[0001] I型糖尿病是由于胰腺的β细胞不能分泌足够胰岛素引起的广泛代谢紊乱。大部分细胞类型吸收葡萄糖都需要胰岛素，并且胰岛素产量不足造成葡萄糖吸收的降低和血糖水平的提高。不经合适治疗，糖尿病能致死。尽管能拯救生命，胰岛素治疗经常不提供对血糖的充分控制以防止所述疾病导致短命的并发症，并且这能深入研究实现和维持血糖量正常的更好的方法。在提出的更新的治疗策略中，移植获自其他人或动物的胰腺β胰岛细胞在世界范围内取得了巨大关注。这是因为胰岛细胞移植不仅能恢复胰岛素分泌单元，也能恢复响应朗格汉斯岛内外所产生多种神经和体液信号的胰岛素释放的精确调节。

[0002] 自从第一个试图通过移植同种异体移植供体胰岛来缓解I型糖尿病的实验以来，所述领域受到对改善从供体胰岛收回和/或获得胰岛方法需求的挑战。世界范围内对进一步开发通过移植胰岛治疗I型糖尿病的概念作出巨大努力，但是在动物模型中开发的所述技术的临床应用充满挑战。

[0003] 所述胰岛的来源是首要关注问题，并且从供体胰腺分离需要与供体器官的来源、供给和病症有关问题的解决方法。就这个目的而言认为依赖于人体器官的充足够供应是无用的，从而积极地寻找替代来源(Bonner-Weir,S.等,New sources of pancreatic β-cells（《胰腺β细胞的新来源》）,Nat.Biotechnol.23:857–861,2005;Hering,B.J. 等 ,Prolonged diabetes reversal after intraportal xenotransplanation of wild-type porcine islets in immunosuppressed nonhuman primates（在免疫抑制非人灵长类动物中野生型猪胰岛的门静脉内异种移植后延长了糖尿病的复发）,Nat.Med.,12:301–303,2006;Inada,A.;Bonner-Weir,S.等,How can we get moreβcells?（《我们如何能取得更多的β细胞》）,Curr.Diab.Rep.,6:96–101,2006)。

[0004] 认为多种哺乳动物是异种胰岛移植的最佳候选。对有潜力的哺乳动物而言，出于很多强有力的理由，认为猪是选择异种胰岛移植的供体物种。猪与人共有很多生理相似性，并且很多年来猪胰岛素显示了临床功效。猪作为食物来源饲养，并且通过在控制环境下饲养以确保猪胰岛异种移植安全性的而提供符合伦理的供体胰岛来源。然而，很多实验室在过去10多年的经验显示相较分离人体(Kenmochi,T.等,Improved quality and yield of islets isolated from human pancreas using two-step digestion method（《使用两步消化方法从人胰腺分离胰岛的质量和产率的提高》）,Pancreas20:184–190,2000)、牛(Figliuzzi,M.等,Influence of donor age on bovine pancreatic islet isolation（《供体年龄对牛胰岛分离的影响》）,Transplantation,70:1032–1037,2000)或啮齿动物胰岛(Shapiro,A.M.等,High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion—a comparison with standard technique（《管内胶原酶和静止消化的啮齿动物胰岛的高产率—与标准技术比较》）,Cell Transplant.,5:631–638,1996)，分离猪胰岛似乎更加困难(Finke,E.等,Large scale isolation,function,and transplantation of islets of Langerhans from the adult pig pancreas（《成年猪胰腺的朗格汉斯岛的大规模分离、功能和移植》）.Transplant.Proc.23:772–773,1991;Giannarelli,R.等,Preparation of pure,viable porcine and bovine islets by a simple method（《通过简单方法制备纯的、可变的猪和牛胰岛》）.Transplant.Proc.,26:630–631,1994;Marchetti,P.等,Automated largescale isolation,in vitro function and xenotransplantation of porcine islets of Langerhans（《猪朗格汉斯岛的自动大规模分离、体外功能和异种移植》）,Transplantation52:209–213,1991;O’Neil,J.J.等,The isolation and function of porcine islets from market weight pigs（《上市体重猪的猪胰岛的分离和功能》）.Cell Transplant.,10:235–246,2001;Toso,C.等,Isolation of adult porcine islets of Langerhans（《成年猪朗格汉斯岛的分离》）.Cell Transplant.,9:297–305,2000)。

[0005] 例如，猪胰岛不太紧凑，并且在分离过程和体外培养的延长期内易于片段化(Ricordi,C.等,A method for the mass isolation of islets from the adult pig pancreas（从成年猪胰腺大量分离胰岛的方法）,Diabetes,35:649–653,1986)。另外，数个组记载了供体猪的年龄、甚至品系显著影响胰岛分离过程，证明小的所谓上市大小猪(<6月龄)特别难以作为可移植胰岛的来源(Bottino,R.等,Isolation outcome and functional characteristics of young and adult pig pancreatic islets for transplantation studies（《对移植研究的年轻和成年猪胰岛的分离结果和功能特 性》）,Xenotransplantation,14:74–82,2007;Dufrane,D. 等 ,Impact of porcine islet size on cellular structure and engraftment after transplantation:Adult versus young pigs（《猪胰岛大小对细胞结构和移植后植入的影响:成年对比年轻猪》）,Pancreas30:138–147,2005;Toso,C.等,Isolation of adult porcine islets of Langerhans（《成年猪朗格汉斯岛的分离》）.Cell Transplant.,9:297–305,2000)。成年猪(>2岁龄)胰岛不仅提供更高的产率，也保留了在分离和培养过程中保持完整形态的能力，以及移植后更高的功能特性。尽管很多组在试图从年轻猪中分离胰岛时遇到了挑战，但上市体重供体猪(<80kg=<12月龄)优于退役的种畜(>200kg=>2岁龄)，这是由于其丰富性、更低的动物和饲养成本，并且其更适合符合异种移植供体组织的调控准则。如果通过培养更易得来源的供体胰岛以扩大胰岛细胞(包括但不必限于β细胞)的供给，其可以不太紧凑，并且在细胞培养中可以显示或不显示片段化属性(例如获自年轻猪的胰岛)，这种新的胰岛来源可以提供足够材料用于胰岛素依赖性糖尿病的新治疗。

[0006] 然而，尽管为改善胰岛分离和制备技术作出很多努力，所述领域受到包含少于5%内分泌组织腺体的酶消化局限性和异常变化的限制。因此，从单个供体胰腺中收集胰岛产生的胰岛量经常不足以逆转受体的糖尿病，从而经常必需考虑多个供体以治疗单个受体。用于缓解对人胰腺供给不足的需求的异种移植潜能依赖于从来源胰腺分离和制备胰岛技术的功效和效率的提高(Hering,B.J.等,The International xenotransplantation Association consensus statement on conditions for undertaking clinical trials of porcine islet products in type1diabetes—executive summary（国际异种移植协会关于对I型糖尿病中猪胰岛产物进行临床试验的条件的共识声明—执行摘要）,Xenotransplantation16:196–202,2009)。发明内容

[0007] 本发明提供了制备胰岛群和胰岛的新方法，所述胰岛群可包含异质或均质的pancreatite，所述胰岛可包含从这种方法制备的pancreatite。在实施方式中，所述胰岛可包含"pancreatite"。在实施方式中，本发明方法包含用例如酶消化破坏胰腺和/或其部分，和培养基中接种包含胰岛的经回收细胞产物，所述培养基包含至少可检测量的内分泌组织和/或外分泌组织，例如获自供体胰腺的内分泌组织和/或外分泌组织。

[0008] 本发明的新方法能获得、制备和/或培养足够质量和数量的胰岛以努力符合上面需要(即使供体组织生成的胰岛在细胞产物分离过程和延长的体外培养期中可能不成熟、不太紧凑和/或易于片段化，例如年轻的、获自所谓上市大小猪的胰岛，<6月龄)。本发明的新方法生成可以包含后面称为“pancreatite”结构的新胰岛组合物。本发明的"pancreatite"可以在培养中形成，并且包含胰岛(内分泌)和/或外分泌组织的组合。

[0009] 在下面详细描述的实施方式中描述了本发明的其他特性和优势，并且其从实施方式中显而易见。

[0010] 附图简要说明

[0011] 图1显示了通过用于插管腹腔干(CT)和肠系膜上动脉(SMA)的降主动脉片段切割的胰腺；

[0012] 图2包含的图片显示了 机器上猪胰腺的低体温灌注保存；更低的图显示了 的原理特性；中间图显示装入灌注盒中和通过环形密封套管钩住灌注入口的猪胰腺的细节；这个专有的套管能以环形密封套管中夹住的主动脉贴片方式同时灌注腹腔干(CT)和肠系膜上动脉(SMA)(见圆形小图)；所述小图显示了通过环形密封套管开口暴露以观察的主动脉贴片(AP)上CT和SMA的开口；

