[0001] 本分案申请是基于申请号为201080046746.6、申请日为2010年9 月1日、申请人为“巴斯夫农业化学产品公司”、发明名称为“耐受 除草剂的植物”的原始中国专利申请(原国际申请号为 PCT/US2010/047571)的分案申请。

[0002] 发明背景

[0003] 水稻是世界上(特别是亚洲)最重要的粮食作物之一。稻米是由 稻属(Oryza)的植物产生的谷粒。两种最常栽培的物种是稻(Oryza sativa)和光稃稻(Oryza glaberrima)，其中稻是最常栽培的驯化 水稻。除了这两种驯化物种外，稻属还包括超过20种野生物种。这些 野生物种之一，普通野生稻(Oryza rufipogon)(“红稻”，其也称 为稻红芒亚种(Oryza sativa subsp.rufipogon))，在商业栽培中 具有一个主要问题。红稻产生红色的被覆种子。在收获后，碾磨水稻 种子以除去其谷壳。在碾磨后，驯化水稻是白色的，而野生红稻看起 来脱了色。脱色的种子的存在降低了水稻作物的价值。由于红稻属于 与栽培水稻(稻(Oryza sativa))相同的物种，因此它们的遗传组 成是非常相似的。该遗传相似性使红稻的除草剂控制变得困难。

[0004] 已经开发了耐受咪唑啉酮类除草剂的驯化水稻，并且目前以商品 名进行销售。咪唑啉酮类除草剂抑制植物的乙酰羟酸合 酶(AHAS)。当栽培 水
稻时，可以通过施用咪唑啉酮类 除草剂来控制红稻和其他杂草。不幸的是，已经产生了耐受咪唑啉酮 类除草剂的红稻。

[0005] 乙酰辅酶A羧化酶(ACCase；EC 6.4.1.2)合成丙二酸单酰CoA 作为植物叶绿体中脂肪酸从头合成途径的起始。禾草叶绿体中的ACCase是多功能的、由核基因组编码的、非常大的单多肽，其经由N- 末端转运肽而被运输到质体中。禾草叶绿体中的活性形式为同聚体蛋 白质，可能是同源二聚体。

[0006] 禾草中的ACCase被三种类别的除草活性成分所抑制。两种最普遍 的类别是芳氧苯氧丙酸酯类(“FOP类(FOPs)”)和环己烯酮类(“DIM 类(DIMs)”)。除了这两种类别外，还已经描述了第三种类别，苯 基吡唑啉类(“DEN类(DENs)”)。

[0007] 在展示出对于一种或多种DIM或FOP除草剂的耐受性的单子叶杂 草物种中已经发现了众多的ACCase抑制剂耐受性(AIT)突变。而且， 已经由BASF销售了AIT玉米。所有此类突变均在ACCase的羧基转移 酶结构域中被发现，并且这些突变看起来位于底物结合口袋中，从而 改变了对催化位点的接近。

[0008] DIMs和FOPs是重要的除草剂，并且如果能够提供展现出对这些 类别的除草剂的耐受性的水稻，那将是有利的。目前，这些类别的除 草剂在稻作农业中具有有限的价值。在一些情况下，诱导除草剂耐受 性的突变在耐受性植物中产生严重的适合度惩罚(fitness penalty)。 因此，在本领域中仍然存在有对于还不展示出适合度惩罚的AIT水稻 的需要。这一需要和其他需要通过本发明而得到满足。

[0009] 发明简述

[0010] 本发明涉及耐受除草剂的植物，以及产生和处理耐受除草剂的植 物的方法。在一个实施方案中，本发明提供了水稻植物，所述水稻植 物耐受处于通常会抑制水稻植物生长的除草剂水平的至少一种抑制乙 酰辅酶A羧化酶活性的除草剂。一般地，本发明的耐受除草剂的水稻 植物表达这样的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，所述乙酰辅酶A羧化 酶中的氨基酸序列不同于野生型水稻植物的乙酰辅酶A羧化酶的氨基 酸序列。按照惯例，单子叶植物ACCase氨基酸残基中的突变通常根据 其在大穗看麦娘(Alopecurus myosuroides)(黑草)质体的单体ACCase序列(Genbank CAC84161.1)中的位置来称呼，并用(Am)标示。 在其之处本发明的耐受除草剂的植物的乙酰辅酶A羧化酶不同于相应 野生型植物的乙酰辅酶A羧化酶的这样的氨基酸位置的实例包括但不 限于下列位置中的一个或多个：1781(Am)、1785(Am)、1786(Am)、 1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、1999(Am)、2027(Am)、2039(Am)、 2041(Am)、2049(Am)、2059(Am)、2074(Am)、2075(Am)、2078(Am)、 2079(Am)、2080(Am)、2081(Am)、2088(Am)、2095(Am)、2096(Am)或 2098(Am)。在这些氨基酸位置处的差异的实例包括但不限于下列中的 一个或多个：在位置1781(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他 氨基酸；在位置1785(Am)处的氨基酸为除了丙氨酸之外的其他氨基 酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为除了丙氨酸之外的其他氨基酸；在 位置1811(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 1824(Am)处的氨基酸为除了谷氨酰胺之外的其他氨基酸；在位置 1864(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 1999(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2027(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2039(Am)处的氨基酸为除了谷氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2041(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2049(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2059(Am)处的氨基酸为除了丙氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2074(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2075(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2078(Am)处的氨基酸为除了天冬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2079(Am)处的氨基酸为除了丝氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2080(Am)处的氨基酸为除了赖氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2081(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2088(Am)处的氨基酸为除了半胱氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2095(Am)处的氨基酸为除了赖氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2096(Am)处的氨基酸为除了甘氨酸之外的其他氨基酸；或者在位置2098(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸。在一些实施方 案中，本发明提供了水稻植物，所述水稻植物表达包含这样的氨基酸 序列的乙酰辅酶A羧化酶，所述氨基酸序列包含下列中的一个或多个： 在位置1781(Am)处的氨基酸为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸；在 位置1785(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为脯 氨酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置1824(Am)处的 氨基酸为脯氨酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置 1999(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或甘氨酸；在位置2027(Am)处的氨基 酸为半胱氨酸；在位置2039(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置2041(Am) 处的氨基酸为天冬酰胺；在位置2049(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在 位置2059(Am)处的氨基酸为缬氨酸；在位置2074(Am)处的氨基酸为亮 氨酸；在位置2075(Am)处的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸； 在位置2078(Am)处的氨基酸为甘氨酸或苏氨酸；在位置2079(Am)处的 氨基酸为苯丙氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置 2080(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2081(Am)处的氨基酸是缺失 的；在位置2088(Am)处的氨基酸为精氨酸或色氨酸；在位置2095(Am) 处的氨基酸为谷氨酸；在位置2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸或丝氨 酸；或者在位置2098(Am)处的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组 氨酸或丝氨酸。

[0011] 本发明还提供了产生耐受除草剂的植物的方法，和通过此类方法 产生的植物。通过本发明的方法产生的植物的实例为耐受除草剂的水 稻植物，其耐受处于通常会抑制所述植物生长的除草剂水平的至少一 种抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂，其中所述耐受除草剂的植物 通过下述方式来产生：a)从不耐受所述除草剂的植物获得细胞；b)使 所述细胞与包含一种或多种乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的培养基相接 触；和c)从所述细胞产生耐受除草剂的植物。通过本发明的方法产 生的耐受除草剂的植物包括但不限于，通过施行上述a)、b)和c)而产 生的耐受除草剂的植物，和通过施行上述a)、b)和c)而产生的植物的 后代。在一个实施方案中，用于实施该类型的方法的细胞将以愈伤组 织的形式存在。

[0012] 本发明提供了植物，所述植物表达包含确定的氨基酸序列的乙酰 辅酶A羧化酶。例如，本发明提供了水稻植物，其中所述水稻植物的 基因组中的一个或多个编码这样的蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO: 2和3之一或两者的经修饰形式，其中所述序列经修饰，从而所编码 的蛋白质包含下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的氨基酸为亮 氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸；在位置1785(Am)处的氨基酸为甘氨 酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为脯氨酸；在位置1811(Am)处的氨基 酸为天冬酰胺；在位置1824(Am)处的氨基酸为脯氨酸；在位置1864(Am) 处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置1999(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或甘 氨酸；在位置2027(Am)处的氨基酸为半胱氨酸；在位置2039(Am)处的 氨基酸为甘氨酸；
在位置2041(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置 2049(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置
2059(Am)处的氨基酸为缬氨 酸；在位置2074(Am)处的氨基酸为亮氨酸；在位置2075(Am)处的氨基 酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸；在位置2078(Am)处的氨基酸为甘 氨酸或苏氨酸；在位置2079(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置 2080(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸是缺失 的；在位置2081(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2088(Am)处的氨基 酸为精氨酸或色氨酸；在位置2095(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置 2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸或丝氨酸；或者在位置2098(Am)处的氨 基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸或丝氨酸。下面的图19提供 了大穗看麦娘乙酰辅酶A羧化酶序列(SEQ ID NO:
1)、籼稻(印度 稻)(Oryza sativa Indica)乙酰辅酶A羧化酶序列(SEQ ID NO:2) 和粳稻(日本稻)(Oryza sativa Japonica)乙酰辅酶A羧化酶序列 (SEQ ID NO:3)的比对，其中显示了这样的位置的实例，在所述位 置处野生型序列可不同于所示的本发明序列。

[0013] 在另一个实施方案中，本发明包括根据布达佩斯条约保藏在可接 受的保藏单位的种子，源自此类种子的细胞，从此类种子和源自此类 种子的细胞生长出的植物，从此类种子生长出的植物的后代，以及源 自此类后代的细胞。一般地，从所保藏的种子产生的植物和此类植物 的后代的生长将会耐受处于通常会抑制相应野生型植物生长的除草剂 水平的抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂。在一个实施方案中，本发明 提供了从由下述植物产生的种子生长出的水稻植物：品系OsHPHI2、 OsARWI1、OsARWI3、OsARWI8或OsHPHN1中任一个品系的植物，每个 品系的代表性种子样品已经分别以专利保藏指定编号PTA-10267、 PTA-10568、PTA-10569、PTA-10570或PTA-10571保藏于美国典型培 养物保藏中心(ATCC)。本发明还包括从品系OsHPHI2、OsARWI1、 OsARWI3、OsARWI8或OsHPHN1中任一个品系的植物制备的突变体、重 组体和/或基因工程衍生物，每个品系的代表性种子样品已经分别以专 利保藏指定编号PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569、PTA-10570或 PTA-10571保藏于ATCC；
以及从品系OsHPHI2、OsARWI1、OsARWI3、 OsARWI8或OsHPHN1中任一个品系的植物生长或繁育出的植物的任何 后代，每个品系的代表性种子样品已经分别以专利保藏指定编号 PTA-
10267、PTA-10568、PTA-10569、PTA-10570或PTA-10571保藏于 ATCC，只要此类植物或后代具有从品系OsHPHI2、OsARWI1、OsARWI3、 OsARWI8或OsHPHN1中任一个品系的植物生长出的植物的除草剂耐受 性特征，每个品系的代表性种子样品已经分别以专利保藏指定编号 PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569、PTA-10570或PTA-10571保藏于 ATCC。本发明还包括从此类种子培养出的细胞，和从所述培养的细胞 产生的植物及其后代。

[0014] 本发明的耐受除草剂的植物可以是稻这一物种的成员。一般地， 本发明的耐受除草剂的植物耐受处于通常会抑制相应野生型植物(例 如，水稻植物)生长的除草剂水平的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己 烯酮类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合。在一些实施方案中， 本发明的耐受除草剂的植物不是GMO植物。本发明还提供了经诱变的 耐受除草剂的植物，例如经诱变的水稻植物。本发明还包括源自上面 所描述的耐受除草剂的植物的植株和种子的细胞。

[0015] 本发明提供了用于控制杂草生长的方法。在一个实施方案中，本 发明提供了在水稻植物附近控制杂草生长的方法。此类方法可以包括 向杂草和水稻植物施用一定量的抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂(其 抑制天然出现的乙酰辅酶A羧化酶活性)，其中所述水稻植物包含经 改变的乙酰辅酶A羧化酶活性，从而所述水稻植物耐受所施用的量的 除草剂。本发明的方法可以用任何干扰乙酰辅酶A羧化酶活性的除草 剂来实施，所述除草剂包括但不限于芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己 烯酮类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合。

[0016] 本发明提供了用于在水稻植物附近控制杂草生长的方法。此类方 法的一个实例可以包括以通常会抑制水稻植物生长的除草剂水平向所 述杂草和向所述水稻植物施用一种或多种除草剂，其中至少一种除草 剂抑制乙酰辅酶A羧化酶活性。此类方法可以用任何抑制乙酰辅酶A 羧化酶活性的除草剂来实施。可以在控制杂草的方法的实施中使用的 除草剂的合适实例包括但不限于，芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯 酮类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合。

[0017] 本发明包括用于控制杂草生长的方法。此类方法的一个实例可以 包括：(a)使耐受除草剂的水稻植物与其他水稻种质杂交，并且收获 所得到的杂种水稻种子；(b)种植所述杂种水稻种子；和(c)以通常 会抑制水稻植物生长的除草剂水平，向所述杂种水稻和向处于所述杂 种水稻附近的杂草施用一种或多种抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂。 此类方法可以用任何抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂来实施。可 以在控制杂草的方法的实施中使用的除草剂的合适实例包括但不限 于，芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯酮类除草剂、苯基吡唑啉类除 草剂或其组合。

[0018] 在另一个实施方案中，本发明包括用于选择耐受除草剂的水稻植 物的方法。此类方法的一个实例可以包括：(a)使耐受除草剂的水稻 植物与其他水稻种质杂交，并且收获所得到的杂种水稻种子；(b)种植 所述杂种水稻种子；和(c)以通常会抑制水稻植物生长的除草剂水平， 向所述杂种水稻施用一种或多种除草剂，其中所述除草剂中的至少一 种抑制乙酰辅酶A羧化酶；和(d)从向其已施用了除草剂的水稻植物 收获种子。此类方法可以用任何抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂 来实施。可以在控制杂草的方法的实施中使用的除草剂的合适实例包 括但不限于，芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯酮类除草剂、苯基吡 唑啉类除草剂或其组合。

[0019] 本发明还包括用于使耐受除草剂的水稻植物生长的方法。此类方 法的一个实例包括：(a)种植水稻种子；(b)让所述水稻种子发芽； (c)以通常会抑制水稻植物生长的除草剂水平，向所述水稻籽苗施用 一种或多种除草剂，其中所述除草剂中的至少一种抑制乙酰辅酶A羧 化酶。此类方法可以用任何抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂来实 施。可以在控制杂草的方法的实施中使用的除草剂的合适实例包括但 不限于，芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯酮类除草剂、苯基吡唑啉 类除草剂或其组合。

[0020] 在一个实施方案中，本发明提供了耐受除草剂的水稻植物的种子。 此类种子可以用于生长出耐受除草剂的水稻植物，其中从所述种子生 长出的植物耐受处于通常会抑制水稻植物生长的除草剂水平的至少一 种抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂。从本发明的种子生长出的植 物所将会耐受的除草剂的实例包括但不限于，芳氧苯氧丙酸酯类除草 剂、环己烯酮类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合。

[0021] 在另一个实施方案中，本发明提供了水稻植物的种子，其中从所 述种子生长出的植物表达这样的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，所述 乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序列在下列位置中的一个或多个位置处 不同于野生型水稻植物的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列：1781(Am)、 1785(Am)、1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、1999(Am)、 2027(Am)、
2039(Am)、2041(Am)、2049(Am)、2059(Am)、2074(Am)、 2075(Am)、2078(Am)、2079(Am)、2080(Am)、2081(Am)、2088(Am)、 2095(Am)、2096(Am)或2098(Am)。在这些氨基酸位置处的差异的实例 包括但不限于下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的氨基酸为除 了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置1785(Am)处的氨基酸为除了丙 氨酸之外的其他氨基酸；在位置
1786(Am)处的氨基酸为除了丙氨酸之 外的其他氨基酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的 其他氨基酸；在位置1824(Am)处的氨基酸为除了谷氨酰胺之外的其他 氨基酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基 酸；在位置1999(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在 位置2027(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2039(Am)处的氨基酸为除了谷氨酸之外的其他氨基酸；在位置 
2041(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2049(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2059(Am)处的氨基酸为除了丙氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2074(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2075(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2078(Am)处的氨基酸为除了天冬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2079(Am)处的氨基酸为除了丝氨酸之外的其他氨基酸；在位置 
2080(Am)处的氨基酸为除了赖氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2081(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2088(Am)处的氨基酸为除了半胱氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2095(Am)处的氨基酸为除了赖氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2096(Am)处的氨基酸为除了甘氨酸之外的其他氨基酸；或者在位置 2098(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸。在一些实施方 案中，从所述种子生长出的植物表达包含这样的氨基酸序列的乙酰辅 酶A羧化酶，所述氨基酸序列包含下列中的一个或多个：在位置 1781(Am)处的氨基酸为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸；在位置 1785(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为脯氨 酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置1824(Am)处的氨 基酸为脯氨酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置 1999(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或甘氨酸；在位置2027(Am)处的氨基 酸为半胱氨酸；在位置
2039(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置2041(Am) 处的氨基酸为天冬酰胺；在位置2049(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在 位置2059(Am)处的氨基酸为缬氨酸；在位置2074(Am)处的氨基酸为亮 氨酸；在位置2075(Am)处的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸； 在位置2078(Am)处的氨基酸为甘氨酸或苏氨酸；在位置2079(Am)处的 氨基酸为苯丙氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置 2080(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2081(Am)处的氨基酸是缺失 的；在位置2088(Am)处的氨基酸为精氨酸或色氨酸；在位置2095(Am) 处的氨基酸为谷氨酸；在位置2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸或丝氨 酸；或者在位置2098(Am)处的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组 氨酸或丝氨酸。

[0022] 本发明包括特别的耐受除草剂的栽培种的种子。此类种子的一个 实例是水稻栽培种Indica1的种子，其中所述栽品种的代表性种子样 品以ATCC登录号PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569或PTA-10570 进行了保藏。此类种子的另一个实例是耐受除草剂的Nipponbare栽品 种的种子，其中所述栽品种的代表性种子样品以ATCC登录号 PTA-10571进行了保藏。本发明还包括通过使所述种子生长而产生的 水稻植物或其部分，以及从所述种子产生的细胞的组织培养物。细胞 的组织培养物可以从种子直接产生，或者从由种子生长出的植物的部 分产生，例如从叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖、 雌蕊、花药、花和/或茎产生。本发明还包括从细胞的组织培养物产生 的植物及其后代。一般地，此类植物将会具有栽品种Indica1的所有 形态学和生理学特征。

[0023] 本发明还提供了用于产生水稻种子的方法。此类方法可以包括： 使耐受除草剂的水稻植物与其他水稻种质杂交；并且收获所得到的杂 种水稻种子，其中所述耐受除草剂的水稻植物耐受处于通常会抑制水 稻植物生长的除草剂水平的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯酮类除 草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合。

[0024] 本方法还包括产生F1杂种水稻种子的方法。此类方法可以包括： 使耐受除草剂的水稻植物与不同的水稻植物杂交；并且收获所得到的 F1杂种水稻种子，其中所述耐受除草剂的水稻植物耐受处于通常会抑 制水稻植物生长的除草剂水平的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯酮 类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合。

[0025] 本方法还包括产生F1杂种植物的方法。此类方法可以包括：使耐 受除草剂的植物与不同的植物杂交；并且收获所得到的F1杂种种子并 使所得到的F1杂种植物生长，其中所述耐受除草剂的植物耐受处于通 常会抑制植物生长的除草剂水平的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯 酮类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合。

[0026] 本发明还提供了产生可以还包含转基因的耐受除草剂的水稻植物 的方法。此类方法的一个实例可以包括：用转基因转化水稻植物的细 胞，其中所述转基因编码乙酰辅酶A羧化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶 赋予对至少一种选自芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯酮类除草剂、 苯基吡唑啉类除草剂或其组合的除草剂的耐受性。在本发明的方法的 实施中可以使用任何合适的细胞，例如，所述细胞可以以愈伤组织的 形式存在。在一些实施方案中，所述转基因可以包含这样的核酸序列， 所述核酸序列编码包含SEQ ID NO:2和3之一或两者的经修饰形式的 氨基酸序列，其中所述序列经修饰，从而所编码的蛋白质包含下列中 的一个或多个：在位置1781(Am)处的氨基酸为亮氨酸、苏氨酸、缬氨 酸或丙氨酸；在位置1785(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置1786(Am) 处的氨基酸为脯氨酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位 置1824(Am)处的氨基酸为脯氨酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为苯丙 氨酸；在位置1999(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或甘氨酸；在位置 2027(Am)处的氨基酸为半胱氨酸；在位置2039(Am)处的氨基酸为甘氨 酸；在位置2041(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置2049(Am)处的氨 基酸为苯丙氨酸；在位置2059(Am)处的氨基酸为缬氨酸；
在位置 2074(Am)处的氨基酸为亮氨酸；在位置2075(Am)处的氨基酸为亮氨 酸、异亮氨酸或甲硫氨酸；在位置2078(Am)处的氨基酸为甘氨酸或苏 氨酸；在位置2079(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置2080(Am)处的 氨基酸为谷氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置 2081(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2088(Am)处的氨基酸为精氨酸 或色氨酸；在位置2095(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置2096(Am) 处的氨基酸为丙氨酸或丝氨酸；或者在位置2098(Am)处的氨基酸为丙 氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸或丝氨酸。本发明还包括通过此类方 法产生的植物。产生包含转基因的耐受除草剂的植物的方法的另一个 实例可以包括：用编码赋予除草剂耐受性的酶的转基因转化水稻植物 的细胞，其中所述细胞产生自表达乙酰辅酶A羧化酶的水稻植物或其 种子，所述乙酰辅酶A羧化酶赋予对至少一种选自芳氧苯氧丙酸酯类 除草剂、环己烯酮类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合的除草剂 的耐受性。在本发明的方法的实施中可以使用任何合适的细胞，例如， 所述细胞可以以愈伤组织的形式存在。本发明还包括通过此类方法产 生的耐受除草剂的植物。

[0027] 在一个实施方案中，本发明包括产生重组体植物的方法。用于产 生重组体水稻植物的方法的一个实例可以包括：用转基因转化水稻植 物的细胞，其中所述细胞产生自表达乙酰辅酶A羧化酶的水稻植物， 所述乙酰辅酶A羧化酶赋予对至少一种选自芳氧苯氧丙酸酯类除草 剂、环己烯酮类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合的除草剂的耐 受性。在本发明的方法的实施中可以使用任何合适的细胞，例如，所 述细胞可以以愈伤组织的形式存在。用于在本发明的方法中使用的转 基因可以包含任何所希望的核酸序列，例如，所述转基因可以编码蛋 白质。在一个实例中，所述转基因可以编码酶，例如，改变脂肪酸代 谢和/或碳水化合物代谢的酶。合适的酶的实例包括但不限于，果糖基 转移酶、果聚糖蔗糖酶、α-淀粉酶、转化酶和淀粉分支酶，或编码硬 脂酰-ACP去饱和酶的反义的酶。本发明还包括通过本发明的方法产生 的重组体植物。

[0028] 本发明的方法可以用于产生具有任何所希望的性状的植物，例如 水稻植物。此类方法的一个实例包括：(a)使耐受处于通常会抑制水 稻植物生长的除草剂水平的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯酮类除 草剂、苯基吡唑啉类除草剂或其组合的水稻植物与包含所希望的性状 的另一水稻栽品种的植物杂交，以产生后代植物；(b)选择一个或多 个具有所希望的性状的后代植物，以产生经选择的后代植物；(c)使 所选择的后代植物与耐受除草剂的植物杂交，以产生回交后代植物； (d)选择具有所希望的性状和除草剂耐受性的回交后代植物；和(e) 相继地重复步骤(c)和(d)三次或更多次，以产生经选择的包含所希望 的性状和除草剂耐受性的第四代或更高代的回交后代植物。使用本发 明的方法，可以引入任何所希望的性状。可以希望的性状的实例包括 但不限于，雄性不育，除草剂耐受性，干旱耐受性，昆虫抗性，改变 的脂肪酸代谢，改变的碳水化合物代谢，和对于细菌性疾病、真菌性 疾病或病毒性疾病的抗性。用于产生雄性不育水稻植物的方法的一个 实例可以包括：用赋予雄性不育的核酸分子转化水稻植物，所述水稻 植物耐受处于通常会抑制水稻植物生长的除草剂水平的至少一种抑制 乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂。本发明还包括通过此类方法产生的 雄性不育植物。

