[0001] 本发明属于生物学领域，尤其涉及一种家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法。

[0002] 家蚕是一种重要经济昆虫，具有极高的经济价值，对提高人类生存质量做出了积极的贡献。在上下五千年的悠久文明历史中，丝绸之路和丝绸文化是一块绚丽的文化瑰宝，也是中国古老文明的象征。时至今日，在当前农村经济中，蚕丝产业仍然是部分农村地区的支柱产业之一。蚕病一直是严重影响蚕丝产业的重要因素，每年因蚕病带来的经济损失约占整个产业的20％，而且没有有效的预防措施。因此，研究家蚕免疫防御机制，解析宿主对病原菌的免疫应答反应，最终能够有效防御蚕病的发生是蚕桑研究人员重要的工作内容之一。昆虫属开放式循环系统，整个体腔都浸浴在血淋巴中，血淋巴起着运输养料、激素和代谢废物，维持正常生理所需的血压、渗透压和离子平衡，参与中间代谢，清除解离的组织碎片，修补伤口，对侵染物产生免疫反应和调节体温等诸多功能。在血淋巴中，血细胞是细胞免疫应答反应的主要执行者，在免疫反应中发挥着重要的作用。根据形态，昆虫主要包含五种血细胞类型：原血细胞、颗粒细胞、浆细胞、拟绛色细胞和小球细胞，它们在免疫反应中有着不同的角色分工，共同协助昆虫应对来自体内外的各种挑战。作为一种重要的鳞翅目模式，随着基因组三部曲的顺利完成，转基因和基因编辑技术的建立与完善，家蚕成为变态与发育研究的重要材料之一。家蚕饲养方便，血细胞含量丰富，与果蝇相比具有更好的操作性，是造血及血细胞功能研究的重要介质之一。更为重要的是，鳞翅目昆虫约占据农林害虫的70％，研究家蚕造血与其调控机制，探究血细胞的功能，也可以为鳞翅目病虫害的防治提供新的策略。现阶段家蚕血细胞分类主要依据形态学和化学染色，虽然传统的方法简单方便和快捷，但是血细胞形态多样，仅仅依靠肉眼观察有时很难准确判断细胞类型，此外传统方法也要研究人员有较为丰富的的鉴定经验，都极大地影响了家蚕血细胞的研究。

[0003] 综上所述，现有技术存在的问题是：传统的方法判断细胞类型比较困难，判断不准确。

[0004] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法。

[0005] 本发明是这样实现的，一种家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法，所述家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法包括：

[0006] 步骤一，通过对家蚕细胞的转录组生物信息学数据分析，共筛选获得浆细胞特异性性表达的候选基因；

[0007] 步骤二，通过实时荧光定量PCR对基因在mRNA水平上验证，家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3在浆细胞里特异性地高表达；

[0008] 步骤三，采用家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3特有的引物序列，经过PCR技术对这两个基因的序列进行克隆扩增，并将所得的扩增产物进行测序验证；

[0009] 步骤四，采用家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3特有的RACE引物序列，利用RACE扩增技术获得其cDNA全长序列；

[0010] 步骤五，根据cDNA全长序列，进行家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3的原核表达及蛋白纯化，并制备获得抗体；

[0011] 步骤六，利用所获得Integrinβ2和Integrinβ3的抗体在家蚕细胞水平，以及转基因家蚕个体水平等验证，确定Integrinβ2和Integrinβ3能特异性地标记家蚕循环血细胞中的浆细胞。

[0012] 进一步，所述步骤一中共筛选获得141个浆细胞特异性性表达的候选基因。

[0013] 进一步，所述步骤三中Integrinβ2和Integrinβ3特有的引物序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

[0014] 进一步，所述步骤四中Integrinβ2和Integrinβ3特有的RACE引物序列为：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

[0015] 本发明的优点及积极效果为：可以准确判断细胞类型；利用转录组分析，共筛选获得139个颗粒细胞和141个浆细胞特异性表达候选基因。利用荧光定量PCR，对转录组结果进行验证。其中Integrinβ2和Integrinβ3高表达于浆细胞。随后，成功鉴定克隆了这些候选基因，经原核表达和蛋白纯化获得相应抗原后免疫动物制备抗体。免疫荧光结果表明Integrinβ2和Integrinβ3能特异标记家蚕血液中的浆细胞。附图说明

