可缩放的细胞培养生物反应器和细胞培养方法

申请号 CN200980121214.1 申请日 2009-05-11 公开(公告)号 CN102057033B 公开(公告)日 2015-03-25
申请人 辛尼克萨生命科学(私人)有限公司; 发明人 W·爱德华兹; S·J·弗拉瑟;
摘要 本 发明 涉及可缩放的 生物 反应器 ,其包括:至少1个包括 歧管 和空心 纤维 膜装置的盒体;上顶板;和下顶板,其中盒体是模 块 化部件,其适于彼此配合及与顶板配合,以限定内部毛细管外培养空间(ECS),且其中空心纤维膜装置包括分离的入口和出口。本发明还涉及用于此类生物反应器的成套工具,用于此类生物反应器和利用细胞和/或 微生物 代谢的方法的盒体,所述方法包括利用本发明的生物反应器的步骤。
权利要求

1.可缩放的生物反应器,其包括:
至少1个盒体,所述盒体包括:歧管和空心纤维膜装置;
上顶板;和
下顶板,
其中所述盒体是模化部件,其适于与另一盒体和/或与所述上和下顶板配合,以限定内部毛细管外培养空间,且包括适于接收空心纤维膜的2个相对的歧管,其中所述空心纤维膜设置在基本上平行的膜层中,所述盒体包括多于一个层,各层相对于布置在其上和/或其下的膜层偏移,所述歧管在空心纤维膜的各端各接收空心纤维膜层,使得各膜层与其他膜层间隔,它们能使分开的和内含的流体流通过各膜层,且其中所述空心纤维膜装置包括分离的入口和出口,空心纤维膜的各层经所述入口和出口储液池与入口和出口连通,所述入口和出口储液池位于在所述空心纤维膜各端的歧管处,各储液池与相应入口或出口成流体连通,且其中所述盒的不同膜层彼此密封并且膜层内的各毛细管膜的开放端开向独立的储液池且被独立的储液池包括。
2.权利要求1的可缩放的生物反应器,其中空心纤维膜各层在平或竖直方向上与其上和/或其下层垂直设置。
3.权利要求1的可缩放的生物反应器,其中所述盒体针对每个功能包括1个空心纤维膜层。
4.盒体,其包括:
歧管,所述歧管适于接收空心纤维膜装置,和
用于各空心纤维膜装置的分离的入口和出口,且
其中所述盒体适于
与另一盒体接合,和/或
与上和下顶板接合,
以限定内部毛细管外培养空间,且
其中所述盒体是模块化部件,其适于与另一盒体和/或与所述上和下顶板配合,以限定内部毛细管外培养空间,且包括适于接收空心纤维膜的2个相对的歧管,其中所述空心纤维膜设置在基本上平行的膜层中,所述盒体包括多于一个层,各层相对于布置在其上和/或其下的膜层偏移,所述歧管在空心纤维膜的各端各接收空心纤维膜层,使得各膜层与其他膜层间隔,它们能使分开的和内含的流体流通过各膜层,且其中所述空心纤维膜装置包括分离的入口和出口,空心纤维膜的各层经所述入口和出口储液池与入口和出口连通,所述入口和出口储液池位于在所述空心纤维膜各端的歧管处,各储液池与相应入口或出口成流体连通,且其中所述盒的不同膜层彼此密封并且膜层内的各毛细管膜的开放端开向独立的储液池且被独立的储液池包括。
5.用于权利要求1的可缩放的生物反应器的成套工具,其包括:
歧管,所述歧管适于接收空心纤维膜装置、和
上和下顶板。
6.权利要求5的成套工具,其包括适于接收歧管的盒体,所述盒体适于与另一盒体和/或与所述上和下顶板配合。
7.权利要求5的成套工具,其包括至少1个空心纤维膜,所述空心纤维膜被配置为安装在所述歧管内。
8.权利要求6的成套工具,其中所述盒体包括适于接收所述空心纤维膜的2个相对的歧管,所述歧管通过侧向支撑件彼此连接,以形成框架
9.利用细胞和/或微生物代谢的方法,所述方法包括利用权利要求1的生物反应器的步骤。
10.权利要求9的方法,其中所述方法包括:将所述细胞和/或微生物接种到所述生物反应器的所述内部毛细管外培养空间中。
11.权利要求9的方法,其中,
所述细胞和/或微生物被固定于所述空心纤维膜的外表面,和/或
所述细胞和/或微生物被悬浮于所述内部毛细管外培养空间中。