[0029] 本发明提供了包含植物细胞(例如来自水稻植物的细胞)的组合 物。此类组合物的一个实例包含水稻植物的一个或多个细胞；和水性 培养基，其中所述培养基包含抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的化合物。 在一些实施方案中，所述细胞可以源自耐受处于通常会抑制水稻植物 生长的除草剂水平的芳氧苯氧丙酸酯类除草剂、环己烯酮类除草剂、 苯基吡唑啉类除草剂或其组合的水稻植物。在本发明的组合物中可以 使用任何抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的化合物，例如芳氧苯氧丙酸酯 类除草剂、环己烯酮类除草剂、苯基吡唑啉类除草剂和其组合中的一 种或多种。

[0030] 本发明包括编码乙酰辅酶A羧化酶的全部或部分的核酸分子。在 一些实施方案中，本发明包括编码水稻乙酰辅酶A羧化酶(ACCase) 的重组的、经诱变的、合成的和/或分离的核酸分子，在所述水稻乙酰 辅酶A羧化酶中的氨基酸序列在下列位置中的一个或多个位置处不同 于野生型水稻植物的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列：1781(Am)、 1785(Am)、1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、1999(Am)、 2027(Am)、2039(Am)、2041(Am)、2049(Am)、2059(Am)、2074(Am)、 2075(Am)、2078(Am)、2079(Am)、2080(Am)、2081(Am)、2088(Am)、2095(Am)、2096(Am)或2098(Am)。在这些氨基酸位置处的差异的实例 包括但不限于下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的氨基酸为除 了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置1785(Am)处的氨基酸为除了丙 氨酸之外的其他氨基酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为除了丙氨酸之 外的其他氨基酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的 其他氨基酸；在位置1824(Am)处的氨基酸为除了谷氨酰胺之外的其他 氨基酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基 酸；在位置1999(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在 位置2027(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2039(Am)处的氨基酸为除了谷氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2041(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2049(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2059(Am)处的氨基酸为除了丙氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2074(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2075(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2078(Am)处的氨基酸为除了天冬氨酸之外的其他氨基酸；
在位置 2079(Am)处的氨基酸为除了丝氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2080(Am)处的氨基酸为除了赖氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2081(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2088(Am)处的氨基酸为除了半胱氨酸之外的其他氨基酸；在位置 
2095(Am)处的氨基酸为除了赖氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2096(Am)处的氨基酸为除了甘氨酸之外的其他氨基酸；或者在位置 2098(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸。在一些实施方 案中，本发明的核酸分子可以编码包含这样的氨基酸序列的乙酰辅酶 A羧化酶，所述氨基酸序列包含下列中的一个或多个：在位置1781(Am) 处的氨基酸为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸；在位置1785(Am)处 的氨基酸为甘氨酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为脯氨酸；在位置 1811(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置1824(Am)处的氨基酸为脯氨 酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置1999(Am)处的氨 基酸为半胱氨酸或甘氨酸；在位置2027(Am)处的氨基酸为半胱氨酸； 在位置2039(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置2041(Am)处的氨基酸为 天冬酰胺；在位置2049(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；
在位置2059(Am) 处的氨基酸为缬氨酸；在位置2074(Am)处的氨基酸为亮氨酸；在位置 
2075(Am)处的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸；在位置2078(Am) 处的氨基酸为甘氨酸或苏氨酸；在位置2079(Am)处的氨基酸为苯丙氨 酸；在位置2080(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置2080(Am)处的氨基 酸是缺失的；在位置2081(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置
2088(Am) 处的氨基酸为精氨酸或色氨酸；在位置2095(Am)处的氨基酸为谷氨 酸；在位置
2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸或丝氨酸；或者在位置 2098(Am)处的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸或丝氨酸。 在一些实施方案中，本发明包括重组的、经诱变的、合成的和/或分离 的核酸，其编码这样的蛋白质，所述蛋白质包含SEQ ID NO:2和3 之一或两者的经修饰形式的全部或部分，其中所述序列经修饰，从而 所编码的蛋白质包含下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的氨基 酸为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸；在位置1785(Am)处的氨基酸 为甘氨酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为脯氨酸；在位置1811(Am) 处的氨基酸为天冬酰胺；在位置1824(Am)处的氨基酸为脯氨酸；在位 置1864(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置1999(Am)处的氨基酸为半 胱氨酸或甘氨酸；在位置2027(Am)处的氨基酸为半胱氨酸；在位置 2039(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置2041(Am)处的氨基酸为天冬酰 胺；
在位置2049(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置2059(Am)处的氨 基酸为缬氨酸；在位置
2074(Am)处的氨基酸为亮氨酸；在位置2075(Am) 处的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸；在位置2078(Am)处的氨 基酸为甘氨酸或苏氨酸；在位置2079(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在 位置2080(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸是缺 失的；在位置
2081(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2088(Am)处的氨 基酸为精氨酸或色氨酸；在位置
2095(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位 置2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸或丝氨酸；或者在位置2098(Am)处的 氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸或丝氨酸。

[0031] 在一个实施方案中，本发明提供了耐受除草剂的BEP进化枝 (clade)植物。一般地，此类植物是具有相比于该植物的野生型品种 而言增加的对ACCase抑制剂(ACCI)的耐受性的植物。此类植物可以 通过包含下列步骤的过程来产生：

[0032] (I)要么，下述步骤：

[0033] (a)提供具有第一的、零或非零的ACCI耐受性水平的BEP进化枝 植物细胞；

[0034] (b)在与培养基接触下使所述细胞生长以形成细胞培养物；

[0035] (c)使所述培养物的细胞与ACCI相接触；

[0036] (d)使来自步骤(c)的与ACCI接触的细胞生长以形成这样的培养 物，所述培养物包含具有大于步骤(a)的第一水平的ACCI耐受性水平 的细胞；和

[0037] (e)从步骤(d)的耐受ACCI的细胞产生具有大于该植物的野生型 品种的ACCI耐受性水平的植物；

[0038] (II)要么，下述步骤：

[0039] (f)提供第一的耐受除草剂的BEP进化枝植物(具有相比于该植 物的野生型品种而言增加的对ACCase抑制剂(ACCI)的耐受性)，所 述耐受除草剂的植物已经通过包括步骤(a)-(e)的过程而产生；和

[0040] (g)从第一植物产生第二的耐受除草剂的BEP进化枝植物，其保 留了第一植物的增加的除草剂耐受性特征；

[0041] 由此获得耐受除草剂的BEP进化枝植物。

[0042] 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的BEP进化枝植物是BET 亚进化枝(subclade)植物。

[0043] 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的BET亚进化枝植物是 BET作物植物。

[0044] 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物可以是竹亚科 (Bambusoideae)-稻亚科(Ehrhartoideae)亚进化枝的成员。在本 发明的实施中可以使用任何合适的用于使植物细胞生长的培养基。在 一些实施方案中，所述培养基可以包含诱变剂，而在其他实施方案中， 所述培养基不包含诱变剂。在一些实施方案中，本发明的耐受除草剂 的植物可以是稻亚科的成员。在本发明的实施中可以使用任何合适的 细胞，例如，所述细胞可以以愈伤组织的形式存在。在一些实施方案 中，本发明的耐受除草剂的植物可以是稻属的成员，例如可以是稻这 一物种的成员。

[0045] 本发明包括通过上述方法产生的耐受除草剂的BEP进化枝植物。 此类耐受除草剂的植物可以表达这样的乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)， 所述乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序列在下列位置中的一个或多个位 置处不同于相应野生型BEP进化枝植物的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸 序列：1781(Am)、1785(Am)、1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、 1999(Am)、2027(Am)、2039(Am)、2041(Am)、2049(Am)、2059(Am)、 2074(Am)、2075(Am)、2078(Am)、2079(Am)、2080(Am)、2081(Am)、 2088(Am)、2095(Am)、2096(Am)或2098(Am)。在这些氨基酸位置处的 差异的实例包括但不限于下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的 氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置1785(Am)处的氨基 酸为除了丙氨酸之外的其他氨基酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为除 了丙氨酸之外的其他氨基酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为除了异亮 氨酸之外的其他氨基酸；在位置1824(Am)处的氨基酸为除了谷氨酰胺 之外的其他氨基酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的 其他氨基酸；在位置1999(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨 基酸；在位置2027(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸； 在位置2039(Am)处的氨基酸为除了谷氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2041(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2049(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2059(Am)处的氨基酸为除了丙氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2074(Am)处的氨基酸为除了色氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2075(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2078(Am)处的氨基酸为除了天冬氨酸之外的其他氨基酸；在位置2079(Am)处的氨基酸为除了丝氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2080(Am)处的氨基酸为除了赖氨酸之外的其他氨基酸；在位置 
2081(Am)处的氨基酸为除了异亮氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2088(Am)处的氨基酸为除了半胱氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2095(Am)处的氨基酸为除了赖氨酸之外的其他氨基酸；在位置 2096(Am)处的氨基酸为除了甘氨酸之外的其他氨基酸；或者在位置 2098(Am)处的氨基酸为除了缬氨酸之外的其他氨基酸。在一些实施方 案中，本发明的耐受除草剂的BEP进化枝植物可以表达包含这样的氨 基酸序列的乙酰辅酶A羧化酶，所述氨基酸序列包含下列中的一个或 多个：在位置1781(Am)处的氨基酸为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨 酸；在位置1785(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置1786(Am)处的氨基 酸为脯氨酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置1824(Am) 处的氨基酸为脯氨酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位 置1999(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或甘氨酸；在位置
2027(Am)处的氨 基酸为半胱氨酸；在位置2039(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置 2041(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置2049(Am)处的氨基酸为苯丙 氨酸；在位置2059(Am)处的氨基酸为缬氨酸；在位置2074(Am)处的氨 基酸为亮氨酸；在位置2075(Am)处的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲 硫氨酸；在位置2078(Am)处的氨基酸为甘氨酸或苏氨酸；在位置 
2079(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸为谷氨 酸；在位置2080(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2081(Am)处的氨基 酸是缺失的；在位置2088(Am)处的氨基酸为精氨酸或色氨酸；在位置 2095(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸 或丝氨酸；或者在位置2098(Am)处的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨 酸、组氨酸或丝氨酸。

[0046] 在一个实施方案中，本发明还包括由于相比于相应野生型ACCase 而言在其质体ACCase中具有仅一个置换而耐受ACCase抑制剂的水稻 植物。在另外一个实施方案中，本发明包括由于相比于相应野生型 ACCase而言在其质体ACCase中具有两个或更多个置换而耐受ACCase 抑制剂的水稻植物。

[0047] 在一个实施方案中，本发明提供了由于相比于相应野生型ACCase 而言在其质体ACCase中具有两个或更多个置换而耐受ACCase抑制剂 的水稻植物,其中所述置换处于选自下列的氨基酸位置处：1781(Am)、 1785(Am)、1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、1999(Am)、 2027(Am)、2039(Am)、2041(Am)、2049(Am)、2059(Am)、2074(Am)、 2075(Am)、
2078(Am)、2079(Am)、2080(Am)、2081(Am)、2088(Am)、 2095(Am)、2096(Am)或2098(Am)。

[0048] 在一个实施方案中，本发明提供了水稻植物，其中所述水稻植物 包含不是转基因的质体ACCase。在一个实施方案中，本发明提供了植 物，其中所述植物包含是转基因的水稻质体ACCase。

[0049] 在一个实施方案中，本发明提供了用于在本文所描述的水稻植物 附近控制杂草生长的方法，其包括向所述杂草和水稻植物施用一定量 的抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂(其抑制天然出现的乙酰辅酶A羧 化酶活性)，其中所述水稻植物包含经改变的乙酰辅酶A羧化酶活性， 从而所述水稻植物耐受所施用的量的除草剂。

[0050] 在一个实施方案中，本发明提供了用于产生种子的方法，其包括： (i)种植从本发明的植物产生的种子，(ii)使来自所述种子的植物 生长，和(iii)从所述植物收获种子。

[0051] 本发明还包括通过下述过程而产生的耐受除草剂的BEP进化枝植 物：(a)使从如上面所描述那样产生的耐受除草剂的BEP进化枝植物 的种子生长出的植物与其他种质杂交或回交；(b)在至少一种通常抑 制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂以通常会抑制植物生长的除草剂水平存 在下，使由所述杂交或回交而得到的植物生长；和(c)选择进一步的 由所述杂交或回交而得到的繁殖植物，其中所选择的植物是在所述除 草剂存在下生长而没有显著损伤的植物。

[0052] 本发明还包括重组的、经诱变的、合成的和/或分离的核酸分子， 其包含编码在禾本科(Poaceae)BEP进化枝中的植物的经诱变的乙酰 辅酶A羧化酶的核苷酸序列，其中所述经诱变的乙酰辅酶A羧化酶的 氨基酸序列在下列位置中的一个或多个位置处不同于相应野生型植物 的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列：1781(Am)、1785(Am)、1786(Am)、 1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、1999(Am)、2027(Am)、2039(Am)、 2041(Am)、2049(Am)、2059(Am)、2074(Am)、2075(Am)、2078(Am)、 2079(Am)、2080(Am)、2081(Am)、2088(Am)、2095(Am)、2096(Am)或 2098(Am)。此类核酸分子可以通过包含下列步骤的过程来产生：

[0053] (I)要么，下述步骤：

[0054] (a)提供具有第一的、零或非零的ACCase抑制剂(ACCI)耐受性 水平的BEP进化枝植物细胞；

[0055] (b)在与培养基接触下使所述细胞生长以形成细胞培养物；

[0056] (c)使所述培养物的细胞与ACCI相接触；

[0057] (d)使来自步骤(c)的与ACCI接触的细胞生长以形成这样的培养 物，所述培养物包含具有大于步骤(a)的第一水平的ACCI耐受性水平 的细胞；和

[0058] (e)从步骤(d)的耐受ACCI的细胞产生具有大于该植物的野生型 品种的ACCI耐受性水平的植物；

[0059] (II)要么，下述步骤：

[0060] (f)提供第一的耐受除草剂的BEP进化枝植物(具有相比于该植 物的野生型品种而言增加的对ACCase抑制剂(ACCI)的耐受性)，所 述耐受除草剂的植物已经通过包括步骤(a)-(e)的过程而产生；和

[0061] (g)从第一植物产生第二的耐受除草剂的BEP进化枝植物，其保 留了第一植物的增加的除草剂耐受性特征；

[0062] 由此获得耐受除草剂的BEP进化枝植物；并且从所述耐受除草剂 的BEP进化枝植物中分离核酸。

[0063] 在一个实施方案中，本发明包括筛选、分离、鉴定和/或表征单子 叶植物质体ACCase中的耐受除草剂的突变的方法。在一个实施方案 中，本发明包括愈伤组织或植物细胞系的用途。在其他实施方案中， 本发明包括在组织培养环境中进行植物材料或细胞的培养。在另外其 他实施方案中，本发明包括在组织培养环境中尼龙膜的存在。在其他 实施方案中，所述组织培养环境包括液相培养基，而在其他实施方案 中，所述环境包括半固体培养基。在另外其他实施方案中，本发明包 括在液体培养基中在除草剂(例如，噻草酮)存在下培养植物材料， 随后为在具有除草剂的半固体培养基中进行培养。在另外其他实施方 案中，本发明包括在半固体培养基中在除草剂存在下培养植物材料， 随后为在具有除草剂的液体培养基中进行培养。

[0064] 在一些实施方案中，本发明包括直接施用致死剂量的除草剂(例 如，噻草酮)。在其他实施方案中，本发明包括从亚致死剂量开始， 逐步增加除草剂剂量。在其他实施方案中，本发明在一个步骤中或者 同时地包括至少一种，至少两种，至少三种，至少四种，至少五种， 至少六种，至少七种，至少八种或更多种除草剂。

[0065] 在其他实施方案中，通过将突变型耐受除草剂的克隆的数目除以 在实验中所使用的独个愈伤组织的数目来决定突变频率。在一些实施 方案中，本发明包括至少0.03％或更高的突变频率。在一些实施方案 中，本发明包括至少0.03％，至少0.05％，至少0.10％，至少0.15％， 至少0.20％，至少0.25％，至少0.30％，至少0.35％，至少0.40％或更 高的突变频率。在其他实施方案中，本发明包括这样的突变频率，其 为其他的筛选、分离、鉴定和/或表征单子叶植物质体ACCase中的耐 受除草剂的突变的方法的至少2倍，至少3倍，至少4倍，至少5倍， 至少6倍，至少7倍，至少8倍，至少9倍，至少10倍或更高。

[0066] 在一些实施方案中，本发明的方法包括鉴定ACCase中的耐受除草 剂的突变。在进一步的实施方案中，本发明包括在单子叶植物细胞中 重演所述耐受除草剂的突变。

[0067] 在一些实施方案中，本发明包括分离的细胞或组织，所述具有植 物来源的细胞或组织具有：a)源自宿主ACCase(即，内源的)基因 的ACCase活性的缺陷；和b)来自源于单子叶植物的质体ACCase基 因的ACCase活性。

[0068] ACCase的单子叶植物来源

[0069] 在其他实施方案中，本发明包括来自本文所描述的单子叶植物科 植物的质体ACCase或其部分。

[0070] 在其他实施方案中，本发明包括在宿主植物细胞中筛选单子叶植 物质体ACCase的耐受除草剂的突变体。

[0071] 在其他实施方案中，本发明包括使用所制备的宿主细胞来筛选单 子叶植物质体ACCase的耐受除草剂的突变体。在一些实施方案中，本 发明提供了没有质体ACCase活性的宿主细胞。在其他实施方案中，本 发明的宿主细胞表达对除草剂敏感的单子叶植物质体ACCase。

[0072] 在其他实施方案中，本发明的方法包括由于基因组质体ACCase 基因的突变而在ACCase活性方面缺陷的宿主细胞，所述突变包括单点 突变、多点突变、部分缺失、部分敲除、完全缺失和完全敲除。在另 一个实施方案中，使用其他分子生物学技术(例如RNAi、siRNA或反 义RNA)来降低或消除基因组质体ACCase活性。此类分子生物学技术 是本领域众所周知的。在另外其他实施方案中，可以通过ACCase的代 谢抑制剂来降低或消除源于基因组ACCase的活性。

[0073] 在一些实施方案中，所述宿主细胞是单子叶植物宿主细胞。

[0074] 在另外其他实施方案中，本发明包括制备转基因植物细胞的方法， 其包括：a)分离具有单子叶植物来源的细胞；b)使至少一个拷贝的 基因组ACCase基因失活；c)给所述细胞提供源于单子叶植物的质体 ACCase基因；d)分离包含所述源于单子叶植物的质体ACCase基因的 细胞；和任选地，e)使至少另外拷贝的基因组ACCase基因失活，其 中所述细胞在由基因组ACCase基因所提供的ACCase活性方面是缺陷 的。

[0075] 在一个实施方案中，耐受噻草酮的突变频率大于0.03％。

[0076] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中耐受噻 草酮的植物细胞或组织还耐受其他ACCase抑制剂。

[0077] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中耐受噻 草酮的植物细胞或组织包含仅一个在除草剂存在下进行培养之前在该 单子叶植物质体ACCase中不存在的突变。

[0078] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中耐受噻 草酮的植物细胞或组织包含两个或更多个在除草剂存在下进行培养之 前在该单子叶植物质体ACCase中不存在的突变。

[0079] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中噻草酮 以亚致死剂量存在。

[0080] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中在噻草 酮存在下进行的培养在逐步或逐渐增加噻草酮浓度的情况下施行。

[0081] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中所述方 法包括在膜上培养细胞。在优选的实施方案中，本发明提供了用于筛 选的方法，其包括在尼龙膜上培养细胞。

[0082] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选耐受噻草酮的植物细 胞的方法，其中细胞的培养在液体培养基或半固体培养基中进行。

[0083] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中所述方 法还包括鉴定至少一个在噻草酮存在下进行培养之前在外源单子叶植 物质体ACCase中不存在的突变。

[0084] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中所述单 子叶植物是水稻。

[0085] 在一个实施方案中，本发明提供了用于筛选的方法，其中所述外 源单子叶植物ACCase来自水稻。

[0086] 附图简述

[0087] 图1为柱状图，其显示了在不同的除草剂选择水平存在下生长的 源自籼稻的水稻愈伤组织的相对生长。图1A显示了用吡喃草酮获得的 结果，图1B显示了用烯禾定获得的结果，和图1C显示了用噻草酮获 得的结果。

[0088] 图2为用于产生耐受除草剂的水稻植物的选择过程的图解。

[0089] 图3显示了在用除草剂处理后一周获取的植物的照片。

[0090] 图4显示了在用除草剂处理后两周获取的植物的照片。

[0091] 图5提供了来自大穗看麦娘的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(GenBank登录号CAC84161)。

[0092] 图6提供了编码来自大穗看麦娘的乙酰辅酶A羧化酶的mRNA (GenBank登录号AJ310767区域:157..7119)(SEQ ID NO:4)。

[0093] 图7A提供了籼稻和粳稻乙酰辅酶A羧化酶基因的基因组核苷酸序 列(SEQ ID NO:5)。

[0094] 图7B提供了编码籼稻和粳稻乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。

[0095] 图7C提供了籼稻乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。

[0096] 图8A提供了编码玉蜀黍(Zea mays)乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸 序列(SEQ ID NO:11)。

[0097] 图8B提供了玉蜀黍乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 12)。

[0098] 图9A提供了编码玉蜀黍乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)。

[0099] 图9B提供了玉蜀黍乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。

[0100] 图10A提供了编码普通小麦(Triticum aestivum)乙酰辅酶A 羧化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)。

[0101] 图10B提供了普通小麦乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 16)。

[0102] 图11A提供了编码小米(Setaria italica)乙酰辅酶A羧化酶的 核苷酸序列(SEQ ID NO:17)。

[0103] 图11B提供了小米乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 18)。

[0104] 图12A提供了编码小米乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO: 19)。

[0105] 图12B提供了小米乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 20)。

[0106] 图13A提供了编码小米乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列(SEQ ID NO: 21)。

[0107] 图13B提供了小米乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 22)。

[0108] 图14A提供了编码大穗看麦娘乙酰辅酶A羧化酶的核苷酸序列 (SEQ ID NO:23)。

[0109] 图14B提供了大穗看麦娘乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO:24)。

[0110] 图15A提供了编码节节麦(Aegilops tauschii)乙酰辅酶A羧化 酶的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)。

[0111] 图15B提供了节节麦乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列(SEQ ID NO: 26)。

[0112] 图16提供了单突变体和双突变体的比较。

[0113] 图17提供了图，其显示了突变型水稻对于各种ACCase抑制剂的 结果。

[0114] 图18提供了大穗看麦娘乙酰辅酶A羧化酶氨基酸序列(GenBank 登录号CAC84161)。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中可以改变的氨基 酸以粗体双下划线标示出。

[0115] 图19提供了与大穗看麦娘乙酰辅酶A羧化酶相比对的野生型稻乙 酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列，其中标明了一些关键残基。

[0116] 发明详述

[0117] 定义

[0118] 如本文中所使用的，“耐受...的”或“耐受除草剂的”是指在通常 在非耐受性(例如，野生型)植物或其部分中引起生长抑制的除草剂量 存在下能够生长的植物或其部分。通常抑制非耐受性植物生长的除草剂 水平是已知的，并且可由本领域技术人员容易地确定。实例包括由制造 商推荐用于施用的量。最大比率是通常会抑制非耐受性植物生长的除草 剂量的实例。

[0119] 如本文中所使用的，“重组体”是指具有来自不同来源的遗传物质 的生物。

[0120] 如本文中所使用的，“经诱变的”是指具有相比于相应野生型生物 而言经改变的遗传物质的生物，其中所述遗传物质的改变通过人工作用 来进行诱导和/或选择。可以用于产生经诱变的生物的人工作用的实例包 括但不限于：在亚致死浓度的除草剂(例如，乙酰辅酶A羧化酶抑制剂 例如噻草酮或烯禾定)中进行植物细胞(例如，愈伤组织)的组织培养； 用化学诱变剂处理植物细胞，并随后用除草剂(例如，乙酰辅酶A羧化 酶抑制剂例如噻草酮或烯禾定)进行选择；或者用x-射线处理植物细胞， 并随后用除草剂(例如，乙酰辅酶A羧化酶抑制剂例如噻草酮或烯禾定) 进行选择。可以使用本领域中已知的任何方法来诱导突变。诱导突变的 方法可以在遗传物质的随机位置处诱导突变，或者可以在遗传物质的特 定位置处诱导突变(即，可以为定向诱变技术)。

[0121] 如本文中所使用的，“基因改造生物”(GMO)是其遗传特征已经通 过插入来自另一来源生物的遗传物质而被改变的生物，或者保留了所插 入的遗传物质的其后代。来源生物可以为不同的生物类型(例如，GMO 植物可以包含细菌的遗传物质)，或者来自相同的生物类型(例如，GMO 生物可以包含来自另一植物的遗传物质)。如本文中所使用的，“重组 体”和“GMO”被认为是同义词，并且表明来自不同来源的遗传物质的存 在；然而，“经诱变的”表明经改变的来自相应野生型生物的遗传物质， 而不是来自另一来源生物的遗传物质。