[0016] 图1是本发明实施提供的家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法流程图。

[0017] 图2是本发明实施提供的引物序列表。

[0018] 图3是本发明实施提供的主要仪器及设备表。

[0019] 图4是本发明实施提供的实验试剂表。

[0020] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0021] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

[0022] 如图1所示，本发明实施例提供的家蚕浆细胞特异性分子标记鉴定方法包括以下步骤：

[0023] S101：通过对家蚕细胞的转录组生物信息学数据分析，共筛选获得141个浆细胞特异性性表达的候选基因；

[0024] S102：通过实时荧光定量PCR对这141个基因在mRNA水平上再一步验证，由此发现家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3在浆细胞里特异性地高表达；

[0025] S103：首次推测和设计了家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3特有的引物序列(见图2)，再经过PCR技术对这两个基因的序列进行克隆扩增，并将所得的扩增产物进行测序验证；

[0026] S104：设计家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3特有的RACE引物序列(见图2)，利用RACE扩增技术获得其cDNA全长序列；

[0027] S105：根据所得的cDNA全长序列，进行家蚕基因Integrinβ2和Integrinβ3的原核表达及蛋白纯化，并制备获得抗体；

[0028] S106：利用所获得Integrinβ2和Integrinβ3的抗体在家蚕细胞水平，以及转基因家蚕个体水平等验证，最后确定Integrinβ2和Integrinβ3能特异性地标记家蚕循环血细胞中的浆细胞。

[0029] Integrinβ2和Integrinβ3特有的引物序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。

[0030] Integrinβ2和Integrinβ3特有的RACE引物序列为：SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

[0031] 下面结合实验对本发明的应用原理作进一步的描述.

[0032] 步骤1：实验材料(如图2)

[0033] 步骤2：主要仪器设备(如图3)

[0034] 步骤3：实验试剂(如图4)

[0035] 步骤4：主要培养基及溶液配制

[0036] (1)氨苄(或卡拉)抗生素(100mg/mL)：称取5g氨苄(或卡拉)抗生素粉末，加入40mL灭菌水溶解后，定容至50mL。用0.22μm滤器过滤除菌，小分分装，保存于-20℃。

[0037] (2)IPTG(24mg/mL)：称取1.2gIPTG粉末，加入40mL灭菌水溶解后，定容至50mL。用0.22μm滤器过滤除菌，小分分装，保存于-20℃。

[0038] (3)LB液体培养基：称取10gNaCl，10g胰蛋白胨和20g酵母提取物，用ddH2O定容至1L，121℃高压灭菌20分钟；

[0039] (4)LB固体培养基：称取2gNaCl，2g胰蛋白胨，4g酵母提取物和3g琼脂粉，用ddH2O定容至200mL，121℃高压灭菌20分钟。待培养基冷却至50℃左右时，加入抗生素，混合均匀后即刻倒置平板，待完全凝固后保存于4℃备用。

[0040] (5)1MNaOH：称取40gNaOH固体，加ddH2O定容至1L，0.22μm滤器过滤后室温保存。

[0041] (6)200mMEDTA：称取74.448gEDTA.2H2O，加入800mLddH2O，搅拌溶解后定容至1L，0.22μm滤器过滤后室温保存。

[0042] (7)4MNaCl：称取233.76gNaCl粉末，加入800mLddH2O，搅拌溶解后定容至1L，0.22μm滤器过滤后室温保存。

[0043] (8)30％异丙醇：量取150mL异丙醇，加ddH2O至500mL。

[0044] (9)2M尿素，25mMTris-HCl，5mMEDTA：称取120.12g尿素，3.0285gTrisbase，和1.8612gEDTA.2H2O，加入800mLddH2O，搅拌溶解后定容至1L。

[0045] (10)8M尿素，25mMTris-HCl，0.3MNaCl(pH8.0)：称取480.48g尿素，3.0285gTrisbase和17.532gNaCl，加入800mLddH2O，搅拌溶解后调节pH至8.0后，定容至1L。

[0046] (11)50mMTrisbase：称取3.0285gTrisbase，加水至500mL。

[0047] (12)20mMTris，0.5MNaCl，50％EtOH(pH7.0)：称取1.2114gTrisbase和5.61gNaCl，量取250mL无水乙醇，加入150mLddH2O，搅拌溶解，调节pH至7.0后定容至500mL。

