大熊猫肠道放线菌的分离方法 |
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| 申请号 | CN201710790423.1 | 申请日 | 2017-09-05 | 公开(公告)号 | CN107384797A | 公开(公告)日 | 2017-11-24 |
| 申请人 | 四川农业大学; | 发明人 | 赵珂; 李静; 张潇月; 张小平; 陈强; 李倜; 李德生; 黄治; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于 微 生物 培养技术领域，具体为一种大熊猫肠道放线菌的分离方法，将采集的新鲜大熊猫 粪便 样品加 水 ，再加入 苯酚 、Tween 20、CMC，培养和离心 力 离心，上清液稀释，得到菌悬液，菌悬液涂布于放线菌分离培养基上培养，挑取疑似放线菌菌落在ISP4培养基上划线纯化，接种于ISP4斜面培养基上。本发明提对大熊猫粪便 含水量 高、大肠杆菌及其他一些革兰氏阴性菌较多、放线菌在大熊猫肠道中所占比例较低等特点，在样品前处理中加入苯酚以抑制一般细菌的生长；CMC和吐温20的加入可以最大限度的分散样品，充分释放出放线菌，提高后期放线菌的分离效果。本发明有助于更全面了解大熊猫肠道内放线菌的种群组成，进一步丰富了大熊猫肠道放线菌的资源。 | ||||||
| 权利要求 | 1.大熊猫肠道放线菌的分离方法，其特征在于，包括以下过程： |
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| 说明书全文 | 大熊猫肠道放线菌的分离方法技术领域背景技术[0002] 放线菌种类繁多，代谢功能各异，能产生大量的生物活性物质，如抗生素、酶和酶的抑制剂等，是分泌天然药物最多的一类微生物。目前临床和农业生产使用的抗生素有3/4是用放线菌生产的，是一类具有较大的实用价值和开发潜力的微生物。随着致病菌耐药性的不断增强，加之一些新疾病的出现，对具有新结构和新功能的药物需求越来越大，使新药物的研发越发的重要。但长期以来在天然产物的筛选过程中运用传统的菌种分离与鉴定技术，导致大量菌株被重复分离和筛选，从中发现新化合物的几率降低，严重阻碍了新的活性物质的筛选过程。因此，新的筛选过程及来自新生境的新菌株是加快这一过程的重要手段，肠道放线菌就是这样一类相对未开发的新资源。肠道放线菌所产生的代谢产物如抗生素、酶抑制剂、免疫调节剂等在动物体内起着至关重要的作用，具有促进机体的营养吸收和抵御病害等多种生物学功能。动物肠道放线菌在与宿主长期的协同进化过程中，与宿主进行着物质、能量及基因的互动作用，构成了宿主小生境特定的微生态系统，由于与宿主的长期相互作用，其遗传和代谢与外界环境放线菌不同，使肠道放线菌表现出有别于分离自其它环境放线菌的生物学功能。因此，肠道放线菌的生理特征和生物学特性与自由生活的相应菌株都存在着较大的差异。 [0003] 从动物肠道中获得微生物的纯培养菌株是当前筛选微生物产生的新的活性物种的第一步，也是开发新的活性物质的关键。目前对于肠道微生物的研究多是以粪便为对象开展的，粪便样品的采集是一种非侵入性、方便的方法，并且基本上包括了肠道内所有的微生物种类，是研究肠道微生物比较好的样品。主要采用以下方法对动物肠道放线菌进行分离分离：样品处理-稀释涂布-分离纯化培养。现有的样品处理方法主要是干热处理，即将采集回来的样品干燥后置于80℃处理1h。不考虑某些种属的放线菌不能在长期干燥的环境中存活或者不能耐受高温处理，直接导致粪便样品当中的某些稀有种属的放线菌在干燥或者高温处理过程中就已经死亡，最终影响肠道放线菌的分离效果。 [0004] 大熊猫是世界上最珍贵的动物之一，数量十分稀少，主要栖息在我国四川、陕西，甘肃三省交界的山区，属于哺乳动物纲，食肉动物目，主要以竹子为食，较之其它草食动物，大熊猫的肠子长度只是自身体长的4倍，具有典型的肉食性哺乳动物的消化系统，由于大熊猫独特的消化系统和饮食习惯，其肠道内的微生物与肉食动物和草食动物均存在较大差异。通过传统的培养技术和高通量测序研究发现大熊猫肠道内存在着大量的放线菌，仅有极少部分的放线菌获得了纯培养，绝大部分放线菌采用目前的分离培养方法还未获得纯培养。 发明内容[0005] 本发明针对大熊猫等动物肠道放线菌分离效果不理想等现有技术的不足，提供了一种有效获得大熊肠道可培养放线菌的分离筛选方法。 [0006] 具体的技术方案为： [0007] 将采集的新鲜大熊猫粪便样品制备菌悬液，通过改进的方法对样品进行前处理后，将处理后的菌悬液涂布于改进后的选择性培养基上培养。