[0013] 图3是第0天分离后非培养的幼猪胰岛的光学显微图;

[0014] 图4A-H的光学显微图显示了在培养过程的不同阶段中包含胰岛的经培养细胞产物；胰岛由双硫腙染色鉴定，并且与显示灰-褐色的未染色外分泌组织相反，显示紫-红色，A=24小时(x100)、B=24小时(x100),C=48小时(x100)、D=48小时(x200)、E=5天(x100)、F=6天(x100)、G=6天(x200)、H=6天(x100);和

[0015] 图5显示给予裸小鼠包含pancreatite的猪胰岛的活力测试的数据，所述猪胰岛从HMP灌注24小时后保存的胰腺分离。

[0016] 本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代形式，除非文中另有明确说明。因此，例如，提及“细胞”指的是一种或多种细胞，并且包含本领域技术人员所知的其等同物，等等。

[0017] 术语"pancreatite"指例如外分泌材料存在时，在分散胰岛的培养中形成的成熟的和/或不成熟的胰岛聚集物。

[0018] 术语"小分子"指例如核酸、肽、多肽、氨基酸、糖、脂质或其他有机或无机分子。

[0019] 本文使用的术语"水肿"指例如细胞、组织或浆膜腔中积累的过量水状液。

[0020] 本文使用的术语"器官"、"组织"、"供体器官"和"供体组织"指任何天然或工程改造的器官或组织，例如胰腺或其片段或部分。

[0021] 本文使用的术语"灌注"指液体流过组织。灌注器官和灌注的技术描述于例如Fahy等的美国专利号5,723,282，其全文纳入本文。

[0022] 本文使用的术语"培养"指将细胞维持于其能增殖、保留其功能状态的条件下。例如，培养的胰岛增殖并且保留其胰岛素生成的能力。细胞能在包含合适生长因子（如生长因子混合物）的生长培养基中培养。

[0023] 涉及胰岛使用的术语"自体"指获自个体的包含胰岛的细胞产物，所述个体根据本发明方法培养后给予可包含pancreatite的胰岛。

[0024] 涉及胰岛使用的术语"异源"指获自不同个体的包含胰岛的细胞产物,所述不同个体与根据本发明方法培养后给予可包含pancreatite胰岛的个体不同。

[0025] 本发明提供了制备胰岛群和胰岛的新方法，所述胰岛群可包含异质或均质的pancreatite，所述胰岛可包含从这种方法制备的pancreatite。在实施方式中，所述胰岛可以包含"pancreatite"。在实施方式中，本发明的方法包含用例如酶消化破坏包含胰岛的胰腺和/或供体组织，和在培养基中接种包含胰岛的经回收细胞产物，所述培养基包含至少可检测量的外分泌组织，例如获自供体胰腺的外分泌组织。

[0026] 本发明的新方法能获得、制备和/或培养足够质量和数量的胰岛以努力符合上面需要(即使供体胰岛在分离过程和延长的体外培养期中不太紧凑和易于片段化，例如年轻的、获自所谓上市大小猪的胰岛，<6月龄)。本发明的新方法生成可以包含"pancreatite"的新胰岛的组合物。本发明的"pancreatite"可以在培养中形成，并且包含胰岛和外分泌组织的组合。

[0027] 本公开也涉及制备的可包含pancreatite的胰岛在植入个体用于糖尿病体内治疗的应用。本公开还涉及使用体外制备的可包含pancreatite胰岛的方法，以体内修复器官从而具有与正常胰腺组织中所观察相同的功能、形态和组织特性。制备、获得和/或培养可包含pancreatite的胰岛的能力为糖尿病相关的体外研究和治疗开辟了重要的新途径。

[0028] 本公开也提供了可包含pancreatite的胰岛。本公开所述的可包含pancreatite的胰岛能在膜上培养和/或形成，所述膜可以是平坦表面，例如有硅酮膜的烧瓶。在实施方式中，所述膜置于锥形容器或者容器表面积从容器顶部向容器底部减少的容器中。在实施方式中，所述膜是透气膜。

[0029] 本公开也提供了可包含pancreatite的胰岛，其植入受体后可以提供对所述受体血糖状态快得多的影响。

[0030] 本公开也描述了能制备可包含pancreatite胰岛的方法，例如有与天然分离的胰岛所显示相似的组织特性和胰岛素生成能力的功能胰岛。本公开所述方法能用于生成可包含pancreatite胰岛的储液，以用于实验性研究或治疗胰岛移植。在实施方式中，可包含pancreatite的大量胰岛可以通过本方法从相对少量胰腺组织中生成。在实施方式中，可包含pancreatite的胰岛和使用本公开方法获得的细胞材料能用于生成可包含pancreatite的其他胰岛(即在实施方式中所述可包含pancreatite的胰岛是自复制的。本方法因此可以提供生成大量实验上有用的可包含pancreatite胰岛的方法。另外，鉴于可包含pancreatite的胰岛的特性，本文所公开方法可用于临床应用以提供治疗胰岛移植或研究的胰岛来源。

[0031] 在实施方式中，可包含pancreatite的胰岛能从包含胰岛的细胞产物中制备，所述包含胰岛的细胞产物获自一个或多个新鲜、冷冻、或低温处理供体的胰腺。在实施方式中，包含胰岛的细胞产物可包含不成熟胰岛、成熟胰岛或其混合物。在实施方式中，可包含pancreatite的胰岛能从获自任何动物例如哺乳动物的含胰岛细胞产物中制备。合适的哺乳动物对象包含啮齿动物例如小鼠、大鼠、豚鼠和兔，非啮齿类哺乳动物例如猪、狗、猫、棉羊、马、牛和山羊，灵长动物例如大猩猩和人。在实施方式中，包含胰岛的细胞产物可以获自胎儿供体、新生儿供体或年轻供体。

[0032] 由本公开方法制备的可包含pancreatite的胰岛能用于很多试验。在实施方式中，所述可包含pancreatite的胰岛能用于例如筛选和评价促胰岛素化合物、药物、其他大分子或小分子。在另一个实施方式中，所述可包含pancreatite的胰岛能用于例如测量胰岛素含量和分析胰岛素生物合成。在实施方式中，由本公开方法制备的可包含pancreatite的胰岛能用于鉴定小分子或药物化合物对第二信使活性的影响(例如cAMP、三磷酸肌醇(IP,钙))。本公开的其他实施方式涉及使用可包含pancreatite的胰岛以测量胰岛的代谢。另外，由本公开方法制备的可包含pancreatite的胰岛能用于测量胰高血糖素和促生长素抑制素的释放，和通过各种小分子和药物化合物调节胰高血糖素和促生长素抑制素。

[0033] 在实施方式中，制备可包含pancreatite的胰岛的方法包含在培养基中接种含胰岛的细胞产物。在实施方式中，所述培养基在膜上存在，所述膜可以位于容器例如培养瓶中。在实施方式中，所述膜是可透气的硅胶膜。在实施方式中，所述膜是可透气或不透气的平坦膜。在实施方式中，所述膜是透气膜。在其他实施方式中，培养基在聚碳酸酯透气硅胶膜培养瓶上存在。在实施方式中，制备可包含pancreatite胰岛的方法可以包含膜上培养含胰岛的细胞产物，所述膜可以是平坦的，例如硅胶膜。在实施方式中，所述培养基在可选位于培养瓶的膜上存在。在实施方式中，所述膜是可透气的硅胶膜。在实施方式中，所述膜是可透气或不透气的平坦膜。在实施方式中，所述膜是透气膜。在其他实施方式中，培养基在聚碳酸酯透气硅胶膜培养瓶中存在。

[0034] 在实施方式中，制备可包含pancreatite胰岛的方法可以在威尔森沃尔夫制造公司（Wilson Wolf Manufacturing）(明尼苏达州威尔森沃尔夫制造有限公司（Wilson Wolf Inc.)生产的透气培养瓶中包括含有胰岛的细胞产物。在实施方式中，透气培养瓶包含硅胶膜，并且所述包含胰岛的细胞产物获自例如动物如哺乳动物如人或猪。在实施方式中，包含胰岛的细胞产物可以获自胎儿供体、新生儿供体或年轻供体。

[0035] 本公开的方法可以利用包含胰岛的分散细胞产物，并且因此通常可使用包含胰岛的所有经分离细胞产物。因此，本公开的方法避免了胰岛的人工选择，并且因此在样品制备中节省了大量时间。