12.权利要求9的方法,包括由标准交叉流操作或由死端操作通过所述空心纤维膜装置的入口系统的流体流。
13.权利要求9的方法,包括控制器,所述控制器用于调节通过所述空心纤维膜的流体传送。
14.权利要求9的方法,包括供给和/或移出物质,所述物质包括营养物、气体、缓冲剂、调控生长或改变代谢的化合物、耗竭的培养基、代谢废物、目的产物和热交换物质,其中所述物质
经所述盒体的入口或出口系统、和/或
通过所述上和下顶板中的开口
被供给到所述生物反应器中。
15.权利要求14的方法,其中所述气体选自和二氧化
16.权利要求14的方法,其中所述缓冲剂是酸性或性缓冲溶液。
17.权利要求14的方法,其中所述调控生长或改变代谢的化合物是激素
18.权利要求14的方法,其中所述开口是孔。
19.权利要求9~18中任一项的方法,其包括通过所述内部毛细管外培养空间的流体流,其中所述流体流还再循环或以死端模式循环。

说明书全文

可缩放的细胞培养生物反应器和细胞培养方法

【技术领域】

[0001] 本发明涉及可缩放的毛细管(空心纤维)膜生物反应器及其用途,其用于培养和维持细胞和/或微生物,以利用这些细胞的代谢,用于以提高的方法灵活性生产生物产物或生物转化。【背景技术】
[0002] 毛细管膜或空心纤维反应器(HFRs)已被广泛用于上游和下游过滤和纯化方法;在废处理中作为固定了微生物或酶的生物反应器;和作为细胞或组织培养系统。
[0003] 大多数细胞培养HFR设计使用轴流,其中分开的流体流通过膜两侧的膜表面(Chresand et al,1987)。通过增加包括在圆柱状歧管内的空心纤维束中的膜数来增加这些模,由此增加活跃的膜表面积。物质或营养物经膜表面通过扩散从一侧流体流向另一侧流体流交换。此导致跨纤维束的轴向和辅向营养物梯度,其会产生不均一性,不利地影响细胞生长,生物过程稳定性和产。这些不均一性随着HFR尺寸增大而增加。
[0004] 已将细胞培养HFR中的交叉流(正切)和死端(流通)过滤用于改善2个分开的流体流之间的物质交换,其中物质通过对流而非扩散运输穿过膜表面。这2种流体传送手段已被分别用于灌流(US4,804,628)和固定的(WO2007004170A2)细胞培养系统。各情况中观察到增强的营养物递送到细胞和从细胞培养空间移出代谢废物和/或生物目的产物。然而,仍观察到空心纤维束内的轴向梯度和不均一性,及限制HFR设计的规模。
[0005] 起初开发横向流模块用于过滤,渗透物蒸发废水处理过程,以限制轴向梯度和不均一性,允许沿膜表面良好限定的流体动力学进料流和渗流,由此控制浓度极化和优化基于浓度的跨膜推进力(Futselaar,1993)。这些模块中,毛细管膜的位置与进料流方向垂直。膜的规则设置防止了流错误分配,而横向定向显著增加了质量转移系数(Futselaar,1993)。此膜的均匀的2-D分布允许了改善的可缩放性,且已有几种设计的描述(Zhang et al 2003,Smart et al 1998, 1999)。各情况中固定了通过膜的流道,以
相同方向取向的全部膜被歧入单个流体入口和出口通道(图1A~C)。
[0006] US 5,516,691描述了改良的横向流模块,其中膜以3-D设置分布(图1D),其被用作用于培养和维持细胞及使用它们的代谢(代谢产物)的细胞培养设备。此生物反应器设计涵盖以下原理:通过交叉流和/或死端过滤改善质量转移,和通过其3-D纤维网络改善底物和代谢物交换和可控性,由此促进贯穿细胞培养空间的连贯的流体传送和导致改善的代谢和细胞活力。此3-D设置还促进至少3个独立的膜系统,各包括多个膜。第一膜系统用于培养基流入,第二膜系统用于供给O2或移出CO2,第三膜系统用于培养基流出。将膜系统和外部歧管之间的内部空间用作细胞培养空间。此设计首次将多维纤维设置应用于细胞培养,且给出概念,组织培养作为合成的器官或肝辅助装置,其中未考虑可缩放性。此外,以相同方向取向的各膜层被歧入单个流体入口和出口通道(图1D)。
