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用于制造发酵产物的方法
申请号 CN201710458195.8 申请日 2012-11-30 公开(公告)号 CN107267558A 公开(公告)日 2017-10-20
申请人 诺维信公司; 诺维信北美公司; 发明人 R·戴因哈默; J·克雷格; 松井知子; 高木忍; S·克拉克; J·马修斯; A·G·尤尔曼德; C-L·宋;
摘要 本 发明 涉及由含有 淀粉 的材料制造 发酵 产物的方法，其中在 液化 过程中存在和/或加入α-淀粉酶、热 稳定性 蛋白酶和任选的产生 碳 水 化合物源的酶和/或支链淀粉酶。本发明还涉及适合用于本发明的方法的组合物。
权利要求

1.一种由含有淀粉的材料制造发酵产物的方法，其包括以下步骤：
i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使所述含有淀粉的材料液化：
-与SEQ ID NO:1有至少80％的序列同一性的α-淀粉酶；
-与SEQ ID NO:13具有至少80％的同一性并且在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和
ii)使用产生碳水化合物源的酶进行糖化；
iii)使用发酵有机体进行发酵。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述α-淀粉酶为本文SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性大于25％。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶源自强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)菌株。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在和/或加入在
85℃、pH 5.3的条件下热稳定性为至少20％的葡糖淀粉酶。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中在液化和/或糖化过程中存在有支链淀粉酶。
8.一种酶组合物，其包括：
i)与SEQ ID NO:1有至少80％的序列同一性的α-淀粉酶；
ii)与SEQ ID NO:13具有至少80％的同一性并且在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述α-淀粉酶为本文SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶。
10.根据权利要求8或9所述的组合物，其中所述α-淀粉酶在pH4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的组合物，其中所述蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性大于25％。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的组合物，其中所述蛋白酶源自强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)菌株。
13.根据权利要求8-12中任一项所述的组合物，其还包括葡糖淀粉酶。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述葡糖淀粉酶在85℃、pH 5.3的条件下热稳定性为至少20％。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的组合物，其还包括支链淀粉酶。
说明书全文

用于制造发酵产物的方法

发明领域

[0001] 本发明涉及由含有淀粉的材料制造发酵产物的方法。本发明还涉及适合用于本发明的方法的组合物。
[0002] 序列表的参照
[0003] 本申请含有计算机可读形式的序列表。在此将计算机可读表格并入作为参考。

背景技术

[0004] 由含有淀粉的材料制造发酵产物例如乙醇是本领域公知的。当今工业上使用两种不同的方法。最常用的方法常称作“传统法”，包括在高温下通常使用细菌α-淀粉酶使凝胶化的淀粉液化，然后在葡糖淀粉酶和发酵有机体的存在下同时进行糖化和发酵。另一种公知的方法常称作“原淀粉水解”法(RSH法)，包括在初始凝胶化温度以下通常在至少一种葡糖淀粉酶的存在下使颗粒淀粉同时糖化和发酵。
[0005] 尽管过去十年以来发酵产物制造方法取得显著进步，但仍有大量的残余淀粉材料未转化成所需的发酵产物，例如乙醇。至少有一些未转化的残余淀粉材料，例如糖和糊精，处于不可发酵的美拉德(Maillard)产物的形式。
[0006] 因此，对于与传统方法相比较提供更高的发酵产物产率或其他优势的由含有淀粉的材料制造发酵产物例如乙醇的方法，仍存在有要求和需要。

发明内容

[0007] 本发明涉及使用发酵有机体由含有淀粉的材料制造发酵产物例如乙醇的方法。
[0008] 在第一方面，本发明涉及由含有淀粉的材料制造发酵产物例如乙醇的方法，其包括以下步骤：
[0009] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[0010] -α-淀粉酶；
[0011] -在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和
[0012] -任选的产生碳水化合物源的酶；
[0013] ii)使用产生碳水化合物源的酶进行糖化；
[0014] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[0015] 在优选的实施方式中，液化在80-90℃，例如大约85℃的温度下进行。在优选的实施方式中，液化在pH 5.0-6.0的pH范围下进行。
[0016] 在第二方面，本发明涉及一种酶组合物，其包括：
[0017] i)α-淀粉酶；
[0018] ii)在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和
[0019] iii)任选的产生碳水化合物源的酶。
[0020] 任选的产生碳水化合物源的酶可以是热稳定性葡糖淀粉酶和/或支链淀粉酶。在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶，具体地为葡糖淀粉酶，是草酸青霉(Penicillium oxalicum)葡糖淀粉酶。附图说明
[0021] 图1显示了分别在pH 5.4和5.8下在85℃下在液化2小时的过程中加入和不加入蛋白酶Pfu和/或葡糖淀粉酶PE001的α-淀粉酶1407的54小时乙醇发酵产率(％)的比较。

具体实施方式

[0022] 本发明涉及使用发酵有机体由含有淀粉的材料制造发酵产物例如乙醇的方法。
[0023] 发明人已经发现，当在85℃下、在pH 5.4或5.8下，用具有双缺失(I181*+G182*)和取代N193F的SEQ  ID  NO:1所公开的成熟嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)α-淀粉酶以及强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)蛋白酶(pfu S)或野生型橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)的热稳定性变体使含有淀粉的材料液化2小时时，得到的乙醇产率增加。
[0024] 在第一方面，本发明涉及用于制造发酵产物，优选地乙醇的方法，其包括以下步骤：
[0025] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[0026] -α-淀粉酶；
[0027] -在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和任选地
[0028] -产生碳水化合物源的酶；
[0029] ii)使用产生碳水化合物源的酶进行糖化；
[0030] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[0031] 步骤ii)和iii)顺序进行或同时进行。在一优选的实施方式中，步骤ii)和iii)同时进行。α-淀粉酶、热稳定性蛋白酶和任选的产生碳水化合物源的酶(优选为葡糖淀粉酶)、和/或任选的支链淀粉酶可以在液化步骤i)之前和/或该步骤过程中加入。本发明的组合物可以适用于本发明的方法中。但是，酶也可以分别加入。α-淀粉酶的例子可以见于下文“液化过程中存在和/或加入的α-淀粉酶”部分中。热稳定性蛋白酶的例子可以见于下文“液化过程中存在和/或加入的蛋白酶”部分中。合适的任选的产生碳水化合物源的酶，优选热稳定性的产生碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶的例子可见于下文“液化过程中存在和/或加入的产生碳水化合物源的酶”部分中。合适的任选的支链淀粉酶可见于下文“液化过程中存在和/或加入的支链淀粉酶”部分中。
[0032] 液化过程中的pH大于5.0，例如5.0-6.5，例如5.2-6.2，例如5.0-6.0，例如大约5.2，例如大约5.4，例如大约5.6，例如大约5.8。在一实施方式中，pH为5.0-5.5。
[0033] 根据本发明，温度高于初始凝胶化温度。术语“初始凝胶化温度”是指通常通过加热淀粉开始溶解的最低温度。对于不同的淀粉，温度可以变化。
[0034] 在一实施方式中，液化步骤i)中的温度范围在70-100℃，例如75-95℃，例如75-90℃，优选80-90℃，例如大约85℃。
[0035] 在一实施方式中，本发明的方法在步骤i)之前还包括以下步骤：
[0036] a)优选地通过干磨降低含有淀粉的材料的粒径；
[0037] b)形成包括含有淀粉的材料和水的浆料。
[0038] 可以例如通过研磨，降低含有淀粉的起始原料，例如全谷物的粒径，以打开结构，增加表面积，使得可以进行进一步加工。通常有两种类型的工艺：干磨和湿磨。在干磨中，将全谷粒研磨并使用。湿磨对胚芽和粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)提供较好的分离。湿磨常常在其中使用淀粉水解物制造例如糖浆的位置处应用。干磨和湿磨在淀粉加工领域均是公知的。根据本发明，优选干磨。在一实施方式中，粒径降低至0.05-3.0mm，优选0.1-0.5mm，或者使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、再更优选至少90％的含有淀粉的材料通过具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛子。在另一实施方式中，至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、特别是至少90％的含有淀粉的材料通过具有#6筛网的筛子。
[0039] 含水浆料可以包含含有淀粉的材料中的10-55w/w-％干固体(DS)，优选25-45w/w-％干固体(DS)，更优选30-40w/w-％干固体(DS)。
[0040] 浆料可以加热至初始凝胶化温度以上，优选加热至80-90℃，pH5.0-7.0，优选5.0-6.0，加热30分钟至5小时，例如，大约2小时。
[0041] 可以在最初将α-淀粉酶、热稳定性蛋白酶和任选的产生碳水化合物源的酶(特别是热稳定性葡糖淀粉酶)和/或任选的支链淀粉酶加入到含水浆料中，以开始液化(变稀)。在一实施方式中，仅将一部分酶加入到含水浆料中，而其余的酶在液化步骤i)过程中加入。
[0042] 液化步骤i)根据本发明进行0.5-5小时，例如1-3小时，例如通常大约2小时。
[0043] 在一实施方式中，在进行步骤i)中的液化之前，可以将含水浆料喷射烹煮(jet-cook)，以使浆料进一步凝胶化。喷射烹煮可以在110-145℃，优选120-140℃，例如125-135℃，优选大约130℃的温度下进行大约1-15分钟，优选大约3-10分钟，特别是大约5分钟。
[0044] 糖化和发酵
[0045] 在糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中可以存在和/或加入一种或多种产生碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶。产生碳水化合物源的酶可以优选为葡糖淀粉酶，但也可以是选自β-淀粉酶、麦芽糖淀粉酶和α-葡糖苷酶的酶。糖化步骤ii)和/或发酵步骤iii)过程中加入的产生碳水化合物源的酶通常不同于任选地在液化步骤i)过程中加入的任选的产生碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶。在一实施方式中，将产生碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶与真菌α-淀粉酶一起加入。
[0046] 产生碳水化合物源的酶，包括葡糖淀粉酶的例子可见于下文“糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的产生碳水化合物源的酶”部分中。
[0047] 当进行顺序的糖化和发酵时，糖化步骤ii)可以在本领域公知的条件下进行。例如，糖化步骤ii)可以持续大约24至大约72小时。在一实施方式中，进行预糖化。预糖化通常在30-65℃，通常为大约60℃的温度下进行40-90分钟。预糖化之后，在同时糖化和发酵(“SSF”)中在发酵过程中进行糖化。糖化通常在20-75℃、优选40-70℃、通常大约60℃的温度下在4-5的pH下、通常在大约pH 4.5下进行。
[0048] 同时糖化和发酵(“SSF”)在工业规模的发酵产物制造方法特别是乙醇制造方法中得以广泛应用。当进行SSF时，糖化步骤ii)和发酵步骤iii)同时进行。糖化没有保持阶段，意味着发酵有机体例如酵母和酶可以一起加入。但是，也考虑分别地加入发酵有机体和酶。根据本发明SSF通常在25℃-40℃，例如28℃-35℃，例如30℃-34℃，优选大约32℃的温度下进行。在一实施方式中，发酵持续进行6-120小时，特别是24-96小时。在一实施方式中，pH为
3.5-5，特别是3.8-4.3。
[0049] 发酵介质
[0050] “发酵介质”是指进行发酵的环境。发酵介质包括发酵底物，即通过发酵有机体代谢的碳水化合物来源。根据本发明，发酵介质可以包括用于发酵有机体的营养物和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域广泛应用，其包括氮源，例如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。
[0051] 发酵有机体
[0052] 术语“发酵有机体”是指任何适合用于发酵过程并能够产生所需发酵产物的有机体，包括细菌和真菌有机体，特别是酵母。特别合适的发酵有机体能够使糖，例如葡萄糖或麦芽糖直接地或间接地发酵，即转化成所需的发酵产物，例如乙醇。发酵有机体的例子包括真菌有机体，例如酵母。优选的酵母包括酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)。
[0053] 发酵过程例如SSF中活的发酵有机体的适当浓度是本领域公知的，或者可以由本领域技术人员很容易地确定。在一实施方式中，将发酵有机体，例如乙醇发酵酵母(例如酿酒酵母)加入到发酵介质中，使得活的发酵有机体例如酵母相对于每mL发酵介质计数范围为105至1012，优选107至1010，特别是大约5x107。
[0054] 市售酵母的例子包括，例如，RED STARTM和ETHANOL REDTM酵母(获自Fermentis/Lesaffre,USA)、FALI(获自Fleischmann’s Yeast,USA)、SUPERSTART和THERMOSACCTM新鲜酵母(获自Ethanol Technology,WI,USA)、BIOFERM AFT和XR(获自NABC-North American Bioproducts Corporation,GA,USA)、GERT STRAND(获自Gert Strand AB,Sweden)和FERMIOL(获自DSM Specialties)。
[0055] 含有淀粉的材料
[0056] 根据本发明可以使用任何适当的含有淀粉的材料。起始原料通常基于所需的发酵产物来选择。适用于本发明方法的含有淀粉的材料的例子包括全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍(milo)、西米、木薯(cassava)、木薯粉(tapioca)、高粱(sorghum)、大米、豌豆、豆子或甜马铃薯，或其混合物或自其得到的淀粉，或谷类。另外考虑了蜡状和非蜡状的玉米和大麦。在优选的实施方式中，根据本发明用于制造乙醇的含有淀粉的材料是玉米或小麦。
[0057] 发酵产物
[0058] 术语“发酵产物”是指通过包括使用发酵有机体的发酵步骤的方法制造的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇(例如，乙醇、甲醇、丁醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇和肌醇)；有机酸(例如，柠檬素、乙酸、衣康酸、乳酸、琥珀酸、葡糖酸)；酮(例如，丙酮)；氨基酸(例如，谷氨酸)；气体(例如，H2和CO2)；抗生素(例如，青霉素和四环素)；酶；维生素(例如，核黄素、B12、β-胡萝卜素)；和激素。在优选的实施方式中，发酵产物是乙醇，例如燃料乙醇；饮用乙醇，即可饮用中性酒精(neutral spirits)；或可消费酒精工业(例如，啤酒和葡萄酒)、乳制品工业(例如，发酵乳制品产品)、皮革工业和烟草工业中使用的工业乙醇或产品。优选的啤酒类型包括爱尔啤酒(ale)、司陶特啤酒(stouts)、波特啤酒(porters)、拉格啤酒(lagers)、苦啤酒(bitters)、麦芽酒(malt liquors)、happoushu、高醇啤酒、低醇啤酒、低卡路里啤酒或淡啤酒。优选地，本发明的方法用于制造醇，例如乙醇。根据本发明得到的发酵产物例如乙醇可以用作燃料，其通常与汽油混合。但是，在乙醇的情况下，其也可以用作可饮用乙醇。
[0059] 回收
[0060] 在发酵或SSF之后，可以将发酵产物从发酵介质中分离。可以将浆料蒸馏，以提取所需的发酵产物(例如，乙醇)。或者，可以通过微过滤或膜过滤技术从发酵介质中提取所需的发酵产物。发酵产物也可以通过汽提或本领域公知的其他方法回收。
[0061] 液化过程中存在和/或加入的α-淀粉酶
[0062] 根据本发明，在液化过程中与热稳定性蛋白酶和任选的产生碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶和/或任选的支链淀粉酶一起存在和/或加入α-淀粉酶。
[0063] 液化步骤i)中加入的α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶。优选细菌α-淀粉酶，其通常在液化过程中使用的温度下是稳定的。
[0064] 细菌α-淀粉酶
[0065] 术语“细菌α-淀粉酶”是指分类在EC 3.2.1.1下的任何细菌α-淀粉酶。根据本发明使用的细菌α-淀粉酶可以，例如，源自芽孢杆菌(Bacillus)属，其有时也称作地芽孢杆菌(Geobacillus)属。在一实施方式中，芽孢杆菌α-淀粉酶源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的菌株，但也可以源自其他的芽孢杆菌属。
[0066] 细菌α-淀粉酶的具体例子包括WO 99/19467中SEQ ID NO:3的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，WO 99/19467中SEQ ID NO:5的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，以及WO 99/19467中SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(在此将所有序列并入作为参考)。在一实施方式中，α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中SEQ ID NOS:3、4或5分别所示的序列中任意者具有至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少
99％同一性程度的酶。
[0067] 在一实施方式中，α-淀粉酶可以是与WO 99/19467中SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1所示的任一序列具有至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一性程度的酶。
[0068] 在优选的实施方式中，α-淀粉酶源自嗜热脂肪芽孢杆菌。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是成熟的野生型或者其成熟变体。成熟的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体可以是重组产生的过程中天然截短的。例如，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶可以是截短的，使得其具有大约491个氨基酸(与WO 99/19467中SEQ ID NO:3相比较)，例如480-495个氨基酸。
[0069] 芽孢杆菌α-淀粉酶也可以是变体和/或杂交体。这种变体的例子可以见于任一以下文献中：WO 96/23873、WO 96/23874、WO 97/41213、WO 99/19467、WO 00/60059和WO 02/10355(在此将所有文件并入作为参考)。具体的α-淀粉酶变体公开于美国专利第6,093,
562、6,187,576、6,297,038和7,713,723号(在此并入作为参考)，其包括具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(常称作BSGα-淀粉酶)变体：在R179、G180、I181和/或G182位具有一个或两个氨基酸缺失，优选WO 96/23873–例如，参见第20页第1-10行(在此并入作为参考)中公开的双缺失，优选与WO 99/19467中所公开的SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶氨基酸序列相比较相应于I181和G182位的缺失，或者氨基酸R179和G180的缺失，编号使用WO 99/19467(在此将其并入作为参考)中SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1。再更优选芽孢杆菌α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶，其与WO 
99/19467中所公开的SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所示的野生型BSGα-淀粉酶氨基酸序列相比较，具有与181和182位的缺失相应的双缺失，并进一步包括N193F取代(也称作I181*+G182*+N193F)。细菌α-淀粉酶还可以在与WO 99/19467中SEQ ID NO:4所示的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶或WO 99/19467中SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242变体中的S239相应的位置中具有取代。
[0070] 在一实施方式中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的S242A、E或Q变体，优选S242Q变体(编号使用本文SEQ ID NO:1)。
[0071] 在一实施方式中，变体是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的位置E188变体，优选E188P变体(编号使用本文SEQ ID NO:1)。
[0072] 在一实施方式中，细菌α-淀粉酶可以是截短的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。特别是，截短使得WO 99/19467中SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1中所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的长度为大约491个氨基酸，例如，长度为480-495个氨基酸。
[0073] 细菌杂交α-淀粉酶
[0074] 细菌α-淀粉酶还可以是杂交的细菌α-淀粉酶，例如，包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的445个C-端氨基酸残基(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:4中)和源自解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的37个N-端氨基酸残基(示于WO 99/19467的SEQ ID NO:5中)的α-淀粉酶。在优选的实施方式中，该杂交体具有一个或多个，特别是全部的以下取代：G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S(使用WO 99/19467中SEQ ID NO:4的地衣芽孢杆菌编号)。另外，优选具有一个或多个以下突变(或其他芽孢杆菌α-淀粉酶中的相应突变)的变体：H154Y、A181T、N190F、A209V和Q264S；和/或176位与179位之间的两个残基的缺失，优选E178和G179缺失(位置编号使用WO 99/19467的SEQ ID NO:5)。
[0075] 在一实施方式中，细菌α-淀粉酶是Richardson等人,2002,The Journal of Biological Chemistry 277(29):.267501-26507中公开的嵌合α-淀粉酶的成熟部分，称作BD5088或其变体。该α-淀粉酶与WO 2007134207中SEQ ID NO:2所示者相同。成熟的酶序列在1位的起始“Met”氨基酸之后开始。
[0076] 热稳定性α-淀粉酶
[0077] 根据本发明，α-淀粉酶可以是热稳定性α-淀粉酶，例如，热稳定性细菌α-淀粉酶，优选来自嗜热脂肪芽孢杆菌。在一实施方式中，根据本发明使用的α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10。
[0078] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少15。
[0079] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少20。
[0080] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少25。
[0081] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少30。
[0082] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少40。
[0083] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少50。
[0084] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少60。
[0085] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为10-70。
[0086] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为15-70。
[0087] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为20-70。