[0036] 本公开方法提供了对当前所用胰岛制备方法的改善，并且显著增加了胰岛制备的效率。

[0037] 在实施方式中，本方法还包括使包含胰岛的细胞产物和/或可包含pancreatite的胰岛与抗氧化剂接触，所述抗氧化剂，例如Trolox(α-生育酚的类似物;范围是约30-约80μM,如约50μM)、Q-VD-OPH(广谱半胱天冬酶抑制剂;范围是约5-约20μM,例如约10μM)、肝细胞生长因子、卡波西成纤维细胞生长因子、烟酰胺或其组合。

[0038] 在实施方式中，提供了制备pancreatite的试剂盒。在一个实施方式中，所述试剂盒包含例如消化酶，有膜的培养瓶(如上面所讨论)和培养基。在另一个实施方式中，所述试剂盒也可包括例如在分离包含胰岛的细胞产物前保存供体组织的膜和灌注溶液。

[0039] 在实施方式中，提供了制备可包含pancreatite的胰岛的方法。在实施方式中，所述方法包含在膜上培养含有胰岛的细胞产物以制备和/或获得可包含pancreatite的胰岛。在实施方式中，包含胰岛的细胞产物还包含外分泌物质。在实施方式中，包含胰岛的细胞产物不包含任何外分泌物质。在实施方式中，将外分泌物质分别加入到培养基中(即与包含胰岛的细胞产物分开)。例如，在实施方式中，外分泌物质可以在包含胰岛的细胞产物(可包括或不包括任何外分泌物质)加入到培养基之前或之后加入培养基。

[0040] 在实施方式中，提供了胰岛移植的方法。例如，在实施方式中，所述胰岛移植的方法包含在膜上培养含有胰岛的细胞产物以获得可包含pancreatite的胰岛，和向受体例如哺乳动物给予可包含pancreatite的胰岛。在实施方式中，包含胰岛的细胞产物还包含外分泌物质。在实施方式中，包含胰岛的细胞产物不包含任何外分泌物质，并且分开加入外分泌物质。例如，在实施方式中，外分泌物质可以在包含胰岛的细胞产物(可包括或不包括任何外分泌物质)加入到培养基之前或之后加入培养基。在实施方式中，可以给予糖尿病受体，例如糖尿病哺乳动物。在实施方式中，所述膜是可透气的硅胶膜。在实施方式中，所述膜是可透气或不透气的平坦膜。在实施方式中，所述膜是透气膜。在其他实施方式中，培养基在聚碳酸酯透气硅胶膜培养瓶中存在。

[0041] 在实施方式中，给予可包含pancreatite的胰岛能通过哺乳动物肾小囊下、皮下、静脉内、经肝门静脉、或进入胰腺间充质移植。在实施方式中，将所述可包含pancreatite的胰岛给予受体，所述受体是哺乳动物例如人。在其他实施方式中，所给予可包含pancreatite的胰岛是自体或异源的。

[0042] 本公开形成胰岛的方法可包括分离含胰岛的细胞产物的方法，可适应胰岛细胞的培养基，和培养含胰岛的细胞产物以制备可包含pancreatite胰岛的方法，并且引起从给定数量供体组织分离的含胰岛细胞产物数量增加以及胰岛的功能和活力提高。所述可包含pancreatite的胰岛和本公开方法可以增强胰岛的移植能力，和增加移植成功性。

[0043] 分离包含胰岛的细胞产物前，切除供体胰腺(或胰腺供体组织)意味着供体胰腺（胰腺供体组织）的缺血是总体的和不可避免的，尽管所述时间段可以短暂。供体胰腺（或胰腺组织）停止血液供应的直接结果是剥夺了供体组织的氧供应，但是缺氧(总体)或低氧(局部)仅是很多缺乏血液供应的后果之一。缺血开始后继发多因素级联事件。关键的事件是在缺氧的前几分钟内发生的ATP耗尽。这个早期事件立即造成有氧代谢向厌氧代谢的转化，其快速变成自我限制，生成乳酸盐和质子。级联中也极早发生细胞去极化，造成破坏离子内稳态、最终在凋亡或坏死引起的细胞死亡中积累的其他细胞内和膜相关事件的关联。在分离含胰岛细胞产物的方法开始前，防止这种破坏性通路增加了从给定胰腺或其部分收集的含胰岛细胞产物的质量和数量。

[0044] 就临床应用而言细胞保存的基本原理是使保存间隔中缺血和缺氧的有害影响最小化。药理学上这能通过使用广泛的细胞保护药物和/或通过降低温度来实现。有趣的是，传统智慧教给我们没有单个药物或药物混合物能如低温应用那样安全和有效地抑制代谢和提供对多个组织和器官的缺血保护。因此，焦点变成控制细胞环境以优化低温保存。

[0045] 在实施方式中，本文所公开的方法实施某种方法，所述方法利用灌注技术的进展，并且可选与那些低温血液替代溶液的进展组合以通过PFC扩大方法来提高O2递送。这个方法避免了现有临床胰腺存储模式中数个公认缺点，其中最显著的是使用传统二层法(TLM)显示PFC和氧的低渗透。

[0046] 在胰腺保存然后分离包含胰岛的细胞产物的特定示例中，出现年轻猪模型中低温机器灌注(HMP)对胰岛产率的有益效果。然而，由于胰岛对甚至短时期(<10h)冷缺血的易损性，本文所述方法通过避免传统胰腺保存技术中认可的限制来延长对缺血的耐受，并且使包含胰岛的细胞产物产率增加，并且因此使可包含pancreatite的胰岛的质量和数量增加。

[0047] 在实施方式中，可以在保存胰岛完整性同时通过应用HMP和发展间质性水肿来分离包含胰岛的细胞产物，所述胰岛待培养形成可包含pancreatite的胰岛，相较应用于非灌注供体组织(即新鲜或静态冷冻保存的供体组织)的传统方法，这可以大幅增加包含胰岛的经回收细胞产物的量和质量。在实施方式中，可以利用酶消化从而进一步帮助分离包含胰岛的细胞产物。

[0048] 实施方式中，用作起始材料的包含胰岛的细胞产物可以通过从哺乳动物含胰岛体的胰腺（如来自胎儿、新生或成年胰腺）获得功能胰岛的公知方法获得。这种方法可以包含粉碎全部胰腺或其部分，并且通过使其暴露于酶溶液足够的时间以使胰岛从周围胰腺组织中释放，从而消化所述粉碎段，所述酶裂解结缔组织，如胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶和其混合物。在实施方式中，所述粉碎段仅进行非常温和的消化，例如从而组织裂解程度大约对应于用胶原酶溶液在约37°C消化约12-15分钟获得的那些，所述胶原酶溶液包含约750胶原酶单位/ml。例如，所述粉碎的胰腺部分可以用酶处理，通过例如把酶溶液灌注到供体组织中，和/或当接触酶溶液时振荡供体组织的方法。在实施方式中，所述供体组织可与酶溶液以任何需要的时间接触，例如仅仅是释放大量胰岛所需的最短时间。在实施方式中，可使用酶的稀释溶液，例如组织裂解潜能不多于包含约1,500单位胶原酶/ml的参照溶液，例如约1000单位/ml或约750单位/ml。在实施方式中，本公开方法可以使用更温和的结缔组织裂解酶例如胶原酶和/或透明质酸酶，而不是更加剧烈作用的酶例如已知解离细胞的胰蛋白酶。在实施方式中，可以使用所述罗氏公司（Roche）MTF酶。

[0049] 在实施方式中，可通过包含在灌注供体胰腺和/或其（供体组织）部分或片段或期间发展水肿的方法分离含胰岛的细胞产物，所述胰岛待培养形成可含有pancreatite胰岛。在这种实施方式中，灌注供体组织期间发展水肿可以通过增加灌注溶液通过所述组织的第一流速以实现第二流速，增加由灌注设备向所述组织应用的第一灌注压力以实现第二灌注压力，和/或选择造成组织水肿的灌注溶液组合物来完成。

[0050] 在实施方式中，发展水肿可以通过增加灌注溶液通过供体组织的第一流速以实现第二流速，增加由灌注设备向供体组织应用的第一灌注压力以实现第二灌注压力，和/或选择造成供体组织水肿的灌注溶液组合物来完成，其中水肿的程度可以通过监测供体组织的浮力，监测供体组织的表面积，监测供体组织的周长，监测供体组织的重量和/或质量，和/或监测供体组织的容积来评价。

[0051] 实施方式中，包含待培养形成可含有pancreatite的胰岛的含胰岛细胞产物可以通过某些方法分离，所述方法包含提供具有不易破坏性冷冻的所需细胞和更易破坏性冷冻的不需要细胞的组织，冷冻所述组织，破坏所述组织，加热所述组织，和分离所需含胰岛的细胞产物与不需要的细胞材料以获得包含胰岛的细胞产物。