[0007] 【发明概述】
[0008] 本发明第一方面提供了可缩放的生物反应器,其包括:
[0009] ●至少1个包括歧管和空心纤维膜装置的盒体;
[0010] ●上顶板;和
[0011] ●下顶板,
[0012] 其中盒体是模块化部件,其适于彼此配合及与顶板配合,以限定内部毛细管外培养空间(ECS),且其中空心纤维膜装置包括分离的入口和出口。
[0013] 优选入口和出口经空心纤维膜成流体连通。盒体优选包括入口和出口储液池,所述入口和出口储液池与(各)歧管成流体连通。歧管优选位于膜的各端,且各储液池与相应入口或出口成流体连通。
[0014] 各盒体优选仅包括分离的入口和出口,所述分离的入口和出口与储液池成流体连通,即未通过盒体与ECS成流体连通。
[0015] 空心纤维膜可设置在基本上平行的膜排中。各盒体优选包括1个或多个所述排。
[0016] 当各盒体包括多于1个所述层(排)时,空心纤维膜各层优选在水平或竖直方向上与其上和/或其下层垂直设置。空心纤维膜各层更优选相对于其上和/或其下的膜层偏移。
[0017] 生物反应器优选包括2个或多个盒体。各盒体可针对每个功能包括1个空心纤维膜层(排)。
[0018] 顶板优选包括向ECS的开口(孔),从而流体可导入,排出和/或使通过ECS自由流动。顶板可适于包括至少1个配件或孔,其使探头传感器插入到ECS隔间,从而可监控和/或控制ECS内的流体组成。各开口(孔)优选是可闭合的。与ECS成流体连通的此类孔优选仅位于顶板中/上,且非盒体中。
[0019] 本发明第二方面提供了盒体,所述盒体包括适于接收空心纤维膜装置的歧管,所述盒体还包括各空心纤维膜装置的分离的入口和出口,且其中所述盒体适于与另一盒体接合和/或与上和下顶板接合,以限定内部ECS。
[0020] 本发明第三方面提供了用于生物反应器的成套工具,其包括:
[0021] ●歧管,其适于接收空心纤维膜装置;和
[0022] ●上和下顶板。
[0023] 成套工具优选包括适于接收或包括歧管的盒体,所述盒体适于与另一盒体配合和/或与上和下顶板配合。成套工具还可包括至少1个空心纤维膜,所述空心纤维膜任选安装在歧管内。
[0024] 空心纤维膜优选为轴向延伸的空心管,形状如同饮水吸管。空心纤维膜优选选择性可渗透,且可为陶瓷膜。
[0025] 歧管可包括在框架中,所述框架包括2个(或多个)相对的歧管,所述歧管适于接收空心纤维膜,歧管彼此连接以形成框架。各歧管可包括适于接收空心纤维膜的孔。各盒体优选包括(入口或出口)储液池,其与歧管(孔)和入口或出口成流体连通,还与储液池成流体连通。
[0026] 储液池可通过框架与端板配合形成。
[0027] 盒体,框架,歧管,端板和顶板可由不锈或任何适宜形式的聚合物/塑料构成。
[0028] 本说明书中,对生物反应器的各部件(例如,盒体,歧管,框架和/或空心纤维膜)的描述适用于本发明的全部方面。
[0029] 本发明第四方面提供了利用细胞和/或微生物代谢的方法,所述方法包括利用本发明的生物反应器的步骤。
[0030] 所述方法可包括:将细胞和/或微生物接种到上述生物反应器的ECS中。优选地,细胞和/或微生物被固定于空心纤维膜外表面,和/或细胞和/或微生物被悬浮于ECS中。本领域技术人员会理解,ECS可含气体和/或液体。
[0031] 细胞可选自哺乳动物和昆虫细胞系,微生物可选自:细菌,酵母真菌。哺乳动物和昆虫细胞系优选,但不限于,贴壁依赖型细胞系,和微生物优选非丝状微生物。