[0048] (13)5％乙酸1％TritonX-100：量取25mL乙酸和5mLTritonX-100，加ddH2O定容至500mL，摇晃混合均匀。

[0049] (14)4M咪唑：称取137.6g咪唑，加ddH2O定容至500mL，溶解后用0.22μm滤器过滤。

[0050] (15)考马斯亮蓝R-250染色液：称取1g考马斯亮蓝R-250，置于1L烧杯，然后加入250mL异丙醇，搅拌溶解后加入100mL冰醋酸并混合均匀，加入650mLddH2O，混合均匀后过滤除去颗粒状物质，室温保存。

[0051] (16)考马斯亮蓝染色脱色液：分别量取100mL冰醋酸，50mL乙醇和850mLddH2O，混匀后使用。

[0052] 步骤5：实验方法

[0053] 1、原核表达载体构建

[0054] (1)以血细胞cDNA为模板，利用设计的Intgrinβ2和Integrinβ3原核表达引物进行PCR扩增。Intgrinβ2的扩增引物为

[0055] F2：“GGAATTCACTTCCATTTGTGGACAGTTCA”，

[0056] R2：“CCGCTCGAGTATACGGCGCGTCAGTGA”；

[0057] Intgrinβ3的扩增引物为

[0058] F3：“GGAATTCGACCTATGCGAAAAATCTGAA”，

[0059] R3：“CCGCTCGAGTATTCTCATCGCAATTCTTGTT”。

[0060] 将扩增产物用切胶回收的方法进行回收；

[0061] (2)用EcoR I和Xho I限制性内切酶同时对回收PCR产物和PET28a载体进行切割，并分别进行切胶回收，用1％琼脂糖凝胶对回收产物进行检测；

[0062] (3)取PET28a酶切回收产物，1μL；PCR回收片段，4μL；10×T4Buffer，1μL；T4DNA连接酶，1μL；ddH2O，3μL，混匀瞬时离心后，室温连接4小时；

[0063] (4)从-80℃冰箱取出感受态细胞，用手握住使其快速融化，加入10μL连接产物，冰上静置30分钟，然后42℃热激45-60秒，冰上静置2分钟，加入400μL无抗生素LB液体培养基，于220rpm，37℃的条件下震荡摇晃1小时；

[0064] (5)取适量菌液，均匀涂布于含卡拉抗生素的LB培养板上，37℃过夜培养后，用白色枪头挑取单克隆于含卡拉抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡培养4-6小时后，进行菌液电泳检测，筛选出阳性单克隆，并送至华大基因测序；

[0065] (6)将测序验证正确的阳性克隆扩大培养，参照Qiagen质粒提取试剂盒说明书提取质粒，利用1％琼脂糖胶和紫外分光光度计检测质粒浓度和纯度。

[0066] 2、原核诱导表达

[0067] (1)从-80℃冰箱取出Rosseta感受态细胞，用手握住使其快速融化，加入1μL PET28a重组质粒，轻柔混合均匀后冰上静置30分钟，然后于42℃热激60-90秒，冰上静置2分钟后，加入400μL无抗生素LB液体培养基，于220rpm，37℃的条件下震荡摇晃1小时；

[0068] (2)取适量菌液，均有涂布于含卡拉抗生素的LB培养板上，37℃过夜培养，次日用白色枪头挑取单克隆于含卡拉抗生素的LB液体培养中，37℃震荡培养4-6小时候后，进行菌液PCR检测，筛选出阳性单克隆；

[0069] (3)将阳性克隆扩大培养，取1mL菌液加至10mL新鲜的含有卡那抗生素的LB培养基中，37℃，300rpm震荡培养，当OD值达到0.6-1.0之间时，往各试管中加入适量氯霉素和IPTG，其中以只加氯霉素组为对照。然后分别在37℃，25℃和16℃培养6，12和16小时；

[0070] (4)分别收集所有组别的菌液菌体，10000rpm，4℃离心10分钟，弃上清液，下层菌体用PBS重悬；

[0071] (5)将所有组别的菌液用液氮反复冻融三次，利用超声破碎仪对菌液进行破碎，直至菌液至澄清状；

[0072] (6)12000rpm，4℃离心10分钟，将上清液转移至新的离心管中，再往沉淀中加入PBS，用移液抢轻轻悬浮沉淀；

[0073] (7)分别取20μL上清和沉淀混悬液，然后各加入5μL 5×LoadingBuffer，100℃水浴30分钟，取其中10μL样品进行SDS-PAGE电泳，检测目的蛋白的表达及表达形式。