[0052] 在实施方式中，包含待培养形成可含有pancreatite的胰岛的含胰岛细胞产物可以通过某些方法分离，所述方法包含手术制备用于血管和导管插管（cannulation）的离体组织，冷却所述组织，用低温保护剂平衡组织，可选冷冻所述组织到约-10°C–约-200°C的温度，可选在保持组织冷冻下机械破坏所述组织，可选解冻所述组织，过滤所述组织，洗涤所述组织，纯化包含胰岛的细胞产物，例如通过梯度纯化。

[0053] 在实施方式中，包含待培养形成可含有pancreatite胰岛的胰岛的细胞产物可以通过某些方法分离，所述方法包含通过血管系统用含低温保护剂(CPA)的低温保护溶液注入胰岛组织，通过导管系统用水溶液注入腺泡组织，冷冻所述胰腺，破坏所述胰腺，加热所述胰腺和分离所述胰岛。在实施方式中，包含胰岛的细胞产物可保持足够的功能完整性以用作移植来源。

[0054] 低温机器灌注(HMP)：传统的移植器官保存方法主要依赖于冰上静态冷冻储存，这是使用了几十年的相对简单和经济的技术。然而，在胰腺保存领域，特别是应用于作为分离含胰岛细胞产物的来源器官时，静态冷冻存储对获自单个供体胰腺的岛产率和质量有严重的限制。例如，引入据称增加缺血器官氧供应的全氟化合物层在静态冷冻保存方法中没能提供额外的保护。

[0055] 在实施方式中，包含待培养形成可含有pancreatite胰岛的胰岛的细胞产物可以从供体组织中分离，所述供体组织通过使用HMP和低体温血液替代（HBS）技术组合以及PFC氧化的方法来保存。

[0056] 低温血液替代物作为保存介质：传统上，开发了各种器官保存溶液。

[0057] Brasile的美国专利号5,643,712、5,699,793、5,843,024和Brasile等的美国专利号5,599,659、5,702,881描述了组织和器官的单独复苏和保存溶液，所述专利通过引用全文纳入本文。所述Brasile专利描述了可用于本公开方法的组合物。

[0058] Taylor 等 制 备 并 评 价 了 称 为 HypothermosolTM- 吹 扫 (HTS-P) 和TMHypothermosol -维持(HTS-M)的两种溶液。这些溶液的一些方面描述于Taylor的美国专利号5,405,742和5,514,536，两者的公开内容通过引用全文纳入本文。所述Taylor的专利描述了可用于本公开方法的组合物。

[0059] 溶液例如 家族溶液的保护特性(描述于Taylor的美国专利号6,492,103和6,994,954，标题为"System for organ and tissue preservation and hypothermic blood substitution（用于器官和组织保存以及低温血液替代的系统）"，其公开内容通过引用全文纳入本文)可以用于本公开的方法。在实施方式中，除了细胞保护添加剂，Unisol可以用作乳化PFC的载剂溶液以显著增加氧输送能力。

[0060] 在实施方式中，主要溶液可以是设计成在最低温度(<10°C)低温暴露中“维持”细胞完整性的高血钾、“胞内型”溶液。

[0061] 增加低体温保存中对组织的氧输送和PFC作用：开发出所述 “维持”溶液，并且在温度范围7-10°C测试，所述温度范围确证了如果通过连续灌注维持充分O2供应，能重新建立ATP逆转。例如，很多研究提示氧供应在肝低温保存中很重要。

[0062] 在0-2°C冷冻保存器官(如传统静态冷冰保存)期间腺嘌呤核苷酸的快速耗尽可以提示低温严重损伤了线粒体功能。灌注中可能需要维持所述O2水平以确保包含胰岛的细胞产物的最高数量和质量，并且使用PFC以允许其实现。

[0063] PFC是所有或大部分氢原子用氟取代(即全氟碳)的烃。其有两倍的水密度，和用于溶解呼吸道气体的高容量。PFC中溶解氧的可溶性比血液或水高约25倍。根据亨利定律，PFC释放氧的能力不受温度显著影响，使其理想用于低温器官保存期间的氧输送。近期的证明也支持这个观点：在用于系统氧化的腹膜灌注应用中需要全氟碳的气体溶解和气体卸载特性，因为当用单独盐水溶液作为灌注液时，不能获得相同的效果。然而，低温条件下使用全氟碳受到限制。

[0064] 应用一种或多种这些胰腺或供体组织保存策略使供体组织或器官的损伤和细胞死亡最小化，其可以促进包含胰岛的细胞产物整体产率增加，并且因此提高可包含pancreatite的胰岛整体产率增加。

[0065] 如上面所讨论，胰岛的获取和保存对分离包含胰岛的细胞产物重要，作为在膜上培养含胰岛细胞产物的前期工作以获得可包含pancreatite的胰岛，并且所述可包含pancreatite的胰岛的最终移植作为治疗I型糖尿病的选择。胰腺灌注还能用于在分离含胰岛细胞产物前保存暴露于热缺血的器官，并且就更佳产率和质量优化胰腺保存溶液。

[0066] 生理上，胰腺是低流动器官。实施方式中，在分离包含胰岛的细胞产物期间和/或之前，本公开的所述方法可包含胰腺灌注，所述灌注可基于低恒压(约10mmHg或更小，例如约1mmHg–约10mmHg)驱动的流动。 的现有设计可能不适合于小于10mmHg的输注压力。因此，可以用更低压力值以达到本文保存胰岛的公开方法所需的小于10mmHg的输注压力，以分离包含胰岛的细胞产物。在实施方式中，可以根据包含胰岛特性和质量(如热缺血暴露、大小、种类等)的所需细胞产物来选择驱动流速值。

[0067] 在实施方式中，所述灌注方法可以基于高(约10mmHg或等高，例如约10mmHg–约60mmHg)恒压驱动的流动。

[0068] 在实施方式中，本文所述方法使用灌注一种或多种胰腺器官或组织(此后通称为供体组织)的设备。示例性设备描述于美国专利申请号12/379,239，其是2005年3月10日提交的美国专利申请号11/075,690(2009年3月17日授权的美国专利号7,504,201)的分案，其全部公开通过引用全文纳入本文。在实施方式中，本文所述方法使用平台运输器或改良的 平台运输器以完成供体组织(即胰腺)的低体温机器灌注(HMP)。

[0069] 在实施方式中，HMP可以在供体组织内产生均一的流体积聚，进而提供对包含胰岛的细胞产物产生有利影响的受破坏胞外空间，而不损害胰岛活力和胰岛功能。在实施方式中，当使用酶消化时，这种破坏可以更有效完成所述酶消化，并且因此降低了对分离包含胰岛的细胞产物必要的所需时间。本文所述关于年轻猪胰岛的方法可容易应用于人和其他供体胰腺。在实施方式中，可实现胰腺低温灌注优化以发展灌注期间器官评价和质量控制的方法发展，从而可靠选择分离包含胰岛的细胞产物的胰腺。

[0070] 在实施方式中，用于胰腺灌注的 机器可适应在小于150ml/min的流速操作，例如小于100ml/min，或约10ml/min-约100ml/min，例如约15ml/min–约50ml/min，或约20ml/min–约30ml/min。

[0071] 在实施方式中，用于胰腺灌注的 机器可适应在高压设定操作(约10mmHg或更高，例如范围约10mmHg-约60mmHg，或范围约20mmHg-约50mmHg)-控制的猪胰腺的灌注作为分离含胰岛细胞产物过程的前期工作。在实施方式中，用于胰腺灌注的机器可以适应在小于200ml/min的流速操作，例如小于150ml/min，或约10ml/min-约150ml/min，例如约50ml/min–约120ml/min，或约60ml/min–约110ml/min。

[0072] 本公开的实施方式可以提供分离包含胰岛的细胞产物的改善方法(可选与酶消化组合)，这比传统基于酶消化的方法更一致和更可靠。实施方式也提供产生最优量的所需包含胰岛细胞产物的方法。在实施方式中，供体组织中水肿发展形成的溶胀组织可以通过应用低温机器灌注(HMP)完成。作为分离包含胰岛的细胞产物的前期工作，应用供体组织HMP(所述胰腺HMP)，也利用了其他多种器官(主要是肾)显示的一些HMP优势，作为延长保存期中更好保存的方法，特别对于次最优的器官。

[0073] 延长器官的机器灌注中累进发生水肿，通常认为这是不需要的现象。与期望相反，水肿发展例如至约280%(即在监测评价水肿的程度例如重量、质量、周长、浮力和/或容积的特定参数中增加180%)或多至约250%、多至约150%没有证明对收获包含胰岛的细胞产物有害，但是观察到了酶消化中与更有效破坏胰腺有关的显著优势，产生显著更多数目的含胰岛细胞产物。