具体的技术内容为： [0008] 大熊猫肠道放线菌的分离方法，包括采样、样品前处理、菌悬液制备、分离培养基制备、分离纯化及保种步骤，具体包括： [0009] (1)采样：以饮食状况良好、近期内没有生病的健康大熊猫为对象，采集亚成年、成年、老年大熊猫所产新鲜粪便装于无菌封口袋中，并保存于4℃封口袋中带回实验室，立即进行后续分离工作； [0010] (2)样品前处理：称取新鲜的大熊猫粪便5g放入带有玻珠盛装45mL无菌水的三角瓶里，轻轻摇匀形成混合物，按混合物重量0.5％的比例加入苯酚和0.1％的比例加入Tween 20，然后再加入终浓度为2.5g/L的CMC，于28℃，150r/min，振荡培养1-2h，4℃下用800g的离心力离心15-20min； [0011] (3)菌悬液制备：以步骤(2)获得的上清液为原液进行梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3浓度的菌悬液备用； [0012] (4)分离纯化保种：分别取步骤(3)获得的各稀释浓度菌悬液100ul均匀涂布于放线菌分离培养基上，于28℃培养箱中倒置培养30天，待平板上形成菌落后，进行菌落观察并挑取疑似放线菌菌落在ISP4培养基上划线纯化，并进行镜检确定纯菌株，纯化后的菌株接种于ISP4斜面培养基上，于4℃临时保藏；菌株同时用添加20％(v/v)甘油水溶液中于-80℃保藏，并制成冻干牛奶管于4℃保藏。 [0013] 所述的放线菌分离培养基，包括以下成分：CMC 7.5g；MgSO4.7H2O 0.2g；K2HPO4 1.0g；KH2PO4 1.0g；NH4NO4 1.0g；FeCl3·6H2O 0.05g；CaCl2 0.02g；混合糖1.2g；微量元素 1ml；琼脂20.0g；pH 7.0-7.2； [0015] 所述混合糖成分为：半乳糖0.2g；海藻糖0.4g；鼠李糖0.2g；果糖0.15g；木糖0.25g。 [0016] 所述微量元素成分为：H3BO3 5mmol/L；MnSO4·H2O 2.5mmol/L；Co(NO3)2·6H2O 0.1mmol/L；CuSO4·5H2O 0.5mmol/L；Na2MoO4·2H2O 0.1mmol/L；用0.1mol/L HCl溶解上述微量元素。 [0017] 本发明提供的大熊猫肠道放线菌的分离方法，针对大熊猫粪便含水量高、大肠杆菌及其他一些革兰氏阴性菌较多、放线菌在大熊猫肠道中所占比例较低等特点，在样品前处理中加入苯酚以抑制一般细菌的生长；CMC和吐温20的加入可以最大限度的分散样品，充分释放出放线菌，提高后期放线菌的分离效果。本方法进一步结合大熊猫粪便的特点，在分离培养基中加入了混合糖和CMC作为碳源，以及添加微量元素模似大熊猫肠道放线菌所需的营养条件。此外，由于大多数放线菌普遍存在生长缓慢的问题，在分离培养基中加入抑菌剂可以有效的抑制非放线菌对放线菌生长的影响，减少非放线菌对后期挑菌干扰，防止污染。本发明有助于更全面了解大熊猫肠道内放线菌的种群组成，进一步丰富了大熊猫肠道放线菌的资源，同时也为后继功能菌株的筛选提供丰富的菌种资源。 [0019] 图1a为实施例1亚成年大熊猫肠道内放线菌分离结果之一； [0020] 图1b为实施例1亚成年大熊猫肠道内放线菌分离结果之二； [0021] 图2a为实施例2成年大熊猫肠道内放线菌分离结果之一； [0022] 图2b为实施例2成年大熊猫肠道内放线菌分离结果之二； [0023] 图3a为实施例3老年大熊猫肠道内放线菌分离结果之一； [0024] 图3b为实施例3老年大熊猫肠道内放线菌分离结果之二。 具体实施方式[0025] 以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。 [0026] 实施例1 [0027] 大熊猫肠道放线菌的分离方法，包括采样、样品前处理、菌悬液制备、分离培养基制备、分离纯化及保种步骤，具体包括： [0028] (1)采样：以饮食状况良好、近期内没有生病的健康大熊猫为对象，采集亚成年大熊猫所产新鲜粪便装于无菌封口袋中，并保存于4℃封口袋中带回实验室，立即进行后续分离工作； [0029] (2)样品前处理：称取新鲜的大熊猫粪便5g放入带有玻珠盛装45mL无菌水的三角瓶里，轻轻摇匀形成混合物，按混合物重量0.5％的比例加入苯酚和0.1％的比例加入Tween 