[0088] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为25-70。
[0089] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为30-70。
[0090] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为40-70。
[0091] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为50-70。
[0092] 在一实施方式中，热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为60-70。
[0093] 在本发明一实施方式中，α-淀粉酶是细菌α-淀粉酶，优选源自芽孢杆菌属的细菌α-淀粉酶，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的细菌α-淀粉酶，具体地WO 99/19467中公开的的嗜热脂肪芽孢杆菌的作为SEQ ID NO:3(本文的SEQ ID NO:1)的细菌α-淀粉酶，其在R179、G180、I181和/或G182位缺失一个或两个氨基酸，具体地，缺失R179和G180，或者缺失I181和G182，具有以下列表的突变。
[0094] 在优选的实施方式中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有双缺失I181+G182，和任选的取代N193F，进一步包括选自以下列表的突变：
[0095]
[0096]
[0097] 在优选的实施方式中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：
[0098] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
[0099] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[0100] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
[0101] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用本文的SEQ ID NO:1)。
[0102] 应当理解到，当提到嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶及其变体时，其通常以截短的形式产生。具体地，截短可以使得WO 99/19467中SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所示的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体在C-端截短且通常长度为大约491个氨基酸，例如，长度为480-495个氨基酸。
[0103] 在优选的实施方式中，α-淀粉酶变体可以是与WO 99/19467中SEQ ID NO:3或本文的SEQ ID NO:1所示的序列具有至少60％，例如至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％，但小于100％的同一性程度的酶。
[0104] 液化过程中存在和/或加入的蛋白酶
[0105] 根据本发明，在液化过程中与α-淀粉酶，例如热稳定性α-淀粉酶，和任选的产生碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶和/或任选的支链淀粉酶一起存在和/或加入热稳定性蛋白酶。
[0106] 蛋白酶基于其催化机理分类成以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)和未知的或尚未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook of Proteolytic Enzymes,A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(eds),Academic Press(1998)，特别是概述部分。
[0107] 在优选的实施方式中，根据本发明使用的热稳定性蛋白酶是定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)，优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)的“金属蛋白酶”。
[0108] 为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参考上述的“Handbook  of Proteolytic Enzymes”和其中所述的原则。这种确定可以对于所有类型的蛋白酶进行，上述蛋白酶是天然出现的或野生型蛋白酶，或基因工程化或合成的蛋白酶。
[0109] 蛋白酶活性可以使用任何适当的检定测量，其中采用底物，其包括与所考察蛋白酶的特异性相关联的肽键。检定pH和检定温度同样地调节成适合于所考察的蛋白酶。检定pH值的例子为pH 6、7、8、9、10或11。检定温度的例子为30、35、37、40、45、50、55、60、65、70或80℃。
[0110] 蛋白酶底物的例子为酪蛋白，例如Azurine-交联的酪蛋白(AZCL-酪蛋白)。下文“材料和方法”部分中描述了两种蛋白酶检定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白检定”是优选的检定。
[0111] 在一实施方式中，通过“材料和方法”部分所述的AZCL-酪蛋白检定测定，热稳定性蛋白酶具有蛋白酶196变体或蛋白酶Pfu的蛋白酶活性的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％。
[0112] 本发明的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足以下定义的热稳定性特性即可。
[0113] 在一实施方式中，蛋白酶是真菌来源的。
[0114] 蛋白酶可以是，例如，野生型蛋白酶的变体，只要蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性即可。在优选的实施方式中，热稳定性蛋白酶是上文定义的金属蛋白酶的变体。在一实施方式中，本发明的方法中使用的热稳定性蛋白酶是真菌来源的，例如，真菌金属蛋白酶，例如，源自以下的真菌金属蛋白酶：嗜热子囊菌(Thermoascus)属菌株，优选橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，特别是橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670(分类为EC 3.4.24.39)。
[0115] 在一实施方式中，热稳定性蛋白酶是以下的变体：WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2所示的金属蛋白酶的成熟部分，或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1且示作本文SEQ ID NO:3的成熟部分，其进一步具有选自以下列表的突变：
[0116] -S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0117] -D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
[0118] -S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0119] -N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0120] -T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
[0121] -D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
[0122] -A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
[0123] -D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
[0124] -D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
[0125] -D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
[0126] -D79L+S87P+A112P+D142L；
[0127] -D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
[0128] -S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
[0129] -D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
[0130] -A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
[0131] -D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
[0132] -D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
[0133] -S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0134] -A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0135] -S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0136] -S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0137] -D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
[0138] -D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
[0139] -S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
[0140] -D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
[0141] -S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
[0142] -D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
[0143] -D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
[0144] -Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
[0145] -Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0146] -A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0147] -A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0148] -A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0149] -A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0150] -A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0151] -D79L+S87P+D142L。
[0152] 在优选的实施方式中，热稳定性蛋白酶是公开为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2的成熟部分，或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分，其具有以下突变：
[0153] D79L+S87P+A112P+D142L；
[0154] D79L+S87P+D142L；或
[0155] A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
[0156] 在一实施方式中，蛋白酶变体与WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，再更优选至少93％，最优选至少94％，再最优选至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的同一性。
[0157] 热稳定性蛋白酶也可以源自任何细菌，只要蛋白酶具有根据本发明定义的热稳定性特性即可。
[0158] 在一实施方式中，热稳定性蛋白酶源自炽热球菌属(Pyrococcus)细菌的菌株，例如，强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)菌株(pfu蛋白酶)。
[0159] 在一实施方式中，蛋白酶是美国专利第6,358,726-B1号(Takara Shuzo Company)中的SEQ ID NO:1和本文的SEQ ID NO:13所示者。
[0160] 在另一实施方式中，热稳定性蛋白酶是本文的SEQ ID NO:13所公开者，或者与美国专利第6,358,726-B1号中SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13具有至少80％同一性，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的蛋白酶。强烈炽热球菌蛋白酶可以购自Takara Bio,Japan。
[0161] 强烈炽热球菌蛋白酶是根据本发明的热稳定性蛋白酶。经发现，强烈炽热球菌蛋白酶的市售产品(Pfu S)在pH 4.5下如本文实施例2中所述测得的热稳定性为110％(80℃/70℃)和103％(90℃/70℃)。
[0162] 在一实施方式中，本发明的方法中使用的热稳定性蛋白酶在80℃/70℃下如实施例2中所述测定为相对活性的热稳定性值大于20％。
[0163] 在一实施方式中，蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，例如大于105％，例如大于110％，例如大于115％，例如大于120％。
[0164] 在一实施方式中，蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为20-50％，例如20-40％，例如20％和30％。
[0165] 在一实施方式中，蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为50-115％，例如50-70％，例如50-60％，例如100-120％，例如105-115％。
[0166] 在一实施方式中，蛋白酶在85℃/70℃下如实施例2中所述测定为相对活性的热稳定性值大于10％。
[0167] 在一实施方式中，蛋白酶在85℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性大于10％，例如，大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于110％。
[0168] 在一实施方式中，蛋白酶在85℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为10-50％，例如10-30％，例如10-25％。
[0169] 在一实施方式中，蛋白酶在80℃下测定为残余活性大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％；且/或
[0170] 在一实施方式中，蛋白酶在84℃下测定为残余活性大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％。
[0171] “相对活性”和“残余活性”的测定如实施例2中所述进行。
[0172] 在一实施方式中，蛋白酶在85℃下使用实施例3中所公开的Zein-BCA检定测定的热稳定性大于90，例如大于100。
[0173] 在一实施方式中，蛋白酶在85℃下使用Zein-BCA检定测定的热稳定性大于60％，例如大于90％，例如大于100％，例如大于110％。
[0174] 在一实施方式中，蛋白酶在85℃下使用Zein-BCA检定测定的热稳定性为60-120％，例如70-120％，例如80-120％，例如90-120％，例如100-120％，例如110-120％。
[0175] 在一实施方式中，热稳定性蛋白酶具有JTP196蛋白酶变体或蛋白酶Pfu的活性的至少20％，例如至少30％，例如至少40％，例如至少50％，例如至少60％，例如至少70％，例如至少80％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少100％，其通过AZCL-酪蛋白检定测定。
[0176] 液化过程中存在和/或加入的产生碳水化合物源的酶
[0177] 根据本发明，在液化过程中可以与α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶一起存在和/或加入产生碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶。如上所述，液化步骤i)过程中还可以存在和/或加入支链淀粉酶。
[0178] 术语“产生碳水化合物源的酶”包括任何产生可发酵糖的酶。产生碳水化合物源的酶能够通过所讨论的发酵有机体产生可用作能量来源的碳水化合物，例如，当用于本发明的方法时用于产生发酵产物，例如乙醇。所产生的碳水化合物可以直接或间接地转化为所需的发酵产物，优选乙醇。根据本发明，可以使用产生碳水化合物源的酶的混合物。具体例子包括葡糖淀粉酶(葡萄糖生成者)、β-淀粉酶和麦芽糖淀粉酶(麦芽糖生成者)。
[0179] 在优选的实施方式中，产生碳水化合物源的酶是热稳定性的。可以将产生碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶与α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶一起或者分别加入。
[0180] 在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶在85℃下如实施例4中所述测定的相对活性热稳定性为至少至少20％，至少30％，优选至少35％(热稳定性)。
[0181] 在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶是在最佳pH 5.0的pH下如实施例4中所述测定的相对活性为至少90％，优选至少95％，优选至少97％，例如100％的葡糖淀粉酶(pH最佳)。
[0182] 在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶是在pH 5.0下如实施例4中所述测定的pH稳定性为至少至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶(pH稳定性)。
[0183] 在具体和优选的实施方式中，产生碳水化合物源的酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌来源的，优选来自丝状真菌，例如，来自青霉菌(Penicillium)属菌株，特别是草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，特别是在公开为WO 2011/127802的PCT/CN10/071753(在此将其并入作为参考)中公开为SEQ ID NO:2且示于本文的SEQ ID NOs:9或14的草酸青霉葡糖淀粉酶。
[0184] 在一实施方式中，热稳定性葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NOs:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，再更优选至少93％，最优选至少94％，再最优选至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。
[0185] 在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶，特别是热稳定性葡糖淀粉酶是草酸青霉葡糖淀粉酶。
[0186] 在优选的实施方式中，产生碳水化合物源的酶是具有K79V取代的公开为WO 2011/127802中SEQ ID NO:2且示于本文中SEQ ID NO:9或14的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体(称作PE001)(编号使用SEQ ID NO:14所示的成熟序列)。相对于在共同未决的美国申请第61/
531,189号或PCT/US12/053779(在此将其并入作为参考)中公开的亲本，K79V葡糖淀粉酶变体对于蛋白酶降解的敏感性降低。
[0187] 在一实施方式中，热稳定性葡糖淀粉酶是公开为WO 2011/127802中SEQ ID NO:2且示于本文中SEQ ID NO:9和14的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体。在优选的实施方式中，草酸青霉葡糖淀粉酶是公开为WO 2011/127802中SEQ ID NO:2且示于本文中SEQ ID NO:9和14的葡糖淀粉酶，其在79位具有Val(V)(编号使用SEQ ID NO:14)。
[0188] 考虑的草酸青霉葡糖淀粉酶变体公开于共同未决的PCT申请PCT/EP12/070127(在此将其并入作为参考)中。
[0189] 在一实施方式中，这些变体对于蛋白酶降解的敏感性降低。
[0190] 在一实施方式中，与亲本相比较，变体的热稳定性提高。
[0191] 更具体地，在一实施方式中，葡糖淀粉酶具有与PE001变体相应的K79V取代(编号使用SEQ ID NO:14)，并进一步包括至少一种以下取代或取代的组合：
[0192] T65A；或
[0193] Q327F；或
[0194] E501V；或
[0195] Y504T；或
[0196] Y504*；或
[0197] T65A+Q327F；或
[0198] T65A+E501V；或
[0199] T65A+Y504T；或
[0200] T65A+Y504*；或
[0201] Q327F+E501V；或
[0202] Q327F+Y504T；或
[0203] Q327F+Y504*；或
[0204] E501V+Y504T；或
[0205] E501V+Y504*；或
[0206] T65A+Q327F+E501V；或
[0207] T65A+Q327F+Y504T；或
[0208] T65A+E501V+Y504T；或
[0209] Q327F+E501V+Y504T；或
[0210] T65A+Q327F+Y504*；或
[0211] T65A+E501V+Y504*；或
[0212] Q327F+E501V+Y504*；或
[0213] T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0214] T65A+Q327F+E501V+Y504*；
[0215] E501V+Y504T；或
[0216] T65A+K161S；或
[0217] T65A+Q405T；或
[0218] T65A+Q327W；或
[0219] T65A+Q327F；或
[0220] T65A+Q327Y；或
[0221] P11F+T65A+Q327F；或
[0222] R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或
[0223] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[0224] P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[0225] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[0226] R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或
[0227] P11F+T65A+Q327W；或
[0228] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0229] P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[0230] T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0231] T65A+S105P+Q327W；或
[0232] T65A+S105P+Q327F；或
[0233] T65A+Q327W+S364P；或
[0234] T65A+Q327F+S364P；或
[0235] T65A+S103N+Q327F；或
[0236] P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或
[0237] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或
[0238] P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或
[0239] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或
[0240] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或
[0241] P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或
[0242] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或
[0243] P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或
[0244] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
[0245] P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或
[0246] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或
[0247] P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或
[0248] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或
[0249] P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或
[0250] P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0251] P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0252] P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0253] K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0254] P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0255] P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0256] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或