[0074] 在实施方式中，供体组织灌注中水肿发展形成溶胀组织可以造成溶胀组织显示约110%的起始或最初非灌注供体组织重量、质量、周长、表面积、浮力和/或容积(即在重量、质量、周长、表面积、浮力和/或容积上增加约10%)，例如约120%-约280%(即在重量、质量、周长、表面积、浮力和/或容积上增加约20%-约180%)，或约130%-约250%(即在重量、质量、周长、表面积、浮力和/或容积上增加约30%-约150%)。

[0075] 认为存在预定量的水肿造成对胰腺或胰腺组织的胞外基质和结构的足够破坏，腺体的后续膨胀和消化更有效推进。这由显著更短的消化时间、更均匀的消化产物证明。包含胰岛的细胞产物的结构和功能本身看来没有受这些研究中遇到的组织水肿水平影响。HMP引起的包含胰岛的经分离细胞产物水合变化可改变所述胰岛的浮力密度，并且因此改变其在密度梯度上与任何不需要的外分泌组织分离的能力，这个关注没有成为问题。这可能是由于胰岛中的任何固有水肿与高渗介质UW溶液的预梯度孵育互相对抗，所述UW溶液会在30-min冷孵育中使胰岛脱水，然后加载到通常用于胰岛分离操作方案的浓度梯度纯化(Lakey,J.R.T.,Technical aspects of islet preparation and transplantation（《胰岛制备和移植的技术方面》）,Transpl.Int.,16:613–632,2003;Lakey,J.R.T.;Current human islet isolation protocol（《新编人胰岛分离实验指南》）,Chuo-ku,Osaka:Medical Review医学综述有限公司（Medical Review Co.Ltd.）,2004;其公开内容通过引用全文纳入本文)。

[0076] 上述HMP未预期的优势可以在不损害收获的含胰岛细胞产物质量情况下实现。可以使用两种专有溶液KPS1和Unisol-UHK中任一种来实现这些保存的影响和标准。

[0077] 这个技术的其他提高和优势可以通过下面方法完成：加入设计用于尽可能减少保存和灌注损伤的细胞保护剂，和/或PFC来优化这些基线灌注液组合物。

[0078] 例如，细胞保护添加剂可以是低温保存期间显示效果的添加剂，并且因此其有很大可能对低温机器灌注中胰腺保存的质量产生正面影响，例如抗氧化剂、抗凋亡剂和营养因子。

[0079] 在实施方式中，所述供体组织可以分成更小的断裂和/或片段化的部分。为了增强供体组织例如胰腺的破碎，体积升温（volumetric warming）可以与浸在热水浴中加入压缩空气热交换器组合。实施方式中，这能解冻供体细胞，而不需要从平台上移出其。在暴露于消化酶之前的任何时间（例如在加温供体组织中）都可以发生供体组织的分裂或断裂。

[0080] 在实施方式中，使所述供体组织暴露于各种剂量的消化酶（例如上面提到的那些和市售可得的那些）是有利的，以帮助结缔组织分散从而使包含胰岛的细胞产物(可选是冷冻保护的胰岛)从破坏的组织中释放出来。

[0081] 在实施方式中，水肿程度达到预定水平后，例如水肿水平在体重、质量、周长、表面积、浮力和/或体积上增加多达约200%(即如果组织的起始或最初体重、质量、周长、表面积、浮力和/或体积是X(例如100克)，增加约200%可以产生3X(300克)的终体重，例如增加多至约150%、或增加多至约100%，可以破坏所述供体组织以释放来自分解供体组织的细胞产物。在实施方式中，当所述供体组织冷冻时、当所述供体组织加热时、和/或在所述组织达到室温后，可发生所述供体组织的破坏。在实施方式中，这种破坏能通过以下实现：机械压力、差异膨胀引起的热-机械压力、大温度梯度引起的热-机械压力、和冷冻后体积改变引起的热-机械压力、通过消化酶、或其组合。

[0082] 热-机械压力可以是材料冷冻后接触趋势（tendency）的结果，其由三个不同影响驱动：如上述冷冻后的体积改变、大温度梯度、和复合材料的差异膨胀。实践中，两个或多个上述影响可以协同作用。在其他实施方式中，破坏供体组织可以通过机械破裂冷冻的供体组织来实现。例如，这可以通过两个阶段完成。第一阶段可以是将冷冻的供体组织物理分裂成部分，例如用锤子和凿子。第二阶段可以是将冷冻的组织部分浸没在热水或等渗介质中研磨，例如通过使用电子碎冰机或搅拌机。这也可以在机械研磨所述组织的同时，影响冰冻保护剂（如果包含）的快速加热和稀释。

[0083] 在实施方式中，所述方法还包含从所述不需要的供体组织材料中分离包含胰岛的细胞产物。在实施方式中，存在的所述胰岛含量大于培养基中存在的外分泌组织和内分泌组织总面积的约20%，例如含量大于培养基中存在的外分泌组织和内分泌组织总面积的约40%、或含量大于约60%、或含量大于约80%，其中所述胰岛含量通过胰岛包围的面积与培养基中所存在外分泌组织和内分泌组织总面积之比来计算。在实施方式中，存在的所述胰岛含量大于培养基中存在的外分泌组织和内分泌组织总面积的约70%，例如含量大于培养基中存在的外分泌组织和内分泌组织总面积的约60%或50%，其中所述胰岛含量通过胰岛包围的面积与培养基中所存在外分泌组织和内分泌组织总面积之比来计算。在实施方式中，存在的所述外分泌物质含量大于培养基中存在的外分泌组织和内分泌组织总面积的约60%，例如含量大于培养基中存在的外分泌组织和内分泌组织总面积的约70%、或含量大于约80%、或含量大于约90%，其中所述外分泌物质的量通过外分泌物质包围的面积与培养基中所存在外分泌组织和内分泌组织总面积之比来计算。

[0084] 在其他实施方式中，所述含胰岛的细胞产物可以包含任何所需量的外分泌物质，例如小于10%的量，例如约0.5%-约10%，例如约1%-约8%或约2%-约5%。在其他实施方式中，包含胰岛的细胞产物与外分泌物质分离，并且因此不包含任何外分泌物质。可以通过例如过滤、密度梯度分离、组织培养或其组合实现含胰岛细胞产物的分离。可以使用过滤设备例如不锈钢丝网(滤茶网)进行过滤。分离可包括用培养基洗涤过滤的供体细胞，所述培养基包含蛋白酶抑制剂例如 和脱氧核糖核酸酶例如从而从裂解的外分泌组织去除有害的内源性蛋白酶和DNA。在实施方式中，所述过滤的供体组织用指示剂染色以鉴定所述细胞产物，例如用于胰岛的双硫腙染色，并且显微镜检查是否存在包含胰岛的完整细胞产物。

[0085] 包含胰岛的经分离细胞产物可以不从供体组织干净地切除，并且不是所有的含胰岛细胞产物都可以充分完整。例如，对胰岛而言，一些胰岛组织可以有能反映渗透休克的弥漫性或松散结构，所述渗透休克是由于在任何冷冻胰腺加热中直接浸没于水性培养基而引起。在实施方式中，可通过解冻冷冻胰腺期间或之后，在从胰岛组织洗脱CPA中使用渗透缓冲液来避免这个问题。使用渗透缓冲技术的实施方式可以在渗透CPA的流出中保护胰岛组织结构和尽可能减少渗透溶胀和裂解。相反，在这种实施方式中，渗透缓冲没有同时影响腺泡细胞的破坏和裂解，因为这些细胞没有CPA渗透的保护。

[0086] 在实施方式中，包含胰岛的细胞产物可以根据Ricordi等的方法(An automated method for the isolation of human pancreatic islets（《分离人胰岛的自动方法》）,Diabetes,1988;37:413)或本领域技术人员熟悉的其他方法分离。在实施方式中，所述包含胰岛的细胞产物加入到本文公开的或本领域技术人员熟悉的培养基中，培养合适的时间段以维持或增强功能和活力，并且通过本领域已知的任何合适方法引入受体，例如通过门静脉输注到肝。

[0087] 在实施方式中，包含胰岛的细胞产物可以培养约3小时-约4周或更长的时间，例如约24小时-约14天，例如约4天-约10天。然而，包含胰岛的细胞产物可以使用本组合物和方法培养60天或者甚至更长。

[0088] 在实施方式中，所述培养基可以是能维持哺乳动物细胞生长的任何液体组合物。大量的合适液体培养基市售可得。任何给定液体培养基的促进细胞生长品质可以当然通过实施试验培养（例如用分离的胰岛）的试验和实验容易测定，并且测定细胞是否发生聚集、增殖、繁殖和/或生长。