[0032] 贴壁依赖性细胞系一般选自正常二倍体细胞系,例如人胚胎细胞系,人包皮细胞系,人胚胎肾细胞系,鸡、兔、小鼠和大鼠的胚胎成纤维细胞系,黑猩猩肝成纤维细胞系,大鼠神经胶质细胞系,猫肺成纤维细胞系和次代猴肾细胞系;原代细胞系,例如猴、狗和兔肾细胞系,小鼠巨噬细胞系,大鼠胰腺细胞系,大鼠肝细胞系,鸡胚胎成纤维细胞系,大鼠垂体细胞系和羊水细胞系;建立的和转化的细胞系,例如小鼠成纤维细胞系,正常大鼠肾细胞系,中国仓鼠卵巢和肺细胞系,幼仓鼠肾细胞系,黑猩猩胚胎肺细胞系,非洲绿猴肾细胞系,小鼠L细胞系,HeLa细胞系,小鼠巨噬细胞细胞系,转化的狗肾细胞系,肉瘤病毒转化的大鼠肾和小鼠成纤维细胞系,人神经胶质瘤细胞系,人骨肉瘤细胞系,小猎犬肾细胞系,KB细胞系,恒河猴肾细胞系,McCoy细胞系,人甲状腺癌细胞系,人横纹肌肉瘤细胞系,大鼠肌肉衍生的成纤维细胞系和兔膜细胞系。
[0033] 微生物一般选自正常的或转化的枯草杆菌,念珠菌属,大肠杆菌,汉森酵母属,乳酸克鲁维酵母,乳球菌属,乳杆菌属,葡萄球菌属,毕赤酵母属。酿酒酵母,粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母。
[0034] 所述方法可包括由标准交叉流操作或由死端操作通过空心纤维膜装置的入口系统的流体流。
[0035] 所述方法可包括控制器,所述控制器用于调节通过空心纤维膜的流体传送。控制器优选为特定集成的控制器,其可为压力控制器。
[0036] 所述方法优选包括供给和/或移出物质,所述物质包括营养物,气体,例如和二氧化,缓冲剂(酸性或性溶液),激素,调控生长或改变代谢的化合物,耗竭的培养基,代谢废物,目的产物,和热交换物质。所述物质可经盒体的入口或出口系统(即通过空心纤维膜)和/或通过上和下顶板中的开口(孔)被供给到细胞和/或微生物。
[0037] 所述方法可包括通过ECS的流体流,且所述流体流还可再循环,或可通过死端模式再循环。通过ECS的流体流可在压力下操作。本领域技术人员会理解,通过ECS的流体流优选由自下顶板到上顶板或从上顶板到下顶板的横向流实现。
[0038] 本文通过引用包括下列参考文献:
[0039] 1.Chresand J.J.,Gillier R.J.and Dale B.E.(1987)Optimisation fibre spacing in a hollow fibre bioreactor.Biotechnol.Bioeng.32:983-982.
[0040] 2.Cracauer,R.F.,Walker R.D.,and Gruenberg M.(1998)Hollow fiber cell culture device and method of operation.US 4,804,628.
[0041] 3.Fraser,S.J.,Edwards,W.and Leukes,W.D.(2007)Production of secondary metabolites and recombinant proteins.Synexa Life Sciences(PTY.)LTD.WO2007004170A2
[0042] 4.Futselaar H.(1993)The transverse-flow module construction,performance and application.PHD Thesis.University of Trente,Netherlands.[0043] 5.Gerlach J.(1996)Module for culturing and using metabolisms and/or for maintaining microorganisms.US 5,516,691
[0044] 6.Smart J.,Starov V.M.,Schucker R.C.and Lloyd D.R.(1998)Pervaporative extraction of volatile organic compounds from aqueous systems with use of a tubular transverse flow module.J Membr Sci143:159-179.
