]的DMEM∶F-12培 养基培养来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞所得的培养上清 液，或在补充1×N2添加剂的本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细 胞样细胞的条件培养基中，于大约37℃(例如37±0.2℃)和大约5％CO2 包被聚L-赖氨酸、层粘连蛋白等等的培养容器中实施培养。
在另一个方面，本发明提供了将胚胎干细胞分化为神经细胞的方 法，其特征在于使用本发明方法制备的来源于胚胎干细胞的星形胶质 细胞样细胞的条件培养基作为培养基。胚胎干细胞分化为神经细胞例 如是在本发明方法制备的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的 条件培养基存在下诱导的。根据本发明的分化方法，可以制备不含来 源于除靶动物外的动物种类的成分的神经细胞。也就是说，在制备本 发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基时，使 用来源于与待培养神经细胞相同动物种类的胚胎干细胞。因此，优选 由本发明的诱导分化方法制备的神经细胞可以用于细胞移植治疗。此 外，本发明的诱导分化的方法在制备基本上不含非人成分，适于临床 应用于人患者，用作如神经细胞移植治疗的神经细胞具有优势。
本发明的诱导分化方法中使用的胚胎干细胞可以根据产生的神经 细胞的使用目的方便地选择。用作本发明诱导分化方法中所用胚胎干 细胞的来源的动物种类可以包括但不限于例如哺乳动物，如小鼠、大 鼠、貂、仓鼠、猪、狗、绵羊、山羊、猴、人等等。
本发明的诱导分化方法可以根据上述制备条件培养基的方法的步 骤(A)的步骤1′实施。
通过检测分化为神经细胞(神经元或神经胶质细胞)的能力、神经干 细胞标记的表达可以评价所制备的神经干细胞。
根据本方法，诱导胚胎干细胞分化为神经元可以如下完成：在来 源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基中实施胚胎干细 胞菌落的悬浮培养，以得到包含核心(中心)的未分化胚胎干细胞层和表 面上的许多神经干细胞层的细胞球(NSS)；在本发明的来源于胚胎干细 胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基存在下实施所述制备的NSS的 贴壁培养；在本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基存在下实施所述神经干细胞的贴壁培养。可以通过神经元标 记如神经丝、酪氨酸羟化酶、谷氨酸脱羧酶和胆碱乙酰转移酶的表达 鉴定所制备神经元。在该方法中可以使用的培养基，如本发明的来源 于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基，和所述条件培养 基可以与任何一种培养基，如DMEM∶F-12、DMEM、F-12、MEM、 NeurobasalTM等等混合，或补充更多的添加剂。可以在约5％CO2，如 4.8-5.2％，100％湿度的空气，约37℃，如37±0.2℃下进行培养。培养 时间可以根据胚胎干细胞所来源的动物种类决定，在小鼠的情况下， 期望它可以是1-7天，和在猴的情况下，是1-14天。
制备的细胞是否是神经元可以通过研究例如细胞的形态特征，包 括细胞体、树突、轴突、生长锥等等所证实。此外，可以通过研究标 记如神经丝、酪氨酸羟化酶、谷氨酸脱羧酶、胆碱乙酰转移酶等等或 其编码基因的表达来评价所制备的神经元。
根据本发明方法诱导从胚胎干细胞分化为神经胶质细胞可以通过 贴壁培养上述NSS或神经干细胞来完成。可以用于整个方法的培养基 包括但不限于DMEM∶F-12+N2添加剂(N2培养基)等等。培养时间可 以根据胚胎干细胞的类型决定，在小鼠胚胎干细胞的情况下，可以是 1-4天，和在猴胚胎干细胞的情况下，可以是1-4天。此外，所制备的 神经胶质细胞可以通过研究形态特征或神经胶质细胞的标记如星形胶 质细胞的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的表达来鉴定。
本发明诱导分化方法所制备的神经细胞可以在不存在来自非靶动 物的任何成分的情况下制备，例如不存在非人成分。因此，所述基本 上不含来自非靶动物的成分的神经细胞可以有效用于细胞移植治疗。 此外，根据本发明的诱导分化方法，使用来源于胚胎干细胞的星形胶 质细胞样细胞的条件培养基制备神经细胞。使用来源于所述动物例如 人的胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基诱导动物胚胎干 细胞的分化，可以提供与动物活体具有高相容性和基本上不含来自非 靶动物的成分的神经细胞。因此，本发明的神经细胞可以用于对靶动 物有用的药物开发的试验体系。本发明的神经细胞可以应用于神经系 统的再生治疗，对象是由神经退行性变或神经损害引起的疾病或病 情，例如神经退行性病变包括帕金森氏症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩 性侧索硬化；脑缺血、脱髓鞘疾病、颅脑损伤、脊髓损伤、中风等等； 在再生治疗中，将本发明的神经细胞导入观察到的神经退行性变区域 或神经损害区域。这种神经细胞也包括在本发明中。
