分泌表达葡萄糖氧化酶的方法、重组菌及其应用 |
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| 申请号 | CN201710796403.5 | 申请日 | 2017-09-06 | 公开(公告)号 | CN107475212A | 公开(公告)日 | 2017-12-15 |
| 申请人 | 华东理工大学; | 发明人 | 钱江潮; 魏东升; 王泽建; 段广东; 吴凡; 储炬; 庄英萍; 张嗣良; 肖慈英; 黎亮; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及分泌表达 葡萄糖 氧 化酶 (GOD)的方法、重组菌及其应用，揭示一种能够有效促进GOD表达、提高其酶活的方法，通过在 酵母 菌中共表达GOD基因和PDI1基因或PDI3基因来实现。同时，本发明还提供了以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主构建的高效分泌GOD的重组菌。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种利用酵母细胞表达葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于，所述方法包括： |
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| 说明书全文 | 分泌表达葡萄糖氧化酶的方法、重组菌及其应用技术领域背景技术[0002] 葡萄糖氧化酶(Glucose oxidase，GOD)广泛应用于食品、化工、医药、生物技术等领域。 [0003] 基于葡萄糖氧化酶催化反应的特异性，可用于生物传感器。葡萄糖氧化酶是用来检测血液中葡萄糖浓度传感器的核心成分，固定在传感器电极上的GOD可将血液中微量的葡萄糖转化成容易测定的过氧化氢，铂电极检测到的过氧化氢越多，电信号就越强。 [0005] 葡萄糖氧化酶广泛应用于食品行业中。用于食品除氧保鲜，在商品真空袋中加入少许葡萄糖氧化酶和葡萄糖，可以将真空袋中氧气耗尽，从而抑制微生物的生长和繁殖，延长食品的保质期。去除蛋白制品中的葡萄糖。鸡蛋的蛋白中含有0.5～0.6％的葡萄糖，在贮存和加工的过程中，葡萄糖的羰基和蛋白质的氨基发生了梅拉德反应，会在蛋白中出现小黑点。加入GOD可以消耗掉葡萄糖，从而保证蛋白质的质量。可作为食品添加剂加入到面粉中。Bonet等发现，GOD能够和面团中的葡萄糖反应，产生过氧化氢，在过氧化氢的帮助下，面筋蛋白可以形成二硫键，进而形成复杂的网络结构，这种结构能够增强面团的劲道，提升面制品的口感。此外，过氧化氢还能够改变面粉的色泽，使面制品的外貌变得美观。 [0006] 在纺织业中，GOD常被应用于漂白脱色工艺。由于GOD催化β-D-葡萄糖的过程中，产生了强氧化性的过氧化氢，很难重复使用GOD。Tzanov等人将GOD共价固定在矾土和玻璃支撑物上，提高酶重复利用率。大约450分钟后，固定在玻璃支撑物的最大过氧化氢浓度达到了0.35g/L，而在矾土上是0.24g/L，与标准漂白工艺相比，纺织品上的过氧化氢浓度大致在同一水平，增加了GOD的重复使用率。 [0007] GOD在低酒精酿造工艺中有很大的潜力。在白酒生产中加入葡萄糖氧化酶后，发现白酒中的酒精含量降低了2％，使白酒变得口味纯正，不产生沉淀、浑浊等现象。发酵过程中，GOD能够杀死乙酸菌和乳酸菌，GOD的杀菌作用意味着GOD不能广泛应用在酿酒生产中，Pickering等使用GOD/CAT双酶系统处理葡萄汁，降低了乙醇含量，87％的葡萄糖转化成葡萄糖酸。 [0008] 现阶段，葡萄糖氧化酶还被应用在生物燃料电池行业中，将过氧化氢酶和GOD固定在同一电极上，由于GOD催化葡萄糖反应是氧化还原反应，所以电子能够转移到另一端的碳电极上，从而形成了绿色环保的生物燃料电池，可以为生物传感器和人造器官提供持续的能源。 [0010] 葡萄糖酸及其衍生物广泛应用在保健品行业中，而GOD作为葡萄糖酸生产中的关键酶，既可以单独使用进行酶法生产，也可以在利用黑曲霉生产的过程中通过添加GOD来快速合成葡萄酸，提高葡萄糖酸的产量。 [0011] 目前，本领域通过微生物发酵的方法生产GOD，但是，利用黑曲霉或青霉发酵生产GOD存在着酶产量低、分离纯化胞内酶困难等问题。而利用大肠杆菌生产GOD，无法对GOD进行翻译后加工，合成的GOD无活性。本领域技术人员也利用毕赤酵母生产GOD，但是产量及酶活性尚不够理想，还需要进一步地优化GOD的生产工艺。 