[0045] 7.Vladisavljevic G.T.and Mitrovic M.V.(1999)Pressure drops and hydraulic resistances in a three-phase hollow fiber membrane contactor with frame elements.Chem Eng Processing 40:3-11
[0046] 8.Zhang S.,van Houten R.,Eikelboom D.H.,Doddema H.,Jiang Z.,Fan Y.and Wang J.(2003)Bioresource Technol 185-192.【附图说明】
[0047] 以下将参照非限制性附图详述本发明,所述详述仅旨在举例。
[0048] 图1显示各种现有技术装置。
[0049] 图2显示本发明的完整的可缩放的生物反应器的(A)断面图,(B)俯视图或仰视图和(C,D)透视图。
[0050] 图3显示本发明的可缩放的生物反应器的立体图。
[0051] 图4显示方法例的示意图。
[0052] 图5显示实施例1中使用的生物反应器装置。
[0053] 图6显示实施例1的CHO-K1方法数据。
[0054] 【发明详述】
[0055] 本设计中,模块增加和处理灵活性原理被编入毛细管网络膜的2-D和3-D设计。可缩放的膜生物反应器设备(图2和3)包括2个顶板(1)和固定在2个顶板之间的至少
1个盒体(5),有效限定毛细管外空间(ECS),及将其从位于空心纤维膜内的毛细管内空间(ICS)区分开。图2显示完整的细胞培养模块,显示2个顶板(1)固定了例如7个独立的盒体(5)。上和/或下顶板可包括中央透明观察板(2),其可使在操作期间观察模块内情况。
各顶板还可包括至少1个ECS孔(3,4),其发挥到ECS的入口/出口的作用;和至少1个配件或孔,其允许通过例如pH配件(29)或DO探头(30)将探头或传感器插入到ECS隔间。使用O型环,垫圈或通过其他手段(8)将各盒体(5)与相邻盒体(5)和/或顶板(1)密封。盒体和顶板封件通过例如位于层叠的设备4个角的4个杆或钉(6)挤压在一起,及固定。更大的生物反应器可需要更多钉,以辅助挤压。
[0056] 各盒体(图3)包括内框架(7),其中使用树脂环氧树脂或通过其他手段固定至少4层毛细管膜(9)。在优选实施方式中,毛细管膜是陶瓷,给框架提供刚性,及提供对用聚合物膜时常观察到的结构变形的耐力。但是,应注意,此设计不限于任何特定尺寸,化学性质或技术特征的毛细管。在优选实施方式中,各层包括类似类型的膜,但不同层可包括具有不同化学或技术性质的膜,包括,但不限于,制造材料,孔尺寸和分布,涂层,选择性和/或导电性
[0057] 2-D膜阵列(9)确保通过膜在反应器内的所有位置均匀供给和移出物质,由此最小化生物反应器内的轴向梯度和不均一性。通过在压力下操作模块,细胞培养流体中可达到更高浓度的溶解的营养物或气体。自1个膜系统(层或排)到ECS(细胞培养空间)、并通过第二膜系统出的营养物死端流可用于在膜表面浓缩和固定细胞,及确保营养物改善的质量转移和均匀递送到生物膜内全部固定的细胞。已将细胞浓度和生物膜形成与细胞-细胞通信,细胞-活力和增强的产力相关联。
[0058] 歧管中的孔(10,11,12,13)排内接收膜的各连续层,各层与其上和其下膜层以垂直取向。而且,相同取向的各连续膜层可偏移,从而当从上观察时,膜交错形成连续的双轴膜网络(9),通过沟流限制流体错误分配和ECS内细胞的重力下沉淀。
[0059] 通过包括在框架(7)上的流体分配歧管将各膜层与其他膜层有效间隔。膜层内的各毛细管膜的开放端开向且被独立的流体分配室(储液池)(14,15)包括。单个盒体(5)内的不同膜层和流体分配室(14,15)通过O型环,垫圈或通过其他手段(19)彼此密封。4个独立的端板(18)均与框架(7)对齐和密封,且通过至少2个螺丝或钉(20)固定,以限定流体分配室(储液池)。各膜层在各相对的流体分配室中有ICS入口(21,23,25,27)或ICS出口(22,24,26,28),它们能使分开的和内含的流体流通过各膜层。
[0060] 在优选实施方式中,使用至少1个膜层将营养物溶液供给到ECS内的细胞,而使用至少1个层移出含目的产物和/或代谢废物的耗竭的培养基。可使用更多层:
[0061] ●以使用气体可渗透膜给培养空间充氧;