实施例
现在参考下列实施例，其具体说明本发明，但下列实施例决不限 制本发明。在下列实施例中，“％”是指重量％，除非另作说明，而有 关CO2的“％”是指体积％。
实施例1
小鼠胚胎干细胞系，以通常的方式培养129SV细胞并在细胞接种3 天后，使用毛细管物理挑取细胞的整个菌落。所产生的菌落在悬液中、 37℃、5％CO2、使用诱导神经分化的培养基(其被用作原代星形胶质细 胞的条件培养基的替代品；产品编号MB-X9501、Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.)培养4天。制备了神经干球(NSS)，其包括3层：中心的未分 化胚胎干细胞层；表面的神经干细胞层：和两层之间的夹层。
然后，所述NSS铺在涂有聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿上并使用含 1×B27添加剂[目录号17504-044，Invitrogen Corporation；由市场上可 买到的X50产品调剂的]的NeurobasalTM培养基[目录号：21103-049， Invitrogen Corporation]，在37℃、5％CO2下培养，每天不断增加碱 性成纤维细胞生长因子(bFGF)至终浓度20ng/ml以使神经干细胞增 殖。上述涂有聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿是用10μg/ml层粘连蛋白[目 录号：L0001，Asahi Techno Glass Corporation]涂布市场上可买到的涂 有聚L-赖氨酸的皿3小时所制备的。
培养7天后，使用毛细吸管物理移除增殖细胞中心的未分化细胞 以便增加移动和增殖的神经干细胞的丰度比，然后，培养物在37℃、 5％CO2再孵育7天以使神经干细胞增殖。
此后，弃去培养基并用不含Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水洗涤细 胞，以便诱导神经干细胞选择性分化为星形胶质细胞样细胞，之后使 用0.05重量％的胰蛋白酶-EDTA解离增殖细胞。所述解离细胞在含N2 添加剂[5μg/ml胰岛素、100μg/ml转铁蛋白、6.3ng/ml孕酮、16.11μg/ml 腐胺、5.2ng/ml亚硒酸盐，目录号：17502-048，Invitrogen Corporation] 的DMEM∶F-12培养基中传代培养。
培养3天后，从所产生的培养物中除去上清液，通过22nm过滤器 [商品名：DISMIC-25CS，Advantech Co.，Ltd.]过滤，以提供来源于胚胎 干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基。向制备的星形胶质细胞 样细胞的条件培养基中补充1％终浓度(由上述的100×的N2添加物 配制)的N2添加剂，用于营养。
实施例2
为了制备用于研究培养神经元的能力的神经元，在室温下冻融冰 冻的小鼠胎儿皮质[神经元培养系统商品名[Sumitomo Bakelite制 造]：SHINKEISAIBOU CX(M)[目录号MB-X0305]]于细胞分散液[[目 录号MB-X9901]包含在神经元培养系统[Sumitomo Bakelite制造]中分 散]，以提供含来源于小鼠胎儿皮质的原代神经元的悬液。
然后，所述含来源于小鼠胎儿皮质的原代神经元的悬液在300rpm 离心1分钟，使用himac CF702[Hitachi制造]洗涤原代神经元。接着， 来源于小鼠胎儿皮质的原代神经元以1×105个细胞/ml悬浮于根据上述 实施例1制备的来源于小鼠胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件 培养基，并以0.5ml/孔将细胞铺在聚L-赖氨酸包被的24孔板[Sumitomo Bakelite Corporation制造]上，37℃、5％CO2下培养。每2天用新鲜 培养基替换一半培养基。对于对照，以与使用来源于小鼠胚胎干细胞 的星形胶质细胞样细胞的条件培养基相同的方式，在N2培养基中培养 来源于小鼠胎儿皮质的原代神经元。图1示出培养2天后细胞的形态。 在图1中，A和B板表明了使用N2培养基的情况，和C和D板表明 了使用来源于小鼠胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基的 情况。
如图1的C和D板所示，在使用来源于小鼠胚胎干细胞的星形胶 质细胞样细胞的条件培养基的情况下，观察到神经突的很好贴壁和延 伸。另一方面，如A和B板所示，在使用N2培养基的情况下，观察 到神经突的细胞贴壁不足且贴壁细胞很少延伸。