[0122] 如本文中所使用的，“野生型”或“相应野生型植物”表示生物或 其遗传物质的典型形式，正如它通常出现的那样，其区别于经诱变的和/ 或重组的形式。

[0123] 对于本发明，术语“耐受除草剂的”和“抗除草剂的”可互换使用， 并且意在具有相等的含义和相等的范围。类似地，术语“除草剂耐受性” 和“除草剂抗性”可互换使用，并且意在具有相等的含义和相等的范围。 类似地，术语“耐受...的”和“抗...的”可互换使用，并且意在具有 相等的含义和相等的范围。

[0124] 如本文中关于在其各种实施方案中有用的除草剂而使用的，诸如生 长素除草剂(auxinic herbicide)、AHAS抑制剂、乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)抑制剂、PPO抑制剂、EPSPS抑制剂、咪唑啉酮类、磺酰脲类 等的术语，是指那些在本领域中认可的在农艺学上可接受的除草剂活性 成分(A.I.)。类似地，诸如杀真菌剂、杀线虫剂、杀虫剂等的术语， 是指其他在本领域中认可的在农艺学上可接受的活性成分。

[0125] 当关于特定的突变型酶或多肽进行使用时，诸如“耐受除草剂的 (HT)”和“除草剂耐受性”的术语是指此类酶或多肽在通常会使所述 酶或多肽的野生型(非突变型)形式的活性失活或抑制所述酶或多肽的 野生型(非突变型)形式的活性的除草剂A.I.量存在下执行其生理学活 性的能力。例如，当特别地关于AHAS酶或AHASL多肽进行使用时，它特 别地是指耐受AHAS抑制剂的能力。AHAS抑制剂的类别包括，磺酰脲类、 咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类、磺酰基氨基羰基三唑啉酮类和嘧啶基氧基 [硫代]苯甲酸酯类。

[0126] 如本文中所使用的，“后裔(descendant)”是指任何代的植物。

[0127] 如本文中所使用的，“后代(progeny)”是指第一代的植物。

[0128] 植物

[0129] 本发明提供了耐受除草剂的禾本科(Poaceae)的单子叶植物。可以 将禾本科分为两个主要的进化枝，包括竹亚科(Bambusoideae)、稻亚 科(Ehrhartoideae)和早熟禾亚科(Pooideae)的进化枝(BEP进化枝)；  和包括黍亚科(Panicoideae)、芦竹亚科(Arundinoideae)、虎尾草 亚科(Chloridoideae)、假淡竹叶亚科(Centothecoideae)、 Micrairoideae、三芒草亚科(Aristidoideae)和扁芒草亚科 (Danthonioideae)的进化枝(PACCMAD进化枝)。竹亚科包括稻族 (Oryzeae)。本发明涉及BEP进化枝的植物，特别是竹亚科和稻亚科的 植物。一般地，本发明的植物由于表达下面所描述的本发明的乙酰辅酶 A羧化酶而耐受至少一种抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂。BET进化 枝包括竹亚科，稻亚科，和小麦组(Triticodae)，但不包括其他的早 熟禾亚科的组。BET作物植物是作为BET亚进化枝的成员的为了粮食或 饲草而培植的植物，例如大麦、玉米等。

[0130] 本发明还提供了商业上重要的耐受除草剂的单子叶植物，包括甘蔗 (甘蔗属物种(Saccharum spp.)，以及草坪草，例如草地早熟禾(Poa pratensis)(蓝草)、剪股颖属物种(Agrostis spp.)(剪股颖)、 黑麦草属物种(Lolium spp.)(黑麦草)、羊茅属物种(Festuca spp.) (羊茅)、结缕草属物种(Zoysia spp.)(结缕草)、狗牙根属物种(Cynodon spp.)(百慕大草)、侧钝叶草(Stenotaphrum secundatum)(圣奥古 斯丁草)、雀稗属物种(Paspalum spp.)(巴哈草)、假俭草(Eremochloa ophiuroides)(百足草)、地毯草属物种(Axonopus spp.)(地毯草)、 指形垂穗草(Bouteloua dactyloides)(野牛草)和垂穗草属变种物种 (Bouteloua var.spp.)(格兰马草)。

[0131] 在一个实施方案中，本发明提供了耐受除草剂的竹亚科植物。一般 地，此类植物耐受一种或多种抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂。耐 受除草剂的竹亚科植物的实例包括但不限于，青篱竹属(Arundinaria)、 箣竹属(Bambusa)、丘斯夸竹属(Chusquea)、瓜多竹属(Guadua)和 倭竹属(Shibataea)的那些。

[0132] 在一个实施方案中，本发明提供了耐受除草剂的稻亚科植物。一般 地，此类植物耐受一种或多种抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂。耐 受除草剂的稻亚科植物的实例包括但不限于，皱稃草属(Ehrharta)、 假稻属(Leersia)、Microlaena、稻属(Oryza)和菰属(Zizania)的 那些。

[0133] 在一个实施方案中，本发明提供了耐受除草剂的早熟禾亚科植物。 一般地，此类植物耐受一种或多种抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂。 耐受除草剂的早熟禾亚科植物的实例包括但不限于，小麦族 (Triticeae)、燕麦族(Aveneae)、早熟禾族(Poeae)这些属的那些。

[0134] 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物是水稻植物。两种 水稻物种是最常栽培的，稻(Oryza sativa)和光稃稻(Oryza glaberrima)。稻的许多亚种是商业上重要的，包括籼稻(稻印度亚种) (Oryza sativa subsp.indica)、粳稻(稻日本亚种)(Oryza sativa subsp.japonica)、稻爪哇亚种(Oryza sativa subsp.javanica)、 稻粘性亚种(Oryza sativa subsp.glutinosa)(糯稻)、香稻组(Oryza sativa Aromatica group)(例如，巴斯马蒂(basmati))和稻(浮稻 组)。本发明包括耐受除草剂的在所有上面提及的物种和亚种中的植物。

[0135] 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物是小麦植物。两种 小麦物种是最常栽培的，普通小麦(Triticum aestivum)和圆锥小麦 (Triticum turgidum)。许多其他物种是商业上重要的，包括但不限于， 提莫非维小麦(Triticum timopheevii)、一粒小麦(Triticum monococcum)、茹可夫斯基小麦(Triticum zhukovskyi)和乌拉尔图小 麦(Triticum urartu)以及其杂种。本发明包括耐受除草剂的在所有上 面提及的物种和亚种中的植物。在本发明中所包括的普通小麦的亚种的 实例为，普通小麦(原亚种)(Triticum aestivum subsp.aestivum)、 密穗小麦(Triticum aestivum subsp.compactum)、马卡小麦(Triticum aestivum subsp.macha)、瓦维洛夫小麦(Triticum aestivum subsp. vavilovii)、斯佩尔特小麦(Triticum aestivum subsp.spelta)和 球粒小麦(Triticum aestivum subsp.sphaerococcum)。在本发明中 所包括的圆锥小麦的亚种的实例为，圆锥小麦(原亚种)(Triticum turgidum subsp.turgidum)、波斯小麦(Triticum turgidum subsp. carthlicum)、双粒小麦(Triticum turgidum subsp.dicoccon)、硬 粒小麦(Triticum turgidum subsp.durum)、Triticum turgidum subsp. paleocolchicuna、波兰小麦(Triticum turgidum subsp.polonicum)、 东方小麦(Triticum turgidum subsp.turanicum)和野生二粒小麦 (Triticum turgidum subsp.dicoccoides)。在本发明中所包括的一 粒小麦的亚种的实例为，一粒小麦(原亚种)(Triticum monococcum subsp. monococcum)和拟山羊草小麦(Triticum monococcum subsp. aegilopoides)。在本发明的一个实施方案中，小麦植物是普通小麦物 种的成员，并且更特别地，是CDC Teal栽培种。

[0136] 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物是大麦植物。两种 大麦麦物种是最常栽培的，大麦(Hordeum vulgare)和亚利桑那大麦(Hordeum arizonicum)。许多其他物种是商业上重要的，包括但不限 于，布顿大麦草(Hordeum bogdanii)、短药大麦(Hordeum brachyantherum)、短芒大麦(Hordeum brevisubulatum)、球茎大麦 (Hordeum bulbosum)、丛毛大麦(Hordeum comosum)、平展大麦(Hordeum depressum)、短尾大麦(Hordeum intercedens)、芒颖大麦(Hordeum jubatum)、海滨大麦(Hordeum marinum)、海滨大麦(Hordeum marinum)、 帕氏大麦(Hordeum parodii)、小大麦(Hordeum pusillum)、草地大 麦(Hordeum secalinum)和钝稃野大麦(Hordeum spontaneum)。本发 明包括耐受除草剂的在所有上面提及的物种和亚种中的植物。

[0137] 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物是黑麦植物。商业 上重要的物种包括但不限于，野黑麦(Secale sylvestre)、劲直黑麦 (Secale strictum)、黑麦(Secale cereale)、瓦维洛夫黑麦(Secale vavilovii)、非洲黑麦(Secale africanum)、纤毛颖黑麦(Secale ciliatoglume)、古黑麦(Secale ancestrale)和山黑麦(Secale montanum)。本发明包括耐受除草剂的在所有上面提及的物种和亚种中 的植物。

[0138] 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物是草坪植物。草坪 草的许多商业上重要的物种包括，结缕草(Zoysia japonica)、匍匐剪 股颖(Agrostis palustris)、草地早熟禾(Poa pratensis)、早熟禾 (Poa annua)、马唐(Digitaria sanguinalis)、香附子(Cyperus rotundus)、短叶水蜈蚣(Kyllinga brevifolia)、阿穆尔莎草(Cyperus amuricus)、加拿大飞蓬(Erigeron canadensis)、天胡荽(Hydrocotyle sibthorpioides)、鸡眼草(Kummerowia  striata)、地锦(Euphorbia humifusa)和耕地堇菜(Viola arvensis)。本发明包括耐受除草剂的 在所有上面提及的物种和亚种中的植物。

[0139] 除了能够耐受抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂外，本发明的植 物还能够耐受作用于其他生理学过程的除草剂。例如，本发明的植物可 以耐受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，并且还耐受其他除草剂，例如酶抑制 剂。本发明的植物可以耐受的其他酶抑制剂的实例包括但不限于，5-烯 醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的抑制剂例如草甘膦，乙酰羟酸 合酶(AHAS)的抑制剂例如咪唑啉酮类、磺酰脲类和磺酰胺类除草剂， 以及谷氨酰胺合酶的抑制剂例如草铵膦。除了酶抑制剂外，本发明的植 物还可以耐受具有其他作用方式的除草剂，例如，生长素除草剂例如 2,4-D或麦草畏，叶绿素/类胡萝卜素色素抑制剂例如羟基苯基丙酮酸双 加氧酶(HPPD)抑制剂或八氢番茄红素去饱和酶(PDS)抑制剂，原卟啉 原-IX氧化酶抑制剂，细胞膜破坏剂，光合作用抑制剂例如溴苯腈或碘 苯腈，细胞分裂抑制剂，根抑制剂，芽抑制剂，以及其组合。因此，可 以使耐受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的本发明的植物耐受多种类别的除草 剂。

[0140] 例如，在一些实施方案中，耐受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂例如“dim 类”(例如，噻草酮、烯禾定、烯草酮或吡喃草酮)、“fop类”(例 如，炔草酸、禾草灵、吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵或喹禾灵)和“den类” (例如，唑啉草酯(pinoxaden))的本发明的植物可以耐受生长素除草 剂；耐受EPSPS抑制剂，例如草甘膦；耐受PPO抑制剂，例如，嘧啶二 酮类，例如苯嘧磺草胺(saflufenacil)，三唑啉酮类，例如甲磺草胺、 唑草酯，丙炔氟草胺，二苯醚类，例如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟 禾草灵、乙氧氟草醚，N-苯基酞酰亚胺类，例如氟烯草酸，CGA-248757； 和/或耐受GS抑制剂，例如草铵膦。除了这些类别的抑制剂外，耐受乙 酰辅酶A羧化酶抑制剂的本发明的植物还可以耐受具有其他作用方式的 除草剂，例如叶绿素/类胡萝卜素色素抑制剂、细胞膜破裂剂、光合作用 抑制剂、细胞分裂抑制剂、根抑制剂、芽抑制剂以及其组合。此类耐受 性性状可以例如表现为突变型EPSPS蛋白或突变型谷氨酰胺合成酶蛋 白；或者表现为突变型原生的、近交的或转基因的芳氧基链烷酸双加氧 酶(AAD或DHT)、卤芳基腈水解酶(BXN)、2,2-二氯丙酸脱卤素酶(DEH)、 草甘膦-N-乙酰转移酶(GAT)、草甘膦脱羧酶(GDC)、草甘膦氧化还原 酶(GOX)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、膦丝菌素乙酰转移酶(PAT或 bar)、或具有除草剂降解活性的细胞色素P450(CYP450)蛋白。在此 的耐受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的植物还可以叠加有其他性状，包括但 不限于杀虫性状，例如Bt Cry和其他对于鞘翅类、鳞翅类、线虫类或其 他害虫具有杀虫活性的蛋白质；营养或营养药用(nutraceutical)性状， 例如改变的油含量或油谱性状、高蛋白质或高氨基酸浓度性状，和其他 本领域中已知的性状类型。

[0141] 进一步地，还涵盖了这样的植物，所述植物除了能够耐受抑制乙酰 辅酶A羧化酶活性的除草剂外，还通过使用重组DNA技术而能够合成一 种或多种杀昆虫蛋白，尤其是已知的来自芽孢杆菌属(Bacillus)，特  别是来自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的那些，例如δ- 内毒素，例如CryIA(b)、CryIA(c)、CryIF、CryIF(a2)、CryIIA(b)、 CryIIIA、CryIIIB(b1)或Cry9c；植物杀昆虫蛋白(VIP),例如VIP1、 VIP2、VIP3或VIP3A；在线虫中建群的细菌例如光杆状菌属物种 (Photorhabdus spp.)或致病杆菌属物种(Xenorhabdus spp.)的杀昆 虫蛋白；由动物产生的毒素，例如蝎毒素、蜘蛛毒素、黄蜂毒素或其他 昆虫特异性神经毒素；由真菌产生的毒素，例如链霉菌毒素；植物外源 凝集素，例如豌豆或大麦外源凝集素；凝集素；蛋白酶抑制剂，例如胰 蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、patatin、半胱氨酸蛋白酶抑制剂 或木瓜蛋白酶抑制剂；核糖体失活蛋白(RIP)，例如蓖麻毒蛋白、玉米 -RIP、相思豆毒蛋白、软瓜蛋白、肥皂草毒蛋白或异株泻根毒蛋白；类固 醇代谢酶，例如3-羟基-类固醇氧化酶、蜕皮类固醇-IDP-糖基-转移酶、 胆固醇氧化酶、蜕皮素抑制剂或HMG-CoA-还原酶；离子通道阻断剂，例 如钠或钙通道的阻断剂；保幼激素酯酶；利尿激素受体(helicokinin 受体)；茋合酶，联苄合酶，壳多糖酶或葡聚糖酶。
在本发明的范围内， 这些杀昆虫蛋白或毒素也明确地被理解为前毒素、杂合蛋白、截短的或 经其他修饰的蛋白质。杂合蛋白的特征在于蛋白质结构域的重新组合(参 见例如WO 
02/015701)。此类毒素或者能够合成此类毒素的基因改造植 物的进一步实例公开在例如EP-A 374 753、WO 93/007278、WO 95/34656、 EP-A 427 529、EP-A 451 878、WO 03/18810和WO 03/52073中。用于 产生此类基因改造植物的方法通常是本领域技术人员已知的，并且例如 描述在上面提及的出版物中。包含在基因改造植物中的这些杀昆虫蛋白 赋予产生这些蛋白质的植物以对来自所有节肢动物分类群的有害害虫的 耐受性，尤其是对甲虫类(鞘翅目(Coleoptera))、双翅昆虫类(双 翅目(Diptera))和蛾类(鳞翅目(Lepidoptera))以及对线虫(线 虫动物门(Nema toda))的耐受性。

[0142] 进一步地，在一个实施方案中，还涵盖了这样的植物，所述植物例 如通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或以其他方式就此类性状进 行选择，而能够合成一种或多种蛋白质以增加那些植物对于细菌性、病 毒性或真菌性病原体的抗性或耐受性。用于产生此类基因改造植物的方 法通常是本领域技术人员已知的。如本文所描述的那样而产生的植物也 可以叠加有其他性状，包括但不限于，抗病性、提高的矿物质谱、提高 的维生素谱、提高的油谱(例如，高油酸含量)、氨基酸谱(例如，高 赖氨酸玉米)，和其他本领域中已知的性状类型。

[0143] 进一步地，在一个实施方案中，还涵盖了这样的植物，所述植物例 如通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或通过其他选择方式，而能 够合成一种或多种蛋白质以增加生产力(例如，生物量生产、谷粒产量、 淀粉含量、油含量或蛋白质含量)，对于干旱、盐度或其他限制生长的 环境因素的耐受性，或者对于那些植物的害虫和真菌性、细菌性或病毒 性病原体的耐受性。

[0144] 进一步地，在一个实施方案中，还涵盖了这样的植物，所述植物例 如通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或通过其他选择方式，而包 含经改变的量的内含物物质或新的内含物物质，特别地用于改善人或动 物的营养。进一步地，还涵盖了这样的植物，所述植物通过使用重组DNA 技术而包含经改变的量的内含物物质或新的内含物物质，特别地用于改 善原材料生产。

[0145] 进一步地，在一些实施方案中，还涵盖了这样的本发明的植物，所 述植物例如通过使用重组DNA技术和/或通过育种和/或以其他方式就此 类性状进行选择，而被改变以包含增加的量的维生素和/或矿物质，和/ 或改善的营养药用化合物谱。

[0146] 在一个实施方案中，耐受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的本发明的植物 相对于野生型植物而言包含增加的量的选自下列的化合物或者改善的选 自下列的化合物谱：芥子油苷类(例如，萝卜苷(4-甲基亚硫酰基丁基 芥子油苷)、萝卜硫烷、3-吲哚基甲基-芥子油苷(芸苔葡糖硫苷)、1- 甲氧基-3-吲哚基甲基-芥子油苷(新芸苔葡糖硫苷))；酚类(例如， 类黄酮(例如，槲皮素、山奈素)、羟基肉桂酰基衍生物(例如，1,2,2'- 三芥子酰基龙胆二糖、1,2-二阿魏酰基龙胆二糖、1,2'-二芥子酰基-2- 阿魏酰基龙胆二糖、3-O-咖啡酰基-奎尼酸(新氯原酸)))；以及维生 素和矿物质(例如，维生素C、维生素E、胡萝卜素、叶酸、烟酸、核黄 素、硫胺素、钙、铁、镁、钾、硒和锌)。

[0147] 在另一个实施方案中，耐受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的本发明的植 物相对于野生型植物而言包含增加的量的选自下列的化合物或者改善的 选自下列的化合物谱：甲状腺肿素原(progoitrin)；异硫氰酸盐类； 吲哚类(芥子油苷水解的产物)；谷胱甘肽；类胡萝卜素，例如，β- 胡萝卜素，番茄红素，和叶黄素类胡萝卜素例如叶黄二醇和玉米黄素； 酚类，包括类黄酮例如黄酮醇类(例如，槲皮素、芸香苷)，黄烷类/ 单宁类(例如，原花青素类，包括香豆素，原花色素类，儿茶素类，和 花色素苷类)；黄酮类；植物雌激素类，例如，香豆雌素类(coumestans)， 木脂素类，白藜芦醇，异黄酮类例如染料木黄酮，大豆黄素，和黄豆黄 素；雷琐酸内酯类；有机硫化合物；植物甾醇类；类萜，例如鼠尾草酚、 迷迭香酸、甘草皂苷和皂苷类；叶绿素；叶绿酸，糖类，花色素苷类和 香夹兰。

[0148] 在其他实施方案中，耐受乙酰辅酶A羧化酶抑制剂的本发明的植物 相对于野生型植物而言包含增加的量的选自下列的化合物或者改善的选 自下列的化合物谱：长春花新碱、长春花碱、紫杉烷类(例如，紫杉醇 (红豆杉醇)、浆果赤霉素III、10-去乙酰浆果赤霉素III、10-去乙酰 紫杉醇、木糖基紫杉醇、7-表紫杉醇、7-表浆果赤霉素III、10-去乙酰 三尖杉宁碱、7-表三尖杉宁碱、泰素帝、三尖杉宁碱、木糖基三尖杉宁  碱、紫杉吉吩(taxagifine)、8-苯甲酰氧基紫杉吉吩、9-乙酰氧基紫 杉素、9-羟基紫杉素、taiwanxam、紫杉烷Ia、紫杉烷Ib、紫杉烷Ic、 紫杉烷Id、GMP紫杉醇、9-二氢-13-乙酰基浆果赤霉素III、10-去乙酰 -7-表紫杉醇、四氢大麻酚(THC)、大麻二酚(CBD)、染料木黄酮、大 豆黄素、可待因、吗啡、奎宁、紫草素、阿马里新、蛇根碱等。

[0149] 本发明还包括本发明的植物的后代，以及源自本发明的耐受除草剂 的植物的种子和源自本发明的耐受除草剂的植物的细胞。

[0150] 在各种实施方案中，在此的植物可以用于产生植物产品。因此，用 于制备后裔种子的方法包括：种植能够产生此处的植物的种子，使所得 到的植物生长，并且收获其后裔种子。在一些实施方案中，此类方法可 以进一步包括向所得到的植物施用抑制ACCase的除草剂组合物。类似 地，用于产生来自此处的植物的衍生产品的方法可以包括：加工其植物 部分以获得衍生产品。在一些实施方案中，此类方法可以用于获得衍生 产品，其是例如草料、饲料、种子磨粉、油或种子处理包衣种子中的任 一种。通过此类方法获得的种子、经处理的种子和其他植物产品是可以 商业化的有用产品。

[0151] 在各种实施方案中，本发明提供了来自本文所描述的任何植物的食 品、消费产品、工业产品和兽医学产品的生产。

[0152] 乙酰辅酶A羧化酶

[0153] 本发明提供了表达乙酰辅酶A羧化酶的植物，所述乙酰辅酶A羧 化酶所具有的氨基酸序列不同于在相应野生型植物中发现的乙酰辅酶 A羧化酶的氨基酸序列。为了易于理解，本文所使用的氨基酸编号系 统将是用于来自大穗看麦娘[Huds.](也称为黑草)的乙酰辅酶A羧化 酶的编号系统。编码大穗看麦娘乙酰辅酶A羧化酶的mRNA序列在 GenBank登录号AJ310767处可得到，并且蛋白质序列在GenBank登录 号CAC84161处可得到，两者均通过提及而特别地引入本文。所提及的 氨基酸的编号将跟随有(Am)，以指明该氨基酸所对应的大穗看麦娘序 列中的氨基酸。图18提供了大穗看麦娘乙酰辅酶A羧化酶氨基酸序列 (GenBank登录号CAC84161)。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中可以 改变的氨基酸以粗双下划线标示出，并且图19描绘了与大穗看麦娘乙 酰辅酶A羧化酶相比对的野生型稻乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列， 其中标明了一些关键残基。

[0154] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1781(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置1781(Am)处具有异亮氨酸(I1781)。本发 明的1781(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了异亮氨酸之外的 其他氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的 氨基酸的合适实例包括但不限于，亮氨酸(I1781L)、缬氨酸(I1781V)、 苏氨酸(I1781T)和丙氨酸(I1781A)。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸。

[0155] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1785(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置1785(Am)处具有丙氨酸(A1785)。本发明 的1785(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了丙氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，甘氨酸(A1785G)。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸。

[0156] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1786(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置1786(Am)处具有丙氨酸(A1786)。本发明 的1786(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了丙氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，脯氨酸(A1786P)。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸。

[0157] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1811(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置1811(Am)处具有异亮氨酸(I1811)。本发 明的1811(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了异亮氨酸之外的 其他氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的 氨基酸的合适实例包括但不限于，天冬酰胺(I1811N)。在一个实施 方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰 胺。

[0158] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1824(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置1824(Am)处具有谷氨酰胺(Q1824)。本发 明的1824(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了谷氨酰胺之外的 其他氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的 氨基酸的合适实例包括但不限于，脯氨酸(Q1824P)。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1824(Am)处具有脯氨酸。

[0159] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1864(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置1864(Am)处具有缬氨酸(V1864)。本发明 的1864(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了缬氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，苯丙氨酸(V1864F)。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1864(Am)处具有苯丙氨酸。