[0062] ●以通过调节CO2浓度,导入酸性或碱性溶液来缓冲培养空间,或使用选择性可渗透膜从培养空间清除有机酸
[0063] ●用于受控的供给调控生长或改变代谢的化合物,用于增强的处理稳定性和控制。包括,但不限于,特定的营养料,生长期抑制剂或诱导物分子;或
[0064] ●作为热交换器维持反应器在恒定温度
[0065] 细胞培养空间可通过位于顶板的入口或出口用营养物溶液排放,清除或再循环。
[0066] 模块组件提供自相同设计的规模的增加的灵活性,其中只要用包括至少1个膜插入件的生物反应器优化所述方法,可根据需要,将更多膜插入件叠在另一膜插入件上部,从而有效线性增加膜表面积和反应器体积。就给定方法而言,自不同膜插入件的膜层可一起歧化,以辅助流体传送和/或到/从模块内全部膜插入件的移出的均匀分配。
[0067] 在优选实施方式中,生物反应器设备竖直取向,膜网络水平取向(图2,截面A-A)。此例中,位于基部顶板(1)的ECS孔(4)用于将细胞接种物和/或流体导入ECS,而使气体或耗竭的培养基通过位于顶部顶板的ECS孔(3)出。用此方法,整个ECS可被装填流体,防止气塞。这对于用于监控ECS内的处理情况的任何探头(包括,但不限于pH探头(29)或DO探头(30))的有效操作是必要的。横向通过膜网络的流体流可使用标准交叉流操作条件通过ECS再循环(见图1,现有技术),或ECS出口(3)可闭合,且流体流以死端模式操作。
可使用任意流模式将细胞固定在包括在盒体(5)内的膜层中的至少1个空心纤维外表面。
通过对ECS内的流体施加压力来辅助,从而使液体通过选择性可渗透毛细管膜(9)壁渗透到ICS中,且通过至少1个ICS出孔(22,24,26,28)出,而接种物保持在ECS侧的膜表面。
[0068] 长时间操作过程中,可使用位于基部顶板的ECS孔(4)从ECS清除可蓄积在ECS内的和在重力作用下沉淀的细胞碎片或物质。
[0069] 接种后,将ECS孔(3,4)两端密封,在ECS内有效包括细胞培养空间。例如(图2,3和4),营养物溶液通过第一膜层或系统(A)的ICS,从膜层ICS入口(21)进入,填充入口流体分配室(入口储液池),膜层中的全部毛细管腔,出口(14)处的流体分配室(出口储液池),并通过相同膜层的ICS出口(22)出。操作期间此膜层的ICS出口(22)闭,培养基递送以死端模式操作。从此第一膜层(a)中的全部毛细管ICS过滤新鲜的营养物溶液,穿过膜壁进入生物反应器ECS,在那里新鲜的营养物可被细胞代谢。在压力下,耗竭的培养基/渗透物通过滤过毛细管壁进入第二膜层的ICS而出ECS,及通过第二膜层的ICS出口(28)出膜层ICS。在渗透物收集管中收集耗竭的培养基/渗透物。用此方法,将新鲜的营养物连续供给到固定的细胞/生物膜,同时从细胞培养空间连续移出可不利地影响细胞生长的代谢废物。此外,依赖于目的产物的分子特征和第二膜层内毛细管膜的物理特征,分泌的产物可连续产生和随着渗透物从生物反应器移出,由此保持生物质和防止细胞生长被毒性代谢物抑制,产物形成的负反馈控制和/或不稳定的产物的酶解。
[0070] 连续操作下,细胞培养方法可需要其他营养物,例如用于高密度细胞生长的增加的溶解氧(DO)。第二膜层腔可充气(B),在那里,从第二膜层的ICS入口(27)供给湿润的气体,从入口(入口储液池)进入流体分配室,流过膜层中全部毛细管的ICS,从出口(出口储液池)进入流体分配室,随着渗透物从相同膜层的ICS出口(28)出。溶解的氧可从ICS穿过膜壁向ECS(b)扩散,在那里,其可被固定的细胞/生物膜代谢。可通过集成的处理控制器,使用DO探头调节充氧速度,例如通过调节湿润的气体流中的O2水平。
[0071] 第三膜层(C)可用于通过酸性或碱性溶液,二氧化碳(CO2)或碳酸氢盐的控制的供给来调节细胞培养流体pH。这些溶质或溶解的代谢物可从第三膜层的ICS入口(23)供给,从ICS入口进入流体分配室(入口储液池),通过膜层中的全部毛细管腔,从出口(出口储液池)进入流体分配室,从相同膜层的ICS出口(24)出。可从ICS穿过膜壁(c)将缓冲化合物供给到ECS。缓冲化合物穿过膜壁从ICS到ECS内的细胞培养流体的递送速度可通过集成的处理控制器,使用pH探头控制。例如用于调节流体穿过膜壁递送到ECS的集成的压力控制器。