[0257] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或
[0258] P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
[0259] P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
[0260] P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0261] P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或
[0262] P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或
[0263] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
[0264] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或
[0265] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0266] P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0267] K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0268] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
[0269] P2N+P4S+P11F+T65A+V79A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0270] P2N+P4S+P11F+T65A+V79G+Q327F+E501V+Y504T；或
[0271] P2N+P4S+P11F+T65A+V79I+Q327F+E501V+Y504T；或
[0272] P2N+P4S+P11F+T65A+V79L+Q327F+E501V+Y504T；或
[0273] P2N+P4S+P11F+T65A+V79S+Q327F+E501V+Y504T；或
[0274] P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或
[0275] S255N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0276] P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0277] P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0278] P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0279] P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0280] P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0281] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或
[0282] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或
[0283] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或
[0284] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或
[0285] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或
[0286] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
[0287] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
[0288] 在优选的实施方式中，草酸青霉葡糖淀粉酶变体具有与PE001变体相应的K79V取代(编号使用SEQ ID NO:14)，并进一步包括以下突变之一：
[0289] P11F+T65A+Q327F；或
[0290] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[0291] P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[0292] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[0293] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0294] P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T。
[0295] 产生碳水化合物源的酶具体地可以以如下量加入：0.1-100μgEP/g，例如0.5-50μg EP/g，例如1-25μg EP/g，例如2-12μg EP/g DS。
[0296] 液化过程中存在和/或加入的支链淀粉酶
[0297] 任选地，在液化步骤i)过程中可以与α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶一起存在和/或加入支链淀粉酶。如上所述，液化步骤i)过程中还可以存在和/或加入产生碳水化合物源的酶，优选热稳定性葡糖淀粉酶。
[0298] 在液化步骤i)和/或糖化步骤ii)或同时糖化和发酵的过程中可以存在和/或加入支链淀粉酶。
[0299] 支链淀粉酶(E.C.3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖-水解酶)是脱支酶，其特征在于其能够使例如胶淀粉(amylopectin)和支链淀粉(pullulan)中的α-1,6-糖苷键水解。
[0300] 根据本发明考虑的支链淀粉酶包括美国专利第4,560,651号(在此将其并入作为参考)中公开的来自Bacillus amyloderamificans的支链淀粉酶，WO 01/151620(在此将其并入作为参考)中公开为SEQ ID NO:2的支链淀粉酶，WO 01/151620(在此将其并入作为参考)中公开为SEQ ID NO:4的Bacillus deramificans，和WO 01/151620(在此将其并入作为参考)中公开为SEQ ID NO:6并且还描述于FEMS Mic.Let.(1994)115,97-106中的来自嗜酸普鲁兰芽胞杆菌(Bacillus acidopullulyticus)的支链淀粉酶。
[0301] 根据本发明考虑的其他的支链淀粉酶包括来自乌兹炽热球菌(Pyrococcus woesei)的支链淀粉酶，特别是WO92/02614中公开的乌兹炽热球菌DSM No.3773。
[0302] 在一实施方式中，支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在一实施方式中，支链淀粉酶包括X47结构域，如公开为WO 2011/087836(在此将其并入作为参考)的US 61/289,040中所公开的。更具体地，支链淀粉酶可以源自高温球菌(Thermococcus)属菌株，其包括嗜热高温球菌(Thermococcus litoralis)和热水高温球菌(Thermococcus hydrothermalis)，例如，刚好在X47结构域(即，本文SEQ ID NOS:11和12的氨基酸1-782)之后在X4位处截短的SEQ ID NO:11所示的热水高温球菌支链淀粉酶。支链淀粉酶还可以是嗜热高温球菌和热水高温球菌支链淀粉酶的杂交体，或热水高温球菌/嗜热高温球菌杂交酶，其具有X4位截短，如公开为WO 2011/087836的US 61/289,040(在此将其并入作为参考)中所公开或本文的SEQ ID NO:12所公开。
[0303] 在另一实施方式中，支链淀粉酶是包括WO 2011/076123(Novozymes)中所公开的X46结构域的支链淀粉酶。
[0304] 根据本发明，支链淀粉酶可以以有效量加入，其包括大约0.0001-10mg酶蛋白质/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白质/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白质/克DS。支链淀粉酶活性可以测定为NPUN。用于测定NPUN的检定如下文“材料和方法”部分中所述。
[0305] 合适的市售支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYMETM D2(Novozymes A/S,Denmark)、OPTIMAX L-300(Genencor Int.,USA)和AMANO 8(Amano,Japan)。
[0306] 糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的产生碳水化合物源的酶
[0307] 根据本发明，在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入产生碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶。
[0308] 在优选的实施方式中，产生碳水化合物源的酶是真菌来源的葡糖淀粉酶，优选来自曲霉属(Aspergillus)菌株，优选黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.oryzae)；或木霉素(Trichoderma)菌株，优选里氏木霉(T.reesei)；或踝节菌属(Talaromyces)菌株，优选埃默森踝节菌(T.emersonii)。
[0309] 葡糖淀粉酶
[0310] 根据本发明，糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶可以源自任何适当的来源，例如，源自微生物或植物。优选的葡糖淀粉酶是真菌或细菌来源的，其选自曲霉属葡糖淀粉酶，特别是黑曲霉G1或G2葡糖淀粉酶(Boel等人,(1984),EMBO J.3(5),p.1097-1102)或其变体，例如WO 92/00381、WO 00/04136和WO 01/04273中所公开者(来自
Novozymes,Denmark)；WO 84/02921中公开的泡盛曲霉葡糖淀粉酶，米曲霉葡糖淀粉酶(Agric.Biol.Chem.(1991),55(4),p.941-949)或其变体或片段。其他曲霉属葡糖淀粉酶变体包括热稳定性提高的变体：G137A和G139A(Chen等人,(1996),Prot.Eng.9,499-505)；
D257E和D293E/Q(Chen等人,(1995),Prot.Eng.8,575-582)；N182(Chen等人,(1994),
Biochem.J.301,275-281)；二硫键A246C(Fierobe等人,(1996),Biochemistry,35,8698-
8704)；和在A435和S436位引入Pro残基(Li等人,(1997),Protein Eng.10,1199-1204)。
[0311] 其他葡糖淀粉酶包括Athelia rolfsii(之前表示为Corticium rolfsii)葡糖淀粉酶(参见美国专利第4,727,026号和Nagasaka等人,(1998)“Purification and properties of the raw-starch-degrading glucoamylases from Corticium rolfsii,Appl Microbiol Biotechnol 50:323-330)，蓝状菌属葡糖淀粉酶，特别是来自埃默森踝节菌(WO 99/28448)、Talaromyces leycettanus(美国专利第Re.32,153号)、杜邦踝节菌(Talaromyces duponti)、嗜热踝节菌(Talaromyces thermophilus)(美国专利第4,587,
215号)。在优选的实施方式中，糖化和/或发酵过程中使用的葡糖淀粉酶是WO 99/28448中公开的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶。
[0312] 考虑的细菌葡糖淀粉酶包括来自梭菌(Clostridium)属，特别是热解淀粉梭菌(C.thermoamylolyticum)(EP 135,138)和热硫化氢梭菌(C.thermohydrosulfuricum)(WO 
86/01831)的葡糖淀粉酶。
[0313] 考虑的真菌葡糖淀粉酶包括瓣环栓菌(Trametes cingulata)、纸质大纹饰孢菌(Pachykytospora papyracea)；和大白桩菇菌(Leucopaxillus giganteus)，其均公开于WO 2006/069289；和Peniophora rufomarginata，其公开于WO2007/124285；或其混合物。另外根据本发明还考虑杂交葡糖淀粉酶。例子包括WO 2005/045018中公开的杂交葡糖淀粉酶。
具体例子包括实施例1的表1和4中公开的杂交葡糖淀粉酶(在此将其杂交体并入作为参
考)。
[0314] 在一实施方式中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属(Pycnoporus)菌株，特别是公开为WO 2011/066576的US 61/264,977中所述的密孔菌属菌株(SEQ ID NOs 2、4或6)，或者源自褐褶菌(Gloephyllum属)菌株，特别是公开为WO 2011/068803的US 61/406,741中所述的褐褶菌属菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)，或者黑层孔菌(Nigrofomes)属菌株，特别是US 61/411,044或PCT/US10/058375中公开的黑层孔菌属菌株(SEQ ID NO:2)(在此将所有参考文献均并入作为参考)。还考虑有与上述葡糖蛋白酶中任意者表现出高度同一性的葡糖淀粉酶，即与上述酶序列成熟部分任意者的同一性为至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或甚至100％。
[0315] 在一实施方式中，葡糖淀粉酶可以以0.0001-20AGU/g DS、优选0.001-10AGU/g DS、特别是0.01-5AGU/g DS，例如0.1-2AGU/g DS的量加入至糖化和/或发酵中。
[0316] 包括葡糖淀粉酶的市售组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SANTM SUPER、SANTM TM TM TM TMEXTRA L、SPIRIZYME  PLUS、SPIRIZYME  FUEL、SPIRIZYME  B4U、SPIRIZYME  ULTRA、SPIRIZYMETM EXCEL和AMGTM E(来自Novozymes A/S)；OPTIDEXTM 300、GC480、GC417(来自Genencor Int.)；AMIGASETM和AMIGASETM PLUS(来自DSM)；G-ZYMETM G900、G-ZYMETM和G990ZR(来自Genencor Int.)。
[0317] 麦芽糖淀粉酶
[0318] 糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的产生碳水化合物源的酶还可以是产生麦芽糖的α-淀粉酶。“产生麦芽糖的α-淀粉酶”(葡聚糖1,4-α-麦芽糖水解酶，E.C.3.2.1.133)能够使直链淀粉和支链淀粉水解成α-构型的麦芽糖。来自嗜热脂肪芽孢杆菌菌株NCIB 11837的麦芽糖淀粉酶可购自Novozymes A/S。产生麦芽糖的α-淀粉酶描述于美国专利第4,
598,048、4,604,355和6,162,628号中，在此将其并入作为参考。在优选的实施方式中，麦芽糖淀粉酶可以以0.05-5mg总蛋白质/克DS或0.05-5MANU/g DS的量加入。
[0319] 本发明优选方法的例子
[0320] 在优选的实施方式中，本发明涉及由含有淀粉的材料制造发酵产物的方法，其包括以下步骤：
[0321] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[0322] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
[0323] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌，在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；和
[0324] -任选的草酸青霉葡糖淀粉酶；
[0325] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[0326] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[0327] 在另一优选的实施方式中，本发明涉及由含有淀粉的材料制造发酵产物的方法，其包括以下步骤：
[0328] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[0329] -α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，其在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如
60-70；
[0330] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌，其在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于105％，大于110％，大于115％，大于120％；例如，20-50％，20-40％，20-30％，50-115％，50-70％，50-60％，100-120％，105-115％；
[0331] -任选的草酸青霉葡糖淀粉酶；
[0332] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[0333] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[0334] 在另一优选的实施方式中，本发明涉及由含有淀粉的材料制造发酵产物的方法，其包括以下步骤：
[0335] i)在5.0-6.0的pH范围下在80-90℃的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[0336] -α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，其在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10，至少15，至少20，至少25，至少30，至少40，至少50，至少60，至少70，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如
60-70；
[0337] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌，其在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于105％，大于110％，大于115％，大于120％；例如，20-50％，20-40％，20-30％，50-115％，50-70％，50-60％，100-120％，105-115％；
[0338] -任选的草酸青霉葡糖淀粉酶；
[0339] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[0340] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[0341] 在另一优选的实施方式中，本发明涉及由含有淀粉的材料制造发酵产物的方法，其包括以下步骤：
[0342] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[0343] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182和任选的取代N193F；并任选地进一步具有以下组取代之一：
[0344] -E129V+K177L+R179E；
[0345] -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[0346] -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用本文中的SEQ ID NO:1)；
[0347] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌，其在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；和
[0348] -任选的具有选自以下的取代的SEQ ID NO:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：
[0349] -K79V；
[0350] -K79V+P11F+T65A+Q327F；或
[0351] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[0352] -K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[0353] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[0354] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0355] -K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(编号使用SEQ ID NO:14)；
[0356] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[0357] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[0358] 在另一优选的实施方式中，本发明涉及由含有淀粉的材料制造发酵产物的方法，其包括以下步骤：
[0359] i)在5.0-6.0的pH范围下在80-90℃的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[0360] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182和任选的取代N193F；并任选地进一步具有以下组取代之一：
[0361] -E129V+K177L+R179E；
[0362] -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[0363] -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用本文中的SEQ ID NO:1)；
[0364] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌，其在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；任选地，和
[0365] -任选的具有选自以下的取代的SEQ ID NO:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：
[0366] -K79V；
[0367] -K79V+P11F+T65A+Q327F；或
[0368] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[0369] -K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[0370] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[0371] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0372] -K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(编号使用SEQ ID NO:14)；
[0373] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[0374] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[0375] 上述源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶(本文中SEQ ID NO:1)或其变体是成熟的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟α-淀粉酶。
[0376] 上述源自强烈炽热球菌(SEQ ID NO:13)和/或橙橘嗜热子囊菌(SEQ ID NO:3)的蛋白酶或其变体是成熟的蛋白酶或分别与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟蛋白酶。
[0377] 上述源自草酸青霉的葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:14)或其变体是成熟的葡糖淀粉酶或与本文SEQ ID NO:14具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟葡糖淀粉酶。
[0378] 包括α-淀粉酶和热稳定性蛋白酶的组合物
[0379] 本发明的组合物包括α-淀粉酶，例如热稳定性α-淀粉酶，以及热稳定性蛋白酶。组合物还可以进一步包括热稳定性的产生碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，和/或也任选地包括支链淀粉酶。
[0380] 因此，在该方面，本发明涉及组合物，其包括：
[0381] i)α-淀粉酶；
[0382] ii)蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌，其在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；和
[0383] iii)任选的产生碳水化合物源的酶。
[0384] α-淀粉酶：α-淀粉酶可以是任何α-淀粉酶，例如，细菌α-淀粉酶，例如，源自芽孢杆菌属的α-淀粉酶，例如嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶。
[0385] α-淀粉酶可以是热稳定性α-淀粉酶。热稳定性α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)可以为至少10，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70。
[0386] 在一实施方式中，α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体，特别是截短成长度491个氨基酸，例如长度480-495个氨基酸，其具有选自以下的突变：
[0387] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