[0160] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1999(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置1999(Am)处具有色氨酸(W1999)。本发明 的1999(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了色氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，半胱氨酸(W1999C)和甘氨酸(W1999G)。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处 具有甘氨酸。

[0161] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2027(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2027(Am)处具有色氨酸(W2027)。本发明 的2027(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了色氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，半胱氨酸(W2027C)和精氨酸(W2027R)。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处 具有半胱氨酸。

[0162] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2039(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2039(Am)处具有谷氨酸(E2039)。本发明 的2039(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了谷氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，甘氨酸(E2039G)。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2039(Am)处具有甘氨酸。

[0163] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2041(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2041(Am)处具有异亮氨酸(I2041)。本发 明的2041(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了异亮氨酸之外的 其他氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的 氨基酸的合适实例包括但不限于，天冬酰胺(I2041N)或缬氨酸 (I2041V)。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位 置2041(Am)处具有天冬酰胺。

[0164] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2049(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2049(Am)处具有缬氨酸(V2049)。本发明 的2049(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了缬氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，苯丙氨酸(V2049F)、异亮氨酸(V2049I) 和亮氨酸(V2049L)。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化 酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸。

[0165] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2059(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2059(Am)处具有丙氨酸(A2059)。本发明 的2059(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了丙氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，缬氨酸(A2059V)。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2059(Am)处具有缬氨酸。

[0166] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2074(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2074(Am)处具有色氨酸(W2074)。本发明 的2074(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了色氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，亮氨酸(W2074L)。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸。

[0167] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2075(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2075(Am)处具有缬氨酸(V2075)。本发明 的2075(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了缬氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，甲硫氨酸(V2075M)、亮氨酸(V2075L) 和异亮氨酸(V2075I)。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置2075(Am)处具有亮氨酸。在一些实施方案中，本发明的 乙酰辅酶A羧化酶将具有在位置2075(Am)处的缬氨酸，和紧在位置 2075(Am)之后且在位置2076(Am)处的缬氨酸之前的额外的缬氨酸，即 可以在野生型酶具有两个缬氨酸之处具有三个连续的缬氨酸。

[0168] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2078(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2078(Am)处具有天冬氨酸(D2078)。本发 明的2078(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了天冬氨酸之外的 其他氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的 氨基酸的合适实例包括但不限于，赖氨酸(D2078K)、甘氨酸(D2078G) 或苏氨酸(D2078T)。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化 酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸。

[0169] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2079(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2079(Am)处具有丝氨酸(S2079)。本发明 的2079(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了丝氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，苯丙氨酸(S2079F)。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2079(Am)处具有苯丙氨酸。

[0170] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2080(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2080(Am)处具有赖氨酸(K2080)。本发明 的2080(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了赖氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，谷氨酸(K2080E)。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2080(Am)处具有谷氨酸。在另一 个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶通常将具有该位置的缺失 (Δ2080)。

[0171] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2081(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2081(Am)处具有异亮氨酸(I2081)。本发 明的2081(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了异亮氨酸之外的 其他氨基酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶通常将 具有该位置的缺失(Δ2081)。

[0172] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2088(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2088(Am)处具有半胱氨酸(C2088)。本发 明的2088(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了半胱氨酸之外的 其他氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的 氨基酸的合适实例包括但不限于，精氨酸(C2088R)、色氨酸(C2088W)、 苯丙氨酸(C2088F)、甘氨酸(C2088G)、组氨酸(C2088H)、赖氨 酸(C2088K)、丝氨酸(C2088S)、苏氨酸(C2088T)、亮氨酸(C2088L) 或缬氨酸(C2088V)。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化 酶将在位置2088(Am)处具有精氨酸。

[0173] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2095(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2095(Am)处具有赖氨酸(K2095)。本发明 的2095(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了赖氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，谷氨酸(K2095E)。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2095(Am)处具有谷氨酸。

[0174] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2096(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2096(Am)处具有甘氨酸(G2096)。本发明 的2096(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了甘氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，丙氨酸(G2096A)或丝氨酸(G2096S)。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2096(Am)处 具有丙氨酸。

[0175] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2098(Am)处不同于相应野生型乙酰辅酶A羧化酶。野生型大穗看麦娘 乙酰辅酶A羧化酶在位置2098(Am)处具有缬氨酸(V2098)。本发明 的2098(Am)ACCase突变体将在该位置处具有除了缬氨酸之外的其他 氨基酸。在本发明的乙酰辅酶A羧化酶中在该位置处可以发现的氨基 酸的合适实例包括但不限于，丙氨酸(V2098A)、甘氨酸(V2098G)、 脯氨酸(V2098P)、组氨酸(V2098H)、丝氨酸(V2098S)或半胱氨 酸(V2098C)。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置2098(Am)处具有丙氨酸。

[0176] 在一个实施方案中，本发明包括本发明的耐受除草剂的植物的乙 酰辅酶A羧化酶，其在下列位置中的仅一个位置处不同于相应野生型 植物的乙酰辅酶A羧化酶：1781(Am)、1785(Am)、1786(Am)、1811(Am)、 1824(Am)、1864(Am)、1999(Am)、2027(Am)、2039(Am)、2041(Am)、 2049(Am)、2059(Am)、2074(Am)、2075(Am)、2078(Am)、2079(Am)、 2080(Am)、2081(Am)、2088(Am)、2095(Am)、2096(Am)或2098(Am)。 在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物的乙酰辅酶A羧化酶 将在下列位置中的仅一个位置处不同：2078(Am)、2088(Am)或 2075(Am)。在优选的实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物的乙酰 辅酶A羧化酶将在下列位置中的仅一个位置处不同：2039(Am)、 2059(Am)、2080(Am)或2095(Am)。在更优选的实施方案中，本发明的 耐受除草剂的植物的乙酰辅酶A羧化酶将在下列位置中的仅一个位置 处不同：1785(Am)、1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、 2041(Am)、2049(Am)、2074(Am)、2079(Am)、2081(Am)、2096(Am)或 2098(Am)。在最优选的实施方案中，本发明的耐受除草剂的植物的乙 酰辅酶A羧化酶将在下列位置中的仅一个位置处不同：1781(Am)、 1999(Am)、2027(Am)、2041(Am)或2096(Am)。

[0177] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将具有下列置换 中的仅一个置换：在位置2075(Am)处的异亮氨酸，在位置2078(Am) 处的甘氨酸，或在位置2088(Am)处的精氨酸。在优选的实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将具有下列置换中的仅一个置换：在位置 2039(Am)处的甘氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2075(Am) 处的甲硫氨酸，位置2075(Am)的重复(即，在位置2074(Am)和2075(Am) 之间插入缬氨酸，或在位置2075(Am)和2076(Am)之间插入缬氨酸)， 氨基酸位置2080(Am)的缺失，在位置2080(Am)处的谷氨酸，位置 2081(Am)的缺失，或在位置2095(Am)处的谷氨酸。在更优选的实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将具有下列置换中的仅一个置换： 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置2075(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am) 处的甲硫氨酸，在位置2078(Am)处的苏氨酸，在位置2080(Am)处的缺 失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am)处的色氨酸、苯丙氨 酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸， 在位置2096(Am)处的丝氨酸，在位置2096(Am)处的丙氨酸，在位置 2098(Am)处的丙氨酸，在位置2098(Am)处的甘氨酸，在位置2098(Am) 处的组氨酸，在位置2098(Am)处的脯氨酸，或在位置2098(Am)处的丝 氨酸。在最优选的实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将具有下 列置换中的仅一个置换：在位置1781(Am)处的亮氨酸，在位置1781(Am) 处的苏氨酸，在位置1781(Am)处的缬氨酸，在位置1781(Am)处的丙氨 酸，在位置1999(Am)处的甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精 氨酸，在位置2027(Am)处的精氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺， 在位置2041(Am)处的缬氨酸，在位置2096(Am)处的丙氨酸，和在位置 2096(Am)处的丝氨酸。

[0178] 在一个实施方案中，以转基因方式使用编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽具有下列置换中的仅一个置换： 在位置2075(Am)处的异亮氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸，或在位 置2088(Am)处的精氨酸。在另一个实施方案中，用包含编码乙酰辅酶 A羧化酶多肽的核酸的表达载体构建体转化单子叶植物细胞，所述乙 酰辅酶A羧化酶多肽具有下列置换中的仅一个置换：在位置2075(Am) 处的异亮氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸，或在位置2088(Am)处的 精氨酸。

[0179] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的水稻植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在仅一个上面所描 述的氨基酸位置处具有置换。

[0180] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的BEP进化枝植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在仅一个上 面所描述的氨基酸位置处具有置换。

[0181] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的BET亚进化枝植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在仅一个 上面所描述的氨基酸位置处具有置换。

[0182] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的BET作物植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在仅一个上面 所描述的氨基酸位置处具有置换。

[0183] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的单子叶植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在仅一个上面所 描述的氨基酸位置处具有置换。

[0184] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的单子叶植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在氨基酸位置 1781(Am)处具有置换，其中在位置1781(Am)处的氨基酸不同于野生型 的那种并且不是亮氨酸。

[0185] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的单子叶植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在氨基酸位置 1999(Am)处具有置换，其中在位置1999(Am)处的氨基酸不同于野生型 的那种并且不是半胱氨酸。

[0186] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的单子叶植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在氨基酸位置 2027(Am)处具有置换，其中在位置2027(Am)处的氨基酸不同于野生型 的那种并且不是半胱氨酸。

[0187] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的单子叶植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在氨基酸位置 2041(Am)处具有置换，其中在位置2041(Am)处的氨基酸不同于野生型 的那种并且不是缬氨酸或天冬酰胺。

[0188] 在一个实施方案中，本发明提供了包含编码乙酰辅酶A羧化酶多 肽的核酸的单子叶植物，所述乙酰辅酶A羧化酶多肽在氨基酸位置 2096(Am)处具有置换，其中在位置2096(Am)处的氨基酸不同于野生型 的那种并且不是丙氨酸。

[0189] 本发明还包括乙酰辅酶A羧化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶所具有 的氨基酸序列在超过一个氨基酸位置处不同于在相应野生型植物中发 现的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列。例如，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶可以在2个、3个、4个、5个、6个或7个位置处不同于在相应 野生型植物中发现的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列。

[0190] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1781(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。此外，该实施方 案的酶将还包含下列中的一个或多个：在位置1785(Am)处的甘氨酸， 在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置 1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am) 处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在 位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置 2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬 氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、 苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置2096(Am)处的 丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、 组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶 A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙 氨酸，和在位置1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨 酸或丙氨酸，和在位置1811(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、 缬氨酸或丙氨酸，和在位置1824(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏 氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置1864(Am)处具有苯丙氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮 氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置1999(Am)处具有半胱氨酸 或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2027(Am) 处具有半胱氨酸或精氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 和在位置2039(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙 氨酸，和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬 氨酸或丙氨酸，和在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨 酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am) 处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2059(Am)处具有 缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2074(Am) 处具有亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置 2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一 个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有 亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2078(Am)处具有甘氨酸 或苏氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2079(Am) 处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置 2080(Am)处具有谷氨酸或缺失。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅 酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨 酸，和在位置2081(Am)处具有缺失。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或 丙氨酸，和在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨 酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、 缬氨酸或丙氨酸，和在位置2095(Am)处具有谷氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏 氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置
2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处 具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2098(Am)处具有丙 氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、 苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸， 和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或 丙氨酸，在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，在位置2041(Am) 处具有天冬酰胺，和在位置2096(Am)处具有丙氨酸。

[0191] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1785(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1785(Am)处具有甘氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一 个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置 1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am) 处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在 位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置 2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬 氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置 1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和 在位置1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅 酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置1811(Am)处具 有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位 置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置1824(Am)处具有脯氨酸。
在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘 氨酸，和在位置1864(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置
1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置 1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2027(Am) 处具有半胱氨酸或精氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2039(Am)处具有甘 氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘 氨酸，和在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。在一 个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有 甘氨酸，和在位置2059(Am)处具有缬氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置 2074(Am)处具有亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2075(Am)处具有亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2079(Am) 处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2080(Am)处具有谷氨酸或缺 失。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am) 处具有甘氨酸，和在位置
2081(Am)处具有缺失。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位 置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖 氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置 2095(Am)处具有谷氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2096(Am)处具有丙氨 酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位 置1785(Am)处具有甘氨酸，和在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、 脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0192] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1786(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1786(Am)处具有脯氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一 个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置 1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am) 处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在 位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置 2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬 氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸或 缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am)处的精氨酸、色氨 酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸 或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置2096(Am)处的丙氨酸 或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、 半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶 将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置1781(Am)处具有亮氨酸、 苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置1785(Am)处具有甘 氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置1811(Am)处具有天冬酰胺。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯 氨酸，和在位置1824(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置 1864(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置1999(Am)处具有半 胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或 精氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置
2039(Am)处具有甘氨酸。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨 酸，和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置 2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位 置2059(Am)处具有缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置2074(Am)处具有亮 氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、 甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置2078(Am)处具有甘 氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置
2079(Am)处具有苯丙氨酸。在 一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具 有脯氨酸，和在位置2080(Am)处具有谷氨酸或缺失。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和 在位置2081(Am)处具有缺失。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶 A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置
2088(Am)处具有 精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝 氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨酸，和在位置2095(Am)处具有谷氨 酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am) 处具有脯氨酸，和在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1786(Am)处具有脯氨 酸，和在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半 胱氨酸或丝氨酸。

[0193] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1811(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1811(Am)处具有天冬酰胺。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的 一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am) 处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在 位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置 2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬 氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置 1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺， 和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置1786(Am) 处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置1824(Am)处具有脯氨酸。在 一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具 有天冬酰胺，和在位置1864(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在 位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置 2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2039(Am) 处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处 具有天冬酰胺，和在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨 酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am) 处具有天冬酰胺，和在位置2059(Am)处具有缬氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺， 和在位置2074(Am)处具有亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2075(Am) 处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺， 和在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置 2079(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2080(Am)处具有 谷氨酸或缺失。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2081(Am)处具有缺失。在一 个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有 天冬酰胺，和在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘 氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天 冬酰胺，和在位置2095(Am)处具有谷氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置 2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置1811(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2098(Am) 处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0194] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1824(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1824(Am)处具有脯氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一 个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置 1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精 氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺， 在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am) 处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨 酸或苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷 氨酸，在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am)处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、 亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在 位置2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、 甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0195] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1864(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1864(Am)处具有苯丙氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的 一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1999(Am) 处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在 位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置 2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬 氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0196] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 1999(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含 下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸 或丙氨酸，在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸， 在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在 位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置 2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬 氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸， 和在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半 胱氨酸或甘氨酸，和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或 甘氨酸，和在位置1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸， 和在位置1811(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸，和在位 置1824(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸，和在位置 1864(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸，和在位置 2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸，和在位 置2039(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸，和在位置 2041(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸，和在位置 2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨 酸，和在位置2059(Am)处具有半胱氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨 酸，和在位置2074(Am)处具有亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的 乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸，和在 位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处 具有半胱氨酸或甘氨酸，和在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处 具有半胱氨酸或甘氨酸，和在位置2079(Am)处具有苯丙氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半 胱氨酸或甘氨酸，和在位置2080(Am)处具有谷氨酸或缺失。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱 氨酸或甘氨酸，和在位置2081(Am)处具有缺失。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨 酸，和在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、 组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸 或甘氨酸，和在位置2095(Am)处具有谷氨酸。在一个实施方案中，本 发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨 酸，和在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨 酸，和在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半 胱氨酸或丝氨酸。

[0197] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2027(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含 下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸 或丙氨酸，在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸， 在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置 1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在 位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置 2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬 氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置
2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸， 和在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半 胱氨酸或精氨酸，和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或 精氨酸，和在位置1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸， 和在位置1811(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在位 置1824(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在位置 1864(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置
2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在位置 1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在位 置2039(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置
2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在位置 2041(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在位置 
2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨 酸，和在位置2059(Am)处具有缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的 乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在 位置2074(Am)处具有亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶 A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在位置 2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一 个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有 半胱氨酸或精氨酸，和在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。在一 个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有 半胱氨酸或精氨酸，和在位置
2079(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施 方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨 酸或精氨酸，和在位置2080(Am)处具有谷氨酸或缺失。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸 或精氨酸，和在位置
2081(Am)处具有缺失。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸， 和在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨 酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨 酸，和在位置2095(Am)处具有谷氨酸。在一个实施方案中，本发明的 乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在 位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发明的 乙酰辅酶A羧化酶将在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸，和在 位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或 丝氨酸。

[0198] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2039(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2039(Am)处具有甘氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一 个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am) 处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置 2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在 位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am) 处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨 酸或苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷 氨酸，在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置 2088(Am)处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、 亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在 位置2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、 甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0199] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2041(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2041(Am)处具有天冬酰胺。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的 一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am) 处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置 2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位 置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸 或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸， 在位置2075(Am)处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸， 在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨 酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸，在位置2080(Am)处的缺失，在位置 2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am)处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、 甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位 置2095(Am)处的谷氨酸，在位置2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在 位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝 氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、 缬氨酸或丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处 具有天冬酰胺，和在位置1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在 位置1811(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅 酶A羧化酶将在位置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置1824(Am) 处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置1864(Am)处具有苯丙氨酸。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处 具有天冬酰胺，和在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处具有天 冬酰胺，和在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处具有天冬酰胺， 和在位置2039(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2041(Am) 处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2049(Am)处具有苯丙氨 酸、异亮氨酸或亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2059(Am)处具有缬 氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2074(Am)处具有亮氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处具有天 冬酰胺，和在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额 外的缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位 置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨 酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am) 处具有天冬酰胺，和在位置2079(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处具有天冬酰胺， 和在位置2080(Am)处具有谷氨酸或缺失。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处具有天冬酰胺，和在位置 2081(Am)处具有缺失。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化 酶将在位置
2041(Am)处具有异亮氨酸，和在位置2088(Am)处具有精氨 酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、 苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2041(Am)处具有异亮氨酸，和在位置2095(Am)处具有谷氨酸。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2041(Am)处 具有异亮氨酸，和在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置
2041(Am)处具有异亮 氨酸，和在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、 半胱氨酸或丝氨酸。

[0200] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2049(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。此外，该实施方案的 酶将还包含下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨 酸、缬氨酸或丙氨酸，在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am) 处的脯氨酸，在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯 氨酸，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸 或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am) 处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2059(Am)处的缬 氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸 或亮氨酸，和在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨 酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am) 处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，和在位置1785(Am)处具有甘氨 酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am) 处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，和在位置1786(Am)处具有脯氨 酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am) 处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，和在位置1811(Am)处具有天冬 酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，和在位置1824(Am)处 具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位 置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，和在位置1864(Am) 处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，和在位置 1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨 酸，和在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮 氨酸或亮氨酸，和在位置2039(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮 氨酸或亮氨酸，和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、 异亮氨酸或亮氨酸，和在位置2059(Am)处具有缬氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、 异亮氨酸或亮氨酸，和在位置2074(Am)处具有亮氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、 异亮氨酸或亮氨酸，和在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲 硫氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，和在位 置
2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙 酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨 酸，和在位置2079(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或 亮氨酸，和在位置2080(Am)处具有谷氨酸或缺失。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮 氨酸或亮氨酸，和在位置2081(Am)处具有缺失。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮 氨酸或亮氨酸，和在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、 甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、 异亮氨酸或亮氨酸，和在位置2095(Am)处具有谷氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、 异亮氨酸或亮氨酸，和在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。在一 个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2049(Am)处具有 苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，和在位置
2098(Am)处具有丙氨酸、甘 氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0201] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置2059(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2059(Am)处具有缬氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一 个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am) 处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置 2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位 置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸 或亮氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、 异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或 苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸或色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0202] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2074(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2074(Am)处具有亮氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一 个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am) 处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置 2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位 置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸 或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、 异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或 苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置 1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和 在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅 酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置1786(Am)处具 有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置1811(Am)处具有天冬酰胺。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮 氨酸，和在位置1824(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置 1864(Am)处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置1999(Am)处具有半 胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或 精氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置2039(Am)处具有甘氨酸。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨 酸，和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置 2049(Am)处具有苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位 置2059(Am)处具有缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置2075(Am)处具有亮 氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方案中，本 发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置 2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置2079(Am) 处具有苯丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置2080(Am)处具有谷氨酸或缺 失。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am) 处具有亮氨酸，和在位置
2081(Am)处具有缺失。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位 置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖 氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置
2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置2095(Am) 处具有谷氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置2074(Am)处具有亮氨酸，和在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨 酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2074(Am) 处具有亮氨酸，和在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、 组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0203] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2075(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。此外， 该实施方案的酶将还包含下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的 亮氨酸、苏氨酸或丙氨酸，在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置 1786(Am)处的脯氨酸，在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am) 处的脯氨酸，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半 胱氨酸或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置 2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am) 处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在 位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏氨酸，在 位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸，在位置 2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am)处的 精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝 氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置2096(Am) 处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨酸、脯氨 酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置
2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸 或额外的缬氨酸，和在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸 或丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，和在 位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶 A羧化酶将在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额 外的缬氨酸，和在位置1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨 酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，和在位置1811(Am)处具有天冬酰胺。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2075(Am)处 具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，和在位置1999(Am) 处具有半胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外 的缬氨酸，和在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸。在一个实施 方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置
2075(Am)处具有亮氨酸、 异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，和在位置2041(Am)处具有异亮 氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，和在 位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异 亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，和在位置2074(Am)处具有亮氨酸。 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2075(Am)处 具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，和在位置2078(Am) 处具有甘氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的 缬氨酸，和在位置2088(Am)处具有精氨酸或色氨酸、苯丙氨酸、甘氨 酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2075(Am)处具有亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，和在位置2096(Am)处具有 丙氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸， 和在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨 酸或丝氨酸。

[0204] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2078(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下 列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或 丙氨酸，在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸， 在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置 1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在 位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸， 在位置
2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮 氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮 氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬 氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和 在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸或丙氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨 酸，和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的 乙酰辅酶A羧化酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和在位 置1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A 羧化酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和在位置
1811(Am) 处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和在位置1999(Am)处具有半 胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和在位置
2027(Am)处具有半 胱氨酸或精氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和在位置2041(Am)处具有异 亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和在位置
2049(Am)处具有苯丙氨 酸、异亮氨酸或亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和在位置2074(Am) 处具有亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和在位置2075(Am)处具有亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和 在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、 赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中，本 发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸， 和在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸，和 在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸 或丝氨酸。

[0205] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2079(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2079(Am)处具有苯丙氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的 一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am) 处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置 2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位 置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸 或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸， 在位置2075(Am)处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸， 在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸， 在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am) 处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0206] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2080(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2080(Am)处具有谷氨酸或缺失。此外，该实施方案的酶将还包含下列 中的一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙 氨酸，在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在 位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置 1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在 位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸， 在位置
2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮 氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮 氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬 氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯 丙氨酸，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am)处的精氨酸、色 氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨 酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置2096(Am)处的丙氨 酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨 酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0207] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2081(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2081(Am)处具有缺失。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一个 或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，在 位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am) 处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置 2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位 置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸 或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸， 在位置2075(Am)处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸， 在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨 酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸，在位置2080(Am)处的缺失，在位置 2088(Am)处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、 亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在 位置2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、 甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0208] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2088(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨 酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。此外，该实施方案的酶将还 包含下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬 氨酸或丙氨酸，在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯 氨酸，在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸， 在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨 酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘 氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、 异亮氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am) 处的亮氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额 外的缬氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏氨酸，在位置2079(Am) 处的苯丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸，在位置2080(Am)处的缺 失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置2095(Am)处的谷氨酸，在位置 2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨 酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯 丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨 酸，和在位置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在 一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具 有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、 丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精 氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨 酸、苏氨酸或缬氨酸，和在位置1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施 方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精氨酸、 色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏 氨酸或缬氨酸，和在位置1811(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案 中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精氨酸、色 氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨 酸或缬氨酸，和在位置1999(Am)处具有半胱氨酸或甘氨酸。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精氨 酸或色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、 苏氨酸或缬氨酸，和在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸。在一 个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有 精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝 氨酸、苏氨酸或缬氨酸，和在位置2041(Am)处具有异亮氨酸。在一个 实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精 氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨 酸、苏氨酸或缬氨酸，和在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸 或亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨 酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，和在位置2074(Am)处具有亮 氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨 酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，和在位置2075(Am)处具有亮 氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方案中，本 发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬 氨酸，和在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬 氨酸，和在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬 氨酸，和在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、 半胱氨酸或丝氨酸。

[0209] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2095(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2095(Am)处具有谷氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一 个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置 1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am) 处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置 2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位 置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸 或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸， 在位置2075(Am)处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸， 在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨 酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸，在位置2080(Am)处的缺失，在位置 2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am)处的精氨酸或色氨酸、苯丙氨酸、 甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位 置2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘 氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。