[0072] 可使用第四膜层供给特定生长调控因子或影响细胞代谢和/或目的化合物生产的其他化合物(D)。这些化合物可昂贵或不稳定。可将所述化合物在压力下通过第四膜层的ICS入口(25)供给(D)到细胞培养空间,进入入口流体传送室(入口储液池),通过第四膜层中的毛细管腔,从出口(出口储液池)进入流体传送室,通过相同膜系统的ICS出口(26)出。特定代谢物(d)穿过膜壁,从ICS到ECS内的细胞培养流体的递送速度可使用处理特定集成的控制策略控制。例如用于调节流体穿过膜壁递送到ECS的集成的压力控制器。
[0073] 应注意,膜系统(层)数,递送到细胞培养空间的物质的组成和顺序可不同,但改善的质量转移,独立的流体传送和集成的处理控制器的原理保持相同。从不同膜系统的ICS递送到ECS的全部化合物通过对流在ECS内和通过固定的细胞层/生物膜运输。随着这些物质通过固定的细胞层/生物膜,它们被细胞代谢,导致自我调控穿过生物膜建立的梯度。在集成的处理中完全控制这些梯度的性质,及允许可用于在连续的处理中调节形态分化和生长期相关代谢的连贯的处理条件,其规模由所用膜插入件的数量和尺寸限定。
【实施例】
[0074] 【固定在有单个盒体的可缩放的细胞培养生物反应器的ECS内的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的培养】
[0075] CHO细胞常规用于生物和医学研究,包括毒性筛选,营养和基因表达。CHO细胞是用于重组蛋白治疗剂生产的最常用的哺乳动物宿主。
[0076] CHO-K1是贴壁依赖性细胞系,其在适宜细胞培养表面一般生长为单层,且在我们5 2
的实验室,在细胞培养瓶中常规生长至细胞密度约1×10 细胞/cm 表面积。
[0077] 【染色和培养条件】
[0078] 在T-75瓶中,使用30ml补充了5%(v/v)胎血清(FBS)和1%(v/v)青霉素/链霉素的含2mM谷酰胺的DMEM-F12生长培养基常规培养贴壁的CHO-K1细胞。细胞每3~4天传代。使用含80ml生长培养基的T-150瓶进行培养物扩展。全部培养在CO2-温育器中于37℃进行。
[0079] 说道接种,将细胞悬浮于15~20ml生长培养基中。此例中,将约2.5×107细胞用作接种物。
[0080] 【反应器装置】
[0081] 使用包括被顶板固定的单个盒体的一次性的生物反应器模块进行CHO-K1培养。3 2
生物反应器设计提供了在119cm 的工作体积(ECS体积)中,用于贴壁的细胞生长的519cm的总毛细管表面积。生物反应器和辅助装置示意于图5,且其包括集成于顶板之一的pH探头和溶解氧探头,以监控ECS内的处理情况。此例中,盒体内的4个陶瓷膜层均包括相同化学组成、但不同孔尺寸的膜,从而各膜层在操作过程中辅助不同功能,如下所述。
[0082] 层1:1400nm陶瓷毛细管-通过腔用充气移出耗竭的营养物
[0083] 层2:40nm陶瓷毛细管-通过腔供给100%氧
[0084] 层3:1400nm陶瓷毛细管-通过腔供给营养物溶液
[0085] 层4:40nm陶瓷毛细管-通过腔供给100%氧
[0086] 使用5%二氧化碳/压缩气体气动供给生长培养基,从而自培养基供给管的营养物流通过位于层3的全部膜的腔(ICS)。操作之前,通过从培养基供给管填充培养基,通过层3ICS并进入填充收集管来从网和膜腔置换气体。操作期间夹闭层3的ICS出口,且以死端模式操作培养基供给,从而使营养物从ICS通过毛细管膜壁及进入ECS或细胞生长隔间。从ECS置换耗竭的培养基,及经膜层1移出。
[0087] 类似的,通过位于层2和4的毛细管膜ICS供给100%氧。以大于或等于培养基供给压力的压力供给氧,依赖于细胞生长隔间内细胞生长的氧摄取要求。无气泡充氧主要是扩散性的,且被通过ICS表面的气流促进。通过还用于维持比流速的流控制维持反压。
[0088] 终层具有两个功能:第一,自增湿管的压缩气流通过层1的ICS进入收集管,然后其通过流控制阀释放。流控制阀维持气流于比流速,且还提供操作要求的反压;第二,操作期间从ECS移出耗竭的培养基,穿过毛细管壁及以等于培养基供给速度的速度进入层1的ICS。将进入层1膜腔的渗透物随着通过此层的气流排入收集管。渗透物可采样或经采样孔从收集管移出。
[0089] 【灭菌】
[0090] 将有网和无菌连接件的一次性的生物反应器模块用γ-照射。将培养基供给管,填充管,增湿管,渗透物收集管和接种管(各有网和无菌连接件)在接种之前,经独立地高压灭菌,并无菌连接到经γ-照射的生物反应器模块。