[0388] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[0389] -I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
[0390] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用本文的SEQ ID NO:1)。
[0391] 应当理解到，这些α-淀粉酶仅仅是具体的例子。上文“液化过程中存在和/或加入的α-淀粉酶”部分中公开的任何α-淀粉酶均可以用作本发明组合物中的α-淀粉酶成分。
[0392] 蛋白酶：本发明的组合物包括热稳定性蛋白酶。
[0393] 对蛋白酶成分的来源没有限制，只要其满足本文定义的热稳定性特性即可。
[0394] 在优选的实施方式中，蛋白酶是上述橙橘嗜热子囊菌蛋白酶的变体，其在80℃/70℃下如实施例2中所述测定为相对活性的热稳定性值大于20％。
[0395] 在具体的优选实施方式中，蛋白酶是源自橙橘嗜热子囊菌的金属蛋白酶的变体，其公开为：WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2的成熟部分，或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分，其具有以下突变：
[0396] -D79L+S87P+A112P+D142L；
[0397] -D79L+S87P+D142L；和
[0398] -A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
[0399] 在另一优选实施方式中，蛋白酶源自强烈炽热球菌菌株，例如，US 6,358,726中SEQ ID NO:1或本文SEQ ID NO:13中所示者。
[0400] 应当理解到，这些蛋白酶仅仅是例子。上文在“液化过程中存在和/或加入的蛋白酶”部分中公开的任何蛋白酶均可以用作本发明组合物中的蛋白酶成分。
[0401] 产生碳水化合物源的酶：本发明的组合物还可以包括产生碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶，其在85℃、pH 5.3下的热稳定性为至少30％，优选至少35％。
[0402] 所述产生碳水化合物源的酶可以是在85℃下如实施例4中所述测定的相对活性热稳定性为至少20％、至少30％、优选至少35％的热稳定性葡糖淀粉酶(热稳定性)。
[0403] 在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶是在最佳pH 5.0的pH下如实施例4中所述测定的相对活性为至少90％，优选至少95％，优选至少97％，例如100％的葡糖淀粉酶(pH最佳)。
[0404] 在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶是在pH 5.0下如实施例4中所述测定的pH稳定性为至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶(pH稳定性)。
[0405] 在优选的实施方式中，产生碳水化合物源的酶是热稳定性葡糖淀粉酶，优选真菌来源的，优选来自丝状真菌，例如，来自青霉菌属菌株，特别是草酸青霉菌株，在公开为WO 2011/127802的PCT/CN10/071753(在此将其并入作为参考)中公开为SEQ ID NO:2或其变体，且示于本文中的SEQ ID NOs:9或14。
[0406] 在一实施方式中，葡糖淀粉酶或其变体可以与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NOs:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，再更优选至少93％，最优选至少94％，再最优选至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。
[0407] 在具体和优选的实施方式中，产生碳水化合物源的酶是具有K79V取代的公开为WO 2011/127802中SEQ ID NO:2且示于本文中SEQ ID NO:9和14的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体(编号使用SEQ ID NO:14所示的成熟序列)。相对于在共同未决的美国申请第61/531,189号(在此将其并入作为参考)中公开的亲本，K79V葡糖淀粉酶变体对于蛋白酶降解的敏感性降低。
[0408] 合适的热稳定性草酸青霉葡糖淀粉酶的例子在上文和以下实施例17和18中列出。
[0409] 在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶具有支链淀粉酶副活性。
[0410] 应当理解到，这些产生碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶仅仅是例子。上文“液化过程中存在和/或加入的产生碳水化合物源的酶”部分中的任何产生碳水化合物源的酶均可以用作本发明组合物中的成分。
[0411] 支链淀粉酶：本发明的组合物还可以包括支链淀粉酶。在一实施方式中，支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶。在优选的实施方式中，支链淀粉酶包括公开为WO 2011/087836的US 61/289,040(在此将其并入作为参考)中公开的X47结构域。
[0412] 具体地，支链淀粉酶可以源自高温球菌属菌株，其包括嗜热高温球菌和热水高温球菌或其杂交体。
[0413] 支链淀粉酶可以是在X4位处截短的热水高温球菌支链淀粉酶，或者是具有X4位截短的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂交酶，如公开为WO 2011/087836的US 61/289,040中所公开。
[0414] 在另一实施方式中，支链淀粉酶是包括WO 2011/076123(Novozymes)中所公开的X46结构域的支链淀粉酶。
[0415] 应当理解到，这些支链淀粉酶仅仅是具体的例子。上文“液化过程中存在和/或加入的支链淀粉酶”部分中公开的任何支链淀粉酶均可以用作本发明组合物中的任选的支链淀粉酶组分。
[0416] 在优选的实施方式中，本发明的组合物包括：
[0417] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
[0418] -蛋白酶，源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌，在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；和
[0419] -任选的源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。
[0420] 在优选的实施方式中，本发明的组合物包括：
[0421] -α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10；
[0422] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌或橙橘嗜热子囊菌，在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；和
[0423] -任选的源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。
[0424] 在优选的实施方式中，组合物包括：
[0425] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182和任选的取代N193F；并任选地进一步具有以下组取代之一：
[0426] -E129V+K177L+R179E；
[0427] -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[0428] -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用本文的SEQ ID NO:1)；
[0429] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌，在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；和
[0430] -任选的具有选自以下的取代的SEQ ID NO:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：
[0431] -K79V；
[0432] -K79V+P11F+T65A+Q327F；或
[0433] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[0434] -K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[0435] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[0436] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0437] -K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(编号使用SEQ ID NO:14)。
[0438] 在一实施方式中，嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文中SEQ ID NO:1)或其变体是成熟的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟α-淀粉酶。
[0439] 在一实施方式中，强烈炽热球菌蛋白酶(SEQ ID NO:13)和/或橙橘嗜热子囊菌蛋白酶(SEQ ID NO:3)或其变体是成熟的蛋白酶或分别与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟蛋白酶。
[0440] 在一实施方式中，草酸青霉葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:14)或其变体是成熟的葡糖淀粉酶或与本文SEQ ID NO:14具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟葡糖淀粉酶。
[0441] 在一实施方式中，产生碳水化合物源的酶，特别是葡糖淀粉酶是草酸青霉葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以任选地被以上“支链淀粉酶”部分中所述的、优选地源自嗜热高温球菌或热水高温球菌的支链淀粉酶代替或与其组合。
[0442] 本发明的α-淀粉酶变体
[0443] 在最后一方面，本发明涉及一种α-淀粉酶变体。α-淀粉酶是适合用于本发明的方法的热稳定性变体。α-淀粉酶变体也可以是本发明的组合物中的α-淀粉酶(例如，热稳定性α-淀粉酶)。α-淀粉酶变体的稳定性增加。通过与参照α-淀粉酶相比较，可以如本文实施例1所述对稳定性进行测试。本发明的α-淀粉酶变体可以如WO 2011/082425(在此将其并入作为参考)中所述制备。具体地，在本发明的方法中在实施例20中使用具体考虑的变体(AA369)。
[0444] 在该方面，本发明涉及变体α-淀粉酶，其在与59、89、129、177、179、254、284位相对应的位置处包括突变，其中变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且变体具有α-淀粉酶活性。
[0445] 在一实施方式中，本发明的变体在与59位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr，特别是以Ala、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Pro或Thr进行的取代。
[0446] 在一实施方式中，本发明的变体在与89位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Arg、His或Lys进行的取代。
[0447] 在一实施方式中，本发明的变体在与129位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Ala、Thr或Val进行的取代。
[0448] 在一实施方式中，本发明的变体在与177位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Arg、Leu或Met进行的取代。
[0449] 在一实施方式中，本发明的变体在与179位相对应的位置处包括以Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Gln、Glu、Ile、Leu、Lys或Val进行的取代。
[0450] 在一实施方式中，本发明的变体在与254位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Ala、Ser或Thr进行的取代。
[0451] 在一实施方式中，本发明的变体在与284位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以His、Thr或Val进行的取代。
[0452] 在一实施方式中，本发明的变体包括以下突变或由以下突变组成：V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V。
[0453] 在一实施方式中，本发明的变体是来自以下多肽的亲代α-淀粉酶的变体：上述多肽与本文SEQ ID NO:1的成熟多肽或者具有α-淀粉酶活性的SEQ ID NO:1的成熟多肽的片段具有至少60％的序列同一性。
[0454] 在一实施方式中，本发明的变体亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，和100％的序列同一性。
[0455] 在一实施方式中，本发明的变体亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的氨基酸序列或者由其组成。
[0456] 在一实施方式中，本发明的变体亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1的成熟多肽的氨基酸序列的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。
[0457] 在一实施方式中，本发明的变体是亲本野生型α-淀粉酶的变体。
[0458] 在一实施方式中，本发明的变体亲本α-淀粉酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶。
[0459] 在一实施方式中，亲本α-淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌。
[0460] 在一实施方式中，亲本α-淀粉酶是包括以下突变的SEQ ID NO:1所示的α-淀粉酶：I181+G182位的双缺失，以及任选的N193F取代，或R179+G180位的双缺失。
[0461] 在一实施方式中，本发明的变体包括以下突变或者由其组成：I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(编号使用SEQ ID NO:1)。
[0462] 在一实施方式中，本发明的变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少65％，例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的序列同一性。
[0463] 在一实施方式中，本发明的变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％，例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的序列同一性。
[0464] 在一实施方式中，α-淀粉酶变体具有(天然)截短的本文SEQ ID NO:1所示的序列，使得其长度为大约491个氨基酸，例如长度为480-495个氨基酸。
[0465] 在具体的实施方式中，本发明的α-淀粉酶是具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：
[0466] I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(编号使用SEQ ID NO:1)。
[0467] 在一方面，本发明涉及本发明的变体用于洗涤和/或洗碗的用途。
[0468] 在一方面，本发明涉及本发明的变体用于使纺织品退浆的用途。
[0469] 在一方面，本发明涉及本发明的变体用于制造焙烤产品的用途。
[0470] 在一方面，本发明涉及本发明的变体用于使含有淀粉的材料液化的用途。
[0471] 在一方面，本发明涉及制造液化淀粉的方法，其包括用本发明的变体使含有淀粉的材料液化。
[0472] 在一方面，本发明涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。
[0473] 在一方面，本发明涉及包括本发明的多核苷酸的核酸构建物。
[0474] 在一方面，本发明涉及包括本发明的核酸构建物的表达载体。
[0475] 在一方面，本发明涉及包括本发明的核酸构建物的宿主细胞。
[0476] 在一方面，本发明涉及制造变体α-淀粉酶的方法，其包括：
[0477] a.在适合于变体表达的条件下培养本发明的宿主细胞；和
[0478] b.从培养介质中回收变体。
[0479] 在一实施方式中，本发明涉及用本发明的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
[0480] 在一实施方式中，本发明涉及用于获得变体α-淀粉酶的方法，其包括：
[0481] a.在与59、89、129、177、179、254、284位相对应的位置处向亲本α-淀粉酶中引入突变，其中变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且变体具有α-淀粉酶活性；和
[0482] b.回收变体。
[0483] 在一实施方式中，成熟多肽是包括以下突变的SEQ ID NO:1所示的α-淀粉酶：I181+G182位的双缺失，和任选的N193F取代。
[0484] 材料和方法
[0485] 材料：
[0486] α-淀粉酶A(AAA)：截短至491个氨基酸的具有突变I181*+G182*+N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)。
[0487] α-淀粉酶1407(AAA1407)：截短至491个氨基酸的具有突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)。
[0488] α-淀粉酶369(AAA369)：截短至491个氨基酸的具有突变I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1)。
[0489] 蛋白酶WT：公开为本文SEQ ID NO:3中氨基酸1-177和WO 2003/048353中SEQ ID NO:2中氨基酸1-177的源自橙橘嗜热子囊菌GCMCC No.0670的金属蛋白酶。
[0490] 蛋白酶036：公开为本文SEQ ID NO:3中氨基酸1-177和WO 2003/048353中SEQ ID NO:2中氨基酸1-177的源自橙橘嗜热子囊菌GCMCC No.0670的金属蛋白酶，其具有以下突变：D079L+S87P+0142L。
[0491] 蛋白酶050：公开为本文SEQ ID NO:3中氨基酸1-177和WO 2003/048353中SEQ ID NO:2中氨基酸1-177的源自橙橘嗜热子囊菌GCMCC No.0670的金属蛋白酶，其具有以下突变：D79L+S87P+A112P+D142L。
[0492] 蛋白酶196：公开为本文SEQ ID NO:3中氨基酸1-177和WO 2003/048353中SEQ ID NO:2中氨基酸1-177的源自橙橘嗜热子囊菌GCMCC No.0670的金属蛋白酶，其具有以下突变：A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
[0493] 蛋白酶Pfu：作为Pfu Protease S购自Takara Bio(Japan)的源自强烈炽热球菌的蛋白酶(活性10.5mg/mL)，也显示于本文SEQ ID NO:13中。
[0494] 葡糖淀粉酶PO：公开为WO 2011/127802的PCT/CN10/071753中公开为SEQ ID NO:2并示于本文SEQ ID NO:9的草酸青霉葡糖淀粉酶的成熟部分。
[0495] 葡糖淀粉酶PE001：编号使用SEQ ID NO:14所示成熟序列的具有K79V取代的草酸青霉葡糖淀粉酶的变体。
[0496] 葡糖淀粉酶493(GA493)：进一步具有以下突变P11F+T65A+Q327F的草酸青霉葡糖淀粉酶变体PE001的变体(编号使用SEQ ID NO:14)。
[0497] 葡糖淀粉酶BL：WO 99/28448中公开为SEQ ID NO:7的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶和WO06/069289中公开的瓣环栓菌葡糖淀粉酶的比例大约9:1的混合物。
[0498] 葡糖淀粉酶BL2：包括WO99/28448中公开的埃默森踝节菌葡糖淀粉酶、WO 06/69289中公开的瓣环栓菌葡糖淀粉酶和WO 2006/069290表5中公开为V039的具有黑曲霉葡糖淀粉酶连接物和SBD作为副活性的微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)α-淀粉酶的混合物(比例大约65:15:1)。
[0499] 酵母：RED STAR ETHANOL REDTM，获自Red Star/Lesaffre,USA。
[0500] 实施例6和20中的底物：磨碎的玉米和backset在美国获自商用植物。
[0501] 方法
[0502] 同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“同一性”描述。
[0503] 出于本发明的目的，两个氨基酸序列之间的同一性程度，以及两个核苷酸序列之间的同一性程度可以通过程序“对比”测定，其为Needleman-Wunsch比对(即，全局比对)。该程序用于对多肽以及核苷酸序列进行比对。缺省的评分矩阵BLOSUM50用于多肽比对，缺省的同一性矩阵用于核苷酸比对。对于多肽，对于间隙第一残基的补偿为-12，对于核苷酸为-16。对于多肽，对于间隙其他残基的补偿为-2，对于核苷酸为-4。
[0504] “比对”是FASTA软件版本v20u6的一部分(参见W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988),"Improved Tools for Biological Sequence Analysis",PNAS 85:2444-2448，以及W.R.Pearson(1990)"Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA,"Methods in Enzymology 183:63-98)。FASTA蛋白质比对使用对间隙大小没有限制的Smith-Waterman算法(参见"Smith-Waterman algorithm",T.F.Smith和M.S.Waterman(1981)J.Mol.Biol.147:195-197)。
[0505] 蛋白酶检定
[0506] AZCL-酪蛋白检定
[0507] 将0.2％蓝色底物AZCL-酪蛋白溶液混悬在硼砂/NaH2PO4缓冲液pH 9中，同时加以搅拌。在搅拌的同时将溶液分布在微量滴定板上(每孔100微升)，加入30微升酶样品，并将板在Eppendorf Thermomixer中在45℃、600rpm下孵育30分钟。使用变性的酶样品(100℃煮沸20分钟)作为空白。孵育之后，通过将微量滴定板转移至冰上停止反应，并通过在4℃下在3000rpm下离心将有色溶液与固体分离。将60微升上清液转移至微量滴定板，并使用BioRad酶标仪测量595nm处的吸光度。
[0508] pNA-检定
[0509] 将50微升含有蛋白酶的样品加入到微量滴定板中，并通过加入100微升1mM pNA底物(5mg，溶解于100微升DMSO中，并进一步用硼砂/NaH2PO4缓冲液pH 9.0稀释至10mL)开始检定。在室温下监测OD405的增加，作为蛋白酶活性的度量。
[0510] 葡糖淀粉酶活性(AGU)
[0511] 葡糖淀粉酶活性可以以葡糖淀粉酶单位(AGU)测量。
[0512] Novo葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在以下的标准条件下每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量：37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖23.2mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间5分钟。
[0513] 可以使用自动分析仪系统。将变旋酶加入到葡萄糖脱氢酶试剂中，使得任何存在的α-D-葡萄糖变为β-D-葡萄糖。葡萄糖脱氢酶在上述反应中特异性地与β-D-葡萄糖反应，形成NADH，将其在340nm下使用光度计测定，作为初始葡萄糖浓度的度量。
[0514]AMG孵育：  
底物： 麦芽糖23.2mM
缓冲液： 乙酸盐0.1M
pH： 4.30±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
酶工作范围： 0.5-4.0AGU/mL
[0515]显色反应：  
GlucDH： 430U/L
变旋酶： 9U/L
NAD： 0.21mM
缓冲液： 磷酸盐0.12M；0.15M NaCl
pH： 7.60±0.05
孵育温度： 37℃±1
反应时间： 5分钟
波长： 340nm
[0516] 更详细地描述该分析方法的资料(EB-SM-0131.02/01)可应要求获自Novozymes A/S,Denmark，在此将该资料并入作为参考。
[0517] α-淀粉酶活性(KNU)
[0518] α-淀粉酶活性可以使用马铃薯淀粉作为底物测定。该方法基于改性马铃薯淀粉被酶分解，并且反应之后将淀粉/酶溶液样品与碘溶液混合。最初，形成蓝黑色，但在淀粉分解过程中，蓝色变得较弱，逐渐变为红褐色，将其与有色玻璃标准相比较。
[0519] 一Kilo Novoα-淀粉酶单位(KNU)定义为在标准条件下(即，37℃+/-0.05；0.0003M 2+
Ca ；和pH 5.6)使可溶的5260mg淀粉干物质Merck Amylum糊精化的酶的量。
[0520] 更详细地描述该分析方法的资料EB-SM-0009.02/01可应要求获自Novozymes A/S,Denmark，在此将该资料并入作为参考。
[0521] 测定支链淀粉酶活性(NPUN)
[0522] 内切支链淀粉酶的NPUN活性相对于Novozymes支链淀粉酶标准测量。一支链淀粉酶单位(NPUN)定义为在标准条件下(0.7％红色支链淀粉(red pullulan)(Megazyme)，pH 5，40℃，20分钟)每分钟释放出1微摩尔葡萄糖的酶的量。活性使用红色支链淀粉以NPUN/ml测量。
[0523] 将1mL稀释的样品或标准品在40℃下孵育2分钟。加入0.5mL 2％红色支链淀粉、0.5M KCl、50mM柠檬酸pH 5，并混合。将试管在40℃下孵育20分钟，并通过加入2.5ml 80％乙醇停止。将试管在室温下静置10-60分钟，之后在4000rpm下离心10分钟。然后在510nm测量上清液的OD，并使用标准曲线计算活性。
[0524] 本发明在以下实施例中进一步详述，提供这些实施例是为了对本发明进行说明，而绝非是要限定要求保护的本发明的范围。在此将所有引用的参考文献具体地并入，以对于本文所述内容加以参考。
[0525] 实施例
[0526] 实施例1