20，然后再加入终浓度为2.5g/L的CMC，于28℃，150r/min，振荡培养1-2h，4℃下用800g的离心力离心15-20min； [0030] (3)菌悬液制备：以步骤(2)获得的上清液为原液进行梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3浓度的菌悬液备用； [0031] (4)大熊猫肠道放线菌分离培养基制备：在放线菌分离培养基中加入各30ug/ml的利福平、制菌霉素和重铬酸钾作为抑菌剂，抑制非放线菌的生长； [0032] (5)分离纯化保种：分别取步骤(3)获得的各稀释浓度菌悬液100ul均匀涂布于分离培养基上，于28℃培养箱中倒置培养30天，待平板上形成菌落后，观察菌落表型特征并挑取疑似放线菌菌落在ISP4培养基上划线纯化，并进行镜检确定纯菌株，如图1a和图1b；纯化后的菌株接种于ISP4斜面培养基上，于4℃临时保藏；菌株同时用添加20％(v/v)甘油水溶液中于-80℃保藏，并制成冻干牛奶管于4℃保藏。 [0033] 所使用的是大熊猫粪便团聚体中间在采集或移至实验室过程中未暴露在空气中的部分。 [0034] 所使用的放线菌分离培养基配制过程如下：将CMC 7.5g；MgSO4.7H2O 0.2g；K2HPO4 1.0g；KH2PO4 1.0g；NH4NO4 1.0g；FeCl3·6H2O 0.05g；CaCl2 0.02g；混合糖1.2g；琼脂 20.0g；pH 7.0-7.2；琼脂20g,加入到1000mL蒸馏水中，煮沸，调节pH值为7.2-7.4，121℃灭菌30min，放置冷却后加入经过滤灭菌的微量元素1mL，加入经过滤灭菌的利福平、制菌霉素和重铬酸钾，各终浓度均为30ug/ml，充分混匀后，倒平板冷却备用。 [0035] 所加入的混合糖组成为：半乳糖0.2g；海藻糖0.4g；鼠李糖0.2g；果糖0.15g；木糖0.25g； [0036] 加入的微量元素组成为：H3BO3 5mmol/L；MnSO4·H2O 2.5mmol/L；Co(NO3)2·6H2O 0.1mmol/L；CuSO4·5H2O 0.5mmol/L；Na2MoO4·2H2O 0.1mmol/L；用0.1mol/L HCl溶解上述微量元素。 [0037] 实施例1中所述菌落表型特征为菌落的形状、气丝、基丝、色素颜色、孢子、及菌落的干湿度。 [0038] 待放线菌长出后，使用无菌竹签挑取放线菌在ISP4培养基(可溶性淀粉10g,NH4SO4 4.0g,MgSO4·7H2O 4.1g,K2HPO4·3H2O 2.62g,琼脂20g,水1000mL)划线纯化培养，纯化后的菌株保存在ISP4斜面培养基上，于4℃临时保藏；菌株同时用添加20％(v/v)甘油水溶液中于-80℃保藏，并制成冻干牛奶管于4℃保藏。 [0039] 共分离获得纯化的放线菌菌株46株，提取菌株总DNA，采用通用引物(8-27F、1523-1504R)对提取的DNA进行PCR扩增。将所测的序列，通16S rRNA序列比对鉴定，这些菌株分属于放线菌的4个属：Streptomyces,Curtobacterium,Amycolatopsis,Cellulomonas；这些分离得到的大熊猫肠道的放线菌菌株分别与NCBI上发表来源于动物的菌株相似性为99- 100％。 [0040] 实施例2 [0041] 与实施例1的分离方法相同，不同之处在于，其所选的粪便样品为成年大熊猫所产。分离获得菌株45株。如图2a和图2b；分属于放线菌的7个属：Streptomyces,Pseudonocardia,Brachybacterium,Arthrobacter,Nocardiopsis,Microbacterium,Agrococcus；这些分离得到的大熊猫肠道的放线菌菌株分别与NCBI上发表来源于动物的菌株相似性为99-100％。 [0042] 实施例3 [0043] 与实施例1的分离方法相同，不同之处在于，其所选的粪便样品为老年大熊猫所产。分离获得菌株41株。如图3a和图3b；分属于放线菌的6个属：Streptomyces，Pseudonocardia,Nocardiopsis,Microbacterium,Cellulomonas,Arthrobacter；这些分离得到的大熊猫肠道的放线菌菌株分别与NCBI上发表来源于动物的菌株相似性为99-100％。 [0044] 从以上实施例可见，本方法分离获得的Microbacterium、Curtobacterium、Brachybacterium、Nocardiopsis、Amycolatopsis、Pseudonocardia为首次从大熊猫肠道中分离获得的放线菌类群。结果表明，本方法分离获得的大熊猫肠道放线菌菌株的数量多和种类丰富，该发明所提供大熊猫肠道放线菌的分离方法具有可行性。 |
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