[0074] 3、重组蛋白的大规模诱导和蛋白纯化

[0075] (1)包涵体的处理

[0076] a、将含有重组质粒的Rosseta菌株接种于2L含有卡拉青霉素的LB培养基中，37℃，300rpm震荡培养，当OD值达到0.6-1.0之间时，加入IPTG和氯霉素，然后在37℃震荡培养6小时；

[0077] b、12000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，尽量去除培养基，菌体用PBS洗涤两次；

[0078] c、用预冷50mM Tris洗涤沉淀两次，最后菌体用适当体积的(与菌体比例为1:10-20)的预冷50mM Tris溶液重悬菌体；

[0079] d、利用AVESTIN高压均质机对菌体进行高压破碎，重复高压破碎三次后，收集破碎液，于20000rpm，4℃离心30分钟；

[0080] e、用5％乙酸1％Triton X-100对包涵体沉淀室温洗涤50分钟后，高速冷冻离心；

[0081] f、重复步骤e一次，高速冷冻离心后收集沉淀；

[0082] g、用2M尿素、25mM Tris、5mM EDTA洗涤沉淀，高速冷冻离心，收集沉淀；h、用20mM Tris、0.5M NaCl、50％乙醇，pH7.0洗涤，高速冷冻离心，收集沉淀；

[0083] i、用双蒸水洗涤沉淀而去盐；

[0084] j、用8M尿素，25mM Tris-HCL，0.3M NaCl(pH8.0)溶解包涵体，调pH值至11.5-12.0，搅拌过夜。次日将pH调至8.0后，20000rpm，4℃离心30分钟，上清用0.22μm滤器过滤后保存于冰上。

[0085] (2)His柱的处理

[0086] 在对包涵体进行处理的同时，对镍柱进行前期的处理。

[0087] a、将填料装柱后，用ddH2O对镍柱进行清洗；

[0088] b、用2MNaCl洗涤大约10个柱体积，镍柱再生；

[0089] c、用dd H2O彻底清洗后，加入约10个柱体积的1M NaOH，以去除结合的杂蛋白；

[0090] d、用ddH2O彻底清洗后，用30％的异丙醇对镍柱进行处理；

[0091] e、用ddH2O彻底清洗后，加入100mM的EDTA以去掉镍柱材料位点上已结合的镍离子；

[0092] f、待镍柱完全变为白色时，加入ddH2O，对镍柱进行清洗，以彻底除去EDTA；g、加入0.1M Ni2SO4，使得镍离子重新挂柱，所有填料均变蓝后，用ddH2O彻底清洗以除去残余的Ni2SO4；

[0093] h、加入大约5个柱体积的8M尿素，25mM Tris-HCl，0.3M NaCl(pH8.0)，平衡镍柱。

[0094] (3)重组蛋白的纯化

[0095] a、将预处理的蛋白样品穿过镍柱，使得重组蛋白挂柱，收集穿透液；

[0096] b、用浓度梯度的咪唑将重组蛋白洗脱，收集个洗脱液组分；

[0097] c、利用15％的SDS-PAGE胶对纯化过程中产生的各组分进行电泳检测；d、电泳完成后取下胶，考马斯亮蓝染液染色30分钟；

[0098] e、用水对胶进行清洗，除去考马斯亮蓝染液后，加入洗脱液，完全脱色后拍照。

[0099] 4、抗体制备

[0100] (1)Integrinβ2抗体用大鼠制备，整个制备过程均于广州兹尼生物科技有限公司完成。而Integrinβ3抗体制备以昆明鼠为材料制备抗体，共免疫五次：第一次取50μg纯化蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合并均质化后进行皮下注射，第二、三和四次分别取75、100和125μg纯化蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合并均质化后进行皮下注射，每次注射间隔时间为10天。第五次取150μg纯化蛋白直接进行皮下注射，3天后收集小鼠血液；

[0101] (2)将小鼠血液室温静置2小时，于3000rpm室温离心15分钟，小心吸取上层液体至新的离心管中，然后在室温分别用6000、9000和12000rpm对上一回合吸取的上层液体进行离心，最终获得抗血清；