在培养第4天，从培养物中除去培养基。向培养细胞中添加4重 量％的仲甲醛和细胞在室温下孵育5分钟。然后，向产生的混合物中 添加1ml的0.1％TritonTM-X，混合物再孵育5分钟。向产生的混合物 中添加1重量％的正常山羊血清，混合物在室温下再孵育30分钟进行 封闭。
向封闭细胞中添加用1重量％的正常山羊血清稀释的抗GFAP抗 体[目录号：AB5804，CHEMICON]和抗MAP2抗体[目录号：442695， CALBIOCHEM]，混合物在4℃的孵育过夜以进行反应。然后，用无 Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞，向细胞中添加二抗[商品名： Alexa Fluor 488；Molecular Probe]并在室温下孵育30分钟以进行反 应。接着，根据所述二抗的荧光分别检测细胞中胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)和MAP2的表达。图2提供了免疫染色结果。在该图中，A板 显示了使用N2培养基的情况，和B板显示了使用来源于小鼠胚胎干细 胞的星形样细胞的条件培养基的情况。
如图2所示，在使用来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的 条件培养基的情况下，观察到MAP2的高表达，而在细胞中几乎观察 不到GFAP的表达。该结果表明使用来源于胚胎干细胞的星形胶质细 胞样细胞的条件培养基，仅神经元细胞很好增殖。另一方面，如图2 的A板所示，使用N2培养基的培养物既不产生GFAP阳性细胞，也 不产生MAP2阳性细胞。
此外，在培养第2天，用含1×B-27添加剂[Invitrogen Corporation] 的NeurobasalTM培养基替换上述实施例1制备的一些培养物中的条件 培养基，细胞在37℃、5％CO2再孵育10天以评价来源于胚胎干细胞 的星形胶质细胞样细胞的条件培养基对长期培养的效果。
该结果表明从培养开始使用N2培养基培养的细胞在第5天死亡。
图3显示了使用来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件 培养基和含B-27添加剂的NeurobasalTM培养基的细胞培养第8天的情 况，和图4显示了其第10天的情况。在每个图中，A和B板显示了在 补充B-27添加剂的NeurobasalTM培养基中培养的细胞，和C和D板 显示了在来源于小鼠胚胎干细胞的星形样细胞的条件培养基中培养的 细胞。
如每个图C和D的C和D板所示，在第10天，源于胚胎干细胞 的星形胶质细胞样细胞的条件培养基培养的神经细胞在神经元之间保 持着密集的网络。
另一方面，使用含B-27添加剂的NeurobasalTM培养基培养的神经 细胞从第7天开始死亡，和如图3的A和B板所示，大多数细胞在第8 天死亡，如图4的A和B板所示，所有细胞在第10天死亡。
这些结果表明使用来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条 件培养基，神经元，如原代神经元可以在体外长时间稳定维持。过去， 难以以健康的状况长时间维持神经元。
实施例3
如下研究上述实施例制备的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样 细胞的条件培养基诱导小鼠胚胎干细胞分化为神经元的能力。
使用常规方法培养小鼠胚胎干细胞系129SV细胞3天，以便形成 大且成熟菌落。使用毛细吸管挑取细胞菌落，和在37℃、5％CO2下， 分别在上述实施例1制备的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞 的条件培养基和作为对照的N2培养基中悬浮培养4天。
此后，所产生的菌落在包被聚L-赖氨酸的皿(Asahi Techno Glass Corporation)上，37℃、5％CO2培养7天，使用各自培养基，以便菌 落分化为神经细胞。
用抗IIIβ微管蛋白(TuJ)抗体免疫染色研究所产生的细胞群中βIII 类微管蛋白的表达，以研究从小鼠胚胎干细胞分化为神经元的程度(即 神经分化菌落的数量)。
结果如表1所示。在该表中，ESACM表示来源于胚胎干细胞的星 形胶质细胞样细胞的条件培养基，N2表示N2培养基。在该表中，括 号中的数值表示根据公式：(阳性菌落的总数/挑取菌落的数量)×100(％) 计算的阳性细胞数量的比例。
[表1] 培养基   挑取菌落   的数量   接种细胞的   数量       表达βIII微管蛋白的菌落数量   阳性菌落   的总数     ++     +     +- ESACM   105   82(78)     25(24)     20(19)     9(9)   54(51) N2   105   46(44)     3(3)     4(4)     11(10)   18(17)