[0089] 在实施方式中，所述培养基包含适合培养哺乳动物细胞的基础培养基，例如以 商标出售的或获自密迪亚泰克公司(Mediatech)的那些；包含例如CMRL1066，其中加入了有效量的烟酰胺、维生素E和HSA。其他等同的基本培养基可以替代CMRL使用，包括但不限于基础伊格尔培养基(BME)、DMEM;DMEM/F12、培养基
199;F-12(Ham)营养混合物;F-10(Ham)营养混合物;极限必需培养基(MEM)、Williams培养基E;RPMI1640、CO2独立培养基和其混合物。(这些制剂可获自马里兰州盖瑟斯堡的Gibco-BRL/生命技术公司和其他商业来源)。本领域技术人员应了解很多其他合适的基础培养基市售可得，并且能在实验室中常规制备。通常，这种基础培养基包含无机盐(如NaCl、KCl、NaH2PO4、CaCl2、MgSO4、乙酸钠)、天然产生的氨基酸、维生素、缓冲液和支持细胞存活所需的其他可能有利成分(胆固醇、辅酶A、葡萄糖谷胱甘肽、胸苷、尿苷-5三磷酸、抗生素)。

[0090] 在实施方式中，所述培养基还可以包含其他成分，例如ITS液体培养基、ITS+Premix、盐酸环丙沙星、胰岛素、转铁蛋白、硒、水溶性亚油酸、丙酮酸钠、硫酸锌或氯化锌、Hepes、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、热灭活的猪血清、L-谷胺酰胺、肝素钠、Trolox、Q-VD-OPH、百慕时和GlutaMax-1。

[0091] 培养基的示例性制品可以包含：补充ME199的基础培养基(1000ml)[赛尔格罗公司99-601-CM]，其可以通过额外加入50ml丙酮酸钠(100ml储液)、加入1ml硫酸锌(4.8mg/ml储液)、加入10ml ITS液体培养基、加入2ml盐酸环丙沙星(10mg/ml储液)、加入60mg N-乙酰半胱氨酸、加入1.22g烟酰胺(最终10mM)制备。对这种培养基而言，下列步骤可以在临近使用时进行：加入100ml热灭活的猪血清、加入25ml L-谷胺酰胺(200mM储液)、加入10ml肝素钠(1000U/ml储液)、加入14ml百慕时(2500U/2.5ml安瓿)、加入Trolox*(终浓度50μM)、和加入Q-VD-OPH*(终浓度10μM)。

[0092] 在实施方式中，少量葡萄糖可以对应于体内胰腺的浓度加入到培养基中，例如葡萄糖的摩尔浓度为约5-约20mM，例如约10mM，并且所述培养基可以在使用前用包含5%CO2的空气平衡以实现与体内条件对应的溶解气体分压。在实施方式中，所述培养基包含有效浓度的抗生素例如约50-约200μU/ml（如约100μU/ml青霉素）和约50-约200μg/ml（如约100μg/ml链霉素）以抑制不需要的微生物生长。在实施方式中，所述培养基也可以加入了少量哺乳动物血清，所述血清包含促进细胞组织与细胞底物的结合的蛋白。例如，所述血清可以约5-20%体积（基于混合物体积）的量存在，例如约15%体积，并且对培养的含胰岛细胞产物而言是异源的。

[0093] 在实施方式中，所述培养基可以在大约接近体内条件的条件下维持，所述条件认为可适于哺乳动物细胞的生长，如在约35°-40°C范围的大致正常哺乳动物体温，例如约37°C，并且在合适的气体组合物气氛下，例如适合维持溶液中气体分压的约5%CO2/95%空气。在实施方式中，所述培养维持在水饱和空气中以避免培养基中通过蒸发损失引起的不需要浓度改变。

[0094] 气相的重要组成可包括氧气和二氧化碳。通常，大气氧张力对细胞培养有用。培养容器通常排气到培养箱空气中，以通过使用透气盖或防止培养容器密封来使气体交换。二氧化碳与细胞培养基中的缓冲液一起在pH稳定中起作用，并且通常培养箱中存在的浓度是1-10%。在实施方式中，所述CO2浓度可以是约5%。

[0095] 在实施方式中，培养基中初始接种包含胰岛的细胞产物后，可以频繁间隔改变所述培养基以在所述培养基中维持有效的营养和抗生素，并且洗掉任何污染物。例如，对培养基的头3或4天而言，可以约12–24小时的间隔改变培养基。对培养持续时间长于3或4天的阶段而言，可以更长间隔改变培养基，例如约5–约10天。

[0096] 在实施方式中，可引入培养基的胰岛密度可以变化。在实施方式中，胰岛的密度可以是约10–约200胰岛/ml培养基，例如约25-100胰岛/ml培养基，或者30-50胰岛/ml培养基。在实施方式中，培养细胞产物培养物可以维持至少约3天时间段，例如至少约一周或更长。

[0097] 在实施方式中，悬浮中的塑料皿、烧瓶、滚瓶或微载体可用于根据本公开方法培养包含胰岛的细胞产物。合适的培养容器可以包含例如多孔板、皮氏培养皿、组织培养管、烧瓶、滚瓶等。

[0098] 可以对培养系统进行各种修改以降低pO2气和pO2室的差异。例如，可以使用在机械混合或灌注容器中的对流氧气运输，包括搅拌和/或鼓泡氧气通过培养基。所述培养基可以使用水的电化学水解原位产生氧气。或者或另外，还可使用包含透氧膜的培养容器，所述容器有一个或多个细胞能与其接触并生长的边、壁和/或底。本文使用的透氧膜是氧气透过性大于标准培养皿(如聚苯乙烯)的膜。透氧膜的一个示例是氟代乙烯-丙烯共聚物(FEP-特氟龙（Teflon）)膜。包含这种膜的培养容器作为Lumox皿(慕尼黑的葛莱娜第一生化公司（Greiner Bio-One）)市售可得。透氧膜的另一个示例是实施例中使用的硅橡胶膜。

[0099] 在实施方式中，可以使用包含硅橡胶膜的硅橡胶培养容器或器皿。例如，与含胰岛细胞产物接触的所述管的内表面由硅橡胶制成。硅橡胶的优势是其对气体如氧气有高渗透性。可用的培养器皿示例可以从例如明尼苏达州威尔森沃尔夫制造公司市售可得。其他示例可以包含美国专利申请号20080227176所述的那些，所述专利通过引用全文纳入本文。在其他实施方式中，这种透氧膜插入可以置入任何上述容器或培养器皿中。硅橡胶膜插入从明尼苏达州威尔森沃尔夫制造公司市售可得。

[0100] 在实施方式中，本培养方法过程中由本公开方法制备的可包含pancreatite的胰岛能连接到或者变得连接其培养接触的底物。在实施方式中，所述培养方法可以在提供或包含合适底物的器皿中进行，所述底物与哺乳动物细胞组织相容，并且能接受可包含pancreatite的胰岛与其连接。因此合适的器皿包含市售可得的组织培养皿，其底部平面用涂层覆盖，所述涂层促进连接包含胰岛的细胞产物。当然也可以使用提供或包含合适底物表面的其他培养器皿。在实施方式中，本公开方法进行静止培养，即所述培养或培养基停留在静息状态，除了定期的可选培养基改变(可以是液体)。然而，其同样可能实施使用其他培养形式的方法，其中正在培养的含胰岛细胞产物结合浸入培养基的底物，所述培养基可以是液体培养基。

[0101] 在实施方式中，本公开提供了移植可包含pancreatite胰岛的方法，所述方法包含从供体组织分离包含胰岛的细胞产物，在培养基中培养含胰岛的细胞产物以制备可包含pancreatite的胰岛，和将所述可包含pancreatite的胰岛引入受体或宿主。在实施方式中，所述受体或宿主是需要移植胰岛素生产细胞的患者，例如I型糖尿病患者。因此，本公开也提供治疗糖尿病例如I型糖尿病的方法，包含步骤：从供体组织分离包含胰岛的细胞产物，在培养基中培养包含胰岛的细胞产物以制备可包含pancreatite的胰岛，和将所述可包含pancreatite的胰岛移植到宿主、受体或患者。

[0102] 所述可包含pancreatite的胰岛能用于筛选或评价促胰岛素化合物。可通过将促胰岛素化合物给予和/或加入本公开方法制备的可包含pancreatite的胰岛，来评价这种化合物在葡萄糖存在以及GLP-1存在和缺失情况下加强胰岛素分泌的能力。另外，通过本公开方法制备的可包含pancreatite的胰岛也能用于测量胰岛素含量、检测胰岛素合成，测试化合物对例如cAMP的影响(如直接SPA筛选Biotrak试验试剂盒，新泽西州皮斯卡特维的阿莫山公司（Amersham）)，以及测量胰岛细胞中的代谢物(如光谱或荧光酶分析，或本领域技术人员已知的任何其他方法)。本公开方法制备的所述可包含pancreatite的胰岛也能用于测量胰高血糖素释放。高血糖素症是2型糖尿病的常见现象。胰高血糖素的主要生理影响是增加肝葡萄糖的生成。2型糖尿病患者中循环胰高血糖素水平增加对加快高血糖有显著影响。因此，抑制胰高血糖素的释放或降低胰高血糖素对靶标组织的影响是治疗糖尿病的另一个方法。本公开方法制备的所述可包含pancreatite的胰岛能提供测量胰高血糖素释放和多种化合物调节的强有力方法。