[0091] 【接种】
[0092] 接种之前,将无菌生物反应器装置和生长培养基于37℃预温育。将生长培养基用5%二氧化碳/气体喷射和平衡至pH7.2。
[0093] 将2.5×107CHO-K1细胞直接接种到生物反应器ECS内。通过用补充了10%(v/v)胎牛血清(FBS)和1%(v/v)青霉素/链霉素的含2mM谷氨酰胺的DMEM-F12生长培养基填充ECS来将细胞固定于毛细管膜外表面。在穿过膜壁压力下将进入ECS的自接种管的培养基流导入毛细管腔(ICS),导向填充管,然后在操作前再循环到培养基供给管内。
[0094] 【操作】
[0095] 使用补充了10%(v/v)胎牛血清(FBS)和1%(v/v)青霉素/链霉素的含2mM谷氨酰胺的DMEM-F12生长培养基(用5%二氧化碳/气体平衡至pH7.2)于37℃培养细胞。
[0096] 接种后,用通过膜层1的ICS的恒定空气流量和压力(40kPa)及用通过膜层2和4的恒定100%氧流量和压力(50~70kPa)操作生物反应器。每隔一段时间调节氧压力,以支持增加的氧递送和维持ECS内的DO浓度(10~30%),用于增强的细胞生长和活力。
氧压力不得低于施加到培养基供给管的压力,防止耗竭的培养基流进入这些膜层。
[0097] 随着CHO细胞生长,营养物耗竭、且由于通过细胞代谢产生废物产物而ECS内的培养基pH(细胞生长环境)改变。从ECS移出耗竭的培养基,及将新鲜的培养基置换进膜层1的ICS中,所述新鲜的培养基从膜层3的ICS被供给到ECS。将耗竭的培养基从膜层1的ICS置换,并随着流过膜层1的ICS的气体转移到收集管。通过施加到培养基供给管的气动压力(>40kPa)和施加到膜层1的ICS的恒定压力(=40kPa)之间的压力差调节供给新鲜的培养基和从ECS移出耗竭的培养基的速度。调节流速至超过生长细胞的营养物需要(1~10ml/小时)。
[0098] 操作期间,监控ECS内的pH,且当培养基供给速度不能缓冲细胞生长环境时,每隔一段时间向培养基供给掺入小体积碳酸氢盐,以补偿以高细胞密度增加的废物蓄积。用此方法,将ECS的pH维持在pH6.8以上。
[0099] 连续操作生物反应器,且细胞维持11天的时间,然后拆开膜模块,及使用台盼蓝对CHO-K1计数。每天从收集管采样耗竭的培养基,用于底物分析。
[0100] 【结果与讨论】
[0101] 连续操作CHO-K1细胞培养11天。如图6的底物分析显示,培养期间,在全部时间,营养物供给超过需求。接种后,细胞的葡萄糖摄取速度低,表明生长有1~2天的延迟期。第2天后,观察到葡萄糖摄取速度从0.1mg/小时增加,在第4天达到最大值12mg/小时,之后葡萄糖摄取速度下降并稳定在培养残余的约8mg/小时。表明在第4天得到最大细胞产率。
[0102] 乳酸盐生产遵循与葡萄糖摄取速度类似的趋势,细胞将葡萄糖代谢为乳酸盐的水平保持低于摄取速度,直到第9天,在该时间点,细胞应激于低培养基pH,其降至pH6.8以下。当细胞代谢明显不再适于生长实验时停止,及测定总细胞产率。
[0103] 得到1.5×108细胞的总细胞产率。这些细胞中,1.5×107细胞松散粘连或悬浮于8
ECS,而胰蛋白酶消化后收获1.3×10 贴壁的细胞。
[0104] 此实验中,得到2.5×105细胞/cm2的贴壁的细胞密度,良好比肩于Syzmanski等5 2 5 2
人报道的T175瓶(1.7×10 细胞/cm)和HYPER瓶(2.2×10 细胞/cm)培养中的最大CHO
细胞密度(2008)。
[0105] 【参考文献】
[0106] 1.Szymanski,S.L,Huff,K.W,Patel,A.D.,Murray,J.R,Feasby,J.,Sharma,B.V.,Denise Young,D.K.,Strulovici,B.,Peltier,R.R.,Johnson,E.N.and Rush,A.(2008)Automated application of a novel high yield,high performance tissue culture flask.JALA vol.13(3):136-144.
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