如表1所示，在使用根据实施例1制备的来源于胚胎干细胞的星 形胶质细胞样细胞的条件培养基的情况下，阳性菌落的比例是51％。 清楚地表明所述星形胶质细胞样细胞的条件培养基具有足够的能力诱 导胚胎干细胞分化为神经细胞。
此外，使用根据上述实施例1制备的来源于胚胎干细胞的星形胶 质细胞样细胞的条件培养基分化的神经干细胞的增殖能力通过以下方 法测定，即在37℃、5％CO2下在NeurobasalTM培养基[Invitrogen Corporation]中培养该细胞，并在显微镜[Nikon Corporation，商品名： ECLIPSE TE2000-U]下观察所产生的细胞。
该结果表明使用根据实施例1的来源于胚胎干细胞的星形胶质细 胞样细胞的条件培养基而分化的神经干细胞具有良好增殖能力。
此外，在使用根据实施例1的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞 样细胞的条件培养基培养所述增殖的神经干细胞7天后，细胞用MAP2 免疫染色和显微镜观察，以研究细胞分化为神经元的程度。
该结果表明所述增殖细胞分化为具有神经元形态的细胞并且大多 数细胞是MAP2阳性的。因此，提示使用根据实施例1制备的来源于 胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基而获得的神经干细胞 具有增殖和分化的潜力。
使用来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基，在 适于猴细胞的条件下，用与实施例2所述相同方法，将猴胚胎干细胞 系CMK6细胞分化为神经细胞。表2显示了结果。在该表中，ESACM 表示来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基和N2表 示N2培养基。
[表2] 培养基   挑取菌落   的数量   接种细胞的   数量        表达βIII微管蛋白的菌落数量   阳性菌落   的总数     ++     +     +- ESACM   40   27(68)     17(43)     5(13)     4(10)   26(65) N2   40   16(40)     6(15)     5(13)     3(8)   14(35)
如表2所示，该结果清楚地表明来源于胚胎干细胞的星形胶质细 胞样细胞的条件培养基具有足够的能力诱导猴胚胎干细胞分化为神经 细胞。此外，用与小鼠胚胎干细胞相同的方法研究获得的细胞的增殖 潜力并证实制备的猴神经干细胞具有良好的增殖潜力。
实施例4
使用常规方法培养猕猴ES细胞系CMK6细胞，在细胞接种后3 天，使用毛细管物理挑取细胞的菌落。所产生的菌落使用含20ng/ml bFGF的用于神经元培养的培养基(Sumitomo Bakelite：目录号：MB- X9501，用作原代星形胶质细胞培养的条件培养基的替代培养基)，在37 ℃、5％CO2下，悬液中培养10天以制备神经干球(NSS)。在悬浮培养 10天的过程中，每天向所述悬浮培养物中添加终浓度20ng/ml的碱性 成纤维细胞生长因子(bFGF)。
然后，所述NSS铺在聚L-赖氨酸/层粘连蛋白包被的皿上，使用含 1×B27添加剂[目录号：17504-044，Invitrogen Corporation，由市场上 可买到的×50产品调剂]的NeurobasalTM培养基[目录号：21103-049， Invitrogen Corporation制造]培养，和在37℃、5％CO2下贴壁培养7 天，每天添加终浓度20ng/ml的bFGF和表皮生长因子(EGF)以使神经 干细胞增殖。
上述包被聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿是用10μg/ml层粘连蛋白[目 录号：L0001，Asahi Techno Glass Corporation]涂布市场上可买到的涂 有聚L-赖氨酸的皿[IWAKI，Asahi Techno Glass Corporation]3小时所 制备的。
培养7天后，使用毛细管将增殖细胞的中心部分物理转移到包被 聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿上，然后，使用含×1G-5添加剂的[目录 号：17503-012，Invitrogen Corporation；×100产品]Dulbecco改良Eagle 培养基(DMEM)[目录号：11960-069，Invitrogen Corporation](以下简 称为G-5培养基)继续培养细胞。在37℃、5％CO2下继续培养7天。 在上述培养过程中，每天添加终浓度20ng/ml的bFGF和EGF。
在培养7天时，使用毛细管物理移除增殖细胞的中心部分，剩余 细胞再培养7天。