[0103] 本公开方法制备的可包含pancreatite的胰岛能用于多种应用。这些包括但不限于体内移植或植入包含pancreatite的胰岛;体外筛选细胞毒性化合物、变应原、生长/调节因子、药物化合物等;阐明某些疾病的机制;研究药物和/或生长因子作用的机制;诊断和监测患者中的癌症;基因治疗;和生产生物活性化合物等等。

[0104] 所述可包含pancreatite的胰岛能体外用于筛选多种化合物，例如细胞毒性化合物、生长/调节因子、药剂等。为此，所述可包含pancreatite的胰岛体外维持，并且暴露于要测试的化合物。细胞毒性化合物的活性可以通过培养中其损伤或杀死可包含pancreatite的胰岛的能力来测量。这容易通过活体染色技术来评价。可以通过例如总细胞计数和差异细胞计数评价生长/调节因子的影响。这可使用标准细胞学和/或组织学技术完成，包括使用定义类型特异性细胞抗原的抗体的免疫细胞化学技术。可以评价各种药物对可包含pancreatite的胰岛的影响。

[0105] 可包含pancreatite的胰岛能通过本领域已知的任何方法给予患者。给药的合适方法包含例如静脉内、皮下、通过肝门静脉、通过肾小囊下移植、或进入肾间充质。在实施方式中，可包含pancreatite的胰岛能单独或者与制剂或底物联合给予患者。所述可包含pancreatite的胰岛能在合适给予的例如水性和非水性制剂中，在等渗的无菌注射液中，所述注射液能包含使该制剂与预期接受者血液等渗的抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，和在能包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂的水性和非水性无菌悬浮液中。在实施方式中，所述可包含pancreatite的胰岛或其制剂能通过例如肾下直接手术移植、门内给药、静脉内输注或腹膜内输注给予。

[0106] 为测定治疗或预防由减少或异常胰岛素表达所引起病症中待给予的有效量的含pancreatite胰岛，医师评价细胞毒性、移植反应、疾病进展和抗细胞抗体的生成。对给药而言，可以给予有效量的本公开方法制备的所述可包含pancreatite的胰岛以向对象提供标准化的葡萄糖响应性胰岛素生成和标准化葡萄糖水平，考虑应用于质量和患者整体健康时各种浓度下细胞类型的副作用。在实施方式中，给药可以通过单个或分开的剂量完成。

[0107] 示例如下文所示，并且阐明能用于实践实施方式的不同组合物和条件。除非另有说明，所有的比例是重量比例。然而，显然本公开能通过很多类型的组合物来实施，并且根据上述公开和下文所指出，能有很多不同的应用。例如，本领域普通技术人员容易识别这些示例，其也可应用于分离人胰岛，因为猪胰腺是本领域认可的人胰腺模型。

[0108] 猪胰腺是有用的模型，因为至少猪被视作就未来临床异种移植而言最有希望的胰岛来源。分离包含胰岛的细胞产物前，胰腺保存的特殊示例在引起全世界兴趣的胰岛异种移植方面非常重要，可以帮助提高胰岛产量而不损伤胰岛功能。

[0109] 另外，近期由国际异种移植协会（International Xenotransplantation Association）所发表关于1型糖尿病的猪胰岛产物临床试验的共识战略规划强调了就猪源和产物而言无菌、无疾病环境的需要和重要性。为此， 系统提供了从采购点运输胰腺源到胰岛加工设施的便捷无菌环境。这个方法应用于猪胰岛低温灌注保存后，活胰岛的保存和获取，因为出于很多强有力的原因，现在认为猪是异种移植胰岛移植选择的供体物种(O’Neil,J.J.等,The isolation and function of porcine islets from market weight pigs（《上市体重猪的猪胰岛的分离和功能》）,Cell Transplant.10:235–246;2001)。

[0110] 用于离体机器保存的器官获取和胰腺插管的手术过程可以强烈影响用于胰岛分离的猪胰腺低温灌注的成功。猪胰腺手术恢复方法的发展不是明显的过程。最初，缺乏详细猪胰腺解剖学记录造成胰腺获取中不合适的器官血管系统保存。不充分的器官获取造成不一致和不完整的胰腺机器灌注，因而产生低胰岛产率和活力。

[0111] 直到最近，猪胰腺的解剖学才得到良好记载。在生理上和形貌上，认为猪和人胰岛相似。所述胰腺是如图1所示延长的腹膜后腺体。在猪和人中，胰头与十二指肠近端密切关联，但是猪的胰腺管开口在十二指肠远端发现，并且与胆总管分开(Swindle,M.M.;Smith,A.C.Comparative anatomy and physiology of the pig（《猪的比较解剖学和生理学》）.Scand.J.Lab.Anim.Surg.23:1–10;1997)。源自脾、肝、胃十二指肠、肠系膜上和腹腔动脉的血管数目可变，其在个体基础上有非常规胰腺血液供应配置。通常，头部的血液由来自胃十二指肠的前和后动脉以及肠系膜上动脉提供(图1)。猪中，头部不围绕胰十二指肠的动脉和静脉—后者在头部和十二指肠之间，有容易鉴定的胰腺分支。胰腺颈和腺体通常由胰背动脉和胰下动脉血管化。前者源于脾、肝或直接来自腹腔动脉。所述胰下动脉可始于胰腺颈下面的肠系膜上动脉(SMA)并且与腺体密切接触、沿着胰腺表面的后下部边缘流向尾部。其能与不同数目的脾动脉分支联系。胰腺颈也是脾和肠系膜上静脉汇集处的门静脉位点。胰尾接受主要来自脾动脉的血液供应。

[0112] 在所述供体组织(胰腺)可灌注和/或连接到 灌注机器的实施方式中，胰腺的胃十二指肠和肝侧边缘上的所有暴露动脉分支应该小心鉴定和连接，以确保通过腺体的均一灌注，并且使流出物仅从门静脉出现。就胰岛分离而言胰腺灌注/保存的经证明最优手术方法描述于Taylor,M.J.等，Hypothermic perfusion of pancreas:Emphasis on preservation prior to islet isolation（《胰腺的低温灌注：着重胰岛分离前的保存》），收录于Lee,C.Y.编，Organ perfusion preservation（《器官灌注保存》）马萨诸塞州波士顿的阿泰克出版社（Artech House Publisher）;2010，其通过全文整体纳入本文。