[0210] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2096(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。此外，该实施方案的酶将还包含下 列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或 丙氨酸，在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸， 在位置1811(Am)处的天冬酰胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置 1864(Am)处的苯丙氨酸，在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在 位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸， 在位置
2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮 氨酸或亮氨酸，在位置2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮 氨酸，在位置2075(Am)处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬 氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸或苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯 丙氨酸，在位置2080(Am)处的谷氨酸，在位置2080(Am)处的缺失，在 位置2081(Am)处的缺失，在位置2088(Am)处的精氨酸、色氨酸、苯丙 氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸， 在位置2095(Am)处的谷氨酸，和在位置2098(Am)处的丙氨酸、甘氨酸、 脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中，本发明的 乙酰辅酶A羧化酶将在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位 置1781(Am)处具有亮氨酸、苏氨酸或丙氨酸。在一个实施方案中，本 发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸， 和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰 辅酶A羧化酶将在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位置 1786(Am)处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位置1811(Am) 处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置
2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位置1999(Am)处具有半 胱氨酸或甘氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位置2027(Am)处具有半 胱氨酸或精氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将 在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位置2041(Am)处具有异 亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位置
2049(Am)处具有苯丙氨 酸、异亮氨酸或亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位置2074(Am) 处具有亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在位置2075(Am)处具有亮氨 酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方案中，本发 明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和 在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。在一个实施方案中，本发明 的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸，和在 位置2088(Am)处具有精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、 赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中，本 发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸， 和在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨 酸或丝氨酸。

[0211] 在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶在氨基酸位置 2098(Am)处和在一个或多个额外的氨基酸位置处不同于相应野生型乙 酰辅酶A羧化酶。一般地，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置 2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨 酸。此外，该实施方案的酶将还包含下列中的一个或多个：在位置 1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，在位置1785(Am)处 的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在位置1811(Am)处的天冬酰 胺，在位置1824(Am)处的脯氨酸，在位置1864(Am)处的苯丙氨酸，在 位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸 或精氨酸，在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰 胺，在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸，在位置 2059(Am)处的缬氨酸，在位置2074(Am)处的亮氨酸，在位置2075(Am) 处的亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸，在位置2078(Am) 处的甘氨酸或苏氨酸，在位置2079(Am)处的苯丙氨酸，在位置2080(Am) 处的谷氨酸，在位置2080(Am)处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失， 在位置2088(Am)处的精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、 赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸，在位置2095(Am)处的谷 氨酸，和在位置2096(Am)处的丙氨酸或丝氨酸。在一个实施方案中， 本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、 脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸，和在位置
1781(Am)处具有亮氨 酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅 酶A羧化酶将在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨 酸、半胱氨酸或丝氨酸，和在位置1785(Am)处具有甘氨酸。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2098(Am)处具有丙氨 酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸，和在位置1786(Am) 处具有脯氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或 丝氨酸，和在位置1811(Am)处具有天冬酰胺。在一个实施方案中，本 发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、 脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸，和在位置1999(Am)处具有半胱 氨酸或甘氨酸。
在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或 丝氨酸，和在位置2027(Am)处具有半胱氨酸或精氨酸。在一个实施方 案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2098(Am)处具有丙氨酸、 甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸，和在位置2041(Am)处 具有异亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在 位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或 丝氨酸，和在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。在 一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2098(Am)处具 有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸，和在位置 2074(Am)处具有亮氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧 化酶将在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半 胱氨酸或丝氨酸，和在位置2075(Am)处具有亮氨酸、异亮氨酸、甲硫 氨酸或额外的缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化 酶将在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱 氨酸或丝氨酸，和在位置2078(Am)处具有甘氨酸或苏氨酸。在一个实 施方案中，本发明的乙酰辅酶A羧化酶将在位置2098(Am)处具有丙氨 酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸、半胱氨酸或丝氨酸，和在位置2088(Am) 处具有精氨酸或色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨 酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸。在一个实施方案中，本发明的乙酰辅 酶A羧化酶将在位置2098(Am)处具有丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨 酸、半胱氨酸或丝氨酸，和在位置2096(Am)处具有丙氨酸或丝氨酸。

[0212] 在一个实施方案中，本发明包括：在位置2075(Am)处具有异亮氨 酸和在位置1999(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置 2075(Am)处具有甲硫氨酸和在位置2080(Am)处具有谷氨酸的乙酰辅 酶A羧化酶；在位置2075(Am)处具有甲硫氨酸和在位置2095(Am)处具 有谷氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位 置2041(Am)处具有缬氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2078(Am)处具 有甘氨酸和在位置2039(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位 置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2049(Am)处具有丙氨酸的乙酰辅 酶A羧化酶；在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2049(Am)处具有 半胱氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位 置2049(Am)处具有丝氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2078(Am)处具 有甘氨酸和在位置2049(Am)处具有苏氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位 置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2059(Am)处具有缬氨酸的乙酰辅 酶A羧化酶；在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2079(Am)处具有 苯丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位 置2079(Am)处具有脯氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；和在位置2078(Am) 处具有甘氨酸和在位置2088(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅酶A羧化酶。

[0213] 在优选的实施方案中，本发明包括：在位置1781(Am)处具有亮氨 酸和在位置1824(Am)处具有脯氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置 1781(Am)处具有亮氨酸和在位置2027(Am)处具有精氨酸的乙酰辅酶A 羧化酶；和位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置1824(Am)处具有脯氨 酸的乙酰辅酶A羧化酶。

[0214] 在更优选的实施方案中，本发明包括：在位置1781(Am)处具有亮 氨酸和在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置 2098(Am)处具有丙氨酸和在位置
2049(Am)处具有亮氨酸的乙酰辅酶A 羧化酶；在位置2098(Am)处具有丙氨酸和在位置2088(Am)处具有组氨 酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具有丙氨酸和在位置 2088(Am)处具有苯丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具 有丙氨酸和在位置2088(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位 置2098(Am)处具有丙氨酸和在位置2088(Am)处具有亮氨酸的乙酰辅 酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具有丙氨酸和在位置2088(Am)处具有 苏氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具有甘氨酸和在位置 2088(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具有 甘氨酸和在位置2088(Am)处具有组氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具有甘氨酸和在位置2088(Am)处具有亮氨酸的乙酰辅酶A 羧化酶；在位置2098(Am)处具有甘氨酸和在位置2088(Am)处具有丝氨 酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具有甘氨酸和在位置 2088(Am)处具有苏氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具有 甘氨酸和在位置2088(Am)处具有缬氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置 2098(Am)处具有半胱氨酸和在位置2088(Am)处具有色氨酸的乙酰辅 酶A羧化酶；在位置2098(Am)处具有丝氨酸和在位置2088(Am)处具有 色氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；和在位置2080(Am)处具有缺失和在位置 2081(Am)处具有缺失的乙酰辅酶A羧化酶。

[0215] 在最优选的实施方案中，本发明包括：在位置1781(Am)处具有亮 氨酸和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺的乙酰辅酶A羧化酶；在位置 1781(Am)处具有亮氨酸和在位置
2027(Am)处具有半胱氨酸的乙酰辅 酶A羧化酶；在位置1781(Am)处具有亮氨酸和在位置
2075(Am)处具有 亮氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置1781(Am)处具有亮氨酸和在位置 
1864(Am)处具有苯丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置1781(Am)处具 有亮氨酸和在位置
2098(Am)处具有丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位 置1781(Am)处具有亮氨酸和在位置2098(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅 酶A羧化酶；在位置1781(Am)处具有亮氨酸和具有位置2075(Am)的重 复的乙酰辅酶A羧化酶；在位置1999(Am)处具有甘氨酸和在位置 1864(Am)处具有苯丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在位置1999(Am)处具 有甘氨酸和在位置2049(Am)处具有异亮氨酸的乙酰辅酶A羧化酶；在 位置1999(Am)处具有甘氨酸和在位置2075(Am)处具有亮氨酸的乙酰 辅酶A羧化酶；和在位置1999(Am)处具有甘氨酸和在位置2098(Am) 处具有丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶。

[0216] 核酸分子

[0217] 本发明还包括编码上面所描述的乙酰辅酶A羧化酶的全部或部分 的核酸分子。本发明的核酸分子可以包含这样的核酸序列，其编码包 含SEQ ID NO:2和3之一或两者的经修饰形式的氨基酸序列，其中所 述序列经修饰，从而所编码的蛋白质包含下列中的一个或多个：在位 置1781(Am)处的氨基酸为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸；在位置 1785(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为脯氨 酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置1824(Am)处的氨 基酸为脯氨酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置 1999(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或甘氨酸；在位置2027(Am)处的氨基 酸为半胱氨酸或精氨酸；在位置2039(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位 置2041(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置2049(Am)处的氨基酸为苯 丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；在位置2059(Am)处的氨基酸为缬氨酸； 在位置2074(Am)处的氨基酸为亮氨酸；在位置2075(Am)处的氨基酸为 亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸或额外的缬氨酸；在位置2078(Am)处的 氨基酸为甘氨酸或苏氨酸；在位置2079(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸； 在位置2080(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸是 缺失的；在位置2081(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2088(Am)处的 氨基酸为精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮 氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；在位置2095(Am)处的氨基酸为谷氨 酸；在位置2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸或丝氨酸；或者在位置 2098(Am)处的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸或丝氨酸； 以及与所述编码序列的全部或部分互补的核酸分子。在一些实施方案 中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧化酶，其具有多 个上面所描述的与野生型乙酰辅酶A羧化酶的差异。

[0218] 在一个实施方案中，本发明包括编码这样的乙酰辅酶A羧化酶的 核酸分子，所述乙酰辅酶A羧化酶在下列位置中的仅一个位置处不同 于相应野生型植物的乙酰辅酶A羧化酶：1781(Am)、1785(Am)、 1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、1999(Am)、2027(Am)、 2039(Am)、2041(Am)、2049(Am)、2059(Am)、2074(Am)、2075(Am)、 2078(Am)、2079(Am)、2080(Am)、2081(Am)、2088(Am)、2095(Am)、 2096(Am)和2098(Am)。在一个实施方案中，本发明的耐受除草剂的植 物的乙酰辅酶A羧化酶将在下列位置中的仅一个位置处不同： 2078(Am)、
2088(Am)或2075(Am)。在优选的实施方案中，本发明的耐 受除草剂的植物的乙酰辅酶A羧化酶将在下列位置中的仅一个位置处 不同：2039(Am)、2059(Am)、2080(Am)或2095(Am)。在更优选的实施 方案中，本发明的耐受除草剂的植物的乙酰辅酶A羧化酶将在下列位 置中的仅一个位置处不同：1785(Am)、1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、 1864(Am)、2041(Am)、
2049(Am)、2074(Am)、2079(Am)、2081(Am)、 2096(Am)或2098(Am)。在最优选的实施方案中，本发明的耐受除草剂 的植物的乙酰辅酶A羧化酶将在下列位置中的仅一个位置处不同： 
1781(Am)、1999(Am)、2027(Am)、2041(Am)或2096(Am)。

[0219] 在一个实施方案中，本发明包括编码这样的乙酰辅酶A羧化酶的 核酸分子，所述乙酰辅酶A羧化酶具有下列置换中的仅一个置换：在 位置2075(Am)处的异亮氨酸，在位置2078(Am)处的甘氨酸，或在位置 2088(Am)处的精氨酸。在优选的实施方案中，本发明包括编码这样的 乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子，所述乙酰辅酶A羧化酶具有下列置换 中的仅一个置换：在位置2039(Am)处的甘氨酸，在位置2059(Am)处的 缬氨酸，在位置2075(Am)处的甲硫氨酸，位置2075(Am)的重复(即， 在2074(Am)和2075(Am)之间插入缬氨酸，或在位置
2075(Am)和 2076(Am)之间插入缬氨酸)，氨基酸位置2088(Am)的缺失，在位置 2080(Am)处的谷氨酸，位置2088(Am)的缺失，或在位置2095(Am)处的 谷氨酸。在更优选的实施方案中，本发明包括编码这样的乙酰辅酶A 羧化酶的核酸分子，所述乙酰辅酶A羧化酶具有下列置换中的仅一个 置换：在位置1785(Am)处的甘氨酸，在位置1786(Am)处的脯氨酸，在 位置
1811(Am)处的天冬酰胺，在位置2075(Am)处的亮氨酸，在位置 2075(Am)处的甲硫氨酸，在位置2078(Am)处的苏氨酸，在位置2080(Am) 处的缺失，在位置2081(Am)处的缺失，在位置
2088(Am)处的色氨酸， 在位置2096(Am)处的丝氨酸，在位置2096(Am)处的丙氨酸，在位置 
2098(Am)处的丙氨酸，在位置2098(Am)处的甘氨酸，在位置2098(Am) 处的组氨酸，在位置
2098(Am)处的脯氨酸，或在位置2098(Am)处的丝 氨酸。在最优选的实施方案中，本发明包括编码这样的乙酰辅酶A羧 化酶的核酸分子，所述乙酰辅酶A羧化酶具有下列置换中的仅一个置 换：在位置1781(Am)处的亮氨酸，在位置1781(Am)处的苏氨酸，在位 置1781(Am)处的缬氨酸，在位置1781(Am)处的丙氨酸，在位置1999(Am) 处的甘氨酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸，在位置2027(Am)处的精 氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺，在位置2041(Am)处的缬氨酸， 在位置2096(Am)处的丙氨酸，和在位置2096(Am)处的丝氨酸。

[0220] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶 A羧化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶包含：在位置1781(Am)处的亮氨酸、 苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置1999(Am)处的半胱氨酸或甘氨酸。 在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧 化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶包含：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏 氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2027(Am)处的半胱氨酸或精氨酸。 在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧 化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶包含：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏 氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2041(Am)处的天冬酰胺。在一个实 施方案中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧化酶，所 述乙酰辅酶A羧化酶包含：
在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬 氨酸或丙氨酸，和在位置2049(Am)处的苯丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸。 在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧 化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶包含：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏 氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2075(Am)处的亮氨酸或异亮氨酸。 在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧 化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶包含：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏 氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置2078(Am)处的甘氨酸。在一个实施 方案中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧化酶，所述 乙酰辅酶A羧化酶包含：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨 酸或丙氨酸，和在位置2088(Am)处的精氨酸。在一个实施方案中，本 发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧化酶，所述乙酰辅酶A 羧化酶包含：在位置
1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸， 和在位置2096(Am)处的丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的核酸分 子可以编码这样的乙酰辅酶A羧化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶包含： 在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，和在位置 2098(Am)处的丙氨酸。在一个实施方案中，本发明的核酸分子可以编 码这样的乙酰辅酶A羧化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶包含：在位置 1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸，在位置2027(Am)处 的半胱氨酸，和在位置2041(Am)处的天冬酰胺。在一个实施方案中， 本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅酶A羧化酶，所述乙酰辅酶 A羧化酶包含：在位置1781(Am)处的亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨 酸，在位置2027(Am)处的半胱氨酸，在位置2041(Am)处的天冬酰胺， 和在位置2096(Am)处的丙氨酸。

[0221] 在一个实施方案中，本发明包括：编码在位置2075(Am)处具有异 亮氨酸和在位置1999(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分 子；编码在位置2075(Am)处具有甲硫氨酸和在位置2080(Am)处具有谷 氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2075(Am)处具有甲 硫氨酸和在位置2095(Am)处具有谷氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分 子；
编码在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2041(Am)处具有缬氨 酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2078(Am)处具有甘氨 酸和在位置2039(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子； 编码在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2049(Am)处具有丙氨酸 的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2078(Am)处具有甘氨酸 和在位置2049(Am)处具有半胱氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子； 编码在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2049(Am)处具有丝氨酸 的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2078(Am)处具有甘氨酸 和在位置2049(Am)处具有苏氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编 码在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2059(Am)处具有缬氨酸的 乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2078(Am)处具有甘氨酸和 在位置2079(Am)处具有苯丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编 码在位置2078(Am)处具有甘氨酸和在位置2079(Am)处具有脯氨酸的 乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；或者编码在位置2078(Am)处具有甘氨 酸和在位置2088(Am)处具有甘氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子。

[0222] 在优选的实施方案中，本发明包括：编码在位置1781(Am)处具有 亮氨酸和在位置1824(Am)处具有脯氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分 子；编码在位置1781(Am)处具有亮氨酸和在位置2027(Am)处具有精氨 酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；或者编码在位置2078(Am)处具有 甘氨酸和在位置1824(Am)处具有脯氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分 子。

[0223] 在更优选的实施方案中，本发明包括：编码在位置1781(Am)处具 有亮氨酸和在位置2049(Am)处具有苯丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核 酸分子；编码在位置2098(Am)处具有丙氨酸和在位置2049(Am)处具有 亮氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2098(Am)处具有 丙氨酸和在位置2088(Am)处具有组氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分 子；编码在位置2098(Am)处具有丙氨酸和在位置2088(Am)处具有苯丙 氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2098(Am)处具有丙 氨酸和在位置2088(Am)处具有赖氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分 子；编码在位置2098(Am)处具有丙氨酸和在位置2088(Am)处具有亮氨 酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2098(Am)处具有丙氨 酸和在位置2088(Am)处具有苏氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子； 编码在位置2098(Am)处具有甘氨酸和在位置2088(Am)处具有甘氨酸 的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2098(Am)处具有甘氨酸 和在位置2088(Am)处具有组氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编 码在位置2098(Am)处具有甘氨酸和在位置2088(Am)处具有亮氨酸的 乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；
编码在位置2098(Am)处具有甘氨酸和 在位置2088(Am)处具有丝氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码 在位置2098(Am)处具有甘氨酸和在位置2088(Am)处具有苏氨酸的乙 酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2098(Am)处具有甘氨酸和在 位置2088(Am)处具有缬氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在 位置2098(Am)处具有半胱氨酸和在位置2088(Am)处具有色氨酸的乙 酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置2098(Am)处具有丝氨酸和在 位置2088(Am)处具有色氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；或者编 码在位置2080(Am)处具有缺失和在位置2081(Am)处具有缺失的乙酰 辅酶A羧化酶的核酸分子。

[0224] 在最优选的实施方案中，本发明包括：编码在位置1781(Am)处具 有亮氨酸和在位置2041(Am)处具有天冬酰胺的乙酰辅酶A羧化酶的核 酸分子；编码在位置1781(Am)处具有亮氨酸和在位置2027(Am)处具有 半胱氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置1781(Am)处具 有亮氨酸和在位置2075(Am)处具有亮氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸 分子；编码在位置1781(Am)处具有亮氨酸和在位置1864(Am)处具有苯 丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置1781(Am)处具有 亮氨酸和在位置2098(Am)处具有丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分 子；编码在位置1781(Am)处具有亮氨酸和在位置2098(Am)处具有甘氨 酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置1781(Am)处具有亮氨 酸和位置
2075(Am)的重复的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位 置1999(Am)处具有甘氨酸和在位置1864(Am)处具有苯丙氨酸的乙酰 辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在位置1999(Am)处具有甘氨酸和在位 置2049(Am)处具有异亮氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子；编码在 位置1999(Am)处具有甘氨酸和在位置2075(Am)处具有亮氨酸的乙酰 辅酶A羧化酶的核酸分子；或者编码在位置1999(Am)处具有甘氨酸和 在位置2098(Am)处具有丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子。

[0225] 在一个实施方案中，本发明提供了水稻植物，其包含上面所描述 的编码具有一个或多个置换的乙酰辅酶A羧化酶多肽的核酸。

[0226] 在一个实施方案中，本发明提供了BEP进化枝植物，其包含上面 所描述的编码具有一个或多个置换的乙酰辅酶A羧化酶多肽的核酸。

[0227] 在一个实施方案中，本发明提供了BET亚进化枝植物，其包含上 面所描述的编码具有一个或多个置换的乙酰辅酶A羧化酶多肽的核 酸。

[0228] 在一个实施方案中，本发明提供了BET作物植物，其包含上面所 描述的编码具有一个或多个置换的乙酰辅酶A羧化酶多肽的核酸。

[0229] 在一个实施方案中，本发明提供了单子叶植物，其包含上面所描 述的编码具有一个或多个置换的乙酰辅酶A羧化酶多肽的核酸。

[0230] 本发明的核酸分子可以是源自基因组DNA或cDNA的DNA，或者 RNA。本发明的核酸分子可以是天然出现的，或者可以是合成的。本发 明的核酸分子可以是分离的、重组的和/或经诱变的。

[0231] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子编码其中在位置1781(Am) 处的氨基酸为亮氨酸或丙氨酸的乙酰辅酶A羧化酶，或者与此类核酸 分子互补。此类核酸分子包括但不限于：用作用于初级RNA转录的模 板的基因组DNA，编码乙酰辅酶A羧化酶的质粒分子，以及编码此类 乙酰辅酶A羧化酶的mRNA。

[0232] 本发明的核酸分子可以包含非编码序列，其可以被转录或可以不 被转录。可以在本发明的核酸分子中包括的非编码序列包括但不限于， 5'和3'UTR、多腺苷酸化信号和控制基因表达的调节序列(例如，启 动子)。本发明的核酸分子还可以包含编码转运肽、蛋白酶切割位点、 共价修饰位点等的序列。在一个实施方案中，除了编码乙酰辅酶A羧 化酶的序列外，本发明的核酸分子还编码叶绿体转运肽序列。

[0233] 在另一个实施方案中，本发明的核酸分子可以编码这样的乙酰辅 酶A羧化酶，所述乙酰辅酶A羧化酶与SEQ ID NO:2和3之一或两者 的经修饰形式具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或 更高的序列同一性，其中所述序列经修饰，从而所编码的蛋白质包含 下列中的一个或多个：在位置1781(Am)处的氨基酸为亮氨酸、苏氨酸、 缬氨酸或丙氨酸；在位置1785(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置 1786(Am)处的氨基酸为脯氨酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为天冬酰 胺；在位置1824(Am)处的氨基酸为脯氨酸；在位置1864(Am)处的氨基 酸为苯丙氨酸；在位置1999(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或甘氨酸；在 位置2027(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或精氨酸；在位置2039(Am)处的 氨基酸为甘氨酸；在位置2041(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置 2049(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸、亮氨酸或异亮氨酸；在位置2059(Am) 处的氨基酸为缬氨酸；在位置2074(Am)处的氨基酸为亮氨酸；
在位置2075(Am)处的氨基酸为亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸或额外的缬氨酸； 在位置2078(Am)处的氨基酸为甘氨酸或苏氨酸；在位置2079(Am)处的 氨基酸为苯丙氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置 2080(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2081(Am)处的氨基酸是缺失 的；在位置2088(Am)处的氨基酸为精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨 酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；在位置2095(Am) 处的氨基酸为谷氨酸；在位置2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸或丝氨 酸；或者在位置2098(Am)处的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组 氨酸或丝氨酸；以及与所述编码序列的全部或部分互补的核酸分子。

[0234] 如本文中所使用的，“序列同一性百分比(％)”被定义为在将序 列进行比对和引入缺口(如有必要，以达到最大序列同一性百分比， 如用设置为缺省值的搜索参数通过在http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi处可得的BLAST程序所产生的)后，与在目标序 列(或其特定部分)中的核苷酸或氨基酸相同的在候选衍生序列中的 核苷酸或氨基酸的百分比。

[0235] 本发明还包括与编码本发明的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子杂交 的核酸分子，以及与编码本发明的乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子的反 向互补物(reverse complement)杂交的核酸分子。在一个实施方案 中，本发明的核酸分子包括这样的核酸分子，其与编码SEQ ID NO:2 和3之一或两者的经修饰形式中的一个或多个的核酸分子杂交，其中 所述序列经修饰，从而所编码的蛋白质包含下列中的一个或多个：在 位置1781(Am)处的氨基酸为亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或丙氨酸；在位 置1785(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位置1786(Am)处的氨基酸为脯氨 酸；在位置1811(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置1824(Am)处的氨 基酸为脯氨酸；在位置1864(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸；在位置 1999(Am)处的氨基酸为半胱氨酸或甘氨酸；在位置2027(Am)处的氨基 酸为半胱氨酸或精氨酸；在位置2039(Am)处的氨基酸为甘氨酸；在位 置2041(Am)处的氨基酸为天冬酰胺；在位置2049(Am)处的氨基酸为苯 丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸；在位置2059(Am)处的氨基酸为缬氨酸； 在位置2074(Am)处的氨基酸为亮氨酸；在位置2075(Am)处的氨基酸为 亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸或额外的缬氨酸；在位置2078(Am)处的 氨基酸为甘氨酸或苏氨酸；在位置2079(Am)处的氨基酸为苯丙氨酸； 在位置2080(Am)处的氨基酸为谷氨酸；在位置2080(Am)处的氨基酸是 缺失的；在位置2081(Am)处的氨基酸是缺失的；在位置2088(Am)处的 氨基酸为精氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮 氨酸、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸；在位置2095(Am)处的氨基酸为谷氨 酸；在位置2096(Am)处的氨基酸为丙氨酸或丝氨酸；或者在位置 2098(Am)处的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、组氨酸或丝氨酸； 以及与所述编码序列的全部或部分互补的核酸分子，或此类核酸分子 的反向互补物(在严紧条件下)。杂交的严紧度可以通过在杂交和洗 涤期间的温度、离子强度、pH和变性试剂(例如，甲酰胺)的存在来 控制。可以使用的严紧条件包括，在Current Protocols in Molecular Biology,第1卷,第2.10章,John Wiley&Sons,Publishers(1994) 和Sambrook等人,Molecular Cloning,Cold Spring Harbor(1989) 中所定义的那些，这些文献特别地引入本文，因为它们涉及教导严紧 条件。