然后，弃去G-5培养基，用无Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水洗涤 细胞，接着用0.05重量％的胰蛋白酶/EDTA解离所述细胞。使用G-5 培养基再次在包被聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿上培养所产生的解离 细胞(增殖的神经干细胞)10天，以诱导分化为星形胶质细胞样细胞。
图5示出用抗GFAP抗体[目录号：AB5804，CHEMICON Corporation]和抗MAP2抗体[目录号：442695，CALBIOCHEM Corporation]以常规方式对上述方法制备的来源于猴胚胎干细胞的培 养物免疫染色的结果。在该图中，A板显示了GFAP的表达，B板显 示了MAP2的表达，C板显示了A和B板的融合图像。
培养容器中的大多数细胞是星形胶质细胞样细胞(GFAP阳性)，容 器中几乎没有MAP2阳性的神经元。因此，该结果显示制备了高纯度 和同源的猴星形胶质细胞样细胞。
然后，用N2培养基(即补充了1×N2添加剂的DMEM/F-12培养 基)替换该培养基并继续培养。2-4天后，从培养物中回收上清液，和 用22nm过滤器[商品名：DISMIC-25CS，ADVANTEC]过滤上清液以获 得来源于猴胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基。
然后，向所述来源于猴胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件 培养基中补充分别得到×1浓度的量的N2添加剂[目录号：17502-048， Invitrogen Corporation；×100产品]或B-27添加剂[目录号：17504-044， Invitrogen Corporation；×50产品]，研究该培养基诱导胚胎干细胞分 化为神经元和长时间稳定培养神经元的能力。
实施例5
研究根据实施例4制备的来源于猴胚胎干细胞的星形胶质细胞样 细胞的条件培养基诱导CMK6-G4细胞系(稳定表达hrGFP基因的细胞 系)分化为神经元的能力。
使用常规方法培养CMK6-G4细胞系，在细胞接种后3天，使用毛 细管物理挑取细胞菌落。获得的菌落在37℃、5％CO2下，使用含 20ng/ml bFGF的来源于猴胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培 养基(根据实施例4制备的)悬浮培养10天，以得到神经干球(NSS)。在 悬浮培养10天的过程中，每天向该悬浮培养物中添加终浓度20ng/ml 的bFGF。
然后，获得的NSS铺在包被聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿上并使用 相同的来源于猴胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基培 养，和在37℃、5％CO2贴壁培养14天，以诱导NSS分化为神经细胞。 在显微镜下观察到许多神经突。
为证实猴胚胎干细胞分化为神经元，分别用抗βIII微管蛋白(Tuj) 抗体[目录号：MAB1637，CHEMICON Corporation]和抗MAP2抗体[目 录号：442695，CALBIOCHEM Corporation]以常规方式免疫染色该细 胞，评价所制备细胞群中III类β微管蛋白和MAP2的表达。结果如图 6所示。
如图6所示，可见当使用来源于猴胚胎干细胞的星形胶质细胞样 细胞的条件培养基时，许多细表达βIII微管蛋白或MAP2的胞(神经元) 被诱导。
这些结果表明来源于猴胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件 培养基具有诱导猴胚胎干细胞分化为神经干细胞的能力，并且也具有 高效诱导神经干细胞分化为神经元的能力。
另一方面，在对照组中，在N2培养基(即用于制备条件培养基的 基础培养基)和B27培养基(即含B-27添加剂的NeurobasalTM培养基) 用在培养基中时，可能由于自发分化，观察到仅有少许神经元，并且 没有鉴定到实质诱导分化为神经元(数据未显示)。
实施例6
以常规方式培养人ES细胞系SA181细胞，在细胞接种后3天，在 毛细管物理挑取细胞菌落。获得的菌落在37℃、5％CO2下悬浮培养 12天，使用用于神经元培养的含20ng/ml bFGF的培养基[Sumitomo Bakelite Co.，Ltd.：目录号：MB-X9501，用作原代星形胶质细胞的条件 培养基的替代培养基]以制备神经干球(NSS)。在悬浮培养过程中，每 天向该悬浮培养物中添加终浓度20ng/ml的bFGF。
然后，所述NSS铺在包被聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿上并使用含 1×B-27添加剂[目录号：17504-044，Invitrogen Corporation，从市场上可 买到的×50产品调剂]的NeurobasalTM培养基[目录号：21103-049， Invitrogen Corporation]培养，和在37℃、5％CO2下贴壁培养7天， 分别添加终浓度20ng/ml的bFGF和EGF，以诱导神经干细胞增殖。