[0113] 如Taylor等所述，示例性手术方法可以包含下列：1.胰腺获取的两个操作者组;2.遵循用于着装标准和个人保护设备的手术设施要求;3.OR兽医技师确证猪被插管和处于全身麻醉下(即氯胺酮22mg/kg、乙酰丙嗪0.2mg/kg和阿托品0.025mg/kg);OR兽医技师确证维持猪的麻醉和合适的通气;4.OR兽医技师证实监测所有的生命体征(ECG、心率、氧饱和水平、体温等);5.证实电刀、抽吸线和罐是可用的。6.OR证实合适准备了后场手术台(手术设备、手术巾（lap sponge）、纱布、冷盐水、全棉脐带线等);7.证实2L冷乳酸林格溶液置于冰上;8.证实操作台附近可用I.V.杆，并且其高度对重力驱动的器官原位冲洗合适(约6–约6.5英尺);9.从OR兽医技师获得进行手术的许可;10.使胰腺暴露于热缺血最小化到3分钟，除非另有需要;11.当授予许可时，从剑状软骨到刚好骨盆上面进行中线切口并且暴露腹腔;12.指导OR兽医技师向猪给予肝素(约150U/kg)，使在开始原位冲洗前通过至少三分钟;13.(在手术巾帮助下)移动膀胱和肠并且把它们放置一旁，和鉴定降主动脉;14.在肾下面从周围组织/血管中切开主动脉区段(约3cm)，在主动脉区段周围置入脐带胶布结;在两个结之间的主动脉上切一个小开口，而外科手术助理员向主动脉壁上施加压力以防止血液喷射出;15.主动脉插管插入所述开口并且在适当的位置打结(确保全棉脐带线牢固地置于套管（cannula）箍);16.把冲洗器的两个钉插入到乳酸林格溶液两个袋子的合适灌注口(确保辊夹具关闭以防止溶液损失);17.乳酸林格溶液的袋子悬挂在I.V.杆上并且冲洗冲洗器管以合适去除所有空气;关闭辊夹具;18.下腔静脉和主动脉在隔膜上阻断;19.连接套管的胰岛开口与冲洗器流出口，并且打开辊夹具以开始重力驱动的原位冲洗;20.在隔膜上、夹具下游切开下腔静脉，以使血液流出;21.在腹腔内胰腺和肝周围立即放置充足的冰，以在低温下维持/保护器官;22.使用吸入管和容器收集洗出的血液;23.确保来自所述袋通过套管进入主动脉的溶液流没有被阻断，并且从下腔静脉流出;24.当清空时，从I.V.杆除去乳酸林格溶液袋，并且悬挂SPS-1溶液袋(预先保存在冰上)，使用仅一半的SPS-1溶液体积冲洗器官;25.指导OR兽医技师使用静脉内给予致死剂量的5%戊巴比妥钠对猪施以安乐死(根据美国兽医协会组安乐死委员会（American Veterinary Medical Association Panel on Euthanasia(AVMA)）指南可接受的安乐死形式)并且完成原位冲洗;26.把SPS-1溶液袋的另一半转移到胰腺运输生物危险品袋中，并且把后者置于冰上;27.小心并快速(小于15分钟)进行暴露并且解剖分离胰腺与周围组织和器官(如需要，内脏器官周围加上冰)，确保维持胰腺囊和完整性;28.使十二指肠近端的区段(幽门附近，并且包含大部分十二指肠第二降部分)连接到胰腺头;确保十二指肠区段包含胰腺管的开口(图1);29.脾脱落前，连接脾静脉和动脉;30.保持约5–约7cm长的主动脉片段连接到用于未来器官插管的胰腺上;所述主动脉片段应该包含肠系膜上动脉(SMA)和腹腔干(CT)的开口;31.从身体除去胰腺，并且有连接其上的主动脉插管，使用冷盐水从胰腺外表面快速洗去血液；将胰腺浸入运输袋的SPS-1溶液中;32.将有胰腺的袋置于冰上，在胰腺冷却器内以运输到胰岛分离实验室。

[0114] 在所述供体组织(胰腺)可灌注和/或连接到 灌注机器的实施方式中，用于机器灌注的示例性胰腺插管方法可以包含：1.对胰腺清洁和插管推荐两个操作者组;2.在分离实验室进行胰腺插管以在机器灌注前降低静态冷缺血损伤;3.使胰腺暴露于静态冷缺血最小化到小于2小时，静态冷缺血时间是从开始原位冲洗到开始机器灌注的时间;4.将胰腺从运输冷却器转移到不锈钢手术盘中;把后者置于冰上并且从运输袋分配约
20-30mL的SPS-1溶液到所述盘以帮助保持胰腺湿润和冷;5.除去主动脉插管;除去所有的混杂组织，同时密切关注维持胰腺完整性;鉴定和暴露SMA和CT血管;6.在中线切开主动脉片段，以暴露SMA和CT孔，此时所述SMA和CT孔应该在与主动脉口分开的位置清楚看到(1.5cm x4cm);7.在合适位置放置和固定适当尺寸的环形密封套管，正确的尺寸应该包含没有阻塞的SMA和CT孔，并且使其通过套管的顶部清晰孔而清楚可见;8.测试泄漏;向
20cc注射器填充用于灌注的溶液，连接注射器到套管的一端，除去套管内的空气，并且覆盖套管的另一端，溶液温和注入胰腺中，并且鉴定已暴露血管的任意泄露;9.在胰腺的胃十二指肠和肝侧边缘上仔细鉴定和连接所有暴露的泄露动脉分支(使用合适的全棉脐带线和/或丝结);10.插管到胰腺管;从蝶翼输液器中移出针并且使用其管作为所述管的套管;使用微外科手术剪在胰腺管的十二指肠起始位点上开口并且插入套管;通过紧密缝合到十二指肠壁而将后者固定在合适位置上;11.测量和记录胰腺重量(减去插管重量)、质量(减去插管质量)、体积、周长、和/或浮力。

[0115] 胰腺的肝和胃十二指肠侧上所有暴露血管的鉴定和紧密连接都很重要。灌注前通常结扎约12–约14血管以就整个器官中流动而言消除‘最小抗性’通路的可能性，并且使流出物仅从门静脉出现。所打开血管的泄露损害器官灌注的均匀性，进而造成通过器官表面的压力和温度梯度，以及次优胰腺保存。

[0116] 应用胰腺机器灌注的示例性方法可包含以下(图2)：1.用冰和冷水混合物填充冰TM容器(参考LifePort 操作手册)，把容器置于运输器主要附件中;2.将器官盒置于盒孔中，在泵座上安装灌注回路管框架，并且关闭铝锁臂，连接压力传感器与压力换能器;3.按下电源(POWER)以打开运输器的用户控制并按照外显示方向以使运输器可用于灌注;4.加入1L冷灌注溶液到器官盒;在控制面板上设定输注压力为约10mmHg，证明如外显示器所示的冰容器温度低于约8°C;5.按下洗涤(WASH)以开启泵和使灌注液循环通过回路;确保回路中除去所有空气;6.将腺(有连接的十二指肠)置于盒内，并且把器官套管置于支架的套管座（mount），连接套管入口孔与输注线，并且打开套管出口孔;7.按下初次（PRIME）以从套管和输注线中除去空气，并且然后盖上套管;根据检测的抗性，后者会停止流动和泵;8.按下停止（STOP）;按下输注（INFUSE）以起始胰腺灌注模式，监测泵以开始旋转并且增加其速度，直到达到压力设定点(如约10mm Hg);9.确保在外显示器和数据站实时观察和记录流动参数，外部面板所示的灌注参数是：压力设定点(收缩压,mmHg)、流速(mL/min)、抗性(mmHg/(mL/min))、温度(°C,在运输器的绝缘冷部分内，即冰容器)，以读取输注温度(°C)，并且舒张压(mmHg)压迫外显示器右侧的滚动箭头以通过这些其他参数顺序拴牢;10.使胰腺灌注需要的时间量，例如小于约24h(或范围约4h–约24h，例如约8h–约16h)，或约24h或更长，或者在约24h-约48h范围内;停止泵，并且保存数据文件(包含所有灌注参数动态);11.从盒中除去胰腺;测量灌注后胰腺重量、质量、周长、浮力、体积，并且记录;测定器官内流动积累的水平(水肿%)。

[0117] 实施例

[0118] 切除来自年轻猪(<6月龄)的胰腺，用保存溶液冲洗，低温保存1–24小时，通过导管输注胶原酶延长以将腺体分离成腺泡(外分泌)组织和胰岛(内分泌)，并且最终在密度梯度上进行消化以纯化胰岛。实施后一过程，从而没有尝试胰岛的全部纯化。图3显示上面过程产生70-80%纯胰岛。通过(可见和/或实立体镜)监测计算胰岛包围的面积与培养基中外分泌组织和内分泌组织总面积之比来评价胰岛的纯度。图4显示了24小时低温机器灌注(HMP)后，在由年轻胰腺所制备不成熟胰岛的分离后培养中观察到的塑性。所述组织在专门Wilson-Wolfe烧瓶(明尼苏达州威尔森沃尔夫制造公司)中37°C培育，其中所述组织位于硅胶膜表面以帮助与环境的氧交换。图4的各个图显示分离后1周培养中各个时间点的内分泌表观(用双硫腙染成红色)和外分泌表观(未染色的灰褐色)—图4(A-H):A:24小时(x100);B:24小时(x100);C:48小时(x100);D:48小时(x200);E:5天(x100);F:6天(x100);G:6天(x200);H:6天(x100)。

[0119] 有趣的是，在培养的前24小时内，所述胰岛的总体形态改变(比较图4A和4B中24h培养胰岛的更松散、更片段化的特性，与紧接分离后第0天胰岛的“葡萄样”簇相比较)。
组织从24小时的松散分解外观转换成第6天包含外分泌和内分泌细胞的更浓缩聚集结构。
这与来自成年种类的胰岛通常性质明显不同，其在整个培养期间单独维持胰岛和分离后结构。在培养成年胰岛中，污染外分泌组织易于通过自溶崩解和消失，留下个体胰岛的甚至更纯制品。相反，来自未成熟猪的组织似乎重新聚集成与自然胰腺共存的、包含内分泌和外分泌细胞的更大且新型结构–因此的术语“pancreatite”。这些结构后续以各种体外和体内(图5)活力测试进行，并且显示了在响应葡萄糖攻击的胰岛素分泌方面有全部功能。图5显示了通过移植猪pancreatite置于肾小囊下而治愈了免疫受损小鼠的糖尿病病症。传统组织学的进一步分析会确证这些pancreatite的结构组成。