[0527] α-淀粉酶变体的稳定性
[0528] 通过将参照α-淀粉酶(截短至491个氨基酸的具有突变I181*+G182*+N193F的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:1编号))和变体在pH 4.5和5.5以及75℃和85℃的温度下与0.12mM CaCl2一起孵育，然后使用 底物( Ultra淀粉酶检定试剂盒，E33651，Molecular Probes)进行残余活性测定，测定参照α-淀粉酶及其α-淀粉酶变体的稳定性。
[0529] 将纯化的酶样品在酶稀释缓冲液(10mM乙酸盐，0.01％Triton X100，0.12mM CaCl2，pH 5.0)中稀释至0.5和1或5和10ppm(微克/ml)的工作浓度。将20微升酶样品转移至
48孔PCR MTP，并向每孔中加入180微升稳定性缓冲液(150mM乙酸盐，150mM MES，0.01％Triton X100，0.12mM CaCl2，pH 4.5或5.5)，并混合。检定使用两种浓度的酶重复进行两次。在75℃或85℃下孵育之前，取出20微升，并储存在冰上作为对照样品。在PCR机中在75℃和85℃下进行孵育。孵育之后，将样品在残余活性缓冲液(100mM乙酸盐，0.01％Triton X100，0.12mM CaCl2，pH 5.5)中稀释至15ng/mL，并将25微升稀释的酶转移至黑色384-MTP。
使用EnzChek底物，通过向每孔中加入25微升底物溶液(100微克/ml)，测定残余活性。使用
485-P nm的激发滤光片和555nm的发射滤光片(荧光读取仪为Polarstar,BMG)每分钟测定荧光，测15分钟。对于每次设定，将残余活性标准化至对照样品。
[0530] 假定对数衰减半衰期(T1/2(分钟))使用以下方程计算：T1/2(分钟)＝T(分钟)*LN(0.5)/LN(％RA/100)，其中T是以分钟计的检定孵育时间，且％RA是检定中测定的％残余活性。
[0531] 使用该检定设定，测定参照α-淀粉酶及其变体的半衰期，如表1所示。
[0532] 表1
[0533]
[0534]
[0535]
[0536] ND未测定
[0537] 结果表明，相比于参照α-淀粉酶，α-淀粉酶变体具有显著更大的半衰期和稳定性。
[0538] 实施例2
[0539] 制备蛋白酶变体和热稳定性测试
[0540] 菌株和质粒
[0541] 将大肠杆菌(E.coli)DH12S(获自Gibco BRL)用于酵母质粒拯救。pJTP000是TPI启动子控制下的酿酒酵母和大肠杆菌穿梭载体，其构建自WO 01/92502中所述的pJC039，其中已经插入有橙橘嗜热子囊菌M35蛋白酶基因(WO 03/048353)。
[0542] 酿酒酵母YNG318感受态细胞：将MATa Dpep4[cir+]ura3-52、leu2-D2、his 4-539用于蛋白酶变体的表达。其描述于J.Biol.Chem.272(15),pp 9720-9727,1997中。
[0543] 介质和底物
[0544] 10X基础溶液：酵母氮基w/o氨基酸(DIFCO)66.8g/l，琥珀酸盐100g/l，NaOH 60g/l。
[0545] SC-葡萄糖：20％葡萄糖(即，最终浓度2％＝2g/100ml)100ml/l，5％苏氨酸4ml/l，1％色氨酸10ml/l，20％酪蛋白氨基酸25ml/l，10X基础溶液100ml/l。使用孔径0.20微米的滤器对溶液灭菌。将琼脂(2％)和H2O(约761ml)一起高压灭菌，并将单独灭菌的SC-葡萄糖溶液加入到琼脂溶液中。
[0546] YPD：细菌蛋白胨20g/l，酵母提取物10g/l，20％葡萄糖100ml/l。
[0547] YPD+Zn：YPD+0.25mM ZnSO4。
[0548] PEG/LiAc溶液：40％PEG4000 50ml，5M乙酸锂1ml。
[0549] 96孔玉米蛋白微量滴定板：
[0550] 每孔含有200微升0.05-0.1％玉米蛋白(Sigma)、0.25mM ZnSO4和20mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中的1％琼脂。
[0551] DNA操作
[0552] 除非另外指出，DNA操作和转化使用以下文献所述的分子生物学标准方法进行：Sambrook等人,(1989)Molecular cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor lab.Cold Spring Harbor,NY；Ausubel,F.M.等人,(eds.)"Current protocols in 
Molecular Biology",John Wiley and Sons,1995；Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(Eds.)。
[0553] 酵母转化
[0554] 酵母转化使用乙酸锂方法进行。将0.5微升载体(用限制性核酸内切酶转化)和1微升PCR片段混合。将DNA混合物、100微升YNG318感受态细胞和10微升YEAST MAKER载体DNA(Clontech)加入到12ml聚丙烯管(Falcon 2059)中。加入0.6ml PEG/LiAc溶液并轻缓混合。在30℃和200rpm下孵育30分钟，然后在42℃下孵育30分钟(热休克)。转移至微量离心管中，离心5秒。去除上清液，再溶解在3ml YPD中。将细胞悬浮液在30℃下在200rpm下孵育45分钟。将悬浮液倒入SC-葡萄糖板，并在30℃下孵育3天，使群落生长。通过Zymoprep酵母质粒微制备试剂盒(ZYMO research)提取酵母总DNA。
[0555] DNA测序
[0556] 通过电穿孔(BIO-RAD Gene Pulser)进行大肠杆菌转化，用于进行DNA测序。通过碱性方法(分子克隆(Molecular Cloning),Cold Spring Harbor)或用 质粒试剂盒制备DNA质粒。通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用PTC-
200DNA扩增仪进行PCR。将ABI PRISMTM 310基因分析仪用于测定所有的DNA序列。
[0557] 构建蛋白酶表达载体
[0558] 将Themoascus M35蛋白酶基因用引物对Prot F(SEQ ID NO:4)和Prot R(SEQ ID NO:45)扩增。将所得的PCR片段与用限制酶消化的pJC039载体(描述于WO2001/92502)一起引入到酿酒酵母YNG318中，以去除特异腐质霉(Humicola insolens)角质酶基因。
[0559] 回收SC-葡萄糖板上的酵母克隆中的质粒，以确认内部序列，并称作pJTP001。
[0560] 构建酵母文库和定点变体
[0561] 通过SOE PCR方法构建酵母文库和定点变体(通过重叠延伸拼接，参见“PCR:A practical approach”,p.207-209,Oxford University press,eds.McPherson,Quirke,Taylor)，然后进行酵母体内重组。
[0562] 扩增和测序的通用引物
[0563] 使用引物AM34(SEQ ID NO:5)和AM35(SEQ ID NO:6)，通过与简并引物(AM34+反向引物AM35+正向引物)一起的SOE方法制造含有任意突变片段的DNA片段，或仅扩增整个蛋白酶基因(AM34+AM35)。
[0564]
[0565] 通过Qiagen凝胶提取试剂盒从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。将所得的纯化片段与载体消化物混合。将混合溶液引入到酿酒酵母中，以通过体内重组构建文库或定点变体。
[0566] 相对活性检定
[0567] 将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种到含有YPD+Zn介质的96孔微量滴定板的孔中，并在28℃下培养3天。将培养物上清液应用于96孔玉米蛋白微量滴定板，并在至少2个温度下(例如，60℃和65℃，70℃和75℃，70℃和80℃)孵育4小时以上或过夜。测量板中玉米蛋白的浊度作为A630，并测定相对活性(较高/较低温度)作为热活性提高的指标。选择相对活性比亲本变体更高的克隆，并测定序列。
[0568] 残余活性检定
[0569] 将SC-葡萄糖上的酵母克隆接种到96孔微量滴定板的孔中，并在28℃下培养3天。将培养物上清液在20mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中在某一温度下(80℃或84℃，4℃作为参照)孵育10分钟之后，使用偶氮酪蛋白(Megazyme)在65℃下测量蛋白酶活性，以测定残余活性。
选择残余活性比亲本变体更高的克隆，并测定序列。
[0570] 偶氮酪蛋白检定
[0571] 将20微升样品与150微升底物溶液(96ml 20mM乙酸钠pH 4.5中4ml乙醇中12.5％偶氮酪蛋白，含有0.01％triton-100和0.25mM ZnSO4)混合，并孵育4小时或更久。
[0572] 加入20微升/孔100％三氯乙酸(TCA)溶液之后，将板离心，并将100微升上清液用移液器吸出，测量A440。
[0573] 米曲霉中蛋白酶变体的表达
[0574] 使用包括蛋白酶变体基因的构建物来构建曲霉表达载体。曲霉表达载体由表达组件组成，该表达组件基于与构巢曲霉(Aspergillus nidulans)磷酸丙糖异构酶非翻译前导序列(Pna2/tpi)融合的黑曲霉中性淀粉酶II启动子以及黑曲霉淀粉糖苷酶终止子(Tamg)。质粒上另外存在有使得能够在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的来自构巢曲霉的曲霉选择性标记物amdS。将蛋白酶变体的表达质粒转化到曲霉中，如Lassen等人,(2001),
Appl.Environ.Microbiol.67,4701-4707所述。对于每种构建物，分离出10-20菌株，将其纯化，并在摇瓶中培养。
[0575] 纯化表达的变体
[0576] 1.将0.22μm过滤的发酵样品的pH调节至4.0。
[0577] 2.将样品置于磁力搅拌下的冰浴中。以小的等份加入(NH4)2SO4(相应于大约2.0-2.2M(NH4)2SO4，不考虑加入化合物时的体积增加)。
[0578] 3.最后加入(NH4)2SO4之后，将样品在轻缓磁力搅拌下的冰浴上孵育45分钟。
[0579] 4.离心：装有R20A2转头的Hitachi himac CR20G高速冷冻离心机，5℃，20,000rpm，30分钟。
[0580] 5.将形成的沉淀物溶解在200ml 50mM乙酸钠pH 4.0中。
[0581] 6.使用0.22μm PES PLUS膜(IWAKI)将样品通过真空抽吸过滤。
[0582] 7.在冷室中使用超滤(Vivacell 250，来自Vivascience，装有5kDa MWCO PES膜)将样品脱盐/缓冲液交换至50mM乙酸钠pH 4.0过夜。将保留的样品用50mM乙酸钠pH 4.0稀释至200ml。优选样品电导率小于5mS/cm。
[0583] 8.将样品装载到用50mM乙酸钠pH 4.0平衡的阳离子交换柱中。使用3倍柱体积的结合缓冲液(50mM乙酸钠pH 4.0)将未结合的样品从柱上洗出，并使用线性梯度以10倍柱体积0-100％洗脱缓冲液(50mM乙酸钠+1M NaCl pH 4.0)洗脱样品。
[0584] 9.将收集的部分通过内切蛋白酶检定(参考下文)进行检定，之后对选择的部分进行标准SDS-PAGE(还原性条件)。基于内切蛋白酶检定和SDS-PAGE收集这些部分。
[0585] 内切蛋白酶检定
[0586] 1.将Protazyme OL片/5ml 250mM乙酸钠pH 5.0通过磁力搅拌溶解(底物：内切蛋白酶Protazyme AK片获自Megazyme–cat.#PRAK 11/08)。
[0587] 2.在搅拌下，将250微升底物溶液转移至1.5ml微量离心管中。
[0588] 3.将25微升样品加入到每个管中(空白为样品缓冲液)。
[0589] 4.将管在Thermomixer上在50℃震摇(1000rpm)孵育15分钟。
[0590] 5.将250微升1M NaOH加入到每个管中，然后进行涡流。
[0591] 6.在16,100×G和25℃下离心3分钟。
[0592] 7.将200微升上清液转移至MTP，并记录590nm处的吸光度。
[0593] 结果
[0594]
[0595]
[0596]
[0597]
[0598]
[0599]
[0600]
[0601] 实施例3
[0602] 使用纯化酶的所选择变体的温度图谱
[0603] 纯化选择出的显示出较好热稳定性的变体，并在下文所述玉米蛋白-BCA检定中使用纯化的酶。将酶在所示升高的温度孵育60分钟之后在60℃测定残余蛋白酶活性。
[0604] 玉米蛋白-BCA检定：
[0605] 进行玉米蛋白-BCA检定，以检测各种温度下通过变体蛋白酶从玉米蛋白中释放的可溶蛋白质定量。
[0606] 方案：
[0607] 1)将10微升10微克/ml酶溶液和100μl 0.025％玉米蛋白溶液在微量滴定板(MTP)中混合。
[0608] 2)在各种温度下孵育60分钟。
[0609] 3)加入10微升100％三氯乙酸(TCA)溶液。
[0610] 4)在3500rpm下离心MTP 5分钟。
[0611] 5)将15微升取出至含有100微升BCA检定溶液(Pierce Cat#:23225，BCA蛋白质检定试剂盒)的新MTP。
[0612] 6)在60℃下孵育30分钟。
[0613] 7)测量A562。
[0614] 结果示于表5中。与wt蛋白酶相比较，所有测试的变体均表现出提高的热稳定性。
[0615] 表5.玉米蛋白-BCA检定.
[0616]
[0617] 实施例4
[0618] 草酸青霉葡糖淀粉酶的表征
[0619] 草酸青霉葡糖淀粉酶公开于本文SEQ ID NO:9中。
[0620] 底物.底物：去离子水中1％可溶性淀粉(Sigma S-9765)
[0621] 反应缓冲液：pH5.3的0.1M乙酸盐缓冲液
[0622] 葡萄糖浓度测定试剂盒：Wako葡萄糖检定试剂盒(LabAssay glucose,WAKO,Cat#298-65701)。
[0623] 反应条件.将20微升可溶性淀粉和50微升pH 5.3的乙酸盐缓冲液混合。加入30微升酶溶液(50微克酶蛋白质/ml)，至最终体积为100微升，然后在37℃下孵育15分钟。
[0624] 通过Wako试剂盒测定葡萄糖浓度。
[0625] 所有工作均平行进行。
[0626] 温度优化.为评价草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳温度，在20、30、40、50、60、70、80、85、90和95℃下进行上述的“反应条件”检定。结果示于表6。
[0627] 表6温度优化
[0628]温度(℃) 20 30 40 50 60 70 80 85 90 95
相对活性(％) 63.6 71.7 86.4 99.4 94.6 100.0 92.9 92.5 82.7 82.8
[0629] 从结果可以看出，在给定条件下草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳温度为50℃至70℃，并且葡糖淀粉酶在95℃下保持大于80％的活性。
[0630] 热稳定性.为了评价草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，对反应条件检定进行修改，其中酶溶液和乙酸盐缓冲液在20、30、40、50、60、70、75、80、85、90和95℃下预孵育15分钟。孵育之后，将20微升淀粉加入到溶液中，并如上所述进行检定。
[0631] 结果示于表7。
[0632] 表7热稳定性
[0633] 从结果可以看出，预孵育15分钟之后，草酸青霉葡糖淀粉酶在直至70℃是稳定的，其中保持大于80％的活性。
[0634] pH优化.为了评价草酸青霉葡糖淀粉酶的最佳pH，在pH 2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0下进行上述的反应条件检定。使用以下缓冲液代替反应条件检定中所述的乙酸盐缓冲液：100mM琥珀酸、HEPES、CHES、CAPSO、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100，pH用HCl或NaOH调节至2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、
8.0、9.0、10.0或11.0。
[0635] 结果示于表8。
[0636] 表8 pH优化
[0637]
[0638] 从结果可以看出，在给定条件下草酸青霉葡糖淀粉酶在pH 5下活性最高。草酸青霉葡糖淀粉酶在很宽的pH范围内是有活性的，其在pH 2-7时保持大于50％的活性。
[0639] pH稳定性.为了评价草酸青霉葡糖淀粉酶的热稳定性，对反应条件检定进行修改，其中使用pH优化中所述的缓冲液，将酶溶液(50微克/mL)在pH 2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的缓冲液中预孵育20小时。预孵育之后，向溶液中加入20微升可溶性淀粉，至最终体积为100微升，并如上所述进行检定。
[0640] 结果示于表9。
[0641] 表9 pH稳定性
[0642]
[0643] 从结果可以看出，草酸青霉葡糖淀粉酶在pH 3至pH 7的条件下在预孵育20小时之后是稳定的，并在pH 8下其活性降低。
[0644] 实施例5
[0645] 蛋白酶Pfu的热稳定性
[0646] 使用与实施例2相同的方法测试购自Takara Bio Inc,(Japan)的强烈炽热球菌蛋白酶(Pfu S)的热稳定性。经发现，在pH 4.5下热稳定性(相对活性)为110％(80℃/70℃)和103(90℃/70℃)。
[0647] 实施例6
[0648] 使用α-淀粉酶1407和蛋白酶Pfu用于液化的乙醇制造
[0649] 该实验的目的在于评价在85℃下分别在pH 5.4和5.8下液化2小时的过程中加入的源自强烈炽热球菌的蛋白酶Pfu的应用性能。
[0650] 液化(Labomat)
[0651] 每次液化接收磨碎的玉米(84.19％DS)、backset(6.27％DS)和自来水，目标为总重量100g，32.50％干固体(DS)。Backset以总浆料重量的30％w/w混合。最初的浆料pH大约为5.2，并在液化之前使用50％w/w氢氧化钠调节至pH 5.4或5.8。根据以下表11中列出的实验设计加入所有的酶。液化使用以下条件在Labomat中发生：5℃/分钟跃变，跃变17分钟，85℃下103分钟保持时间，整个运行中40rpm，200mL不锈钢罐(canister)。液化之后，将所有的筒在冰浴中冷却，并在SSF下基于以下列出的方案准备发酵。
[0652] 同时糖化和发酵(SSF)
[0653] 将各个醪液用50％w/w氢氧化钠或40％v/v硫酸调节至pH 5.0。向各个醪液应用青霉素，至总浓度为3ppm。通过相对于每15mL预先打孔以允许CO2释放的试管中等分大约4.5g醪液，将试管准备为具有醪液。将试管在4℃下静置过夜，直到次日早晨。
[0654] 将所有醪液的试管从冷贮藏中移出，并在步入式孵育室中升温至32℃。一经升温，将葡糖淀粉酶BL2以0.50AGU/gDS投放至每个醪液试管，加水，使得所有试管均接收120μL液体并且各个醪液样品均接收100μL再水化的酵母。再水化的酵母通过将5.5g Fermentis RED STAR混合到100mL 32℃自来水中至少15分钟而制备。
[0655] 随着时间监测CO2重量损失，将每单位产生和损失的CO2通过以下转化成每克干固体产生的乙醇克数(gEtOH/gDS)：
[0656]
[0657] HPLC分析
[0658] 通过每次处理取3管，发酵54小时后进行发酵取样。每个样品用50μL 40％v/v H2SO4灭活，涡流，在1460×g下离心10分钟，并通过0.45μm Whatman PP滤器过滤。在HPLC下分析54小时样品而无需进一步稀释。在HPLC分析之前和过程中，样品贮存在4℃。
[0659]
[0660] 该方法使用乙醇校正标准(％w/v)对分析物进行定量。使用包括原点的四点校正进行定量。
[0661] 当适用时，使用JMP软件(Cary,NC)以使用Tukey-Kramer HSD或Dunnett’s进行配对的单因素方差分析来对数据进行分析。通过将单因素方差分析的标准误差乘以1.96，建立表示95％置信水平的误差条。
[0662] 表11.实验计划
[0663]
[0664] 结果：
[0665]
[0666] 实施例7
[0667] 用α-淀粉酶A和热稳定性蛋白酶050和蛋白酶036制造乙醇
[0668] 该实验的目的在于评价在pH 5.4下在85℃下液化2小时的过程中加入的橙橘嗜热子囊菌蛋白酶的两种热稳定性蛋白酶变体的应用性能。
[0669] 液化
[0670] 将磨碎的玉米、backset和自来水混合至32.50％DS，并用50％v/v氢氧化钠调节至pH 5.4。加入每种分别的蛋白酶，较好混合，然后以0.02％(w/w)/g玉米的剂量加入α-淀粉酶A。将样品在设定为85℃的水浴中孵育2小时，并接受在孵育的前15分钟过程中和之后每15分钟的频繁混合。液化之后，将所有醪液再冷藏，并保持其中，直至发酵。
[0671] 同时糖化和发酵(SSF)
[0672] 根据需要在SSF之前将醪液用自来水调节至32％DS，并投放总浓度500ppm的尿素和3ppm的青霉素。液化之后，对SSF不进行pH调节。将大约4.5g醪液加入到在顶部预先打孔以允许CO2释放的15mL试管中。以0.50AGU/g DS的剂量投放葡糖淀粉酶BL2，并加水至每个试管中，以保证所有样品均在相同的固体含量下处理。通过将5.5g Fermentis RED STAR混合到100mL 32℃自来水中至少15分钟来制备再水化的酵母，并对每个试管接种100μL，其相应于3千万细胞/mL醪液。
[0673] 选择所有54小时发酵样品用于HPLC分析，并将其用50μL 40％v/v H2SO4灭活，涡流，在1460×g下离心10分钟，然后通过0.45μm Whatman滤器过滤。HPLC分析之前样品在4℃下贮存。HPLC分析如实施例6中所述进行。
[0674] 随着时间监测CO2重量损失，使用实施例6中的公式，将每单位损失的CO2转化成每克干固体产生的乙醇克数(g EtOH/g DS)。
[0675] 所有液化中包括α-淀粉酶A。
[0676]
[0677] 实施例8
[0678] 克隆草酸青霉菌株葡糖淀粉酶基因
[0679] 制备草酸淀粉酶菌株cDNA
[0680] 遵照3’Rapid Amplifiction of cDNA End System(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)的说明书合成cDNA。
[0681] 克隆草酸青霉菌株葡糖淀粉酶基因
[0682] 使用以下所示设计成自5’端扩增葡糖淀粉酶基因的寡核苷酸引物克隆草酸青霉葡糖淀粉酶基因。
[0683] 上游引物：5’-ATGCGTCTCACTCTATTATCAGGTG-3’(SEQ ID NO:15)
[0684] 使用Platinum HIFI Taq DNA聚合酶(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA,USA)，用上游引物和AUAP(由3’Rapid Amplifiction of cDNA End System提供)通过PCR扩增全长基因。扩增反应由5μl 10x PCR缓冲液、2μl 25mM MgCl2、1μl 10mM dNTP、1μl 10uM上游引物、1μl10uM AUAP、2μl第一链cDNA、0.5μl HIFI Taq和37.5μl去离子水组成。PCR程序为：94℃，3分钟；10次循环，94℃40秒，60℃40秒，每循环降1℃；25次循环，94℃40秒，50℃40秒，68℃2分钟；最后在68℃下延伸10分钟。
[0685] 使用pGEM-T载体体系(Promega Corporation,Madison,WI,USA)，将得到的PCR片段克隆到pGEM-T载体(Promega Corporation,Madison,WI,USA)中，以产生质粒AMG 1。质粒AMG 1中插入的葡糖淀粉酶基因经测序确认。将含有质粒AMG 1(指定为NN059173)的大肠杆菌菌株TOP10于2009年11月23日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ)，指定的编号为DSM 23123。
[0686] 实施例9
[0687] 表达克隆的草酸青霉葡糖淀粉酶
[0688] 使用以下所示的两个克隆引物F和引物R，其基于已知的序列设计，并添加通过IN-FUSIONTM策略直接克隆的标记，通过PCR将草酸青霉葡糖淀粉酶基因从质粒AMG 1中再克隆到曲霉表达载体中。
[0689] 引物F：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACTCTATTATC(SEQ ID NO:16)
[0690] 引物R：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTT GG(SEQ ID NO:17)
[0691] 用质粒AMG 1进行PCR反应，以扩增全长基因。PCR反应由40μg质粒AMG 1DNA、1μl各引物(100μM)、12.5μl 2X Extensor Hi-Fidelity混合液(Extensor Hi-Fidelity Master Mix,ABgene,United Kingdom)和9.5μl PCR级的水组成。PCR反应使用DYAD PCR机(Bio-Rad Laboratories,Inc.,Hercules,CA,USA)进行，程序设定如下：94℃下2分钟；然后是25次循环，94℃下15秒，50℃下30秒和72℃下1分钟；然后在72℃下10分钟。
[0692] 使用1x TAE缓冲液通过1.0％琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，其中将大约1.9kb PCR产物条带从凝胶上切除，并使用 PCR  DNA和凝胶条带纯化试剂盒(GE Healthcare,United Kingdom)根据制造商说明书进行纯化。使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(BD Biosciences,Palo Alto,CA,USA)，根据制造商说明书，将与草酸青霉葡糖淀粉酶基因相对应的DNA克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉表达载体中。线性化载体的构建如WO 2005/042735 A1中所述。
[0693] 使用2μl体积的连接溶液，转化25μl的Fusion Blue大肠杆菌细胞(包括在IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒中)。在42℃下热休克45秒且在冰上冷却之后，加入250μl SOC介质，并将细胞在37℃下在225rpm下孵育90分钟，然后铺在含有50μg氨苄青霉素/ml的LB琼脂板上，并在37℃下培养过夜。将所选择的克隆接种到3ml补充有50μg氨苄青霉素/ml的LB介质中并在37℃下在225rpm下孵育过夜。根据制造商说明书使用Mini JETSTAR(Genomed,Germany)纯化来自所选择克隆的质粒DNA。在异源表达之前，通过Sanger测序证实草酸青霉葡糖淀粉酶基因序列。选择一个质粒用于进一步表达，且命名为XYZ XYZ1471-
4。
[0694] 如WO 95/02043中所述制备黑曲霉Mbin118的原生质体。将100μl原生质体悬浮液与2.5μg XYZ1471-4质粒混合，加入250微升60％PEG 4000(Applichem)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl pH 7.5，并轻缓混合。将混合物在37℃下孵育30分钟，将原生质体在补充有10mM乙酰胺和15mM  CsCl的COVE蔗糖(Cove,1996,
Biochim.Biophys.Acta 133:51-56)(1M)板中与6％低熔点琼脂糖(Biowhittaker 