此外，上述涂有聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿是用10μg/ml层粘连 蛋白[目录号：L0001，Asahi Techno Glass Corporation]涂布市场上可 买到的涂有聚L-赖氨酸的皿[IWAKI，Asahi Techno Glass Corporation]3小时所制备的。
培养7天后，使用毛细管将增殖细胞的中心部分物理转移到包被 聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿上，然后，使用含×1G-5添加剂的[目录 号：17503-012，Invitrogen Corporation；×100产品]Dulbecco改良Eagle 培养基(DMEM)[目录号：11960-069，Invitrogen Corporation](以下简 称为G-5培养基)继续培养细胞。在37℃、5％CO2下继续培养细胞7 天。在上述培养过程中，每天添加终浓度20ng/ml的bFGF和EGF。
在培养7天时，使用毛细管物理移动增殖细胞的中心部分，剩余 细胞再培养7天。
然后，弃去G-5培养基，用无Ca2+和Mg2+的磷酸盐缓冲盐水洗涤 细胞，接着用0.05重量％的胰蛋白酶/EDTA解离所述细胞。使用G-5 培养基再次在包被聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿上培养所产生的解离 细胞(增殖的神经干细胞)14天，以诱导分化为星形胶质细胞样细胞。
图7示出用抗GFAP抗体和抗MAP2抗体对上述方法制备的来源 于人的胚胎干细胞的培养物免疫染色的结果。
如图7所示，培养容器中的大多数细胞是星形胶质细胞样细胞 (GFAP阳性)，容器中几乎没有MAP2阳性的神经元。因此，该结果显 示制备了高纯度和同源的星形胶质细胞样细胞。
然后，用N2培养基(即补充×1 N2添加剂的DMEM/F-12培养基) 替换该培养基并继续培养细胞。2-4天后，从培养物中回收上清液，和 用22nm过滤器[商品名：DISMIC-25CS，ADVANTEC]过滤上清液以获 得来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基。
然后，向所述来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件 培养基中补充×1 N2添加剂[目录号：17502-048，Invitrogen Corporation；×100产品]或B-27添加剂[目录号：17504-044，Invitrogen Corporation；×50产品]。
实施例7
评价根据实施例6制备的来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞样 细胞的条件培养基诱导SA181hrG2细胞系(稳定表达hrGFP基因的细 胞系；其被设计成产生绿色荧光以促进鉴定细胞的)分化为神经元的能 力。
以常规方式培养SA181hrG2细胞系，在细胞接种后3天，在毛细 管物理挑取细胞菌落。获得的菌落在37℃、5％CO2下悬浮培养12天， 使用含20ng/ml bFGF的来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的 条件培养基(根据实施例6制备的)以制备神经干球(NSS)。在悬浮培养 12天过程中，每天向该悬浮培养物中添加浓度达20ng/ml的bFGF。
然后，所述NSS铺在包被聚L-赖氨酸/层粘连蛋白的皿上并使用上 述来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件培养基培养，在 37℃、5％CO2下贴壁培养14天，以诱导NSS分化为神经细胞。在获 得的培养物中，显微镜下观察到很多神经突。
为证实是否人胚胎干细胞分化为神经元，分别用抗βIII微管蛋白 (Tuj)抗体[目录号：MAB1637，CHEMICON Corporation]和抗MAP2 抗体[目录号：442695，CALBIOCHEM Corporation]以常规方式免疫染 色所得细胞，评价所制备细胞群中III类β微管蛋白和MAP2的表达。 图8显示了结果。
如图8所示当使用来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的 条件培养基时，许多神经元(即表达βIII微管蛋白或MAP2的细胞)被 诱导。
这些结果表明来源于人胚胎干细胞的星形胶质细胞样细胞的条件 培养基具有诱导人胚胎干细胞分化为神经干细胞的能力，并且也具有 高效诱导神经干细胞分化为神经元的能力。