[0102] (3)向抗血清中加入等体积的灭菌甘油，混合均匀后小包装分装，保存于-80℃。

[0103] 5、蚕体造血器官摘除

[0104] (1)用75％的酒精棉轻轻擦拭五龄幼虫体表，放置于干净的玻璃皿中，待酒精完全挥发。用一次性注射器针头依次轻轻挑破两对翅原基所在位置的皮肤，迅速用镊子取出翅原基-造血器官复合体。对照组用针头挑破稍微偏离翅原基所在位置，不取出翅原基；

[0105] (2)待蚕恢复一定的活力后，用干净桑叶饲养。准备取材的前9个小时，称取幼虫体重，按照5μg/g的量注射EDU。取材时，用针头刺破幼虫足部，将血淋巴收集于提前加入400μL PBS和10μL苯基硫脲的1.5mL离心管中，迅速混合均匀，取200μL混合液滴入提前置入细胞爬片的24孔板，剩余血淋巴经3000rpm低温离心5分钟，弃上清，取1mL RNAiso重悬血细胞后保存于-80℃，用于RNA的提取；

[0106] (3)血细胞室温贴壁15分钟，1×PBS快速洗涤3次后迅速加入1mL4％的多聚甲醛溶液固定15分钟，1×PBS洗涤3×5分钟以弃除残留的多聚甲醛；

[0107] (4)按照Invitrogen公司提供的 EdUImagingKits试剂盒说明书，进行EDU的标记染色，完成后用10％的山羊血清于37℃封闭处理2-3小时；

[0108] (5)用4％的山羊血清配制一抗，4℃孵育16-25小时，室温放置30分钟待温度恢复至室温时回收抗体，1×PBS洗涤3×10分钟；

[0109] (6)用4％的山羊血清配制荧光二抗，室温孵育1-2小时，1×PBS洗涤3×10分钟；

[0110] (7)DAPI染色40分钟，1×PBS洗涤3×10分钟，用镊子取出玻片，倒扣至滴有抗荧光淬灭剂的载玻片上，用无色指甲油封住，避光水平放置于4℃冰箱，次日取出观察。

[0111] 6、造血器官体外培养

[0112] (1)在超菌工作台中按照上述方法收集翅原基-造血器官复合体，用含少许苯基硫脲的无菌PBS快速洗涤3次，然后用含少许苯基硫脲Grace培养基洗涤洗涤2次；

[0113] (2)用镊子轻轻将造血器官夹入24孔板中，每孔6-8个，静置几分钟待造血器官贴壁后加入含10％胎牛血清和适量基硫脲的Grace培养基1mL，轻轻将培养板转移至恒温培养箱，27℃培养；

[0114] (3)培养1.5天后，轻轻夹出造血器官，用PBS快速洗涤2次后，用4％多聚甲醛固定15分钟，后续免疫荧光步骤同上。

[0115] 步骤6：结果与分析

[0116] 1、基因结构分析

[0117] 在前期研究中，对家蚕Integrin家族进行了系统的鉴定与克隆，发现6个α亚基成员和5个β成员。芯片和定量表达分析结果显示，Integrinβ2和Integrinβ3特异高表达于家蚕的浆细胞。，其中包括Integrinβ2和Integrinβ3。Integrinβ2定位于4号染色体nscaf2847，基因全长为6311bp，由8个外显子和7个内含子构成。其基因cDNA全长2434bp，5’和3’UTR分别为118bp和72bp，其CDS为2244bp，编码747AA的蛋白，预测蛋白质分子量为84.42kDa，等电点为5.349。Integrinβ3定位于4号染色体nscaf2847，基因全长为10086bp，由7个外显子和6个内含子构成。Integrinβ2基因cDNA全长2653bp，5’和3’UTR分别为122bp和410bp，其CDS为2172bp，编码723AA的蛋白，预测蛋白质分子量为81.79kDa，等电点为
5.22。

[0118] 2：蛋白同源序列比对

[0119] 对不同物种的Integrinβ蛋白进行多重序列比对，结果表明不同物种的蛋白具有高度保守的结构特征，均由一段较长的胞外域、一个单次跨膜结构域和一个较短的胞内域构成。家蚕Integrinβ2和β3与烟草天蛾(Manducasexta)和草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)的Integrinβ1蛋白相比都具有相似的功能结构域，如N端信号肽序列、I-like结构、MIDAS金属离子结合聚序、EGF结构域、NPxY模式和四个半胱氨酸重复序列。

