[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，特别涉及一种神经干细胞培养方法。

[0002] 神经系统损伤性疾病包括缺血性脑病、出血性脑病、运动神经元疾病等，是一种严重威胁人类健康的疾病，提高这类疾病的生存率，降低致残率，最大限度地提高患者的生活质量，是防治此类疾病的首要任务。由于神经干细胞的发现使得神经系统损伤性疾病的治疗有了新的研究方向，神经干细胞也成为了生物医学工程以及体外模型研究中所必须的种子细胞。

[0003] 神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是具有分化为神经神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力，能自我更新，并足以提供大量脑组织细胞的细胞群，是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞，包括神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。1992年神经干细胞自成年动物脑纹状体内第一次被发现，从而打破了认为神经细胞不能再生的传统理论。根据分化潜能及产生子细胞种类神经干细胞可分为如下几类：(1)神经管上皮细胞：分裂能力最强，只存茌胚胎时期，可以产生放射状胶质神经元和神经母细胞。

[0004] (2)放射状胶质神经元：可以分裂产生本身并同时产生神经元前体细胞或是胶质细胞，主要作用是幼年时期神经发育过程中产生投射神经元完成大脑中皮质及神经核等的基本神经组织细胞。

[0005] (3)神经母细胞：成年人体中主要存在的神经干细胞，分裂能力可以产生神经前体细胞和神经元和各类神经胶质细胞。

[0006] (4)神经前体细胞：各类神经细胞的前体细胞，比如小胶质细胞是由神经胶质细胞前体产生的。

[0007] 神经干细胞作为生物医学工程以及体外模型研究中的种子细胞，需要将其在体外进行扩大培养，而如何在体外大规模培养神经干细胞便成为了医学研究的重点。现有的培养神经干细胞的常用培养基为GIBCO的含1 6 827的Neurobasal培养基，使用明胶预处理过~的培养瓶进行贴壁培养。但经过该培养基培养的神经干细胞增殖能力较弱。因此急需提供一种可增强神经干细胞增殖能力的培养方法。

[0008] 有鉴于此，本发明提供了一种神经干细胞贴壁培养方法。该神经干细胞培养方法能够大大增强神经干细胞的增殖能力，同时能够使得神经干细胞在不用明胶预铺板的惰况下贴壁生长，免除了繁琐的操作步骤简化了生产流程。

[0009] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：神经干细胞贴壁培养方法，其特征在于，采用含有10～20 u mol/mL非必需氨基酸、10～20ng／mL表皮生长因子、5～15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10～20 u g/mL胰岛素、40～60nmol/L氢化可的松、10～20nmol/LWNT3a、40～60nmol/L Notchl、40～60 u g/mL牛血清白蛋白、15～35ng/mL纤连蛋白、50一70ng/mL四型胶原蛋白的神经干细胞培养基培养神经干细胞。

[0010] 作为优选，所述培养的条件为5 6 CO：、37。C。 更进一步的优选是：所述培养的细~胞密度为5×l04～1×10 5/mL。

[0011] 其中非必需氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、甘氨酸、天门冬氨酸、胱氨酸、脯氨酸、笠氨酸或酪氨酸中的一种或两者以上的混合物。

[0012] 本发明至少具有如下优点：本发明提供的神经干细胞培养方法能够大大增强神经干细胞的增殖能力。流式检测结果显示，本发明培养基能够使P6代的神经干细胞的表面标志物Nestin+CD133+的比例能够达到33.3%，而传统培养基在P6代的Nestin+CD133+的比例仅为9.8%；本发明培养的神经干细胞在3～6天时具有明显的对数生长期，细胞增殖较快，而采用传统培养基培方法的神经干细胞的生长曲线显示细胞生长缓慢，无明显对数增殖。本发明培养基添加纤连蛋白和四型胶原蛋白，能够使得神经干细胞在不用明胶预铺板的情况下贴壁生长，免除了繁琐的操作步骤简化了生产流程。

[0013] 本发明提供的神经干细胞培养基及神经干细胞贴壁培养方法中所用试剂、仪器、试验动物等均可由市场购得。例如其中的WNT3a购自上海华骓思创，Notchl购自武汉福来生物；非必需氨基酸购自Gibco，货号为11140，MEM Non-Essentia Amino  Acids SolutionlOmM (100X)。下面结合实施例，进一步阐述本发明。实施例

[0014] 培养基的制备培养液配方成分为：DMEM/F12、10 u mol/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生长因子、
15ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、10 u g/mL胰岛素、50nmol/L氢化可的松、20nmol/LWNT3a、40nmol/L Notchl、50 u g／mL牛血清白蛋白、35ng／mL纤连蛋白、50ng/mL四型胶原蛋白。培养基制备方法为：使用时按照规定量将所有成分混合均匀。

[0015] 培养基培养神经细胞实例 出生1～4天的新生小鼠，脱颈处死后取新生小鼠大脑，剥去脑膜后用4。C PBS清洗2次，加入2mL神经干细胞培养液（试验组1采用实施例1培养基，试验组2采用实施例2培养基，试验组3采用实施例3培养基），并用手术剪将大脑剪碎，接着用ImL手动移液器将碎片吹散成混悬液，然后调整细胞密度到5×l04/mL。将混悬液加入6孔板，每孔2mL在5% CO，、37。C培养箱中放置2小时，2小时后吸取6孔板中的上清液，加入另一个6孔板中继续培养，原6孔板弃去不要。培养24小时后弃去6孔板中的上清液，每孔加入2mL神经干细胞培养液，之后每2～3天换液一次。直到细胞融合度达到80%时倒去培养基并用含0. 04v／v%EDTA的浓度为0.25v/v%的胰蛋白酶消化细胞1分钟，使其脱落，然后用各组所用培养基按照加入胰酶体积的5倍终止消化；离心后去除上清液，将沉淀细胞用各组所用培养基重悬，按照5×l04/mL的蜜度加入培养瓶中，标记为Pl代细胞。重复传代至P6代。将上述各组培养的神经干细胞进行流式检测， 神经干细胞的表面标志物Nestin+、CD133+的比例能够达到
33.3%、29.5%、24.3%，而传统培养基在P6代的Nestin+、CD133+的比例仅为9. 8% 。

[0016] 一般增殖能力强的细胞，生长曲线会呈“S”型，可分为3个生长时期：第一阶段为适应期，细胞增殖较慢：第二阶段为对数生长期，细胞增殖速度变快，呈对数生长；第三阶段为平台期，细胞增殖减缓。根据神经干细胞P6代七天的细胞生长曲线图 ，可看到0～2天为适应期，3～6天为对数生长期，细胞增殖较快，第7天细胞增殖变慢，进入了平台期。细胞生长曲线图可知，该细胞的增殖能力较强。而采用传统培养基培养的神经干细胞的生长曲线显示细胞生长缓慢，无明显对数增殖。可见，本发明提供的神经干细胞培养基能够大大增强神经干细胞的增殖能力。同时本发明的培养基能够使得神经干细胞在不用明胶预铺板的情况下贴壁生长，免除了繁琐的操作步骤简化了生产流程。