[0001] 本发明涉及生物领域，具体涉及一种鸭疫里默氏杆菌的培养方法及其培养基。

[0002] 我国是一个养鸭大国，养鸭业在我国的农业经济中占有着重要的地位，也是人们生活所需肉蛋的重要来源之一。随着该产业向规模化、集约化方向的发展，其经济效益明显提高，但一些重要的疫病正在使其遭受很大的经济损失并对其进一步的发展形成严重的威胁。

[0003] 鸭疫里默氏杆菌病是目前对世界各国养鸭业造成危害最为严重的传染病之一。鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)引起的主要侵害雏鸭、雏火鸡等多种禽类的急性或慢性的接触性传染病，又称为“新鸭病”、“鸭疫综合征”、“鸭败血症”、“鸭传染性浆膜炎”、“鸭疫巴氏杆菌感染”等。该病以纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎和干酪性输卵管炎为特征。其发病率在5％～90％、病死率一般在1％～80％，高峰时可达90％甚至100％，耐过鸭多生长迟缓成僵鸭，该病在世界各养鸭地区几乎都有流行，给世界养鸭业造成了巨大的经济损失。

[0004] 该菌由Hendrickso和Hilbert于1932年首次分离鉴定，并命名为鸭疫斐佛氏菌(Pfeifferella，Anatipestifer)。Bruner和Fabricant于1954年根据相同特性将此菌列人莫拉克氏菌属，称为鸭疫莫拉克氏菌(Moraxellaantipestifer)。此后又按其形态与染色特征等因素被列入巴氏杆菌属，命名为鸭疫巴氏杆菌(Pastenrella anatipestifer)。其后Bangun等((1981，1987)将本菌与莫拉克氏菌和巴氏杆菌在生化反应、生长温度、对理化因素的抵抗力、DNA碱基组成、酯酶特性、菌体蛋白的聚丙烯酞胺凝胶电泳图谱等方面进行比较，并通过DNA-rRNA杂交分析其同源性，用气相色谱法分析细胞脂肪酸图象得出结论认为，该菌应从莫拉克氏菌属或巴氏杆菌属中划分出来。我国学者郭玉璞(1986)将本菌和多杀巴氏杆菌的超微结构进行比较，证明二者在形态结构上不同，在第9版《伯杰氏细菌鉴定手册》中将其列为位置未定的种。Piechulla等(1986)根据NDA结合，甲基萘醌类和侧链脂肪酸的产生，建议将RA划入黄杆菌属/噬纤维素菌中，Rosson等(1991)也为证实该菌与黄杆菌属/噬纤维素菌的成员具有大量的相似性。Segers等(1993)根据DNA-RNA杂交分析，蛋白质、脂肪酸组成的表型特征，建议将其划分为独立一属，由鸭疫巴氏杆菌更名为鸭疫里默氏杆菌。目前这一命名得到国内外学者的认可，并在国际权威性杂志上被采纳和引用。我国原先一直用鸭疫巴氏杆菌病和鸭传染性浆膜炎称谓此病，郭玉璞(1999)建议宜用鸭疫里默氏杆菌病，因为鸭大肠杆菌、沙门氏菌等均可以引起浆膜炎。但习惯上还沿用“鸭传染性浆膜炎”至今。

[0005] 鸭疫里默氏杆菌为革兰氏阴性小杆菌，无芽胞，不能运动。纯培养物涂片，菌体除呈杆状外，有的为椭圆形，多数单个存在，少数成双排列。大小为0.3～0.5μm×0.7～6.5μm，偶见个别菌体呈长丝状，长达11～24μm。经墨汁负染见有夹膜，涂片经瑞氏染色可见部分菌体两极浓染。电镜下细菌的周边荚膜是一电子透明层，细菌胞壁为1条电子致密层，细胞膜有3层结构，外层与内层呈电子致密层(郭玉璞，1996)。细胞膜与细胞层之间有一明显的间隙，在菌体周边有圆形或卵圆形空泡状结构，位于菌体一端，部分RA顶端或侧面还有芽状赘生物。

[0006] 鸭疫里默氏杆菌培养特性，鸭疫里默氏杆菌的生长要求苛刻，需要CO2方可生长，可在巧克力琼脂、胰酶大豆琼脂、LB培养基、胰蛋白肉汤、胰酶大豆肉汤以及改良马丁肉汤等培养基上生长；在普通琼脂和麦康凯琼脂上不能生长，这可作为鉴别诊断的依据。早期就有学者发现硫胺素(1000mL含硫胺素0.01g)能使RA生长较佳，而低浓度的吡啶胺素和amprolium对RA生长有抑制作用。在胰酶大豆琼脂(TSA)或巧克力琼脂平板上生成的菌落表面光滑、微突起，圆形呈奶油状，菌落直径约1～1.5mm，若继续培养，菌落稍大，可达2.0mm，荧光观察均发绿色(Harry EG，1969)。但在普通大气环境中进行培养，菌落较小，呈露珠状。鲜血琼脂平板培养墓上的菌落为不溶血的露珠状小菌落，若在此培养基上继代后，菌落变大，菌苔稍粘稠，可获得最佳生长，菌落呈圆形、稍突起、表面光滑、透明，直径1～2mm。据报道(张大丙，1999)，不同血清型的RA生长速度有所差异，10型RA生长最快，培养7h即可长成，
2型最慢。在含有血清的肉汤或胰酶酵母肉汤中，培养48h，可见上下一致轻微浑浊，管低有少量沉淀。在血清(马血清)凉胎培养基上继代也可生长，菌落为半透明状，但不能在普通琼脂与麦康培养基上生长。本菌的鲜血琼脂斜面培养物，在4℃冰箱保存容易死亡，一般经4～
5d应继代一次，但毒力逐渐降低。

