[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体。

[0002] CHCHD2(coiled-coil-helix-coiled-coil-helix domain containing 2)编码蛋白主要定位于线粒体膜间隙，其对于调节线粒体嵴结构和线粒体呼吸链复合体完整性具有重要意义.近年来在患有常染色体显性遗传帕金森患者全基因组中筛选发现CHCHD2存在错义突变，由于CHCHD2突变可能引起线粒体功能紊乱，其产生的活性氧将影响神经功能，因此，该突变被认为与晚发性帕金森密切相关，但其具体功能和新的帕金森治疗靶点的可能性仍然需要进一步研究。

[0003] 本发明的目的在于：首次提供一种人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体。

[0004] 为了实现本发明上述目的，本发明提供了一种人正常CHCHD2过表达慢病毒载体，其含有人正常CHCHD2基因序列。

[0005] 其中，所述人正常CHCHD2基因序列如SEQ ID NO:1所示。

[0006] 本发明还提供了一种人突变CHCHD2过表达慢病毒载体，其含有人突变CHCHD2基因序列。

[0007] 其中，所述人突变CHCHD2基因序列如SEQ ID NO:2所示。

[0008] 本发明所述人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体在细胞中均能正常表达。

[0009] 相对于现有技术，本发明具有如下优点和有益效果：

[0010] 本发明利用过表达慢病毒载体包载技术，分别构建了人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体，且将人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体分别转染293T细胞后，通过荧光素报告基因检测表明，本发明人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体在细胞中均能正常表达。本发明人正常CHCHD2过表达慢病毒载体和人突变CHCHD2过表达慢病毒载体为帕金森疾病的治疗和研究提供了新的模型，具有重要的研究价值。
附图说明

[0011] 图1是实施例1和2构建得到的载体示意图。

[0012] 图2是实施例1步骤2.2酶切结果的电泳图。

[0013] 图3是实施例1步骤3.2PCR结果的电泳图。

[0014] 图4是实施例1步骤4.3PCR鉴定结果的电泳图。

[0015] 图5是实施例2步骤2.2酶切结果的电泳图。

[0016] 图6是实施例2步骤3.2PCR结果的电泳图。

[0017] 图7是实施例2步骤4.3PCR鉴定结果的电泳图。

[0018] 为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。

[0019] 实施例1

[0020] 人正常CHCHD2过表达慢病毒载体的构建

[0021] 基因名称：CHCHD2(NM_016139)

[0022] 物种：人

[0023] 1.实验材料描述

[0024] 1.1主要试剂

[0025]

[0026] 1.2主要仪器及器材

[0027]

[0028] 2.载体酶切

[0029] 2.1载体信息

[0030] 载体名称：GV341(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)

[0031] 元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin

[0032] 克隆位点：AgeI/NheI

[0033] 对照编号：CON195

[0034] 基因图谱可网上下载，载体如图1所示。

[0035] 2.2酶切结果

[0036] 电泳图如图2所示。图2中，1为10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)。2为载体酶切产物。3为未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)。

[0037] 3.目的基因片段的获取

[0038] 3.1引物

[0039] 引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因，CHCHD2(22498-1)-P1序列如SEQ ID NO:3所示，CHCHD2(22498-1)-P2序列如SEQ ID NO:4所示。

[0040] 3.2PCR结果

[0041] PCR产物大小为498。电泳图如图3所示。图3中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。

[0042] 4.重组质粒构建

[0043] 4.1产物交换入线性化表达载体

[0044] 4.2PCR鉴定引物

[0045] 引物Ubi-F序列如SEQ ID NO:5所示，引物FLAG-R-2序列如SEQ ID NO:6所示。

[0046] 4.3PCR鉴定结果

[0047] 阳性转化子PCR产物大小：666，阴性转化子PCR产物大小：212，电泳图如图4所示。图4中，1为阴性对照(ddH2O)，2为阴性对照(空载自连对照组)，3为阳性对照(GAPDH)，4为Marker，自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp，5～12为1-8号转化子。

[0048] 5.阳性克隆测序结果及结果分析：测通OK。

[0049] 6.病毒滴度检测报告

[0050] 支原体、衣原体、细菌、真菌均为阴性，内毒素小于50EU/ml，符合标准。

[0051] 实施例2

[0052] 人突变CHCHD2过表达慢病毒载体的构建

[0053] 基因名称：CHCHD2(NM_016139(T61I))

[0054] 物种：人

[0055] 1.实验材料描述

[0056] 1.1主要试剂

[0057]

[0058] 1.2主要仪器及器材

[0059]

[0060]

[0061] 2.载体酶切

[0062] 2.1载体信息

[0063] 载体名称：GV341(购自上海吉凯基因化学技术有限公司)

[0064] 元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-puromycin

[0065] 克隆位点：AgeI/NheI

[0066] 对照编号：CON195

[0067] 基因图谱可网上下载，载体如图1所示。

[0068] 2.2酶切结果

[0069] 电泳图如图5所示。图5中，1为10kb Marker(条带自上而下依次为：10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750bp、500bp、250bp)。2为载体酶切产物。3为未酶切载体(从细菌中提取的质粒因可能存在超螺旋，开环，线性等不同的构象而具有不同的迁移速率，在琼脂糖凝胶电泳中呈现大小不同的条带，故此时质粒的电泳条带只能作为质粒分子量大小判断的参考，不可作为准确判断依据。质粒经单酶切消化后，会呈现均一的电泳条带，此时可与Marker对比判断其分子量大小)。

[0070] 3.目的基因片段的获取

[0071] 3.1引物

[0072] 引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR钓取目的基因，CHCHD2(22497-3)-P1序列如SEQ ID NO:7所示，CHCHD2(22497-3)-P2序列如SEQ ID NO:8所示。

[0073] 3.2PCR结果

[0074] PCR产物大小为498。电泳图如图6所示。图6中，Marker自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。

[0075] 4.重组质粒构建

[0076] 4.1产物交换入线性化表达载体

[0077] 4.2PCR鉴定引物

[0078] 引物Ubi-F序列如SEQ ID NO:5所示，引物FLAG-R-2序列如SEQ ID NO:6所示。

[0079] 4.3PCR鉴定结果

[0080] 阳性转化子PCR产物大小：666，阴性转化子PCR产物大小：212，电泳图如图7所示。图7中，1为阴性对照(ddH2O)，2为阴性对照(空载自连对照组)，3为阳性对照(GAPDH)，4为Marker，自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp，5～12为1-8号转化子。

[0081] 5.阳性克隆测序结果及结果分析：测通OK。

[0082] 6.病毒滴度检测报告

[0083] 支原体、衣原体、细菌、真菌均为阴性，内毒素小于50EU/ml，符合标准。

[0084] 根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。