另一方面，在对照组中，在N2培养基(即用于制备条件培养基的 基础培养基)和B27培养基(即含B-27添加剂的NeurobasalTM培养基) 用在培养基中时，可能由于自发分化，观察到仅有少许神经元，并且 没有鉴定到实质诱导分化为神经元。
此外，当使用根据实施例6制备的来源于人胚胎干细胞的星形胶 质细胞样细胞的条件培养基培养源自各种来源的神经元培养物，包括 来源于小鼠胎儿皮质的原代培养神经元[目录号：MB-X0305： SHINKEISAIBOU CX(M)，Sumitomo Bakelite Co.，Ltd]时，维持了人 正常神经前体细胞[产品编号：PT-2599 Cambrex Corporation]，和来源 于人胚胎干细胞的神经元、神经元细胞，并且在显微镜下观察到很多 神经突。上述结果类似于实施例2中所示的结果。
图9显示关于人神经前体细胞的结果。当使用N2培养基(即用于 制备条件培养基的基础培养基)培养时，在培养容器中稀稀拉拉地可见 如A板中所示的区域。另一方面，当使用hES-ACM时，在培养容器 整个区域都可以发现很多神经元，因此可以理解hES-ACM具有极好的 培养神经元的能力。
实施例8
使用小鼠星形胶质细胞细胞系KT-5细胞(GFAP阳性；人类科学 研究资料库的资源号：IFO50161)，用与上述方法类似的方法制备条件 培养基。研究所述条件培养基诱导ES细胞分化为神经元和长时间稳定 培养神经元的能力。
使用含10％胎牛血清的Nutrient Mixture F-12 HAM培养基(目录 号N8641；SIGMA Co制造)以常规方式传代培养小鼠KT-5细胞。当 培养达到70％融合时，用含×1 N2添加剂的DMEM/F-12培养基替换 该培养基。再培养2-4天后，从培养物中回收上清液，并用22nm过滤 器[商品名：DISMIC-25CS，ADVANTEC]过滤以提供小鼠KT-5细胞的 条件培养基。
然后，向所述条件培养基补充×1 N2添加剂[目录号：17502-048， Invitrogen Corporation；×100产品]或×1B-27添加剂[目录号： 17504-044，Invitrogen Corporation；×50产品]，并研究诱导小鼠胚胎 干细胞分化为神经细胞的能力和长时间稳定体外培养神经元的能力。
然而，据发现KT-5细胞的条件培养基既不能长时间稳定培养神经 元，又不能高效诱导胚胎干细胞分化为神经细胞。
这个结果给了我们一个实例，该实例表明不能保证每个GFAP阳 性细胞(即星形胶质细胞)的每种条件培养基都可以用于长时间稳定培 养神经元或诱导胚胎干细胞分化为神经细胞(即通过培养一种类型的星 形胶质细胞所制备的条件培养基不一定具有与来源于胚胎干细胞的星 形胶质细胞样细胞的条件培养基具有相同的能力)。
上述实施例清楚表明本发明的来源于胚胎干细胞的星形胶质细胞 样细胞的条件培养基具有维持长时间稳定的神经元培养和诱导胚胎干 细胞分化为神经细胞等等的用途。
工业实用性
根据本发明，可以稳定和轻易地提供大量星形胶质细胞样细胞的 条件培养基。该条件培养基能够稳定制备神经细胞、工业制备神经细 胞；长时间稳定培养神经元；高效诱导胚胎干细胞分化为神经细胞； 工业规模提供通过诱导胚胎干细胞分化为神经细胞而制备的神经细胞 等等。因此，本发明使轻易提供大量高质量神经细胞成为可能。此外， 因为本发明可以在基本上不存在来自非靶动物的任何细胞成分条件下 维持或制备神经细胞，所以本发明能够提供与活体具有高相容性的适 于移植治疗等等的材料。
[专利文件1]日本专利申请No.JP-A-9-289891
[专利文件1]日本专利申请No.JP-A-9-322765
[非专利文件1]Takashi Nakayama等，Neuroreport.2004 Mar 1；15(3)：487-91.″Efficient production of neural stem cells and neurons from embryonic stem cells″
[非专利文件2]Takashi Nakayama等，Neurosci Res.2003 Jun；46(2)：241-9.″Astrocyte-derived factors instruct differentiation of embryonic stem cell into neurons″
[非专利文件3]Bottenstein JE等，Proc Natl Acad Sci USA.1979 Jan；76(1)：514-7.″Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium″
[非专利文件4]Brewer GJ等，Brain Res.1989 Aug 7；494(1)：65-74. ″Survival and growth of hippocampal neurons in defined medium at low density：advantages，technique or low oxgen″