[0007] 鸭疫里默氏杆菌的生长要求苛刻，在体外培养需要较高的营养条件，据此，目前相关学者探讨了大豆胰酶、血清琼脂、鲜血琼脂等适于里默氏杆菌生长的各种培养基，但没有统一标准的培养方法，对于在各种培养基上的生长特性并没有进行系统的研究。

[0008] 为解决上述问题，本发明提供了一种鸭疫里默氏杆菌的培养方法，。

[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

[0010] 一种鸭疫里默氏杆菌的培养方法，包括如下步骤：

[0011] S1、制备鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板培养基

[0012] 将10.0g胰蛋白胨、5.0g大豆蛋白胨、5.0g酵母膏、5.0g氯化钠和12.0g琼脂粉溶于1000ml的去离子水中，搅拌均匀，用氢氧化钠调节PH值至7.1-7.2，121℃高压灭菌15min后，待冷却至65℃-70℃时，通过无菌方式加入无菌的脱纤维鸭血100ml，摇匀后倾注平板，无菌检验后，得鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板培养基，4℃冰箱保存备用；

[0013] S2、从发病鸭和死亡鸭分离鸭疫里默氏杆菌，无菌取鸭脑组织划线接种于鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板上，置于CO2蜡烛缸中37℃培养24-48小时，即得长出圆形微隆起、表面光滑、奶油状、直径1-2mm无色素菌落，血平板上不溶血。

[0014] 本发明还提供了一种鸭疫里默氏杆菌培养基，由以下组分的原料制备而成：

[0015] 胰蛋白胨10.0g、大豆蛋白胨5.0g、酵母膏5.0g、氯化钠5.0g、琼脂粉12.0g、无菌的脱纤维鸭血100ml、去离子水1000ml。

[0016] 本发明具有以下有益效果：

[0017] 本发明的培养方法操作方便，能适用于普通实验的平板培养需要，能使鸭疫里默氏杆菌在24h内长出较好的菌落；且培养基制作成本低，培养效果好，可大批量、高质量的增菌培养，对临床实践中诊断疾病具有指导意义，为鸭疫里默氏杆菌疫苗生产奠定了基础。

[0018] 为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0019] 以下实施例中，通过以下步骤完成鸭疫里默氏杆菌的分离：

[0020] 从发病鸭和死亡鸭易分离到鸭疫里默氏杆菌，无菌采取病变组织，在胰蛋白酶大豆琼脂或巧克力琼脂上划线，置蜡烛缸内37℃培养24小时，细菌生长为0.5～1mm大小、表面光滑、稍凸起、呈奶酪状的圆形菌落。

[0021] 通过以下步骤完成鸭疫里默氏杆菌的鉴定：

[0022] 鸭疫里默氏杆菌在胰酶大豆琼脂上培养24h形成圆形凸起、透明、呈露珠样，直径为0.5～1.5mm的菌落，用斜射光观察发绿色光，鸭大肠杆菌菌落为2～5mm，鸭沙门氏菌菌落为2～3mm，且后两者在TSA上的培养物均为灰白色；进一步接种麦康凯平板，可见，鸭疫里默氏杆菌不生长，鸭大肠杆菌呈红色菌落，鸭沙门氏菌呈白色菌落。

[0023] 实施例

[0024] 1、鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板培养基的制备：

[0025] 将10.0g胰蛋白胨、5.0g大豆蛋白胨、5.0g酵母膏、5.0g氯化钠和12.0g琼脂粉溶于1000ml的去离子水中，搅拌均匀，调节PH值至7.1-7.2，121℃高压灭菌15min后，待冷却至65℃-70℃时，通过无菌方式加入无菌的脱纤维鸭血100ml，摇匀后倾注平板，无菌检验后，得鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板培养基，4℃冰箱保存备用；

[0026] 2、选用本实验室分离鉴定的一株血清13型YNRA-1为例，将YNRA-1菌株接种鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板上，置5％～10％CO2培养箱，37℃条件下培养24h，可得圆形微隆起、表面光滑、奶油状、直径1～2mm无色素菌落，血平板上不溶血。

[0027] 3、鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板培养基鸭疫里默氏杆菌生长情况

[0028] 以血清13型YNRA-1为例，菌株涂抹接种鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板上(直径90mm)，于12h、24h，用10ml无菌生理盐水洗下菌苔，用721微量分光光度计测定OD420值(OD420值作为细菌总菌数的参考指标，细菌总菌数Y＝2.85X1.24，X为OD420值)。测定结果12h OD420值0.23，细菌总菌数4.6x109CFU/ml，24h OD420值0.52，细菌总菌数1.27x1010CFU/ml。

[0029] 培养特性观察

[0030] 观察细菌在不同培养基上生长情况，鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板培养基上培养24-48小时的菌落形态为圆形、半透明状、隆起、表而光滑、富有光泽、奶油状，直径约1-2mm菌落，麦康凯琼脂上不生长。CO2厌氧烛缸条件下，在鸭血胰蛋胨大豆琼脂平板培养基上生长良好，而在普通琼脂平板上生长不良；菌体革兰氏染色阴性，显微镜下形态为小球杆菌，单个菌体居多，两极略浓染。

[0031] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。