发明内容[0012] 本发明的目的在于提供一种分泌表达葡萄糖氧化酶的方法、重组菌及其应用。 [0013] 在本发明的第一方面，提供一种利用酵母细胞表达葡萄糖氧化酶的方法，所述方法包括： [0014] (1)在酵母细胞中引入外源的葡萄糖氧化酶编码基因； [0015] (2)在步骤(1)的酵母细胞中引入外源的选自下组的至少一种基因：PDI1编码基因，PDI3编码基因； [0016] (3)培养步骤(2)的酵母细胞，表达葡萄糖氧化酶，所述的葡萄糖氧化酶为高酶活的葡萄糖氧化酶。 [0017] 在一个优选例中，葡萄糖氧化酶编码基因，PDI1编码基因或PDI3编码基因通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中。 [0018] 在另一优选例中，所述方法包括： [0019] (1)提供表达载体，所述表达载体中包含葡萄糖氧化酶编码基因的序列，将该表达载体转入到酵母细胞中； [0020] (2)提供表达载体，所述表达载体中包含PDI1编码基因或PDI3编码基因的序列，将该表达载体转入到步骤(1)的酵母细胞中； [0021] (3)培养步骤(2)的酵母细胞，表达葡萄糖氧化酶。 [0022] 在另一优选例中，所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。 [0023] 在另一优选例中，以AOX1启动子驱动外源的葡萄糖氧化酶编码基因的表达，以AOX1启动子驱动外源的PDI3编码基因的表达。 [0024] 在本发明的另一方面，提供一种制备高酶活的葡萄糖氧化酶的表达细胞的方法，所述方法包括： [0025] (1)在酵母细胞中引入外源的葡萄糖氧化酶编码基因； [0026] (2)在步骤(1)的酵母细胞中引入外源的选自下组的至少一种基因：PDI1编码基因，PDI3编码基因； [0027] (3)分离出携带有外源的葡萄糖氧化酶编码基因，外源的选自下组的至少一种基因：PDI1编码基因，PDI3编码基因的重组酵母细胞。 [0028] 在本发明的另一方面，提供一种高酶活的葡萄糖氧化酶的表达细胞，其是酵母细胞，其基因组中整合有： [0029] 外源的葡萄糖氧化酶编码基因(较佳地，其以AOX1启动子驱动表达)；以及外源的选自下组的至少一种基因：PDI1编码基因，PDI3编码基因(较佳地，其以AOX1启动子驱动表达)。 [0030] 在另一优选例中，所述的外源的葡萄糖氧化酶编码基因，外源的PDI1编码基因或PDI3编码基因通过同源重组的方式整合到酵母细胞的基因组中。较佳地，所述的细胞是通过前面所述的方法制备获得。 [0033] 图1、构建GOD分泌表达载体pPIC9K-GOD的构建流程图。 [0034] 图2、PCR扩增GOD基因。 [0035] Lane M：Marker 5,000； [0036] Lane1，2：以质粒pUC57-GOD为模板，GODF/GODR为引物。 [0037] 图3、酶切验证质粒pPIC9K-GOD。 [0038] Lane M：Marker 15,000； [0039] Lane1：pPIC9K-GOD经BamH I和SalI消化(3982bp and 7037bp)。 [0040] 图4、PCR验证重组菌G/GODM。 [0041] Lane M：Marker 5,000；Lane 1：以P.pastoris GS115基因组DNA为模板； [0042] Lane 2、3：以重组菌G/GODM基因组DNA为模板。 [0043] Lane1、2、3：以GODF/GODR为引物。 [0044] 图5、表达载体pAOX-P1、pAOX-P2、pAOX-P3、pAOX-B1、pAOX-B2的构建的示意图。 [0045] 图6、表达载体pAOX-P1、pAOX-P2、pAOX-P3、pAOX-B1、pAOX-B2的双酶切验证。 [0046] Lane M：Marker 15,000； [0047] Lane 1：pAOX-P1经XhoΙ和NotΙ消化； [0048] Lane 2：pAOX-P2经XhoΙ和NotΙ消化； [0049] Lane 3：pAOX-P3经XhoΙ和NotΙ消化。 [0050] Lane 4：pAOX-B1经XhoΙ和NotΙ消化； [0051] Lane 5：pAOX-B2经XhoΙ和NotΙ消化； [0052] 图7、重组菌G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2的构建过程(X代表PDI1、PDI2、PDI3、BIP1、BIP2编码基因)。 [0053] 图8、PCR验证共表达分子伴侣的GOD重组菌。 [0054] A，重组菌RH位点整合验证。Lane M：2,000bp；Lane 1、2、3、4、5：分别以G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2的基因组DNA为模板，以RHF/AOXR为引物。 [0055] B，重组菌DDKC位点整合验证。Lane M：2,000bp；Lane 1、2、3、4、5：分别以G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2的基因组DNA为模板，以CYCTTF2/DDKCR2引物。 [0056] 图9、重组菌G/GODM、G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2在培养基BMMY中的生长曲线。 [0057] 图10、重组菌G/GODM、G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2胞外(A)、胞内(B)比活；以及重组菌G/GMZ1、G/GMG3胞外比活(C)。 [0058] 图11、120h重组菌G/GODM、G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2以及重组菌G/GMZ1、G/GMG3的酶活水平。 具体实施方式[0059] 为了实现GOD的高效生产，本发明以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主，通过代谢工程研究构建高效分泌表达GOD的重组菌，经过深入的研究和大量的筛选，开发了一种能够有效促进GOD分泌表达、提高其酶活的方法，所述方法通过在酵母细胞共表达GOD和选自PDI1基因或PDI3基因的至少一种基因，以此实现GOD的高效表达。同时，本发明还提供了以毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主构建的高效分泌GOD的重组菌。 [0060] 如本文所用，“外源的”或“异源的”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。 [0061] 所述的“启动子”是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。 [0062] 如本文所用，“PDI1”、“PDI3”基因是用于重组表达于酵母细胞中以外的基因，还包括在严格条件下与所述基因序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。该定义中还包含在严格条件下与“PDI1”、“PDI3”杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子。 [0063] 如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。 [0064] 本发明中所述的“PDI1”基因的核苷酸序列(PAS_chr4_0844)如SEQ ID NO:1所示，或者，也可以是其简并的序列。本发明还涉及“PDI1”的多核苷酸变异体，其编码与野生型基因编码的氨基酸序列相同的多肽(酶)。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。 [0065] 本发明中所述的“PDI3”基因的核苷酸序列(PAS_chr-1_0160)如SEQ ID NO:2所示，也可以是其简并的序列。本发明还涉及“PDI3”的多核苷酸变异体，其编码与野生型基因编码的氨基酸序列相同的多肽(酶)。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。 [0066] 本发明中所述的“GOD”基因编码的氨基酸序列(Uniprot：P13006)如SEQ ID NO:3(来自黑曲霉)所示，其前22位为信号肽序列。本发明还涉及“GOD”的多核苷酸变异体，其编码与野生型基因编码的氨基酸序列相同的多肽(酶)。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。 [0067] 本发明的“PDI1”、“PDI3”的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。 [0068] 为了提高葡萄糖氧化酶在重组表达后的酶活性，本发明人作了广泛的研究，找到了适合于进行改良的基因，并构建了相应的构建物。 [0069] 因此，本发明提供了一种构建物，所述构建物包括外源的“GOD基因”和外源的“PDI1”的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有元件(包括启动子、编码DNA以及终止子等)，从而可完整地表达出相应的蛋白。 [0070] 本发明还提供了一种构建物，所述构建物包括外源的“GOD基因”和外源的“PDI3”基因的表达盒。所述的表达盒具备基因表达所需的所有必要元件(包括启动子、编码DNA以及终止子等)，从而可完整地表达出相应的蛋白。 [0071] 通常，所述的构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的构建物。所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。 [0072] 应理解，只要能够实现在酵母细胞中增加“GOD基因”、“PDI1”或“PDI3”的表达，多种重组表达“GOD基因”、“PDI1”或“PDI3”的方式均可选用的。作为本发明的优选方式，GOD基因、“PDI1”或“PDI3”被通过同源重组的方式被整合到酵母细胞的基因组中。 [0073] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性。 [0074] 可采用适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。本发明的表达载体在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。 [0075] 包含上述的适当多核苷酸序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主。在本发明的方法中，所述的宿主是酵母细胞。 [0077] 本发明的方法简单易行，生产效率很高。并且，本发明的结果表明，本发明的重组酵母细胞生产的GOD的酶活性显著提高。与仅表达GOD相比，本发明所述方法可提高GOD的单位菌体酶活约8％以上；更佳地约32％以上。与仅表达GOD相比，本发明所述方法可提高GOD的胞外单位体积产量约11％以上；更佳地约33％以上。 [0078] 本发明还提供了包含有本发明所构建的重组表达载体以及酵母细胞的试剂盒；或者包含本发明所构建的重组酵母细胞的试剂盒。 [0079] 其它常用于进行转基因操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用。 [0081] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。 [0082] 1、材料和方法 [0083] 1.1质粒 [0084] 本发明所用质粒见表1。 [0085] 表1、质粒 [0086] [0087] [0088] 1.2菌株 [0089] 本发明中所用菌株见表2。 [0090] 表2、菌株 [0091] [0092] [0093] 1.3引物 [0094] 本发明中用引物见表3。 [0095] 表3、引物 [0096] [0097] [0098] 1.4培养基 [0099] 1.LB液体培养基： [0100] 20g/L胰蛋白胨，10g/L酵母提取物，10g/L NaCl。 [0101] 固体LB培养基的配制需要补加2％的琼脂糖粉；LB抗性培养基可以加入适当浓度的抗生素。 [0102] 2.YPD液体培养基： [0103] 20g/L胰蛋白胨，20g/L葡萄糖，10g/L酵母提取物。 [0104] 固体YPD培养基的配制需要补加2％的琼脂糖粉；YPD抗性培养基可以加入适当浓度的抗生素。 [0105] 3.YPG液体培养基： [0106] 20g/L胰蛋白胨，10g/L甘油，10g/L酵母提取物。 [0107] 4.MD固体培养基： [0108] 20g/L葡萄糖，0.4mg/L生物素，13.4g/L YNB，20g/L琼脂粉。 [0109] 5.BMGY液体培养基 [0110] 10g/L甘油，10g/L酵母提取物，20g/L Peptone，13.4g/L YNB，0.1M pH＝6K2HPO4/KH2PO4缓冲液。 [0111] 6.BMMY液体培养基： [0112] 1％甲醇，10g/L酵母提取物，20g/L Peptone，13.4g/L YNB，0.1M pH＝6K2HPO4/KH2PO4缓冲液。 [0113] 1.5培养方法 [0115] 试管培养：从培养皿中，挑取单菌落毕赤酵母细胞，接种到盛有3mL的YPD的试管中，于30℃、220rpm恒温摇床中培养约18～24h。 [0116] 摇瓶培养：将重组菌接种到盛有25mL的BMGY培养基中，于30℃、220rpm条件下培养约18h，至OD600＝4～6之间；转移菌液至无菌的50mL离心管中，于4℃、4000rpm条件下离心5min，用BMMY培养基重悬菌体，并调节OD600在1左右，然后，转移至盛有50mL BMMY培养基的 500mL摇瓶中进行诱导培养，每隔24h取样，并补充1％的甲醇。 [0117] 1.6检测分析方法 [0118] 1.菌体干重的测定 [0119] 取发酵液，稀释到一定的倍数，然后在波长为600处时，测定OD600＝OD读数×稀释倍2 数n；根据OD600和菌体干重的关系：DCW(g/L)＝0.24×OD600+1.23(R＝0.994)，计算DCW。 [0120] 1.7葡萄糖氧化酶GOD酶活测定 [0121] 发酵液处理：将发酵液在12000rpm条件下离心5min，转移发酵上清液到1.5mL的EP中，测定酶活；然后将菌体用YeastBuster Protein Extraction Reagent重悬，放在摇板上室温条件下孵育30min，然后离心，取上清液于1.5mL EP管中，测定胞内酶活。 [0122] 终点法测定GOD酶活：在10mL离心管中依次加入2.5mL的0.21mM的邻联茴香胺，0.3mL的18％葡萄糖，0.1mL的90U/mL的辣根过氧化物酶，37℃保温5min后，向离心管中加入V0酶液，反应3min后，加入2mol/L硫酸终止反应，取出离心管，测定OD500的吸光值。 [0123] 将GOD标准品稀释成0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0U/mL，按照GOD酶活测定方法，测定反应3min后的OD500值，以OD500值为横坐标，以GOD酶活为纵坐标，绘制标准曲线用于计算酶活：GOD酶活(U/mL)＝(0.1578×OD500-0.0033)×V/V0，其中V为反应总体积，V0为加入酶的体积。 [0124] GOD酶活定义：在37℃下，每分钟催化1μmol的β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸的酶量为1个单位酶活U。 [0125] 实施例1、重组菌株的构建 [0126] 1、重组菌G/GODM的构建 [0127] 为了进行葡萄糖氧化酶在毕赤酵母中分泌表达，本发明人选择了pPIC9K载体。以pUC57-GOD为模版，通过PCR，在GOD序列5’端引入EcoRΙ，3’端引入NotΙ，经过酶切，与同样酶切的pPIC9K连接，构建流程图如图1。更具体地，以质粒pUC57-GOD(GOD核酸序列连接在pUC57上)为模板，使用引物GODF和GODR，通过PCR制备目的片段GOD(1749bp，见图2)，同时引入EcoRΙ和NotΙ两个酶切位点，使用限制性内切酶分别线性化扩增产物和pPIC9K载体，然后进行连接反应，最后，通过热击转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布在含有Ampicillin抗性的LB培养皿上。 [0128] 从Ampicillin抗性平板上挑取重组大肠杆菌的阳性克隆，进行扩增培养后，抽提质粒并使用BamHI和SalI双酶切验证，从图3可知，pPIC9K-GOD经过酶切后出现的条带大小与预期大小一致，送往测序公司测序，经比对，测序结果与目的基因的预期结果一致。质粒pPIC9K-GOD构建成功。 [0129] 将酶切验证正确的质粒pPIC9K-GOD，用限制性内切酶SalI线性化，并纯化，通过电击转化进入毕赤酵母GS115感受态细胞中，通过同源重组的方法整合到GS115的基因组上，利用GS115的组氨酸缺陷型特征和重组菌可以在不含组氨酸的培养皿上生长的原理，在MD固体培养基培养皿上筛选重组菌，挑取MD培养皿上的单菌落，使用引物GODF/GODR，进行菌落PCR验证重组菌(图4)，并经测序验证重组菌G/GOD构建成功。 [0130] 使用无菌水洗涤收集MD培养皿中的重组菌，并涂布在含有不同抗生素浓度G418(0、0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、1.75、2.0、3.0、4.0mg/mL)的YPD培养皿上，筛选获得高拷贝重组菌G/GODM。 [0131] 2、重组菌G/GMP1、G/GMP3的构建 [0132] 基于重组菌G/GODM，本发明人选取P.pastoris GS115上RH(PAS_chr-4_0191)和DDKC(PAS_chr-4_0192)为同源重组位点，将PDI1、PDI2、PDI3、BIP1、BIP2、zwf1、gdh3通过同源重组的方式整合到P.pastoris基因组上，其重组原理见图6，其中的X代表PDI1、PDI2、PDI3、BIP1、BIP2、zwf1、gdh3。 [0133] 构建共表达菌，以pAOX-SSN为起始载体，在SacΙΙ和NotI中插入PDI1、PDI2、PDI3、BIP1、BIP2、zwf1、gdh3。获得重组的pAOX-P1、pAOX-P1、pAOX-P2、pAOX-P3、pAOX-B1、pAOX-B2、pAOX-zwf1、pAOX-gdh3，所述质粒构建示意图如图5。直接利用上述构建的质粒，将它们转化到大肠杆菌中，培养菌株，抽提质粒，使用XhoI和NotI酶切质粒，经电泳验证后用于转化重组菌，其中pAOX-P1、pAOX-P3等的双酶切验证如图7。 [0134] 表达载体pAOX-P1和pAOX-P3经XhoΙ/EcoRΙ双酶切后，分离纯化得到用于同源重组的片段，电击转化重组菌G/GODM感受态细胞，从含有Zeocin抗性的YPD平板上挑取转化子，以RHF/pAOXR和CYCTTF2/DDKCR2为引物，通过菌落PCR验证阳性重组菌G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2、G/GMZ1、G/GMG3，如图8。并测序验证，由核酸电泳和测序结果知，重组菌G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2、G/GMZ1、G/GMG3等菌株构建成功。 [0135] 实施例2、重组菌性能考察 [0136] 挑取验证正确的转化子G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2、G/GMZ1、G/GMG3，接种到盛有3mL YPG培养基的试管中，培养约18h后，转接到含有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶中，富集培养至OD600为4～6，收集菌体，接种到含有50mL BMMY培养基的500mL摇瓶中培养，起始OD600＝1，每隔24h补充1％的甲醇溶液，同时取样测定OD600，考察共表达PDI1、PDI2、PDI3等基因对重组菌的生长影响、酶活变化等。 [0137] 1、菌体生长 [0138] 由图9可知，重组菌G/GMP1、G/GMP3生长趋势和出发菌G/GODM十分接近，平均比生长速率μ在0.039h-1左右，说明共表达基因PDI1、PDI3的表达并不影响菌体生长。 [0139] 菌株G/GMP1、G/GMP2、G/GMP3、G/GMB1、G/GMB2、G/GMZ1、G/GMG3的生长和对照菌G/GODM的生长趋势接近。 [0140] 2、酶活 [0141] 由图10A可知，诱导120h时，G/GMP1、G/GMP3的单位菌体酶活为7753.58U/g·DCW和6363.72U/g·DCW，分别比G/GODM酶活提高了32.7％和8.9％，因此，PDI1和PDI3的表达能够促进GOD正确而高效地被分泌。 [0142] 从GOD胞内表达量可知(图10B)，在诱导96h时，胞内单位菌体酶活达到最大值，但重组菌G/GMP1、G/GMP3和G/GODM胞内表达水平无明显差异，最高胞内表达水平在1850～2350U/g·DCW之间。 [0143] 按单位体积产酶水平计算重组菌G/GMP1和G/GMP3的产量，从图11及表4可知，诱导120h时，重组菌G/GMP1、G/GMP3的GOD胞外单位体积产量为68.88、57.28U/mL，分别比出发菌株G/GODM提高了33.8％、11.3％。胞内单位体积酶活基本相同。重组菌G/GMP1、G/GMP3的分泌率为77.0％、76.5％，比G/GODM(74.6％)的分泌率分别提高了3.3％、2.6％。但是，菌株G/GMP2、G/GMB1、G/GMB2、G/GMZ1、G/GMG3，则并未发现能够提高GOD酶活的情形。 [0144] 表4、重组菌的GOD表达 [0145] [0146] [0147] 因此，共表达GOD以及PDI1或PDI3之一，可高效地进行GOD的分泌表达。 |
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