[0236] 可以将在组合有目的基因的质粒中的任何上面所描述的突变体用 于转化。

[0237] 在一个实施方案中，本发明提供了表达载体，其包含编码任何上 面所描述的ACCase突变体的核酸分子。

[0238] 在一个实施方案中，本发明提供了上面所描述的突变型ACCase 核酸和由此类突变型ACCase核酸编码的蛋白质作为选择标记的用途。

[0239] 在一个实施方案中，本发明的核酸分子包括可以用作杂交探针、 测序引物和/或PCR引物的寡核苷酸。此类寡核苷酸可以例如用于确定 在编码乙酰辅酶A羧化酶的核酸分子中在特定位置处的密码子序列， 例如，通过等位基因特异性PCR。此类寡核苷酸的长度可以为大约15 至大约30个核苷酸，大约20至大约30个核苷酸，或大约20-25个核 苷酸。

[0240] 关于双突变型ACCase基因的测试“DBLM测定法”：

[0241] (1)在(例如，至少12株植物，和优选地至少20株植物的)受 试群体中，包含1或2个拷贝的编码“至少双突变型ACCase”的转基 因的ACCase基因(即，待测试的转基因的ACCase基因的最少1个和 最多2个染色体插入)的整株水稻植物，

[0242] 其中所述水稻植物为T0(“T-零”)再生体(regenerant)，

[0243] 并且平行地，具有用作未处理的校验(check)植物的此类植物的 对照群体；

[0244] (2)以200L/ha的喷洒体积向受试群体施用包含吡喃草酮(AI) 和1％作物油浓缩物(Crop Oil Concentrate，COC)的组合物，以提 供等价于50g/ha的吡喃草酮(AI)的AI施用率；

[0245] (3)测定每株受试植物和校验植物的植物毒性得分，基于传统的 植物损伤评定体系(例如，评价除草剂灼伤、叶形态学改变、萎蔫、 黄化和其他形态学特征的目视证据，优选地根据典型的、至少5级的 损伤评定量表)；

[0246] (4)分析所收集的数据，以确定是否受试群体中至少75％的植物 展示出平均植物毒性，即小于10％的相对于校验植物而言损伤的增加； 和

[0247] (5)将如此确定的正向结果鉴定为证明了所述双突变型ACCase 提供可接受的AIT。

[0248] 除草剂

[0249] 本发明提供了耐受通常抑制野生型植物生长的除草剂浓度的植 物，例如水稻植物。一般地，所述植物抗干扰乙酰辅酶A羧化酶活性 的除草剂。可以将任何抑制乙酰辅酶A羧化酶活性的除草剂与本发明 的植物相结合地使用。合适的实例包括但不限于，环己烯酮类除草剂、 芳氧苯氧丙酸酯类除草剂和苯基吡唑啉类除草剂。在一些控制杂草和/ 或使耐受除草剂的植物生长的方法中，至少一种除草剂选自烯禾定、 噻草酮、吡喃草酮、吡氟氯禾灵、精吡氟氯禾灵或这些除草剂中任一 种的衍生物。

[0250] 表1提供了环己烯酮类除草剂(DIMs，也称为：环己烯肟类、环 己烯酮肟类；和CHD)的列表，所述环己烯酮类除草剂干扰乙酰辅酶A 羧化酶活性并且可以与本发明的耐受除草剂的植物相结合地使用。本 领域技术人员将会认识到，存在有在该类别中的其他除草剂并且它们 可以与本发明的耐受除草剂的植物相结合地使用。表1中还包括芳氧 苯氧丙酸酯类除草剂(也称为芳氧基苯氧基丙酸酯类；芳氧基苯氧基 链烷酸酯类；羟苯氧基类(oxyphenoxy)；APP；AOPP；APA；APPA； FOP，注意这些有时书写为带有后缀‘-oic’)的列表，所述芳氧苯氧 丙酸酯类除草剂干扰乙酰辅酶A羧化酶活性并且可以与本发明的耐受 除草剂的植物相结合地使用。本领域技术人员将会认识到，存在有在 该类别中的其他除草剂并且它们可以与本发明的耐受除草剂的植物相 结合地使用。

[0251] 表1

[0252]

[0253]

[0254] 除了上面所列出的除草剂之外，还可以将其他ACCase抑制剂与本 发明的耐受除草剂的植物相结合地使用。例如，可以使用苯基吡唑类 别(也称为DENs)的抑制ACCase的除草剂。一个示例性的DEN为唑 啉草酯，其是该类别的苯基吡唑啉类型的成员。包含唑啉草酯的除草 组合物以商标Axial和Traxos进行销售。

[0255] 可以以任何农艺学上可接受的形式使用在此的除草组合物，其包 含一种或多种抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂，和任选地其他农艺学 A.I.，例如一种或多种选自下列的磺酰脲类(SUs)：酰嘧磺隆、氟啶 嘧磺隆、甲酰胺磺隆、唑吡嘧磺隆、碘磺隆、甲磺胺磺隆、烟嘧磺隆、 噻吩磺隆和苯磺隆、其农艺学上可接受的盐和酯，或者一种或多种选 自下列的咪唑啉酮类：咪草啶酸、咪唑乙烟酸、咪唑烟酸、甲咪唑烟 酸、其组合和其农业上合适的盐和酯。例如，可以将这些配制为即喷 型(ready-to-spray)水性溶液、粉剂、悬浮液；配制为浓缩的或高 度浓缩的水性、油性或其他溶液，悬浮液，或分散体；配制为乳液、 油分散体、糊剂、粉尘剂(dusts)、颗粒剂或其他可播撒的形式。可 以通过任何本领域已知的手段(包括例如，喷洒、雾化、撒粉(dusting)、 撒播、灌溉、种子处理或与种子相混合的共种植)来施用除草剂组合 物。使用形式依赖于所想要的目的；在任何情况下，它们应当确保根 据本发明的活性成分的最佳的可能散布。

[0256] 在其他实施方案中，当可选的A.I.包括来自在此的植物通常会易 感的不同类别的除草剂时，待使用的植物选自进一步包含对此类除草 剂的耐受性性状的那些植物。可以通过任何本领域已知的方法(例如 包括，通过杂交或渐渗来获得耐受性性状基因的传统育种的技术，诱 变的技术，和/或转化的技术)将此类进一步的耐受性性状提供给植物。 可以将此类植物描述为具有“叠加的”性状。

[0257] 此外，可以将任一种上面的抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂与一 种或多种另一类别的除草剂相组合，所述另一类别的除草剂例如为下 列中的任一种：本领域已知的抑制乙酰羟酸合酶的除草剂、抑制EPSP 合酶的除草剂、抑制谷氨酰胺合酶的除草剂、脂质或色素生物合成抑 制剂除草剂、细胞膜破裂剂除草剂、光合作用或呼吸抑制剂除草剂、 或者生长调节剂或生长抑制剂除草剂。非限制性的实例包括，在美国 杂草科学学会(Weed Science Society of America)的Herbicide Handbook(第9版，编辑S.A.Senseman,2007年的版权)中所记述 的那些。本文的除草组合物可以包含一种或多种选自下列的农业活性 成分：农业上可接受的杀真菌剂、嗜球果伞素类杀真菌剂、杀昆虫剂 (包括杀线虫剂)、杀螨剂和杀软体动物剂。非限制性的实例包括，  在2009Crop  Protection  Reference(www.greenbook.net),Vance Publications中所记述的那些。

[0258] 在本发明的一个实施方案中，将任一种上面的抑制乙酰辅酶A羧 化酶的除草剂与展示出低的对于水稻的损害的除草剂相组合，其中对 于此类除草剂的水稻耐受性可以任选地为所述作物植物的遗传修饰的 结果。此类除草剂的实例为：抑制乙酰羟酸合酶的除草剂，咪草酸、 咪草啶酸、甲咪唑烟酸、咪唑烟酸、咪唑喹啉酸、咪唑乙烟酸、四唑 嘧磺隆、苄嘧磺隆、氯嘧磺隆、环丙嘧磺隆、乙氧嘧磺隆、氟吡磺隆、 氯吡嘧磺隆、唑吡嘧磺隆、甲磺隆、苯胺嘧磺隆(orthosulfamuron)、 丙哒咪嘧磺隆(propyrisulfuron)、吡嘧磺隆、双草醚、嘧磺苯胺 (pyrimisulfan)或五氟磺草胺；抑制EPSP合酶的除草剂，草甘膦或 草硫膦；抑制谷氨酰胺合酶的除草剂，草铵膦、精草铵膦或双丙氨酰 膦；脂质生物合成抑制剂除草剂，呋草黄、禾草敌或禾草丹；光合作 用抑制剂除草剂，灭草松、百草枯、扑草净或敌稗；漂白剂除草剂， 双环磺草酮、异 草松或呋喃烷磺草酮(tefuryltrione)；生长素除 草剂，2,4-D、氯氟吡氧乙酸、MCPA、二氯喹啉酸、氯甲喹啉酸或三氯 吡氧乙酸；微管抑制剂除草剂，二甲戊灵；VLCFA抑制剂除草剂，莎 稗磷、丁草胺、四唑酰草胺、氟氯苯胺唑草酮(ipfencarbazone)、 苯噻酰草胺、丙草胺、乙草胺、异丙甲草胺或S-异丙甲草胺；或者原 卟啉原-IX氧化酶抑制剂除草剂，唑草酯、 草酮、乙氧氟草醚、双 唑草腈(pyraclonil)或苯嘧磺草胺。

[0259] 在本发明的一个实施方案中，将任一种上面的抑制乙酰辅酶A羧 化酶的除草剂与展示出低的对于谷类(例如，小麦、大麦或黑麦)的 损害的除草剂相组合，其中对于此类除草剂的谷类耐受性可以任选地 为所述作物植物的遗传修饰的结果。此类除草剂的实例为：抑制乙酰 羟酸合酶的除草剂，咪草酸、咪草啶酸、甲咪唑烟酸、咪唑烟酸、咪 唑喹啉酸、咪唑乙烟酸、酰嘧磺隆、氯磺隆、氟吡磺隆、氟啶嘧磺隆、 碘磺隆、甲磺胺磺隆、甲磺隆、磺酰磺隆、噻吩磺隆、醚苯磺隆、苯 磺隆、三氟甲磺隆、双氟磺草胺、甲氧磺草胺(pyroxsulam)、嘧磺 苯胺、氟唑磺隆、丙苯磺隆或噻吩磺脲唑草酮(thiencarbazone)； 抑制EPSP合酶的除草剂，草甘膦或草硫膦；抑制谷氨酰胺合酶的除草 剂，草铵膦、精草铵膦或双丙氨酰膦；脂质生物合成抑制剂除草剂， 苄草丹；光合作用抑制剂除草剂，灭草松、绿麦隆、异丙隆、碘苯腈、  溴苯腈；漂白剂除草剂，吡氟酰草胺、呋草酮、氟吡酰草胺或磺酰苯  吡草酮(pyrasulfotole)；生长素除草剂，环丙嘧啶酸 (aminocyclopyrachlor)、氯氨吡啶酸、2,4-D、麦草畏、氯氟吡氧 乙酸、MCPA、二氯吡啶酸、MCPP或MCPP-P；微管抑制剂除草剂，二甲 戊灵或氟乐灵；VLCFA抑制剂除草剂，氟噻草胺；或者原卟啉原-IX 氧化酶抑制剂除草剂，苯连三嗪唑草酮(bencarbazone)、唑草酯或 苯嘧磺草胺；或者除草剂野燕枯。

[0260] 在本发明的一个实施方案中，将任一种上面的抑制乙酰辅酶A羧 化酶的除草剂与展示出低的对于草坪的损害的除草剂相组合，其中对 于此类除草剂的草坪耐受性可以任选地为所述作物植物的遗传修饰的 结果。此类除草剂的实例为：抑制乙酰羟酸合酶的除草剂，咪草酸、 咪草啶酸、甲咪唑烟酸、咪唑烟酸、咪唑喹啉酸、咪唑乙烟酸、啶嘧 磺隆、甲酰胺磺隆、氯吡嘧磺隆、三氟啶磺隆、双草醚或噻吩磺脲唑 草酮；抑制EPSP合酶的除草剂，草甘膦或草硫膦；抑制谷氨酰胺合酶 的除草剂，草铵膦、精草铵膦或双丙氨酰膦；光合作用抑制剂除草剂， 莠去津或灭草松；漂白剂除草剂，甲基磺草酮、氟吡酰草胺、磺酰苯 吡草酮或异 磺酰苯吡草酮(topramezone)；生长素除草剂，环丙嘧 啶酸、氯氨吡啶酸、2,4-D、2,4-DB、二氯吡啶酸、麦草畏、2,4-滴丙 酸、精2,4-滴丙酸、氯氟吡氧乙酸、MCPA、MCPB、MCPP、MCPP-P、二 氯喹啉酸、氯甲喹啉酸或三氯吡氧乙酸；微管抑制剂除草剂，二甲戊 灵；VLCFA抑制剂除草剂，二甲吩草胺、精二甲吩草胺或氟氯苯胺唑 草酮；原卟啉原-IX氧化酶抑制剂除草剂，苯嘧磺草胺或甲磺草胺； 或者除草剂茚嗪氟草胺(indaziflam)。

[0261] 此外，可以将任一种上面的抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂与安 全剂相组合。安全剂是预防或降低对于有用植物的损害而对于除草剂 对不希望的植物的除草作用没有重大影响的化学化合物。它们可以在 播种之前(例如，在种子处理、幼芽或幼苗上)应用，或者在有用植 物的苗前(pre-emergence)施用或苗后(post-emergence)施用中 应用。可以同时地或相继地施用安全剂和上面提及的除草剂。合适的 安全剂为例如，(喹啉-8-氧基)乙酸类、1-苯基-5-卤代烷基-1H-1,2,4- 三唑-3-羧酸类、1-苯基-4,5-二氢-5-烷基-1H-吡唑-3,5-二羧酸类、 4,5-二氢-5,5-二芳基-3-异 唑-羧酸类、二氯乙酰胺类、α-肟基苯 基乙腈类、苯乙酮肟类、4,6-二卤代-2-苯基嘧啶类、N-[[4-(氨基羰 基)苯基]磺酰基]-2-苯甲酰胺类、1,8-萘二甲酸酐、2-卤代-4-(卤代 烷基)-5-噻唑-羧酸类、硫代磷酸酯类(phosphorthiolates)和N-烷 基-O-苯基氨基甲酸酯类。安全剂的实例为，解草嗪、解草酯、解草胺 腈、环丙磺酰苄草胺(cyprosulfamide)、烯丙酰草胺、二吡环酮 (dicyclonon)、苯二乙硫代磷酸酯(dietholate)、解草唑、解草 啶、解草胺、氟草肟、解草 唑、双苯 唑酸、吡唑解草酸、甲基氨 甲苯酯(mephenate)、萘二甲酸酐、解草腈、4-(二氯乙酰基)-1-氧 杂-4-氮杂螺[4.5]癸烷(MON4660，CAS 71526-07-3)和2,2,5-三甲 基-3-(二氯乙酰基)-1,3-唑烷(R-29148，CAS 52836-31-4)。

[0262] 在一个实施方案中，在此的除草组合物可以包含例如下列的组合： 生长素除草剂，例如麦草畏；AHAS-抑制剂，例如咪唑啉酮类和/或磺 酰脲类；ACCase-抑制剂；EPSPS抑制剂，例如草甘膦；谷氨酰胺合成 酶抑制剂，例如草铵膦；原卟啉原-IX氧化酶(PPO)抑制剂，例如苯 嘧磺草胺；杀真菌剂，例如，嗜球果伞素类杀真菌剂例如吡唑醚菌酯， 等等。在一些实施方案中，在此的除草组合物可以包含例如下列的组 合：生长素除草剂，例如麦草畏；微管抑制剂除草剂，例如二甲戊灵； 和嗜球果伞素类杀真菌剂，例如吡唑醚菌酯(类)。将根据在此的植 物的耐受性来选择除草组合物，并且所述植物可以选自具有叠加的耐 受性性状的那些。

[0263] 在本发明中单独地和/或相组合地描述的除草剂可以作为预混合 物(pre-mixes)或桶混合物(tank mixes)来使用。还可以将此类除 草剂掺入到农艺学上可接受的组合物中。

[0264] 本领域技术人员将会认识到，一些上面提及的除草剂和/或安全剂 能够形成几何异构体，例如E/Z异构体。可能的是，在根据本发明的 组合物中使用两者，纯的异构体及其混合物。此外，一些上面提及的 除草剂和/或安全剂具有一个或多个手性中心，因此以对映异构体或非 对映异构体存在。可能的是，在根据本发明的组合物中使用两者，纯 的对映异构体和非对映异构体以及它们的混合物。特别地，芳氧苯氧 丙酸酯类除草剂中的一些是手性的，并且它们中的一些通常以在对映 异构体方面富集的或对映纯的(enantiopure)形式来使用，例如炔草 酸、氰氟草酸、精 唑禾草灵、精吡氟禾草灵、精吡氟氯禾灵、 唑 酰草胺、喔草酯或精喹禾灵。作为进一步的实例，可以以在对映异构 体方面富集的或对映纯的形式来使用草铵膦，这也称为精草铵膦。

[0265] 本领域技术人员将会认识到，在本发明的实施中可以使用上面提 及的除草剂和/或安全剂的任何衍生物，例如农业上合适的盐和酯。

[0266] 所述除草剂和/或安全剂或者包含它们的除草组合物可以例如以 即喷型水性溶液，粉剂，悬浮液，还有高度浓缩的水性、油性或其他 悬浮液或分散体，乳液，油分散体，糊剂，粉尘剂，用于播撒的材料， 或颗粒剂的形式，借助于喷洒、雾化、撒粉、撒播、灌溉或者种子的 处理或与种子相混合来进行使用。使用形式依赖于所想要的目的；在 任何情况下，它们应当确保根据本发明的活性成分的最佳的可能散布。

[0267] 所述除草组合物包含除草有效量的所述抑制乙酰辅酶A羧化酶的 除草剂中的至少一种，和可能地，其他除草剂和/或安全剂和惯用于配 制作物保护试剂的辅助剂。

[0268] 惯用于配制作物保护试剂的辅助剂的实例为，惰性辅助剂，固体 载体，表面活性剂(例如，分散剂、保护胶体、乳化剂、湿润剂和增 粘剂)，有机和无机增稠剂，杀细菌剂，防冻剂，防沫剂，任选地， 着色剂，和对于种子制剂来说，粘合剂。本领域技术人员十分熟悉此 类制剂的配方。

[0269] 增稠剂(即，赋予该制剂以改变的流动特性(即在静止状态下的 高粘度和在运动时的低粘度)的化合物)的实例为，多糖，例如黄原  胶(来自Kelco的 )、23(Rhone Poulenc)或  (来自R.T.Vanderbilt)，和还有有机和无
机页状矿物，例 如 (来自Engelhardt)。

[0270] 防沫剂的实例为硅氧烷乳液(例如，来自Rhodia的 SRE、Wacker或)、长链醇、脂肪酸、脂肪酸的盐、有机氟化 合物和其混合物。

[0271] 可以添加杀细菌剂以使水性除草制剂稳定化。杀细菌剂的实例为， 基于二氯芬(diclorophen)和苄醇半缩甲醛的杀细菌剂(来自ICI 的 或来自Thor Chemie的RS和来自Rohm&Haas 的 MK)，和还有异噻唑啉酮衍生物例如烷基
异噻唑啉酮类和 苯并异噻唑啉酮类(来自Thor Chemie的Acticide MBS)。

[0272] 防冻剂的实例为，乙二醇、丙二醇、尿素或甘油。

[0273] 着色剂的实例为，微水溶性颜料和水溶性染料。可以提及的实例 为以下列名称而为人所知的染料：罗丹明B、C.I.颜料红112和C.I. 溶剂红1，以及还有颜料蓝15:4、颜料蓝15:3、颜料蓝15:2、颜料蓝 15:1、颜料蓝80、颜料黄1、颜料黄13、颜料红112、颜料红48:2、 颜料红48:1、颜料红57:1、颜料红53:1、颜料橙43、颜料橙34、颜 料橙5、颜料绿36、颜料绿7、颜料白6、颜料棕25、碱性紫10、碱 性紫49、酸性红51、酸性红52、酸性红14、酸性蓝9、酸性黄
23、 碱性红10、碱性红108。

[0274] 粘合剂的实例为，聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和 纤基乙酸钠。

[0275] 合适的惰性辅助剂为例如下列：中至高沸点的矿物油级分，例如 煤油和柴油，此外还有煤焦油和植物或动物来源的油，脂族烃、环烃 和芳香烃，例如石蜡、四氢化萘、烷基化萘和其衍生物，烷基化苯和 其衍生物，醇例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和环己醇，酮例如环己酮， 或者强极性溶剂例如胺(例如N-甲基吡咯烷酮)和水。

[0276] 合适的载体包括液体和固体载体。液体载体包括例如，非水性溶 剂例如环烃和芳香烃，例如石蜡、四氢化萘、烷基化萘和其衍生物， 烷基化苯和其衍生物，醇例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇和环己醇，酮 例如环己酮，强极性溶剂例如胺(例如N-甲基吡咯烷酮)和水，以及 其混合物。固体载体包括例如，矿物土例如硅石、硅胶、硅酸盐、滑 石、高岭土、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、 硅藻土、硫酸钙、硫酸镁和氧化镁，磨细的合成材料，肥料例如硫酸 铵、磷酸铵、硝酸铵和尿素，和植物来源的产物例如谷类粗粉、树皮 粗粉、木材粗粉和坚果壳粗粉，纤维素粉末，或者其他固体载体。

[0277] 合适的表面活性剂(佐剂、湿润剂、增粘剂、分散剂以及乳化剂) 为芳香族磺酸(例如，木质素磺酸(例如Borrespers-类型， Borregaard)、苯酚磺酸、萘磺酸(Morwet类型，Akzo Nobel)和二 丁基萘磺酸(Nekal类型，BASF AG))以及脂肪酸、烷基和烷基芳基 磺酸、烷基硫酸、月桂基醚硫酸酯和脂肪醇硫酸酯的碱金属盐、碱土 金属盐和铵盐，和硫酸化己醇、庚醇和十八烷醇的盐以及脂肪醇二醇 醚的盐，磺化萘及其衍生物与甲醛的缩合物，萘或萘磺酸与苯酚和甲 醛的缩合物，聚氧乙烯辛基苯酚醚，乙氧基化异辛基苯酚、辛基苯酚 或壬基苯酚，烷基苯基或三丁基苯基聚乙二醇醚，烷基芳基聚醚醇， 异十三烷醇，脂肪醇/环氧乙烷缩合物，乙氧基化蓖麻油，聚氧乙烯烷 基醚或聚氧丙烯烷基醚，月桂醇聚乙二醇醚乙酸盐，山梨糖醇酯，木 质素亚硫酸盐(酯)废液，和蛋白质，变性蛋白质，多糖(例如，甲 基纤维素)，疏水改性淀粉，聚乙烯醇(Mowiol类型，Clariant)， 聚羧酸盐(BASF AG，Sokalan类型)，聚烷氧基化物，聚乙烯胺(BASF AG，Lupamine类型)，聚乙烯亚胺(BASF AG，Lupasol类型)，聚乙 烯吡咯烷酮，和其共聚物。

[0278] 可以通过将活性成分与固体载体相混合或相伴地碾磨来制备粉 剂、用于播撒的材料和粉尘剂。

[0279] 可以通过将活性成分结合至固体载体来制备颗粒剂，例如包衣颗 粒剂、浸渍颗粒剂和均质颗粒剂。

[0280] 可以通过添加水而从乳液浓缩物、悬浮液、糊剂、可湿性粉剂或 水分散性颗粒剂来制备水性使用形式。为了制备乳液、糊剂或油分散 体，可以借助于湿润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂来将除草组合物(就 这样的或者溶解在油或溶剂中的)在水中进行均质化。备选地，也可 能的是，制备适合于用水进行稀释的浓缩物，其包含活性化合物、湿 润剂、增粘剂、分散剂或乳化剂，和如果希望，溶剂或油。

[0281] 控制杂草的方法

[0282] 可以将本发明的耐受除草剂的植物与它们所耐受的除草剂相结合 地使用。可以通过使用本领域技术人员已知的任何技术，向本发明的 植物施用除草剂。可以在植物栽培过程中的任何点施用除草剂。例如， 可以以植前(pre-planting)、植时(at planting)、苗前 (pre-emergence)、苗后(post-emergence)或其组合的形式施用 除草剂。