[0120] 3：表达分析

[0121] 利用定量PCR对前期结果进行验证，检测了Integrinβ2和Integrinβ3在家蚕五龄三天表皮、头部、精巢、卵巢、中肠、马氏管、丝腺、脂肪体、血细胞以及翅原基和造血器官复合体中的的表达情况，结果显示，这两个基因均高表达于血细胞，在翅原基和造血器官复合体有一定的表达，而在其他组织中的表达水平都很低。利用手术方法将造血器官剥离翅原基，分别检测这两个基因在这两个组织中的表达，发现均高表达于造血器官，而非翅原基。同时也检测了其在各时期血液中的表达，结果显示，Integrinβ2和Integrinβ3表现出高度相似的表达趋势，在四龄眠期表达水平最低，从五龄开始表达水平逐渐上调，至五龄六天达到峰值，变态发育时期有所下调。

[0122] 4：原核表达与蛋白纯化

[0123] 为了进一步检测Integrinβ2和Integrinβ3基因的表达情况，探索能否作为血细胞特异性分子标记，对Integrinβ2和Integrinβ3基因分别进行了原核表达、蛋白纯化以及抗体制备工作。Integrinβ2和Integrinβ3基因片段经PCR扩增后，分别连接至PET32和PET28a质粒，获得PET32-Integrinβ2和PET28a-Integrinβ3重组质粒。转化至Rosseta感受体后，用终浓度为1mM的IPTG分别在37℃，25℃和16℃温度条件下诱导表达，发现均能诱导重组蛋白的表达，但37℃诱导产生的蛋白最多，所以在大规模诱导是采用37℃进行处理。

[0124] 经过Ni+亲和层析方法对包涵体进行纯化，得到纯度较高的重组蛋白。将Integrinβ2和Integrinβ3重组蛋白分别免疫大鼠和小鼠，制备了相应的多克隆抗体。利用westernblot方法检测这两个抗体，发现都能识别外源重组蛋白和家蚕血细胞内源性蛋白。提取头部、脂肪体、中肠、丝腺、马氏管、表皮、以及血细胞蛋白，检测Integrinβ2和Integrinβ3的表达，发现这两种蛋白均特异表达于血细胞，与前期定量结果一致。

[0125] 5：Integrinβ2和Integrinβ3特异性地标记家蚕循环血细胞中的浆细胞[0126] 为了进一步检测Integrinβ2和Integrinβ3是否能特异性标记循环血细胞中的浆细胞情况，用获得的抗体进行免疫荧光检测。首先，对anti-Integrinβ2大鼠抗体进行实验，在免疫前血清组中，未观测到荧光信号；而在抗体组中，在部分细胞可以观察到明显的荧光信号，并且位于细胞膜上通过形态学鉴定，发现被标记的这一类血细胞均为浆细胞。浆细胞一个最大的特征就是延展反应，因此为了进一步对观察结果进行验证，将血细胞在体外培养1小时，让浆细胞发生延展后再进行免疫荧光检测，结果显示，所有的延展型浆细胞均能够被anti-Integrinβ2大鼠抗体标记上，此外还有部分未成熟的浆细胞也可以被标记，证明Integrinβ2可以特异性地标记家蚕的成熟浆细胞。在EGFP绿色荧光蛋白特性性表达于浆细胞和拟绛色细胞的A3-EGFP品系转基因蚕中，经过免疫荧光分析，发现绝大部分红色荧光信号(Integrinβ2)和绿色荧光信号发生重叠，这在转基因家蚕个体水平上进一步证明了Integrinβ2能特异性地标记家蚕循环血细胞中的浆细胞，。

[0127] 利用相同的免疫荧光检测方法，发现anti-Integrinβ3小鼠抗体也可以特异性标记浆细胞。将细胞胞进行体外培养，在培养15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、12小时和24小时后，分别收集血细胞进行免疫荧光检测，结果显示，大部分被anti-Integrinβ3小鼠抗体标记上的血细胞在未经培养时，呈现圆球型，而随着培养时间的延长，大部分被标记血细胞延展程度越来越大，最后发育成浆细胞，这说明Integrinβ3可以同时特异性地标记家蚕循环血细胞中的未成熟和成熟的浆细胞。

[0128] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。