Molecular Applications)混合，并作为顶层加到补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖(1M)板上用于转化体选择(4ml顶层琼脂/板)。在37℃下孵育5天之后，捡取16种转化体的孢子，并种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖介质上。在30℃下静止培养5天之后，对来自每孔的10μl培养肉汤在SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)凝胶、
Griton XT Precast gel(BioRad,CA,USA)上进行分析，以基于产生大量葡糖淀粉酶的能力识别最好的转化体。将选择的转化体在原始转化板上识别，并作为孢子保藏在20％甘油储液中，冷冻贮存(-80℃)。
[0695] 培养.将选择的转化体接种在100ml MLC介质中，并在旋转摇荡器上在500ml摇瓶中在30℃下培养2天。将3ml培养肉汤接种至100ml M410介质，并在30℃下培养3天。将培养肉汤离心，并将上清液使用0.2μm膜滤器过滤。
[0696] α-环糊精亲和凝胶.将10克环氧活化的琼脂糖6B(GE Healthcare,Chalfont St.Giles,U.K)粉末悬浮在蒸馏水中，并在烧结玻璃滤器上用蒸馏水洗涤。将凝胶悬浮在偶联溶液(100ml 12.5mg/mlα-环糊精，0.5M NaOH)中，并在室温下轻缓震摇下孵育一天。将凝胶在烧结玻璃滤器上用蒸馏水洗涤，悬浮在100ml 1M乙醇胺pH 10中，并在50℃下孵育4小时用于封闭。然后将凝胶交替用50mM pH 8Tris-HCl和50mM pH 4.0NaOAc洗涤数次。最后，使用平衡缓冲液(50mM NaOAc，150mM NaCl，pH 4.5)将凝胶装填到35-40ml柱中。
[0697] 从培养肉汤中纯化葡糖淀粉酶.将来自具有葡糖淀粉酶基因的黑曲霉MBin118发酵的培养肉汤通过0.22μm PES滤器过滤，并应用于之前在50mM NaOAc、150mM NaCl pH 4.5缓冲液中平衡过的α-环糊精亲和凝胶柱。用平衡缓冲液从柱中洗去未结合的材料，并使用含有10mMβ-环糊精的3倍柱体积以上的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
[0698] 考察洗脱液的葡糖淀粉酶活性，以判断葡糖淀粉酶是否已经与α-环糊精亲和凝胶结合。然后将纯化的葡糖淀粉酶样品针对20mM NaOAc pH 5.0透析。最后通过SDS-PAGE确认纯度，仅发现单一条带。
[0699] 实施例10
[0700] 草酸青霉葡糖淀粉酶(PE001)定点变体的构建和表达
[0701] 用实施例9中所述的质粒XYZ1471-4进行两个PCR反应，使用以下所示的引物K79V F和K79VR，其设计成将成熟序列79位的赖氨酸K取代成缬氨酸V，并且使用以下所示的引物F-NP003940和R-NP003940，其基于已知的序列设计并添加通过IN-FUSIONTM策略直接克隆的标记。
[0702] 引物K79V F 18mer GCAGTCTTTCCAATTGAC(SEQ ID NO:18)
[0703] 引物K79V R 18mer AATTGGAAAGACTGCCCG(SEQ ID NO:19)
[0704] 引物F-NP003940：5’ACACAACTGGGGATCCACCATGCGTCTCACT CTATTATC(SEQ ID NO:20)
[0705] 引物R-NP003940：5’AGATCTCGAGAAGCTTAAAACTGCCACACGTCGTTGG(SEQ ID NO:21)。
[0706] 使用PTC-200DNA扩增仪在下述条件下进行PCR。
[0707]
[0708] 通过Qiagen凝胶提取试剂盒根据制造商说明书从琼脂糖凝胶中回收DNA片段。使用IN-FUSIONTM Dry-Down PCR克隆试剂盒(BD Biosciences,Palo Alto,CA,USA)，根据制造商说明书，将所得的纯化的两个片段克隆到用BamHI和HindIII线性化的曲霉表达载体中。线性化载体的构建描述于WO 2005/042735 A1中。
[0709] 使用连接混合物来转化大肠杆菌DH5α细胞(TOYOBO)。将选择的克隆接种到补充有50μg氨苄青霉素/ml的3ml LB介质中，并在37℃下在225rpm下孵育过夜。将来自所选择的克隆的质粒DNA使用Qiagen质粒小型试剂盒(Qiagen)根据制造商说明书纯化。异源表达之前，验证草酸青霉葡糖淀粉酶定点变体基因序列，并选择一个质粒用于进一步的表达，并命名为pPoPE001。
[0710] 如WO 95/02043中所述制备黑曲霉MBin118的原生质体。将100微升原生质体悬浮液与2.5μg pPoPE001质粒混合，加入250微升60％PEG 4000(Applichem)(聚乙二醇，分子量4,000)、10mM CaCl2和10mM Tris-HCl pH 7.5，并轻缓混合。将混合物在37℃下孵育30分钟，将原生质体在补充有10mM乙酰胺和15mM  CsCl的COVE蔗糖(Cove,1996,
Biochim.Biophys.Acta 133:51-56)中与1％琼脂糖L(Nippon Gene)混合，并作为顶层加到补充有10mM乙酰胺和15mM CsCl的COVE蔗糖板上用于转化体选择(4ml顶层琼脂/板)。在37℃下孵育5天之后，捡取16种转化体的孢子，并种在96深孔MT板中的750μl YP-2％麦芽糖介质上。在30℃下静止培养5天之后，对来自每孔的10μl培养肉汤在SDS-PAGE凝胶上进行分析，以基于产生大量葡糖淀粉酶的能力识别最好的转化体。
[0711] 实施例11
[0712] 纯化定点Po AMG变体PE001
[0713] 将选择的变体的转化体和实施例8所述的表达野生型草酸青霉葡糖淀粉酶的菌株在100ml YP-2％麦芽糖介质中培养，将培养物通过0.22μm PES滤器过滤，并应用于之前在50mM NaOAc、150mM NaCl pH 4.5缓冲液中平衡过的α-环糊精亲和凝胶柱。用平衡缓冲液从柱中洗去未结合的材料，并使用含有10mMβ-环糊精的3倍柱体积以上的相同缓冲液洗脱葡糖淀粉酶。
[0714] 考察洗脱液的葡糖淀粉酶活性，以判断葡糖淀粉酶是否已经与α-环糊精亲和凝胶结合。然后将纯化的葡糖淀粉酶样品针对20mM NaOAc pH 5.0透析。
[0715] 实施例12
[0716] 表征PE001蛋白酶稳定性
[0717] 将40μl于50mM乙酸钠缓冲液pH 4.5中的酶溶液(1mg/ml)与1/10体积的1mg/ml蛋白酶溶液，例如Biochem J.1975Apr；147(1):45-53中所述的aspergillopepsinI或来自Sigma的市售产品以及Biochemical journal[0264-6021]Ichishima,2003,371(2):541中所述的aorsin混合，并在4或32℃下孵育过夜。作为对照实验，将H2O代替蛋白酶加入到样品中。将样品装载到SDS-PAGE上，以判断葡糖淀粉酶是否被蛋白酶切割。
[0718] 在SDS-PAGE中，PE001仅显示出一条条带，其与完整的分子相对应，而野生型葡糖淀粉酶则被蛋白酶降解，在60kCa显示出分子大小较低的条带。
[0719] 表12蛋白酶处理之后的SDS-PAGE结果
[0720]
[0721] N.D.：未检测到。
[0722] 实施例13
[0723] 培养过程中切割较少
[0724] 将变体的曲霉转化体和野生型草酸青霉葡糖淀粉酶在含有补充有10mM乙酸钠缓冲液pH 4.5的4X稀释YP-2％麦芽糖介质的6孔MT板中在32℃下培养1周。
[0725] 将培养物上清液装载到SDS-PAGE上。
[0726] 表13培养物上清液的SDS-PAGE结果
[0727]
[0728] N.D.：未检测到。
[0729] 野生型葡糖淀粉酶在发酵过程中被宿主蛋白酶切割，而变体仅产生完整的分子。
[0730] 实施例14
[0731] 与亲本相比较变体PE001的葡糖淀粉酶活性
[0732] 对于野生型草酸青霉的纯化酶和变体葡糖淀粉酶，如上所述考察测量为AGU的葡糖淀粉酶活性。
[0733] 葡糖淀粉酶单位(AGU)定义为在标准条件下(37℃，pH 4.3，底物：麦芽糖100mM，缓冲液：乙酸盐0.1M，反应时间6分钟)每分钟水解1微摩尔麦芽糖的酶的量。
[0734] 表14
[0735]相对特异性活性 AGU/mg
草酸青霉wt 100％
草酸青霉PE001(SEQ ID NO:14+V79K) 102％
[0736] 实施例15
[0737] 纯化热稳定性增加的葡糖淀粉酶变体
[0738] 以类似于实施例10所述的方法，可以构建并表达显示出热稳定性增加的变体。所有变体均源自PE001。在YPM介质中表达之后，如下微纯化包括T65A或Q327F取代的变体：
[0739] 通过0.22μm滤器过滤，回收菌丝体。将50μl柱材料(α-环糊精，其根据制造商推荐与Mini-Leak二乙烯砜活化的琼脂糖介质偶联)加入到过滤板(Whatman,Unifilter 800μl,25-30μm MBPP)的孔中。柱材料用结合缓冲液(200mM乙酸钠pH 4.5)平衡，通过两次加入200μl缓冲液，剧烈震摇10分钟(Heidolph,Titramax 101，1000rpm)并真空除去缓冲液
(Whatman,UniVac 3)。随后，加入400μl培养物上清液和100μl结合缓冲液，并在剧烈震摇下孵育板30分钟。真空除去未结合的材料，并重复结合步骤。通常每个变体使用4孔。然后如下进行3次洗涤步骤：加入200μl离子强度降低的缓冲液(50/10/5mM乙酸钠，pH 4.5)，震摇15分钟，并真空除去缓冲液。通过两次加入100μl洗脱缓冲液(250mM乙酸钠，0.1％α-环糊精，pH 6.0)，震摇15分钟，并通过真空在微量滴定板中收集洗脱的材料来实现结合AMG的洗脱。
使用10kDa截留的离心过滤装置(Millipore Microcon Ultracel YM-10)将合并的洗脱液浓缩，并将缓冲液换成50mM乙酸钠pH 4.5。将微纯化的样品在-18℃下贮存，直至进行热稳定性测试。
[0740] 实施例16
[0741] 蛋白质热去折叠分析(TSA，热偏移检定)
[0742] 使用Sypro Orange(In-vitrogen,S-6650)监测T65A和Q327F变体的蛋白质热去折叠(thermal unfolding)，并使用实时PCR仪器(Applied Biosystems；Step-One-Plus)进行。
[0743] 在96孔板中，将25微升大约100微克/ml的50mM乙酸盐pH 4.5中的微纯化的样品与Sypro Orange(所得浓度＝5X；来自供应商的贮存液＝5000X)混合(5:1)。将板用光学PCR封条密封。PCR仪器设定成扫描速率76℃/小时，开始于25℃，结束于96℃。
[0744] 使用Sypro Orange(In-vitrogen,S-6650)监测E501V+Y504T变体的蛋白质热诱导去折叠，并使用实时PCR仪器(Applied Biosystems；Step-One-Plus)进行。
[0745] 在96孔板中，在存在或不存在200ppm阿卡波糖(Sigma A8980)的条件下，将15微升大约50微克/ml的50mM乙酸盐pH 4.5中的纯化的样品与Sypro Orange(所得浓度＝5X；来自供应商的贮存液＝5000X)混合(1:1)。将板用光学PCR封条密封。PCR仪器设定成扫描速率76℃/小时，开始于25℃，结束于96℃。
[0746] 使用内置的LED激发蓝光和ROX-滤器(610nm，发射)，每20秒监测荧光。
[0747] Tm-值计算为一阶导数(dF/dK)的最大值(参见：Gregory等人,2009,J.Biomol.Screen.14:700)。
[0748] 表15a
[0749]
[0750] 表15b
[0751]
[0752]
[0753] 实施例17
[0754] 通过差示扫描量热法(DSC)进行热稳定性分析
[0755] 基本上如实施例10所述构建在特定位置处具有取代和/或缺失的其他位点特异性变体，并如实施例11中所述纯化。
[0756] 使用VP-毛细管差示扫描量热计(MicroCal Inc.,Piscataway,NJ,USA)，通过差示扫描量热法(DSC)，在pH 4.0或4.8(50mM乙酸钠)下，测定纯化的源自Po-AMG PE001的变体的热稳定性。热变性温度Td(℃)取为以恒定的程序化加热速率200K/小时对所选的缓冲液(50mM乙酸钠，pH 4.0或4.8)中的酶溶液加热之后得到的热解曲线(Cp vs.T)中变性峰(主要吸热峰)的顶点。
[0757] 将样品和参照溶液(大约0.3ml)从10℃贮存条件装载到量热计中(参照：没有酶的缓冲液)，并且在20℃到110℃的DSC扫描之前，在20℃下预先热平衡10分钟。变性温度以大约+/-1℃的精度测定。
[0758] 分离的变体和DSC数据公开于下表16中。
[0759] 表16
[0760]
[0761]
[0762]
[0763] 实施例18
[0764] 通过热应激测试和pNPG检定分析热稳定性
[0765] 从来自实施例10的一种识别的取代变体(识别为PE008)开始，通过热应激检定对其他变体进行测试，其中在83℃下热休克5分钟之后，检定来自生长培养物的上清液的葡糖淀粉酶(AMG)活性。
[0766] 热休克之后，测量变体的残余活性，并在未应激的样品中测量。
[0767] Po-AMG pNPG活性检定说明：
[0768] 草酸青霉葡糖淀粉酶pNPG活性检定是光谱测定的终点检定，其中将样品分成两份，并经热应激和不经热应激测量。因此，输出的数据是应激样品中残余活性的度量。
[0769] 生长：
[0770] 将无菌微量滴定板(MTP)每孔加入200微升富生长介质(FT X-14，无Dowfax)。将兴趣菌株直接从冷冻的贮液接种到MTP中，接种三份。将基准接种到20孔中。具有介质的未接种的孔用作检定空白。将MTP置于含有湿纸巾的塑料箱中，以防止孵育过程中孔的蒸发。塑料箱置于34℃下4天。
[0771] 检定：
[0772] 将50微升上清液转移至50微升0.5M NaAc pH 4.8中，以得到正确的样品pH。
[0773] 将50微升稀释液转移至PCR板，并在PCR机中在83℃下热应激5分钟。剩余一半稀释液保持在RT下。
[0774] 将20微升两种应激和未应激的样品转移至标准MTP。加入20微升pNPG-底物，使反应开始。将板在RT下孵育1小时。
[0775] 终止反应，并通过加入50微升0.5M Na2CO3显色。在405nm处在读板仪(Molecular Devices)上测量黄色。
[0776] 缓冲液：
[0777] 0.5M NaAc pH 4.8
[0778] 0.25M NaAc pH 4.8
[0779] 底物，6mM pNPG：
[0780] 15mg 4-硝基苯基D-吡喃葡萄糖苷，10mL 0.25NaAc pH 4.8中
[0781] 终止/显色溶液：
[0782] 0.5M Na2CO3
[0783] 数据处理：
[0784] 在Excel中，将来自应激和未应激样品的原始Abs405数据均减去其各自的空白。计算残余活性(％残余活性＝(Abs未应激(Abs未应激–Abs应激))/Abs未应激*100％)，并相对于基准Po-amg0008作图。
[0785] 表17
[0786]
[0787] 表18
[0788]
[0789]
[0790] 实施例19
[0791] 测试根据本发明的热稳定性变体的葡糖淀粉酶活性
[0792] 使用实施例18中所述的pNPG检定，确认表16、17和18中公开的所有上述变体在培养物上清液上的葡糖淀粉酶活性。
[0793] 实施例20
[0794] 使用(α-淀粉酶1407或369)和蛋白酶Pfu用于液化的乙醇制造
[0795] 该实验的目的在于评价α-淀粉酶1407和α-淀粉酶369与源自强烈炽热球菌的蛋白酶Pfu组合在pH 4.8、5.3和5.8下在85℃下液化2小时的过程中加入的应用性能。
[0796] 液化(Labomat)
[0797] 每次液化接收磨碎的玉米(85.6％DS)、backset(6.27％DS)和自来水，目标为总重量140g，32.50％干固体(DS)。Backset以总浆料重量的30％w/w混合。最初的浆料pH大约为5.2，并在液化之前使用50％w/w氢氧化钠或40％v/v硫酸调节至pH 4.8、5.3或5.8。根据以下表19中列出的实验设计加入所有的酶。液化使用以下条件在Labomat中发生：5℃/分钟跃变，跃变17分钟，103分钟保持时间，整个运行中40rpm，200mL不锈钢筒。液化之后，将所有的筒在冰浴中冷却，并在SSF下基于以下列出的方案准备发酵。
[0798] 同时糖化和发酵(SSF)
[0799] 将各个醪液用50％w/w氢氧化钠或40％v/v硫酸调节至pH 5.0。向各个醪液应用青霉素，至总浓度为3ppm。通过相对于每15mL预先打孔以允许CO2释放的试管中等分大约4.5g醪液，将试管准备为具有醪液。
[0800] 将葡糖淀粉酶BL2以0.54AGU/gDS投放至每个醪液试管，每个试管中加最少的水，以使固体标准化，并且每个醪液样品均接收100μL再水化的酵母。再水化的酵母通过将5.5g Fermentis RED STAR混合到100mL 32℃自来水中至少15分钟而制备。
[0801] HPLC分析
[0802] 发酵大约54小时后进行发酵取样。每个样品用50μL 40％v/v H2SO4灭活，涡流，在1460×g下离心10分钟，并通过0.45μm Whatman PP滤器过滤。在HPLC下分析54小时样品而无需进一步稀释。在HPLC分析之前和过程中，样品贮存在4℃。
[0803]
[0804] 该方法使用乙醇校正标准(％w/v)对分析物进行定量。使用包括原点的四点校正进行定量。
[0805] 当适用时，使用JMP软件(Cary,NC)以使用Tukey-Kramer HSD或Dunnett’s进行配对的单因素方差分析来对数据进行分析。通过将单因素方差分析的标准误差乘以1.96，建立表示95％置信水平的误差条。
[0806] 表19.液化实验设计
[0807]
[0808] 结果：
[0809]
[0810] 这些结果表明，热稳定性α-淀粉酶、葡糖淀粉酶和热稳定性蛋白酶在液化中可以一起使用，以便与单独的α-淀粉酶A(AAA)相比较增加乙醇的产率。
[0811] 总结性段落
[0812] 本发明在权利要求和所附说明书中定义。出于方便起见，本发明的其他方面在此通过编号段落的方式给出：
[0813] 1.一种由含有淀粉的材料制造发酵产物的方法，其包括以下步骤：
[0814] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[0815] -α-淀粉酶；
[0816] -在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和
[0817] -任选的产生碳水化合物源的酶；
[0818] ii)使用产生碳水化合物源的酶进行糖化；
[0819] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[0820] 2.根据段落1所述的方法，其在液化步骤i)之前还包括以下步骤：
[0821] a)优选地通过干磨降低含有淀粉的材料的粒径；
[0822] b)形成包括含有淀粉的材料和水的浆料。
[0823] 3.根据段落1-2中任一段所述的方法，其中将至少50％、优选至少70％、更优选至少80％、特别是至少90％的含有淀粉的材料通过具有#6筛网的筛子。
[0824] 4.根据段落1-3中任一段所述的方法，其中液化过程中pH为大于5.0至6.5，例如大于5.0至6.0，例如大于5.0至5.5，例如5.2-6.2，例如大约5.2，例如大约5.4，例如大约5.6，例如大约5.8。
[0825] 5.根据段落1-4中任一段所述的方法，其中液化过程中温度范围为70-100℃，例如75-95℃，例如75-90℃，优选80-90℃，例如，大约85℃。
[0826] 6.根据段落1-5中任一段所述的方法，其中在步骤i)中的液化之后进行喷射烹煮(jet-cooking)步骤。
[0827] 7.根据段落6所述的方法，其中喷射烹煮在110-145℃，优选120-140℃，例如125-135℃，优选大约130℃的温度下进行大约1-15分钟，优选大约3-10分钟，特别是大约5分钟。
[0828] 8.根据段落1-7中任一段所述的方法，其中糖化和发酵顺序进行或同时进行。
[0829] 9.根据段落1-8中任一段所述的方法，其中糖化在20-75℃，优选40-70℃，例如大约60℃的温度下，在4-5的pH下进行。
[0830] 10.根据段落1-9中任一段所述的方法，其中发酵或同时的糖化和发酵(SSF)在25℃-45℃，例如28℃-35℃，例如30℃-34℃，优选大约32℃的温度下进行。在一实施方式中，发酵持续进行6-120小时，特别是24-96小时。
[0831] 11.根据段落1-10中任一段所述的方法，其中在发酵之后，例如通过蒸馏，回收发酵产物。
[0832] 12.根据段落1-11中任一段所述的方法，其中发酵产物是醇，优选乙醇，特别是燃料乙醇、可饮用乙醇和/或工业乙醇。
[0833] 13.根据段落1-12中任一段所述的方法，其中含有淀粉的起始原料是全谷物。
[0834] 14.根据段落1-13中任一段所述的方法，其中含有淀粉的材料源自玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍(milo)、西米、木薯(cassava)、树薯(manioc)、木薯粉(tapioca)、高粱、大米或马铃薯。
[0835] 15.根据段落1-14中任一段所述的方法，其中发酵有机体是酵母，优选酵母属(Saccharomyces)菌株，特别是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisae)菌株。
[0836] 16.根据段落1-15中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶是细菌或真菌α-淀粉酶。
[0837] 17.根据段落1-16中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶来自芽孢杆菌(Bacillus)属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1所示者。
[0838] 18.根据段落17所述的方法，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体截短的，优选至具有大约491个氨基酸，例如480-495个氨基酸。
[0839] 19.根据段落17或18中任一段所述的方法，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有I181+G182位处的双缺失以及任选的N193F取代，或R179和G180缺失(编号使用SEQ ID NO:1)。
[0840] 20.根据段落17-19中任一段所述的方法，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在S242位具有取代，优选S242Q取代。
[0841] 21.根据段落17-20中任一段所述的方法，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在E188位具有取代，优选E188P取代。
[0842] 22.根据段落1-21中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70。
[0843] 24.根据段落1-22中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶选自除I181*+G182*和任选的N193F以外还具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：
[0844]
[0845]
[0846] 24.根据段落1-22中任一段所述的方法，其中α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：
[0847] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
[0848] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[0849] -I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
[0850] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用SEQ ID NO:1)。
[0851] 25.根据段落1-24中任一段所述的方法，其中蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于25％。
[0852] 26.根据段落1-25中任一段所述的方法，其中蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，例如大于105％，例如大于110％，例如大于115％，例如大于120％。
[0853] 27.根据段落1-26中任一段所述的方法，其中蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为20-50％，例如20-40％，例如20-30％。
[0854] 28.根据段落1-27中任一段所述的方法，其中蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为50-115％，例如50-70％，例如50-60％，例如100-120％，例如105-115％。
[0855] 29.根据段落1-28中任一段所述的方法，其中蛋白酶在85℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性大于10％，例如，大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于
110％。
[0856] 30.根据段落1-29中任一段所述的方法，其中蛋白酶在85℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为10-50％，例如10-30％，例如10-25％。
[0857] 31.根据段落1-30中任一段所述的方法，其中蛋白酶在85℃下使用Zein-BCA检定测定的热稳定性大于60％，例如大于90％，例如大于100％，例如大于110％。
[0858] 32.根据段落1-31中任一段所述的方法，其中蛋白酶在85℃下使用Zein-BCA检定测定的热稳定性为60-120％，例如70-120％，例如90-120％，例如100-120％，例如110-120％。
[0859] 33.根据段落1-32中任一段所述的方法，其中蛋白酶是真菌来源的。
[0860] 34.根据段落1-33中任一段所述的方法，其中蛋白酶是源自以下的金属蛋白酶的变体：嗜热子囊菌属菌株，优选橙橘嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，特别是嗜热子囊菌CGMCC No.0670。
[0861] 35.根据段落1-34中任一段所述的方法，其中蛋白酶是公开为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2的成熟部分，或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分，突变选自以下：
[0862] -S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0863] -D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
[0864] -S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0865] -N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0866] -T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；
[0867] -D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；