[0283] 可以例如作为叶处理、土壤处理、种子处理或土壤浸润来施用在 此的除草剂组合物。可以通过喷洒、撒粉、播撒或任何其他本领域已 知有用的方式来进行施用。

[0284] 在一个实施方案中，可以使用除草剂来控制可以被发现在本发明 的耐受除草剂的植物附近生长的杂草的生长。在该类型的实施方案中， 可以向其中本发明的耐受除草剂的植物与杂草相邻生长的地块施用除 草剂。然后，可以以足以杀死杂草或抑制杂草生长的浓度，向该地块 施用本发明的耐受除草剂的植物所耐受的除草剂。足以杀死杂草或抑 制杂草生长的除草剂浓度是本领域已知的。

[0285] 对于相关领域的普通技术人员来说将会容易明白的是，对于本文 所描述的方法和应用的其他合适的修饰和调整是显而易见的，并且可 以进行这样的修饰和调整而不背离本发明或其任何实施方案的范围。 现在已经详细地描述了本发明，那么通过参考下面的实施例将会更清 楚地理解本发明，这些实施例被包括在此仅为了举例说明的目的而不 是想要限制本发明。

[0286] 使用组织培养来选择除草剂

[0287] 耐受除草剂的作物为农场主提供了关于杂草治理的另外选择。目 前，在一些作物体系中存在有可用的基因改造(GMO)解决方案。另外 的突变技术已被用于选择赋予除草剂抗性的经改变的酶、活性或结构， 例如目前的来自BASF的CLEARFIELD°解决方案。在美国，CLEARFIELD 水稻是用于在受侵扰的地区中治理红稻的首要工具(USDA-ARS, 2006)；但是，红稻和CLEARFIELD水稻之间的基因流对于AHAS耐受 性来说是一个相当大的风险，因为远交已被报道高达170个Fl杂种/ha (Shivrain等人,2007)。除了许多其他方面之外尤其包括轮种非 CLEARFIELD水稻的管理工作指导方针，可以限制CLEARFIELD水稻市 场渗透。对于杀禾本类剂的不同作用方式(MOA)具有耐受性的栽培水 稻的产生将会降低这些风险，并且为杂草治理提供更多的工具。

[0288] 已经是许多不同的禾本类除草剂的靶标的一种酶为乙酰辅酶A羧 化酶(ACCase，EC 6.4.1.2)，其催化脂肪酸(FA)生物合成中的第 一个关键步骤。在双子叶作物中苗后使用芳氧苯氧丙酸酯(APP或FOP) 和环己烯酮(CHD或DIM)类型除草剂，例外是氰氟草酯，其在水稻中 对于控制禾草杂草来说是选择性的。此外，这些除草剂中的大多数具 有相对较低的在土壤中的存留，并且为种植者提供了关于杂草控制和 作物轮作的灵活性。已知赋予对于特定的FOPS和/或DIMS组的耐受性 的在该酶中的突变(Liu等人,2007；Delye等人,2003,2005)。

[0289] 组织培养提供了备选的方法，因为单块的愈伤组织代表了成百甚 至成千的细胞，可以对这些细胞中的每一个就新性状(例如，除草剂 抗性)进行选择(Jain,2001)。在组织培养中自发地或在某种类型 的诱导后而出现的突变可以在培养物中直接进行选择，并且选择出经 突变的事件。

[0290] 利用对于体外组织培养技术而言固有的体细胞克隆变异已成为用 于选择性地产生在玉米中(Somers,1996；Somers等人,1994；Marshal 等人,1992；Parker等人,1990)和在海滨雀稗中(Heckart等人, 2009)赋予DIM和FOP耐受性的突变的成功方法。在玉米的情况下， 可以计算产生可再生事件的效率。在Somers等人,1994中，通过使 用组织培养选择而获得了抗烯禾定的玉米植物。他们利用了100g的 愈伤组织，并且在0.5、1.0、2.0、5.0和10μM烯禾定下的逐步选 择后获得了2个耐受品系。在他们的实验方案中所计算的突变率为2 个品系/100g愈伤组织，或者0.02个品系/g。

[0291] 在海滨雀稗的情况下，Heckert直接利用了高水平的烯禾定，并 且在大约10,000个愈伤组织块中重获了3个可再生品系，或者说，基 本上0.03％的比率。尽管不是可比较的，但稍后将使用这些数字与水 稻组织培养诱变进行比较。在玉米工作中，在每个选择阶段不断地挑 选愈伤组织，其中只有生长中的愈伤组织被转移；然而，在海滨雀稗 的情况下，在每次继代培养时，所有愈伤组织都被转移。ACCase基因 作为选择标记。

[0292] 植物转化涉及使用选择标记基因来从更大组的未转化的细胞或个 体中鉴定出少数经转化的细胞或个体。存在有选择标记基因，但它们 在数目和可用性方面是有限的。对于叠加性状，需要备选的标记基因。 此外，常常希望使用赋予农艺学性状(即，除草剂抗性)的选择标记 基因。本发明公开了作为选择标记的ACCase基因，其可以添加至目前 有限套的可用的选择标记基因。可以将本文所描述的突变体中的任一 个引入到具有目的基因的质粒中，并且转化到完整植物、植物组织或 植物细胞中以用作选择标记。详细的方法概述在下面的实施例7中。 可以利用本发明的选择标记来产生赋予对于给定组的除草剂和其中显 示出交叉保护的其他除草剂(即，FOP类)的大田耐受性的事件。

[0293] 现代的、高通量的植物转化系统需要有效的选择标记系统；然而， 只存在有限数目的可用的在市场中可接受的选择标记。因此，还输送 商业特性的选择系统总是有价值的。本文所描述的系统是在还编码适 合于在任何单子叶作物中使用的除草剂耐受性性状的植物细胞中或者 对于所述植物细胞来说有效的选择系统。

[0294] 在一个实施方案中，本发明提供了用于选择经转化的植物的方法， 所述方法包括：将编码目的基因的核酸分子引入植物细胞中，其中所 述核酸分子还编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，在该突变型 乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序列在一个氨基酸位置处不同于相应野 生型水稻植物的ACCase的氨基酸序列；和使所述植物细胞与ACCase 抑制剂相接触以获得经转化的植物，其中当在该植物中表达时，所述 突变型ACCase赋予所述经转化的植物以相比于该植物的相应野生型 品种而言增加的除草剂耐受性。

[0295] 在一个实施方案中，本发明提供了标记辅助育种方法，所述方法 包括：用第二植物来使本发明的任何植物进行繁育；和使该繁育步骤 的后代与ACCase抑制剂相接触以获得包含所述突变型ACCase的后代； 其中所述突变型ACCase赋予所述后代植物以相比于所述第二植物而 言增加的除草剂耐受性。

[0296] 在一个实施方案中，将单个ACCase基因与单个目的基因相连接。 可以将ACCase基因连接在目的基因的上游或下游。

[0297] 在一个实施方案中，本发明提供了上面所描述的ACCase核酸或蛋 白在检定测定法中的用途。可以利用本文所描述的用于选择标记的检 定用途来鉴定ACCase基因。检定方法可以包括PCR方法、蛋白质测定 法、经标记的探针以及任何其他本领域已知的标准检定方法。实施例

[0298] 实施例1

[0299] 组织培养条件

[0300] 已开发了体外组织培养诱变测定法来分离和表征耐受抑制乙酰辅 酶A羧化酶的除草剂(例如，吡喃草酮、噻草酮和烯禾定)的植物组 织(例如，水稻组织)。该测定法利用了在体外组织培养中发现的体 细胞克隆变异。源自体细胞克隆变异的自发突变可以通过化学诱变和 随后在浓度渐增的除草剂上逐步地进行选择而得到增强。

[0301] 本发明提供了用于促进可再生的易碎的胚发生性水稻愈伤组织生 长的组织培养条件。从4种不同的水稻栽培种(包括粳稻品种(Taipei 309，Nipponbare，Koshihikari)和籼稻品种(Indica 1))来引发 愈伤组织。将脱壳的种子进行表面消毒，在70％乙醇中大约1分钟， 随后为20％商业Clorox漂白水20分钟。种子用无菌水进行漂洗，并 铺放在愈伤组织诱导培养基上。测试了各种愈伤组织诱导培养基。所 测试的培养基的成分列表呈现在表2中。

[0302] 表2

[0303]成分 供应商 R001M R025M R026M R327M R008M MS711R
B5维生素 Sigma         1.0X  
MS盐 Sigma     1.0X 1.0X 1.0X 1.0X
MS维生素 Sigma     1.0X 1.0X    
N6盐 Phytotech 4.0g/L 4.0g/L        
N6维生素 Phytotech 1.0X 1.0X        
L-脯氨酸 Sigma 2.9g/L 0.5g/L       1.2g/L
酪蛋白氨基酸 BD 0.3g/L 0.3g/L 2g/L      
酪蛋白水解物 Sigma           1.0g/L
L-Asp一水合物 Phytotech           150mg/L
烟酸 Sigma           0.5mg/L
盐酸吡哆醇 Sigma           0.5mg/L
盐酸硫胺素 Sigma           1.0mg/L
肌醇 Sigma           100mg/L
MES Sigma 500mg/L 500mg/L 500mg/L 500mg/L 500mg/L 500mg/L
麦芽糖 VWR 30g/L 30g/L 30g/L 30g/L    
山梨糖醇 Duchefa     30g/L      
蔗糖 VWR         10g/L 30g/L
NAA Duchefa         50μg/L  
2,4-D Sigma 2.0mg/L         1.0mg/L
MgCl2·6H2O VWR         750mg/L  
→pH   5.8 5.8 5.8 5.8 5.8 5.7
Gelrite Duchefa 4.0g/L       2.5g/L  
1型琼脂糖 Sigma   7.0g/L 10g/L 10g/L    
→高压灭菌器   15分钟 15分钟 15分钟 15分钟 15分钟 20分钟
细胞分裂素 Sigma   2.0mg/L 2.0mg/L      
NAA Duchefa   1.0mg/L 1.0mg/L      
ABA Sigma   5.0mg/L        
头孢噻肟 Duchefa   0.1g/L 0.1g/L 0.1g/L    
万古霉素 Duchefa   0.1g/L 0.1g/L 0.1g/L    
G418硫酸氢盐 Sigma   20mg/L 20mg/L 20mg/L    

[0304] 在测试了众多变化形式之后，选择出了R001M愈伤组织诱导培养 基。培养物于30℃在黑暗中进行保持。在10-14天后，将胚发生性愈 伤组织继代培养至新鲜培养基。

[0305] 实施例2

[0306] 耐受除草剂的愈伤组织的选择

[0307] 一旦确定了组织培养条件，就通过在用噻草酮、吡喃草酮、烯禾 定(图1)或吡氟氯禾灵(未显示)的杀伤曲线中的组织存活分析来 进一步建立选择条件。对于组织中除草剂的积累以及其在细胞和培养 基中的存留和稳定性进行了仔细考虑。通过这些实验，对于经突变的 材料的初始选择建立了亚致死剂量。

[0308] 在建立了在选择培养基中烯禾定、噻草酮、吡喃草酮和吡氟氯禾 灵的起始剂量之后，通过在每次转移时增加ACCase抑制剂的浓度而逐 步地对组织进行选择，直至重获在毒性剂量存在下旺盛生长的细胞(参 见图2)。每3-4周将所得到的愈伤组织进一步继代培养至具有选择 试剂的R001M中。使超过26,000个愈伤组织经历选择，持续4-5次继 代培养，直至选择压力处于毒性水平之上，这通过杀伤曲线和连续培 养的观察来确定。毒性水平被确定为50μM烯禾定、20μM噻草酮、 2.5μM吡喃草酮(图1)和10μM吡氟氯禾灵(未显示)。

[0309] 备选地，液体培养从在MS711R(表2)中的愈伤组织开始，其中 缓慢摇动和每周进行继代培养。一旦建立了液体培养，就在每次继代 培养时将选择试剂直接添加到培养瓶中。在2-4轮液体选择之后，将 培养物转移至在固体R001M培养基上的滤纸，以进行进一步生长。

[0310] 实施例3

[0311] 植物的再生

[0312] 使耐受性组织再生，并且在分子方面就ACCase基因序列突变和/ 或在生物化学方面就改变的ACCase活性(在选择试剂存在下)来进行 表征。

[0313] 在进行除草剂选择后，使用下述的培养基方案来使愈伤组织再生： R025M 10-14天，R026M大约2周，R327M直至发育出良好形成的幼芽， 和R008S直至幼芽良好地生根以用于转移至温室(表2)。在光照下 进行再生。在再生期间不包括选择试剂。

[0314] 一旦建立了强壮的根，就将M0再生体移植至温室于4”见方的盆 中，在补充有石膏的沙子、NC Sandhills壤土和Redi-土(2:4:6)的 混合物中。移植物在透明的塑料杯中进行维持，直至它们适应温室条 件(大约1周)。将温室设置为27℃/21℃(80°F/70°F)的昼/夜循 环，其中具有600W高压钠灯用于补充光照以维持14小时的白昼长度。 取决于气候，给植物每天灌溉2-3次，并且每天施肥。将就种子增加 而选择出的水稻植物移植到一加仑的盆中。当植物接近成熟并准备抽 茎(bolt)时，将所述盆置于小的溢流浅箱(flood flats)中以更好 地保持水分和营养物运送。就昆虫和植物健康来对植物进行监测，并 且在标准的综合害虫治理(Integrated Pest Management)准则下进 行管理。

[0315] 实施例4

[0316] 序列分析

[0317] 从为了移植而分开的克隆植物采集叶组织，并且独个地进行分析。 如制造商所指导的那样，使用 96Magnetic DNA Plant System 试剂盒(Promega，US专利号6,027,945&6,368,800)来提取基因 组DNA。使用一个正向引物和一个反向引物，对分离出的DNA进行PCR 扩增。

[0318] 正向引物：

[0319] OsACCpU5142：5’-GCAAATGATATTACGTTCAGAGCTG-3’(SEQ ID NO:7)

[0320] OsACCpU5205：5’-GTTACCAACCTAGCCTGTGAGAAG-3’(SEQ ID NO:8)。

[0321] 反向引物：

[0322] OsACCpL7100:5’-GATTTCTTCAACAAGTTGAGCTCTTC-3’(SEQ ID NO:9)

[0323] OsACCpL7054:5’-AGTAACATGGAAAGACCCTGTGGC-3’(SEQ ID NO:10)。

[0324] 使用Hotstar Taq DNA聚合酶(Qiagen)来进行PCR扩增，其中 采用如下的递降热循环程序：96℃15分钟，随后为35个循环(96℃， 30秒；58℃-0.2℃/循环，30秒；72℃，3分钟30秒)，72℃下10 分钟。

[0325] 通过琼脂糖凝胶电泳就浓度和片段大小来验证PCR产物。通过使 用PCR引物(DNA Landmarks)的直接测序来分析去磷酸化的PCR产物。 使用Vector NTI Advance 10TM(Invitrogen)，就相对于Os05g0295300 而言的突变来分析色谱图描记线文件(.scf)。基于序列信息，在几 个个体中鉴定出了两个突变。I1781(Am)L和D2078(Am)G以杂合状态 存在。序列分析在代表性的色谱图和相应的AlignX比对(具有缺省设 置，并且经编辑以调出次级峰(secondary peaks))上进行。

[0326] 将与ACCase突变不一致的样品就耐受性进行喷洒测试，并且作为 逃逸者丢弃。令人吃惊地，大多数重获的品系关于I1781(Am)L突变而 言是杂合的，并且通过使用噻草酮或烯禾定在所有经测试的基因型中 产生了抗性事件：Indica1(≥18个品系)、Taipei 309(≥14个品 系)、Nipponbare(≥3个品系)和Koshihikare(≥6个品系)。一 个品系关于D2078(Am)G突变而言是杂合的。D2078(Am)G杂合子品系 看起来矮化了，其具有狭窄的叶；而I1781(Am)L杂合子在外观上多样 化，但大多数看起来相对于其亲本基因型而言是正常的。
重获了几个 逃逸者，并通过测序和喷洒测试进行了确证；然而，ACCase的除草剂 敏感区域的测序结果揭示，大多数耐受性突变体关于I1781(Am)L(A 至T突变)而言是杂合的(参见，表3)。一个品系，OsARWI010，关 于D2078(Am)G(A至G突变)而言是杂合的。迄今，所有缺乏ACCase 突变的所重获的植物对于在温室中的除草剂施用都是敏感的。

[0327] 表3：通过组织培养选择而重获的水稻品系的基因型

[0328]

[0329] 实施例5

[0330] 除草剂耐受性的证明

[0331] 将选择出的突变体和逃逸者转移至小盆。从种子萌发出野生型栽 培种和红稻的3个生物变种以用作对照。

[0332] 在移植后大约3周之后，使用履带式喷洒器(track sprayer)， 用补充有0.1％甲基化种子油的400-1600g ai/ha的噻草酮(BAS 517H) 对M0再生体进行喷洒。在植物适应了温室条件之后，用800g ai/ha 的噻草酮对亚组进行喷洒。一旦进行了喷洒，就将植物在干旱条件下 保持24小时，然后再次进行灌溉和施肥。给经喷洒的植物拍摄照片， 并在处理后1周(图3)和2周(图4)时就除草剂损伤进行评定。在 包含I1781(Am)L杂合突变的植物上未观察到损伤，而对照植物和组织 培养逃逸者(关于所测序的突变而言为阴性的再生植物)在处理后被 严重地损害(图3和4)。图5-15提供了来自各种植物的乙酰辅酶A 羧化酶的核酸和/或氨基酸序列。图17提供了图，其显示了突变型水 稻对于各种ACCase抑制剂的结果。

[0333] 实施例6

[0334] 使用组织培养的除草剂选择

[0335] 如上面所详细说明的，选择出培养基用于使用，并且产生杀伤曲 线。为了进行选择，采用了不同的技术。要么应用一步式选择，要么 应用立即致死水平的除草剂。在两者中的任一种情况下，对每个新一 轮的选择，转移所有愈伤组织。选择为4-5个循环的培养，其中每个 循环3-5周。将愈伤组织置于尼龙膜上以促进转移(200微米孔的薄 片，Biodesign,Saco,Maine)。切割膜以适合100x20mm培养皿， 并且在使用前进行高压灭菌。在每个平板中使用25-35个愈伤组织 (“平均重量/愈伤组织”为22mg)。此外，使一组愈伤组织经历在 液体培养基中的选择，其中每周进行继代培养，随后在半固体培养基 上进行进一步的选择。

[0336] 在4种不同的水稻基因型中，使用噻草酮或烯禾定来选择出突变 型品系。基于产生可再生的突变型品系的愈伤组织的百分比或者基于 通过所使用的组织克数而确定的品系数目，获得突变体的效率是高的。 总的说来，突变频率相比于海滨雀稗而言为5倍，和相比于玉米而言 为2倍。在某些情况下，该差异高得多(>10倍)，如在下面的表4 中所显示的。

[0337] 表4

[0338]

[0339] 如果使用选择标准来分析所述数据，那么可能看到，噻草酮选择 贡献出了比烯禾定更高的分离出的突变体的比率，如在表5中所显示 的。

[0340] 表5

[0341]

[0342]Indica 1 2640 烯禾定 3 0.114％ 58.08 0.05
NB 725 烯禾定 0 0.000％ 15.95 0.00
T309 1015 烯禾定 0 0.000％ 22.33 0.00
总计 4380 3 0.068％ 96.36 0.03

[0343] 通过使用该分析，噻草酮的比率为使用烯禾定选择的先前报告中 任一个的几乎10倍，而使用烯禾定选择的比率类似于先前所报告的那 些。进一步地，当在噻草酮上进行选择时，68％的品系被确证为突变体， 而当在烯禾定上进行选择时，21％的品系被确证为突变体。增加看起来 来自于使用噻草酮而非烯禾定作为选择试剂。进一步地，膜的使用使 得在继代培养过程中愈伤组织的转移比独个地移动每个块显著地更容 易。获得了超过20个突变体。除了一个具有已知引起适合度惩罚的突 变的突变体(D2078(Am)G)外，能育性看起来是高的。

[0344] 实施例7

[0345] 在植物转化中使用突变型ACCase基因作为选择标记

[0346] 方法：

[0347] 基本上如Hiei和Komari(2008)中所描述的那样来进行Indica1 和Nipponbare水稻愈伤组织转化，除了所指明的培养基替换(细节参 见所附的培养基表)外。在用于转化之前，在R001M培养基上诱导愈 伤组织4-8周。所使用的土壤杆菌为LBA4404(pSB1)(Ishida等人, 1996)，其用RLM185(L.Mankin,未发表:包含DsRed和用于选择 的突变型AHAS)、包含I1781(Am)L的ACC基因、包含I1781(Am)L和 W2027C的ACC基因、包含I1781(Am)L和I2041(Am)N的ACC基因或包 含I1781(Am)A的ACC基因或者还包含用于选择的突变型AHAS基因的 野生型进行转化。将在固体培养基上生长了1-3天的土壤杆菌悬浮在 M-LS-002培养基中，并且将OD660调节至大约0.1。将愈伤组织浸在土 壤杆菌溶液中大约30分钟。移去液体，然后将愈伤组织移至滤纸以便 在半固体水稻cc培养基上进行共培养。共培养于24℃在黑暗中进行3 天。将包含水稻愈伤组织的滤纸直接转移至包含特美汀的R001M培养 基1-2周以便进行重获，并且于30℃在黑暗中进行培养。将愈伤组织 再分到具有特美汀并补充有100μM咪唑乙烟酸、10μM噻草酮或2.5 μM吡喃草酮的新鲜R001M培养基上。在3-4周后，将愈伤组织转移至 新鲜的选择培养基。再过3-4周后，将生长中的愈伤组织转移至新鲜 培养基，并且让其生长，然后进行Taqman分析。Taqman分析是关于 Nos终止子，并且进行所述Taqman分析以提供所选择的愈伤组织的转 基因性质的分子确证。通过在包含10μM噻草酮或吡氟氯禾灵、2.5μM 吡喃草酮或者100μM咪唑乙烟酸的培养基上使愈伤组织进行继代培 养，用各种选择试剂来测量转基因愈伤组织的生长。在最初继代培养 后和然后在大约1个月的生长后，从扫描的图像测量愈伤组织大小。

[0348] 基本上如Lai等人(已提交)所描述的那样来进行玉米未成熟胚 的转化。简而言之，将未成熟胚与相同的用于水稻转化的土壤杆菌菌 株一起进行共培养，所述土壤杆菌菌株以1.0的OD660悬浮在M-LS-002 培养基中。共培养在玉米CC培养基上于22℃在黑暗中进行3天。将 胚从共培养物中移出，并转移至M-MS-101培养基在27℃下4-7天。 将作出响应的胚转移至用于咪唑乙烟酸选择的M-LS-202培养基或转 移至补充有1μM噻草酮或0.75μM吡喃草酮的M-LS-213培养基。将 胚培养2周，并将生长中的愈伤组织转移至第二轮选择，所述第二轮 选择使用与先前相同的培养基，除了将噻草酮选择增加至5μM外。 将选择出的愈伤组织转移至补充有5μM噻草酮或0.75μM吡喃草酮 的M-LS-504或M-LS-513培养基，并且移至光照下(16小时/8小时， 昼/夜)以进行再生。幼芽在2-3周之间出现，并且将其转移至包含补 充有5μM噻草酮或0.75μM吡喃草酮的M-LS-618或M-LS-613的 plantcon箱中以进行进一步的幼芽发育和生根。对叶样品施行Taqman 分析。将阳性植物转移至土壤以进行生长和种子产生。在第二组实验 中，条件是相同的，除了在再生以及幼芽和根形成期间将吡喃草酮选 择降低至0.5μM外。在第三组实验中，作为选择试剂，还测试了吡 氟氯禾灵。在这些实验中，自始至终使用1μM用于选择。

[0349] 结果和讨论：

[0350] 从使用包含I1781(Am)L和W2027(Am)C的ACC基因以及包含 I1781(Am)L和I2041(Am)N的ACC基因的Indica1水稻转化实验中获 得了转基因的愈伤组织。在吡喃草酮选择后从包含I1781(Am)L和 W2027(Am)C的ACC基因获得了一个愈伤组织，和从包含I1781(Am)L 和I2041(Am)N的ACC基因获得了3个愈伤组织。通过使用噻草酮选择， 从包含I1781(Am)L和I2041(Am)N的ACC基因获得了一个愈伤组织。Nos Taqman显示，所有这些愈伤组织都是转基因的。就在各种关于突 变型AHAS选择标记的选择试剂(包括咪唑乙烟酸(精咪草烟 (Pursuit-P)))下的生长来对愈伤组织进行筛选。