[0868] -A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；
[0869] -D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
[0870] -D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；
[0871] -D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；
[0872] -D79L+S87P+A112P+D142L；
[0873] -D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；
[0874] -S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
[0875] -D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；
[0876] -A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；
[0877] -D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；
[0878] -D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；
[0879] -S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0880] -A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0881] -S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0882] -S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；
[0883] -D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；
[0884] -D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
[0885] -S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；
[0886] -D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；
[0887] -S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；
[0888] -D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；
[0889] -D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；
[0890] -Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；
[0891] -Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0892] -A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0893] -A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0894] -A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0895] -A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；
[0896] -A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；和
[0897] -D79L+S87P+D142L。
[0898] 36.根据段落1-35中任一段所述的方法，其中蛋白酶是公开为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2的成熟部分，或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分，其具有以下突变：
[0899] D79L+S87P+A112P+D142L；
[0900] D79L+S87P+D142L；或
[0901] A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
[0902] 37.根据段落1-36中任一段所述的方法，其中蛋白酶变体与WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，再更优选至少93％，最优选至少94％，再最优选至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％同一性。
[0903] 38.根据段落1-37中任一段所述的方法，其中SEQ ID NO:3中所示的橙橘嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体是以下之一：
[0904] -D79L S87P D142L
[0905] -D79L S87P A112P D142L
[0906] -D79L Y82F S87P A112P D142L
[0907] -S38T D79L S87P A112P A126V D142L
[0908] -D79L Y82F S87P A112P A126V D142L
[0909] -A27K D79L S87P A112P A126V D142L
[0910] -S49P D79L S87P A112P D142L
[0911] -S50P D79L S87P A112P D142L
[0912] -D79L S87P D104P A112P D142L
[0913] -D79L Y82F S87G A112P D142L
[0914] -S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L
[0915] -D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L
[0916] -S70V D79L Y82F S87G A112P D142L
[0917] -D79L Y82F S87G D104P A112P D142L
[0918] -D79L Y82F S87G A112P A126V D142L
[0919] -Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L
[0920] -Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L
[0921] -A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L。
[0922] 39.根据段落1-38中任一段所述的方法，其中蛋白酶是细菌来源的。
[0923] 40.根据段落1-39中任一段所述的方法，其中蛋白酶源自炽热球菌属(Pyrococcus)菌株，优选强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)菌株。
[0924] 41.根据段落1-40中任一段所述的方法，其中蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13所示者。
[0925] 42.根据段落1-41中任一段所述的方法，其中蛋白酶是与US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的蛋白酶。
[0926] 43.根据段落1-42中任一段所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在和/或加入产生碳水化合物源的酶，优选葡糖淀粉酶。
[0927] 44.根据段落1-43中任一段所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在和/或加入的产生碳水化合物源的酶是在85℃、pH 5.3的条件下热稳定性为至少20％，例如至少30％，优选至少35％的葡糖淀粉酶。
[0928] 45.根据段落43-44中任一段所述的方法，其中产生碳水化合物源的酶是在最佳pH 5.0的pH下相对活性为至少90％，优选至少95％，优选至少97％的葡糖淀粉酶。
[0929] 46.根据段落43-45中任一段所述的方法，其中产生碳水化合物源的酶是在pH 5.0下pH稳定性为至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶。
[0930] 47.根据段落43-46中任一段所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在和/或加入的产生碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶，其优选源自青霉菌(Penicillium)属菌株，特别是草酸青霉(Penicillium oxalicum)菌株，公开为WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NOs:9或14。
[0931] 48.根据段落43-47中任一段所述的方法，其中葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NOs:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，再更优选至少93％，最优选至少
94％，再最优选至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。
[0932] 49.根据段落43-48中任一段所述的方法，其中产生碳水化合物源的酶是具有K79V取代的公开为WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2的源自草酸青霉菌株的葡糖淀粉酶的变体(编号使用SEQ ID NO:14所示的成熟序列)。
[0933] 50.根据段落43-49中任一段所述的方法，其中草酸青霉葡糖淀粉酶具有K79V取代(编号使用SEQ ID NO:14)以及以下之一：
[0934] T65A；或
[0935] Q327F；或
[0936] E501V；或
[0937] Y504T；或
[0938] Y504*；或
[0939] T65A+Q327F；或
[0940] T65A+E501V；或
[0941] T65A+Y504T；或
[0942] T65A+Y504*；或
[0943] Q327F+E501V；或
[0944] Q327F+Y504T；或
[0945] Q327F+Y504*；或
[0946] E501V+Y504T；或
[0947] E501V+Y504*；或
[0948] T65A+Q327F+E501V；或
[0949] T65A+Q327F+Y504T；或
[0950] T65A+E501V+Y504T；或
[0951] Q327F+E501V+Y504T；或
[0952] T65A+Q327F+Y504*；或
[0953] T65A+E501V+Y504*；或
[0954] Q327F+E501V+Y504*；或
[0955] T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0956] T65A+Q327F+E501V+Y504*；
[0957] E501V+Y504T；或
[0958] T65A+K161S；或
[0959] T65A+Q405T；或
[0960] T65A+Q327W；或
[0961] T65A+Q327F；或
[0962] T65A+Q327Y；或
[0963] P11F+T65A+Q327F；或
[0964] R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或
[0965] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[0966] P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[0967] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[0968] R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或
[0969] P11F+T65A+Q327W；或
[0970] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0971] P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[0972] T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0973] T65A+S105P+Q327W；或
[0974] T65A+S105P+Q327F；或
[0975] T65A+Q327W+S364P；或
[0976] T65A+Q327F+S364P；或
[0977] T65A+S103N+Q327F；或
[0978] P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或
[0979] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或
[0980] P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或
[0981] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或
[0982] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或
[0983] P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或
[0984] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或
[0985] P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或
[0986] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
[0987] P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或
[0988] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或
[0989] P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或
[0990] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或
[0991] P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或
[0992] P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
[0993] P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0994] P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0995] K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0996] P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0997] P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[0998] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或
[0999] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或
[1000] P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
[1001] P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或
[1002] P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[1003] P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或
[1004] P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或
[1005] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
[1006] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或
[1007] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[1008] P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或
[1009] K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[1010] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或
[1011] P2N+P4S+P11F+T65A+K79A+Q327F+E501V+Y504T；或
[1012] P2N+P4S+P11F+T65A+K79G+Q327F+E501V+Y504T；或
[1013] P2N+P4S+P11F+T65A+K79I+Q327F+E501V+Y504T；或
[1014] P2N+P4S+P11F+T65A+K79L+Q327F+E501V+Y504T；或
[1015] P2N+P4S+P11F+T65A+K79S+Q327F+E501V+Y504T；或
[1016] P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或
[1017] S255N+Q327F+E501V+Y504T；或
[1018] P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；或
[1019] P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或
[1020] P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或
[1021] P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或
[1022] P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或
[1023] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或
[1024] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或
[1025] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或
[1026] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或
[1027] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或
[1028] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或
[1029] P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。
[1030] 51.根据段落43-50中任一段所述的方法，进一步地，其中在糖化和/或发酵过程中存在和/或加入葡糖淀粉酶。
[1031] 52.根据段落1-51中任一段所述的方法，其中糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属(Aspergillus)菌株，优选黑曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉(A.oryzae)；或木霉属(Trichoderma)菌株，优选里氏木霉(T.reesei)；或踝节菌属(Talaromyces)菌株，优选埃默森踝节菌
(T.emersonii)，或密孔菌属(Pycnoporus)菌株，或褐褶菌属(Gloephyllum菌株)，或黑层孔菌属(Nigrofomes)菌株。
[1032] 53.根据段落1-52中任一段所述的方法，进一步地，其中在液化和/或糖化过程中存在支链淀粉酶。
[1033] 54.根据段落53所述的方法，其中在液化步骤i)过程中存在或加入的支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶，其中支链淀粉酶优选包括WO 2011/087836中公开的X47结构域。
[1034] 55.根据段落53-54所述的方法，其中支链淀粉酶源自Thermococcus属菌株，其包括嗜热高温球菌和热水高温球菌或其杂交体。
[1035] 56.根据段落53-55中任一段所述的方法，其中支链淀粉酶是在X4位截短的热水高温球菌支链淀粉酶，或具有截短X4位的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂交酶，公开于WO 2011/087836或示于本文的SEQ ID NO:12。
[1036] 57.根据段落1-56中任一段所述的方法，其包括以下步骤：
[1037] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[1038] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
[1039] -在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的源自强烈炽热球菌或橙橘嗜热子囊菌的蛋白酶；和
[1040] -任选的草酸青霉葡糖淀粉酶；
[1041] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[1042] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[1043] 58.根据段落1-56所述的方法，其包括以下步骤：
[1044] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[1045] -α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10；
[1046] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌或橙橘嗜热子囊菌，在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；
[1047] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[1048] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[1049] 59.根据段落1-56所述的方法，其包括以下步骤：
[1050] i)在5.0-6.0的pH范围下在80-90℃的温度下使含有淀粉的材料液化：
[1051] -α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10；
[1052] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌或橙橘嗜热子囊菌，在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；
[1053] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[1054] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[1055] 60.根据段落1-56所述的方法，其包括以下步骤：
[1056] i)在5.0-7.0的pH范围下在高于初始凝胶化温度的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[1057] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182和任选的取代N193F；并任选地进一步具有以下组取代之一：
[1058] -E129V+K177L+R179E；
[1059] -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[1060] -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用本文中的SEQ ID NO:1)；
[1061] -源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌的在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和任选地，
[1062] -具有选自以下的取代的SEQ ID NO:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：
[1063] -K79V；
[1064] -K79V+P11F+T65A+Q327F；或
[1065] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[1066] -K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[1067] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[1068] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[1069] -K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(编号使用SEQ ID NO:14)；
[1070] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[1071] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[1072] 61.根据段落1-56中任一段所述的方法，其包括以下步骤：
[1073] i)在5.0-6.0的pH范围下在80-90℃的温度下使用以下物质使含有淀粉的材料液化：
[1074] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182和任选的取代N193F；并任选地进一步具有以下组取代之一：
[1075] -E129V+K177L+R179E；
[1076] -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[1077] -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用本文中的SEQ ID NO:1)；
[1078] -源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌的在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和任选地，
[1079] -具有选自以下的取代的SEQ ID NO:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：
[1080] -K79V；
[1081] -K79V+P11F+T65A+Q327F；或
[1082] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[1083] -K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[1084] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[1085] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[1086] -K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(编号使用SEQ ID NO:14)；
[1087] ii)使用葡糖淀粉酶进行糖化；
[1088] iii)使用发酵有机体进行发酵。
[1089] 62.根据段落57-61中任一段所述的方法，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文中SEQ ID NO:1)是成熟的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟α-淀粉酶。
[1090] 63.根据段落57-61中任一段所述的方法，其中强烈炽热球菌蛋白酶(SEQ ID NO:13)和/或橙橘嗜热子囊菌蛋白酶(SEQ ID NO:3)是成熟的蛋白酶或分别与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟蛋白酶。
[1091] 64.根据段落57-61中任一段所述的方法，其中草酸青霉葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:14)或其变体是成熟的葡糖淀粉酶或与本文SEQ ID NO:14具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟葡糖淀粉酶。
[1092] 65.一种酶组合物，其包括：
[1093] i)α-淀粉酶；
[1094] ii)在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和任选地，[1095] iii)产生碳水化合物源的酶。
[1096] 66.根据段落65所述的组合物，其中α-淀粉酶是细菌或真菌的α-淀粉酶。
[1097] 67.根据段落65-66中任一段所述的组合物，其中α-淀粉酶来自芽孢杆菌属，例如嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，特别是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的变体，例如WO 99/019467中的SEQ ID NO:3或本文SEQ ID NO:1所示者。
[1098] 68.根据段落67所述的组合物，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶或其变体是截短的，优选至具有大约491个氨基酸，例如480-495个氨基酸。
[1099] 69.根据段落65-68中任一段所述的组合物，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶具有I181+G182位处的双缺失以及任选的N193F取代，或者R179和G180缺失(编号使用SEQ ID NO:1)。
[1100] 70.根据段落65-69中任一段所述的组合物，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在S242位具有取代，优选S242Q取代。
[1101] 71.根据段落65-70中任一段所述的组合物，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶在E188位具有取代，优选E188P取代。
[1102] 72.根据段落65-71中任一段所述的组合物，其中α-淀粉酶在pH4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10，例如至少15，例如至少20，例如至少25，例如至少30，例如至少40，例如至少50，例如至少60，例如10-70，例如15-70，例如20-70，例如25-70，例如30-70，例如40-70，例如50-70，例如60-70。
[1103] 73.根据段落65-72中任一段所述的组合物，其中α-淀粉酶选自嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体：
[1104] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E；
[1105] -I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[1106] -I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
[1107] -I181*+G182*+N193F+E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S。
[1108] 74.根据段落65-73中任一段所述的组合物，其中蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于25％。
[1109] 75.根据段落65-74中任一段所述的组合物，其中蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，例如大于105％，例如大于110％，例如大于115％，例如大于120％。
[1110] 76.根据段落65-75中任一段所述的组合物，其中蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为20-50％，例如20-40％，例如20％和30％。
[1111] 77.根据段落65-76中任一段所述的组合物，其中蛋白酶在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为50-115％，例如50-70％，例如50-60％，例如100-120％，例如105-115％。
[1112] 78.根据段落65-77中任一段所述的组合物，其中蛋白酶在85℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性大于10％，例如，大于12％，大于14％，大于16％，大于18％，大于20％，大于30％，大于40％，大于50％，大于60％，大于70％，大于80％，大于90％，大于100％，大于110％。
[1113] 79.根据段落65-78中任一段所述的组合物，其中蛋白酶在85℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性为10-50％，例如10-30％，例如10-25％。
[1114] 80.根据段落65-79中任一段所述的组合物，其中蛋白酶在85℃下使用Zein-BCA检定测定的热稳定性大于60％，例如大于90％，例如大于100％，例如大于110％。
[1115] 81.根据段落65-80中任一段所述的组合物，其中蛋白酶在85℃下使用Zein-BCA检定测定的热稳定性为60-120％，例如70-120％，例如80-120％，例如90-120％，例如100-120％，例如110-120％。
[1116] 82.根据段落65-81中任一段所述的组合物，其中蛋白酶是真菌来源的。
[1117] 83.根据段落65-82中任一段所述的组合物，其中蛋白酶是源自以下的金属蛋白酶的变体：嗜热子囊菌属菌株，优选橙橘嗜热子囊菌菌株，特别是橙橘嗜热子囊菌CGMCC No.0670。
[1118] 84.根据段落65-83中任一段所述的组合物，其中蛋白酶是公开为以下的金属蛋白酶的变体：WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2的成熟部分，或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分，其具有以下突变：
[1119] D79L+S87P+A112P+D142L；
[1120] D79L+S87P+D142L；或
[1121] A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。
[1122] 85.根据段落65-84中任一段所述的组合物，其中蛋白酶变体与WO 2003/048353中所公开的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:3的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，再更优选至少93％，最优选至少94％，再最优选至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的同一性。
[1123] 86.根据段落65-85中任一段所述的组合物，其中SEQ ID NO:3所示的橙橘嗜热子囊菌蛋白酶的蛋白酶变体是以下之一：
[1124] -D79L S87P D142L
[1125] -D79L S87P A112P D142L
[1126] -D79L Y82F S87P A112P D142L
[1127] -S38T D79L S87P A112P A126V D142L
[1128] -D79L Y82F S87P A112P A126V D142L
[1129] -A27K D79L S87P A112P A126V D142L
[1130] -S49P D79L S87P A112P D142L
[1131] -S50P D79L S87P A112P D142L
[1132] -D79L S87P D104P A112P D142L
[1133] -D79L Y82F S87G A112P D142L
[1134] -S70V D79L Y82F S87G Y97W A112P D142L
[1135] -D79L Y82F S87G Y97W D104P A112P D142L
[1136] -S70V D79L Y82F S87G A112P D142L
[1137] -D79L Y82F S87G D104P A112P D142L
[1138] -D79L Y82F S87G A112P A126V D142L
[1139] -Y82F S87G S70V D79L D104P A112P D142L
[1140] -Y82F S87G D79L D104P A112P A126V D142L
[1141] -A27K D79L Y82F S87G D104P A112P A126V D142L。
[1142] 87.根据段落65-86中任一段所述的组合物，其中蛋白酶是细菌来源的。
[1143] 88.根据段落65-87中任一段所述的组合物，其中蛋白酶源自炽热球菌属菌株，优选强烈炽热球菌菌株。
[1144] 89.根据段落65-88中任一段所述的组合物，其中蛋白酶是US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13所示者。
[1145] 90.根据段落65-89中任一段所述的组合物，其中蛋白酶是与US 6,358,726中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:13具有至少80％，例如至少85％，例如至少90％，例如至少95％，例如至少96％，例如至少97％，例如至少98％，例如至少99％同一性的蛋白酶。
[1146] 91.根据段落65-90中任一段所述的组合物，其中产生碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶。
[1147] 92.根据段落65-91中任一段所述的组合物，其中产生碳水化合物源的酶是在85℃、pH 5.3的条件下热稳定性为至少20％，例如至少30％，优选至少35％的葡糖淀粉酶。
[1148] 93.根据段落64-92中任一段所述的组合物，其中产生碳水化合物源的酶是在最佳pH 5.0的pH下相对活性为至少90％，优选至少95％，优选至少97％的葡糖淀粉酶。
[1149] 94.根据段落65-93中任一段所述的组合物，其中产生碳水化合物源的酶是在pH 5.0下pH稳定性为至少80％，至少85％，至少90％的葡糖淀粉酶。
[1150] 95.根据段落65-94中任一段所述的组合物，其中产生碳水化合物源的酶是葡糖淀粉酶，其优选源自青霉菌属菌株，特别是草酸青霉菌株，公开为WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NOs:9或14。
[1151] 96.根据段落65-95中任一段所述的组合物，其中葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文中的SEQ ID NOs:9或14所示的成熟多肽具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，再更优选至少93％，最优选至少
94％，再最优选至少95％，例如，再至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。
[1152] 97.根据段落65-96中任一段所述的组合物，其中产生碳水化合物源的酶是具有K79V取代的公开为WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2的源自草酸青霉菌株的葡糖淀粉酶的变体(编号使用SEQ ID NO:14所示的成熟序列)。
[1153] 98.根据段落65-96中任一段所述的组合物，还包括葡糖淀粉酶。
[1154] 99.根据段落65-98中任一段所述的组合物，其中糖化和/或发酵过程中存在和/或加入的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选来自曲霉属菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉；或木霉属菌株，优选里氏木霉；或踝节菌属菌株，优选埃默森踝节菌，或密孔菌属菌株，或褐褶菌属菌株，或黑层孔菌属菌株。
[1155] 100.根据段落65-98中任一段所述的组合物，还包括支链淀粉酶。
[1156] 101.根据段落100所述的组合物，其中支链淀粉酶是GH57家族支链淀粉酶，其中支链淀粉酶优选包括WO 2011/087836中公开的X47结构域。
[1157] 102.根据段落100-101所述的组合物，其中支链淀粉酶源自Thermococcus属菌株，其包括嗜热高温球菌和热水高温球菌或其杂交体。
[1158] 103.根据段落100-102中任一段所述的组合物，其中支链淀粉酶是在X4位截短的热水高温球菌支链淀粉酶，或具有截短X4位的热水高温球菌/嗜热高温球菌杂交酶，公开于WO 2011/087836或示于本文的SEQ ID NO:12。
[1159] 104.根据段落65-103中任一段所述的组合物，其包括：
[1160] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶；
[1161] -在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的源自强烈炽热球菌或橙橘嗜热子囊菌的蛋白酶；和
[1162] -任选的源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。
[1163] 105.根据段落65-104所述的组合物，其包括：
[1164] -α-淀粉酶，优选源自嗜热脂肪芽孢杆菌，在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2的条件下的T1/2(分钟)为至少10；
[1165] -蛋白酶，优选源自强烈炽热球菌或橙橘嗜热子囊菌，在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％；和
[1166] -任选的源自草酸青霉的葡糖淀粉酶。
[1167] 106.根据段落64-104所述的组合物，其包括：
[1168] -源自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶，其具有双缺失I181+G182和任选的取代N193F；并任选地进一步具有以下组取代之一：
[1169] -E129V+K177L+R179E；
[1170] -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+H208Y+K220P+N224L+Q254S；
[1171] -V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V；和
[1172] -E129V+K177L+R179E+K220P+N224L+S242Q+Q254S(编号使用本文中的SEQ ID NO:1)；
[1173] -优选源自强烈炽热球菌和/或橙橘嗜热子囊菌的在80℃/70℃下测定为相对活性的热稳定性值大于20％的蛋白酶；和
[1174] -任选的具有选自以下的取代的SEQ ID NO:14的草酸青霉葡糖淀粉酶：
[1175] -K79V；
[1176] -K79V+P11F+T65A+Q327F；或
[1177] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或
[1178] -K79V+P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或
[1179] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或
[1180] -K79V+P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或
[1181] -K79V+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T(编号使用SEQ ID NO:14)。
[1182] 107.根据段落65-106中任一段所述的组合物，其中嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶(本文中SEQ ID NO:1)或其变体是成熟的α-淀粉酶或与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟α-淀粉酶。
[1183] 108.根据段落65-107中任一段所述的组合物，其中强烈炽热球菌蛋白酶(SEQ ID NO:13)和/或橙橘嗜热子囊菌蛋白酶(SEQ ID NO:3)或其变体是成熟的蛋白酶或分别与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:3具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟蛋白酶。
[1184] 109.根据段落65-108中任一段所述的组合物，其中草酸青霉葡糖淀粉酶(本文的SEQ ID NO:14)或其变体是成熟的葡糖淀粉酶或与本文SEQ ID NO:14具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性的相应的成熟葡糖淀粉酶。
[1185] 110.一种变体α-淀粉酶，其在与59、89、129、177、179、254、284位相对应的位置处包括突变，其中变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且变体具有α-淀粉酶活性。
[1186] 111.根据段落110所述的变体，其在与59位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp或Tyr，特别是以Ala、Gln、Glu、Gly、Ile、Leu、Pro或Thr进行的取代。
[1187] 112.根据段落110或111所述的变体，其在与89位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Arg、His或Lys进行的取代。
[1188] 113.根据段落110-112中任一段所述的变体，其在与129位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Ala、Thr或Val进行的取代。
[1189] 114.根据段落110-113中任一段所述的变体，其在与177位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Arg、Leu或Met进行的取代。
[1190] 115.根据段落110-114中任一段所述的变体，其在与179位相对应的位置处包括以Ala、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Gln、Glu、Ile、Leu、Lys或Val进行的取代。
[1191] 116.根据段落110-115中任一段所述的变体，其在与254位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以Ala、Ser或Thr进行的取代。
[1192] 117.根据段落110-116中任一段所述的变体，其在与284位相对应的位置处包括以Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr或Val，特别是以His、Thr或Val进行的取代。
[1193] 118.根据段落110-117中任一段所述的变体，其包括以下突变或由以下突变组成：V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V。
[1194] 119.根据段落110-1120中任一段所述的变体，其是来自以下多肽的亲本α-淀粉酶的变体：上述多肽与本文SEQ ID NO:1的成熟多肽或者具有α-淀粉酶活性的SEQ ID NO:1的成熟多肽的片段具有至少60％的序列同一性。
[1195] 120.根据段落119所述的变体，其中亲本α-淀粉酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少60％，例如，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，和100％的序列同一性。
[1196] 121.根据段落120所述的变体，其中亲本α-淀粉酶包括SEQ ID NO:1的成熟多肽的氨基酸序列或者由其组成。
[1197] 122.根据段落121所述的变体，其中亲本α-淀粉酶是SEQ ID NO:1的成熟多肽的氨基酸序列的片段，其中该片段具有α-淀粉酶活性。
[1198] 123.根据段落110-122中任一段所述的变体，其是亲本野生型α-淀粉酶的变体。
[1199] 124.根据段落123所述的变体，其中亲本α-淀粉酶是芽孢杆菌属α-淀粉酶。
[1200] 125.根据段落124所述的变体，其中亲本α-淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
[1201] 126.根据段落110-125中任一段所述的变体，其中α-淀粉酶是包括以下突变的SEQ ID NO:1所示的α-淀粉酶：I181+G182位的双缺失以及任选的N193F取代，或R179+G180位的双缺失。
[1202] 127.根据段落126所述的变体，其包括以下突变或者由其组成：I181*+G182*+N193F+V59A Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V(编号使用SEQ ID NO:1)。
[1203] 128.根据段落110-127中任一段所述的变体，其与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少65％，例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的序列同一性。
[1204] 129.根据段落110-1128中任一段所述的变体，其与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％，例如，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，但小于100％的序列同一性。
[1205] 130.根据段落110-129中任一段所述的变体，其中α-淀粉酶变体具有(天然)截短的本文SEQ ID NO:1所示的序列，使得其长度为大约491个氨基酸，例如长度为480-495个氨基酸。
[1206] 131.根据段落110-130中任一段所述的变体，其中α-淀粉酶变体是具有以下突变的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶：I181*+G182*+N193F+V59A+Q89R+E129V+K177L+R179E+Q254S+M284V，截短至491个氨基酸(编号使用SEQ ID NO:1)。
[1207] 132.根据段落110-131中任一段所述的变体用于洗涤和/或洗碗的用途。
[1208] 133.根据段落110-131中任一段所述的变体用于使纺织品退浆的用途。
[1209] 134.根据段落110-131中任一段所述的变体用于制造焙烤产品的用途。
[1210] 135.根据段落110-131中任一段所述的变体用于使含有淀粉的材料液化的用途。
[1211] 136.一种制造液化淀粉的方法，其包括用段落110-131中任一段所述的变体使含有淀粉的材料液化。
[1212] 137.一种分离的多核苷酸，其编码段落110-131中任一段所述的变体。
[1213] 138.一种核酸构建物，其包括段落137所述的多核苷酸。
[1214] 139.一种表达载体，其包括段落138所述的核酸构建物。
[1215] 140.一种宿主细胞，其包括段落136所述的核酸构建物。
[1216] 141.一种制造变体α-淀粉酶的方法，其包括：
[1217] a.在适合于变体表达的条件下培养段落140所述的宿主细胞；和
[1218] b.从介质中回收变体。
[1219] 142.一种用段落137所述的多核苷酸转化的转基因植物、植物部分或植物细胞。
[1220] 143.一种用于获得变体α-淀粉酶的方法，其包括：
[1221] a.在与59、89、129、177、179、254、284位相对应的位置处向亲本α-淀粉酶中引入突变，其中变体与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少65％且小于100％的序列同一性，并且变体具有α-淀粉酶活性；和
[1222] b.回收变体。
[1223] 144.根据段落143所述的变体，其中成熟多肽是包括以下突变的SEQ ID NO:1所示的α-淀粉酶：I181+G182位的双缺失，和任选的N193F取代，或R179+G180位的双缺失。
[1224] 本文描述并要求保护的发明范围并不受在此公开的具体方面的限制，因为这些方面是要作为本发明若干方面的示例说明。任何等同的方面是要落入本发明的范围内。事实上，除本文示出和描述的之外，根据前述描述得出本发明的各种修改方式对于本领域技术人员来说也是显而易见的。这些修改方式也要落入所附权利要求的范围之内。在冲突的情况下，以包括定义在内的本发明的公开内容为准。
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