[0351] 正如可以在表6中所观察到的，除了吡氟氯禾灵外，双突变型构 建体还允许在噻草酮和吡喃草酮上的生长。在这些生长实验中所使用 的水平对于野生型材料来说是抑制性的。

[0352] 表6：转基因Indica1愈伤组织在各种选择培养基上的生长。

[0353] 生长被测量为在选择培养基上培养1个月后大小变化的％。

[0354]

[0355] 来自第一组玉米实验的结果揭示，单突变体和双突变体均可以用 于以相对较高的效率选择噻草酮的抗性或者噻草酮或吡喃草酮两者的 抗性(图16)。

[0356] 相对而言，在这些实验中选择试剂之间的效率是相当的，也许相 比于咪草烟选择而言，在噻草酮上使用单突变体的总体效率有略微下 降。但是，双突变可以具有略微增加的效率。逃逸率，即未确证的推 定事件的百分比，对于噻草酮或吡喃草酮来说是较低的。此外，在所 描述的条件下，可能的是，使用吡喃草酮选择来在单突变体和双突变 体之间进行区分。

[0357] 在第二组实验中获得了相似的结果(未显示)。在第三组实验中 个，吡氟氯禾灵也是用于在用单突变体或双突变体的转化中使用的有 效的选择标记(未显示)。

[0358] 单突变体对于使用噻草酮或吡氟氯禾灵选择的高效转化是有用 的。它对于其他相关的化合物(例如烯禾定)也应当是有用的。双突 变体对于这些选择试剂是有用的，此外还可以使用吡喃草酮。在两阶 段转化中可以使用单突变体和双突变体，因为用吡喃草酮选择可以将 单突变体与双突变体区分开。与其他目前的BASF选择标记相组合地， 这些给出了多于两个的选择以用于单子叶植物(特别是，玉米)的高 效转化。

[0359] 在大田中，在600g/ha噻草酮处理下，在此的耐受ACCase抑制 剂的水稻植物也展示出本文所描述的除草剂耐受性表型(数据未显 示)。

[0360] 尽管为了清楚和理解的目的，略为详细地描述了上述发明，但本 领域技术人员从阅读该公开内容中将会意识到，可以在形式和细节方 面进行各种改变，而不背离本发明和所附权利要求书的真正范围。本 文中所引用的所有专利和出版物通过提及而整体合并入本文。

[0361] 本发明包括以下实施方案：

[0362] 1.水稻植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在氨基酸位置1781(Am)处不同于相应野生型水稻植物的乙酰辅酶A 羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所 述植物以相比于该植物的相应野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0363] 2.段落1的植物，其中在位于1781(Am)的位置处的氨基酸为亮 氨酸。

[0364] 3.段落1的植物，其中在位于1781(Am)的位置处的氨基酸为丙 氨酸。

[0365] 4.段落1的植物，其中在位于1781(Am)的位置处的氨基酸为缬 氨酸。

[0366] 5.段落1的植物，其中在位于1781(Am)的位置处的氨基酸为苏 氨酸。

[0367] 6.水稻植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在氨基酸位置1999(Am)处不同于相应野生型水稻植物的乙酰辅酶A 羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所 述植物以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0368] 7.段落6的植物，其中在位于1999(Am)的位置处的氨基酸为甘 氨酸。

[0369] 8.段落6的植物，其中在位于1999(Am)的位置处的氨基酸为半 胱氨酸。

[0370] 9.水稻植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在氨基酸位置2027(Am)处不同于相应野生型水稻植物的乙酰辅酶A 羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所 述植物以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0371] 10.段落9的植物，其中在位于2027(Am)的位置处的氨基酸为半 胱氨酸。

[0372] 11.段落9的植物，其中在位于2027(Am)的位置处的氨基酸为精 氨酸。

[0373] 12.水稻植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在氨基酸位置2041(Am)处不同于相应野生型水稻植物的乙酰辅酶A 羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所 述植物以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0374] 13.段落12的植物，其中在位于2041(Am)的位置处的氨基酸为 天冬酰胺。

[0375] 14.段落12的植物，其中在位于2041(Am)的位置处的氨基酸为 缬氨酸。

[0376] 15.水稻植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在氨基酸位置2096(Am)处不同于相应野生型水稻植物的乙酰辅酶A 羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所 述植物以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0377] 16.段落15的植物，其中在位于2096(Am)的位置处的氨基酸为 丙氨酸。

[0378] 17.段落15的植物，其中在位于2096(Am)的位置处的氨基酸为 丝氨酸。

[0379] 18.水稻植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在下列位置中的仅一个位置处不同于相应野生型水稻植物的乙酰辅 酶A羧化酶的氨基酸序列：1785(Am)；1786(Am)；1811(Am)；2049(Am)； 2074(Am)；2075(Am)；2078(Am)；在2080(Am)处的缺失；2088(Am)； 和2098(Am)，其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所述植物 以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0380] 19.段落18的植物，其中所述植物表达经诱变的或重组的乙酰辅 酶A羧化酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中 的氨基酸序列包含仅一个选自下列的置换：在2049(Am)处的异亮氨 酸、亮氨酸或苯丙氨酸；在位置2074(Am)处的亮氨酸；在位置2075(Am) 处的亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸，或者位置2075(Am)的重复；在位 置2078(Am)处的苏氨酸、甘氨酸或赖氨酸；在2088(Am)处的精氨酸、 色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏 氨酸或缬氨酸；和在2098(Am)处的丙氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸 或甘氨酸。

[0381] 20.段落18的植物，其中所述植物表达经诱变的或重组的乙酰辅 酶A羧化酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中 的氨基酸序列包含仅一个选自下列的置换：在位置1785(Am)处的甘氨 酸；在位置1786(Am)处的脯氨酸；和在位置1811(Am)处的天冬酰胺。

[0382] 21.水稻植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在下列位置中的仅一个位置处不同于相应野生型水稻植物的乙酰辅 酶A羧化酶的氨基酸序列：2039(Am)；2059(Am)；2080(Am)；和 2095(Am)，其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所述植物以相 比于该植物的相应野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0383] 22.段落21的植物，其中所述植物表达经诱变的或重组的乙酰辅 酶A羧化酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中 的氨基酸序列包含仅一个选自下列的置换：在位置2039(Am)处的甘氨 酸；在位置2059(Am)处的缬氨酸；在位置2080(Am)处的谷氨酸；和在 位置2095(Am)处的谷氨酸。

[0384] 23.水稻植物，其表达经诱变的或重组的质体乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，其中当在该植物中表达时，在所述质体ACCase中在仅一 个氨基酸位置处的突变赋予所述植物以相比于该水稻植物的相应野生 型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0385] 24.段落23的植物，其中所述氨基酸位置选自下列：1785(Am)、 1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、2039(Am)、2049(Am)、 2059(Am)、2074(Am)、2075(Am)、2078(Am)、2079(Am)、2080(Am)、 2081(Am)、2088(Am)、2095(Am)和2098(Am)。

[0386] 25.段落23的植物，其中所述突变型ACCase不是转基因的。

[0387] 26.段落1至22中任一项的植物，其中所述植物不是转基因的。

[0388] 27.段落1至25中任一项的植物，其中所述ACCase由基因组核 酸编码，并且包含经修饰的SEQ ID NO:2作为其氨基酸序列，其中所 述经修饰的序列包含所述修饰。

[0389] 28.用于在段落1至25中任一项的植物附近控制杂草生长的方 法，其包括向所述杂草和植物施用一定量的抑制乙酰辅酶A羧化酶的 除草剂，所述除草剂抑制野生型植物的生长。

[0390] 29.段落28的方法，其中至少一种除草剂选自下列：禾草灭、丁 苯草酮、烯草酮、环己烯草酮、噻草酮、烯禾定、吡喃草酮、三甲苯 草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、 唑禾草灵、精 唑禾草 灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟 氯禾灵、异 草醚、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、三氟苯氧丙酸和唑 啉草酯，或者这些除草剂中任一种除草剂的农艺学上可接受的盐或酯， 以通常会抑制野生型植物生长的除草剂水平。

[0391] 30.用于控制杂草生长的方法，其包括：

[0392] a.使段落1至25中任一项的植物与其他植物种质杂交，并且收 获所得到的杂种种子；

[0393] b.种植所述杂种种子；和

[0394] c.以通常会抑制野生型植物生长的除草剂水平，向所述杂种植物 和向处于所述杂种植物附近的杂草施用一种或多种抑制乙酰辅酶A羧 化酶的除草剂。

[0395] 31.段落1至25中任一项的植物的植物细胞。

[0396] 32.段落1至25中任一项的植物的植物部分。

[0397] 33.由段落1至25中任一项的植物产生的种子。

[0398] 34.产生杂种植物的方法，其包括用第二植物来使段落1至25 中任一项的植物进行繁育，其中所述杂种植物展示出相比于所述第二 植物而言增加的除草剂耐受性。

[0399] 35.从段落1至25中任一项的植物制备的食品。

[0400] 36.从段落1至25中任一项的植物制备的消费产品。

[0401] 37.从段落1至25中任一项的植物制备的工业产品。

[0402] 38.从段落1至25中任一项的植物制备的兽医学产品。

[0403] 39.分离的、重组的或经诱变的核酸分子，其编码在段落1至25 中任一项之中所描述的ACCase。

[0404] 40.段落39的核酸分子作为选择标记的用途。

[0405] 41.处理段落1至25中任一项的植物的方法，其包括使所述植物 与农艺学上可接受的组合物相接触。

[0406] 42.BEP进化枝植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化 酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸 序列在氨基酸位置1781(Am)处不同于相应野生型BEP进化枝植物的乙 酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase 赋予所述植物以相比于该植物的相应野生型品种而言增加的除草剂耐 受性。

[0407] 43.段落42的植物，其中在位于1781(Am)的位置处的氨基酸为 亮氨酸。

[0408] 44.段落42的植物，其中在位于1781(Am)的位置处的氨基酸为 丙氨酸。

[0409] 45.段落42的植物，其中在位于1781(Am)的位置处的氨基酸为 缬氨酸。

[0410] 46.段落42的植物，其中在位于1781(Am)的位置处的氨基酸为 苏氨酸。

[0411] 47.BEP进化枝植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化 酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸 序列在氨基酸位置1999(Am)处不同于相应野生型BEP进化枝植物的乙 酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase 赋予所述植物以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受 性。

[0412] 48.段落47的植物，其中在位于1999(Am)的位置处的氨基酸为 甘氨酸。

[0413] 49.段落47的植物，其中在位于1999(Am)的位置处的氨基酸为 半胱氨酸。

[0414] 50.BEP进化枝植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化 酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸 序列在氨基酸位置2027(Am)处不同于相应野生型BEP进化枝植物的乙 酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase 赋予所述植物以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受 性。

[0415] 51.段落50的植物，其中在位于2027(Am)的位置处的氨基酸为 半胱氨酸。

[0416] 52.段落50的植物，其中在位于2027(Am)的位置处的氨基酸为 精氨酸。

[0417] 53.BEP进化枝植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化 酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸 序列在氨基酸位置2041(Am)处不同于相应野生型BEP进化枝植物的乙 酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase 赋予所述植物以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受 性。

[0418] 54.段落53的植物，其中在位于2041(Am)的位置处的氨基酸为 天冬酰胺。

[0419] 55.段落53的植物，其中在位于2041(Am)的位置处的氨基酸为 缬氨酸。

[0420] 56.BEP进化枝植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化 酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸 序列在氨基酸位置2096(Am)处不同于相应野生型BEP进化枝植物的乙 酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列，其中当在该植物中表达时，所述ACCase 赋予所述植物以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受 性。

[0421] 57.段落56的植物，其中在位于2096(Am)的位置处的氨基酸为 丙氨酸。

[0422] 58.段落56的植物，其中在位于2096(Am)的位置处的氨基酸为 丝氨酸。

[0423] 59.BEP进化枝植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化 酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸 序列在下列位置中的仅一个位置处不同于相应野生型BEP进化枝植物 的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列：1785(Am)；1786(Am)；1811(Am)； 2049(Am)；2074(Am)；2075(Am)；2078(Am)；2080(Am)；2088(Am)； 和2098(Am)，其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所述植物 以相比于该植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0424] 60.段落59的植物，其中所述植物表达经诱变的或重组的乙酰辅 酶A羧化酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中 的氨基酸序列包含仅一个选自下列的置换：在2049(Am)处的异亮氨 酸、亮氨酸或苯丙氨酸；在位置2074(Am)处的亮氨酸；在位置2075(Am) 处的亮氨酸、异亮氨酸或甲硫氨酸，或者位置2075(Am)的重复；在位 置2078(Am)处的苏氨酸、甘氨酸或赖氨酸；在2088(Am)处的精氨酸、 色氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏 氨酸或缬氨酸；和在2098(Am)处的丙氨酸、组氨酸、脯氨酸、丝氨酸 或甘氨酸。

[0425] 61.段落59的植物，其中所述植物表达经诱变的或重组的乙酰辅 酶A羧化酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中 的氨基酸序列包含仅一个选自下列的置换：在位置1785(Am)处的甘氨 酸；在位置1786(Am)处的脯氨酸；和在位置1811(Am)处的天冬酰胺。

[0426] 62.BEP进化枝植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化 酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸 序列在下列位置中的仅一个位置处不同于相应野生型水稻BEP进化枝 植物的乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列：2039(Am)；2059(Am)； 2080(Am)；和2095(Am)。

[0427] 63.段落62的植物，其中所述植物表达经诱变的或重组的乙酰辅 酶A羧化酶(ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中 的氨基酸序列包含仅一个选自下列的置换：在位置2039(Am)处的甘氨 酸；在位置2059(Am)处的缬氨酸；在位置2080(Am)处的谷氨酸；和在 位置2095(Am)处的谷氨酸。

[0428] 64.段落42至63中任一项的植物，其中所述植物不是转基因的。

[0429] 65.段落42至63中任一项的植物，其中所述BEP进化枝植物是 BET亚进化枝植物。

[0430] 66.段落65的植物，其中所述BET亚进化枝植物是BET作物植物。

[0431] 67.用于在段落42至63中任一项的植物附近控制杂草生长的方 法，其包括向所述杂草和单子叶植物施用一定量的抑制乙酰辅酶A羧 化酶的除草剂，所述除草剂抑制野生型植物的生长。

[0432] 68.段落67的方法，其中至少一种除草剂选自下列：禾草灭、丁 苯草酮、烯草酮、环己烯草酮、噻草酮、烯禾定、吡喃草酮、三甲苯 草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、 唑禾草灵、精 唑禾草 灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟 氯禾灵、异 草醚、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、三氟苯氧丙酸和唑 啉草酯，或者这些除草剂中任一种除草剂的农艺学上可接受的盐或酯， 以通常会抑制野生型植物生长的除草剂水平。

[0433] 69.用于控制杂草生长的方法，其包括：

[0434] a.使段落42至63中任一项的植物与其他植物种质杂交，并且收 获所得到的杂种种子；

[0435] b.种植所述杂种种子；和

[0436] c.以通常会抑制野生型植物生长的除草剂水平，向所述杂种植物 和向处于所述杂种植物附近的杂草施用一种或多种抑制乙酰辅酶A羧 化酶的除草剂。

[0437] 70.段落42至63中任一项的植物的植物细胞。

[0438] 71.段落42至63中任一项的植物的植物部分。

[0439] 72.由段落42至63中任一项的水稻植物产生的种子。

[0440] 73.产生杂种植物的方法，其包括用第二植物来使段落42至63 中任一项的植物进行繁育，其中所述杂种植物展示出相比于所述第二 植物而言增加的除草剂耐受性。

[0441] 74.从段落42至63中任一项的植物制备的食品。

[0442] 75.从段落42至63中任一项的植物制备的消费产品。

[0443] 76.从段落42至63中任一项的植物制备的工业产品。

[0444] 77.从段落42至63中任一项的植物制备的兽医学产品。

[0445] 78.分离的、重组的或经诱变的核酸分子，其编码在段落42至 63中任一项之中所描述的ACCase。

[0446] 79.段落78的核酸分子作为选择标记的用途。

[0447] 80.处理段落42至63中任一项的植物的方法，其包括使所述植 物与农艺学上可接受的组合物相接触。

[0448] 81.单子叶植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在仅一个选自下列的氨基酸位置处不同于相应野生型单子叶植物的 乙酰辅酶A羧化酶的氨基酸序列：

[0449] a.在位置1781(Am)处的氨基酸，其中该在位置1781(Am)处的氨 基酸不是亮氨酸，并且不是野生型氨基酸；

[0450] b.在位置1999(Am)处的氨基酸，其中该在位置1999(Am)处的氨 基酸不是半胱氨酸，并且不是野生型氨基酸；

[0451] c.在位置2027(Am)处的氨基酸，其中该在位置2027(Am)处的氨 基酸不是半胱氨酸，并且不是野生型氨基酸；

[0452] d.在位置2041(Am)处的氨基酸，其中该在位置2041(Am)处的氨 基酸不是缬氨酸或天冬酰胺，并且不是野生型氨基酸；和

[0453] e.在位置2096(Am)处的氨基酸，其中该在位置位置2096(Am)处 的氨基酸不是丙氨酸，并且不是野生型氨基酸；

[0454] 其中当在该植物中表达时，所述ACCase赋予所述植物以相比于该 植物的野生型品种而言增加的除草剂耐受性。

[0455] 82.段落81的植物，其中：

[0456] 在1781(Am)处的差异为用丙氨酸、缬氨酸、苏氨酸进行的置换； 在1999(Am)处的差异为用甘氨酸进行的置换；在2027(Am)处的差异为 精氨酸；和在2096(Am)处的差异为用丝氨酸进行的置换。

[0457] 83.单子叶植物，其表达经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶 (ACCase)，所述经诱变的或重组的乙酰辅酶A羧化酶中的氨基酸序 列在仅一个氨基酸位置处不同于相应野生型单子叶植物的乙酰辅酶A 羧化酶的氨基酸序列：

[0458] a.所述仅一个氨基酸位置选自1785(Am)；1786(Am)；1811(Am)； 2049(Am)；2074(Am)；2075(Am)；2078(Am)；2081(Am)；2088(Am)； 和2098(Am)；或

[0459] b.所述仅一个氨基酸位置选自2039(Am)；2059(Am)；2080(Am)； 和2095(Am)。

[0460] 84.段落83的植物，其中：

[0461] a.在位置1785(Am)处的差异为用甘氨酸进行的置换；在位置 1786(Am)处的差异为用脯氨酸进行的置换；在位置1811(Am)处的差异 为用天冬酰胺进行的置换；在位置2049(Am)处的差异为用苯丙氨酸、 异亮氨酸或亮氨酸进行的置换；在位置2074(Am)处的差异为用亮氨酸 进行的置换；在位置2075(Am)处的差异为甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸，或者2075(Am)的重复；在位置2078(Am)处的差异为赖氨酸、甘氨 酸或苏氨酸；在位置2098(Am)处的置换为丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、 组氨酸、丝氨酸或半胱氨酸；或

[0462] b.在位置2039(Am)处的差异为用甘氨酸进行的置换；在位置 2059(Am)处的差异为用缬氨酸进行的置换；在位置2080(Am)处的差异 为用谷氨酸进行的置换，或者2080(Am)的缺失；和在位置2095(Am) 处的差异为用谷氨酸进行的置换。

[0463] 85.用于在段落81至84中任一项的植物附近控制杂草生长的方 法，其包括向所述杂草和单子叶植物施用一定量的抑制乙酰辅酶A羧 化酶的除草剂，所述除草剂抑制野生型植物的生长。

[0464] 86.段落85的方法，其中至少一种除草剂选自下列：禾草灭、丁 苯草酮、烯草酮、环己烯草酮、噻草酮、烯禾定、吡喃草酮、三甲苯 草酮、炔禾灵、炔草酸、氯丁草、禾草灵、 唑禾草灵、精 唑禾草 灵、噻唑禾草灵、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、吡氟氯禾灵、精吡氟 氯禾灵、异 草醚、喔草酯、喹禾灵、精喹禾灵、三氟苯氧丙酸和唑 啉草酯，或者这些除草剂中任一种除草剂的农艺学上可接受的盐或酯， 以通常会抑制野生型植物生长的除草剂水平。

[0465] 87.用于控制杂草生长的方法，其包括：

[0466] a.使段落81至84中任一项的植物与其他植物种质杂交，并且收 获所得到的杂种种子；

[0467] b.种植所述杂种种子；和

[0468] c.以通常会抑制野生型植物生长的除草剂水平，向所述杂种植物 和向处于所述杂种植物附近的杂草施用一种或多种抑制乙酰辅酶A羧 化酶的除草剂。

[0469] 88.段落81至84中任一项的植物的植物细胞。

[0470] 89.段落81至84中任一项的植物的植物部分。

[0471] 90.由段落81至84中任一项的植物产生的种子。

[0472] 91.产生杂种植物的方法，其包括用第二植物来使段落81至84 中任一项的植物进行繁育，其中所述杂种植物展示出相比于所述第二 植物而言增加的除草剂耐受性。

[0473] 92.从段落81至84中任一项的植物制备的食品。

[0474] 93.从段落81至84中任一项的植物制备的消费产品。

[0475] 94.从段落81至84中任一项的植物制备的工业产品。

[0476] 95.从段落81至84中任一项的植物制备的兽医学产品。

[0477] 96.分离的、重组的或经诱变的核酸分子，其编码在段落81至 84中任一项之中所描述的ACCase。

[0478] 97.段落96的核酸作为选择标记的用途。

[0479] 98.处理段落81至84中任一项的水稻植物的方法，其包括使所 述植物与农艺学上可接受的组合物相接触。

[0480] 99.用于选择经转化的植物细胞的方法，所述方法包括：

[0481] a.将编码目的基因的核酸分子引入植物细胞中，其中所述核酸分 子还编码突变型乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)，所述突变型乙酰辅酶 A羧化酶中的氨基酸序列在一个氨基酸位置处不同于相应野生型植物 的ACCase的氨基酸序列；和

[0482] b.使所述植物细胞与ACCase抑制剂相接触以鉴定经转化的植物 细胞，其中所述突变型ACCase展示出相比于相应野生型ACCase而言 增加的对所述ACCase抑制剂的除草剂耐受性。

[0483] 100.育种方法，所述方法包括：

[0484] a.用第二植物来使包含段落99的细胞的植物进行繁育，以获得 后代植物；和[0485] b.确定所述后代植物是否表达所述突变型ACCase；

[0486] 其中所述突变型ACCase赋予所述后代植物以相比于所述第二植 物而言增加的除草剂耐受性。

[0487] 101.段落99和100中任一项的方法，其中所述突变型ACCase 包含有在仅一个选自下列的氨基酸位置处的置换：1781(Am)、1785(Am)、1786(Am)、1811(Am)、1824(Am)、1864(Am)、1999(Am)、 2027(Am)、2039(Am)、2041(Am)、2049(Am)、2059(Am)、2074(Am)、 2075(Am)、2078(Am)、2079(Am)、2080(Am)、2081(Am)、2088(Am)、 2095(Am)、2096(Am)和2098(Am)。

[0488] 102.水稻植物，其中：

[0489] a.所述植物的生长耐受处于通常会抑制水稻植物生长的除草剂 水平的抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂；

[0490] b.所述植物是品系OsHPHI2、OsARWI1、OsARWI3、OsARWI8或 OsHPHN1中任一个品系的植物，每个品系的代表性种子样品已经分别 以专利保藏指定编号PTA-10267、PTA-10568、PTA-10569、PTA-10570 或PTA-10571保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)；或者是品系 OsHPHI2、OsARWI1、OsARWI3、OsARWI8或OsHPHN1中任一个品系的植 物的突变体、重组体或基因工程衍生物，每个品系的代表性种子样品 已经分别以专利保藏指定编号PTA-
10267、PTA-10568、PTA-10569、 PTA-10570或PTA-10571保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)； 或者是作为这些植物中任一种植物的后代的植物；和

[0491] c.所述植物具有品系OsHPHI2、OsARWI1、OsARWI3、OsARWI8或 OsHPHN1中任一个品系的植物的除草剂耐受性特征，每个品系的代表 性种子样品已经分别以专利保藏指定编号PTA-10267、PTA-10568、 PTA-10569、PTA-10570或PTA-10571保藏于美国典型培养物保藏中心 (ATCC)。保藏信息：
PTA-10267保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日期 为2009年8月11日，分类命名是水稻OsHPHI2。
PTA-10568保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日期 为2010年1月7日，分类命名是水稻OsARWI1。
PTA-10569保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日期 为2010年1月7日，分类命名是水稻OsARWI3。
PTA-10570保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日期 为2010年1月7日，分类命名是水稻OsARWI8。
PTA-10571保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏日期 为2010年1月7日，分类命名是水稻OsHPHN1。