减小液体培养基的弯月面曲率的方法

申请号 CN200880011585.X 申请日 2008-02-26 公开(公告)号 CN101652660B 公开(公告)日 2017-09-01
申请人 干细胞技术公司; 发明人 S·伍德赛德; J·多德; G·多桑托斯; O·艾格勒;
摘要 本 申请 涉及改进细胞培养容器测定法的方法。本申请在一个方面涉及减小 弯月面 曲率 的方法,包括给容器的内壁涂覆涂覆材料,其中所述涂覆材料使得 水 溶液和培养基产生大约90度的后退 接触 角 。在另一方面,本申请涉及标记第一溶液中的细胞的方法,其中通过产生含有至少一种细胞标记剂的第二溶液的小滴并使所述第二溶液的小滴与所述第一溶液的表面相接触而标记第一溶液中的细胞。
权利要求

1.减小培养容器内的液体培养基的弯月面曲率的方法,包括将涂覆材料涂覆于培养容器的内壁表面,其中所述涂覆材料使得溶液和培养基产生大致90度的所述容器壁与所述液体之间的后退接触
2.权利要求1的方法,其中所述后退接触角是大约75度至大约110度。
3.权利要求1的方法,其中所述后退接触角是大约85度至大约105度。
4.权利要求1的方法,其中所述涂覆材料抑制存在于水溶液或细胞培养基中的分子组分的粘附,以防止所述涂覆材料的表面特性发生改变。
5.权利要求1的方法,其中所述容器由聚苯乙烯、聚丙烯、聚酸酯、聚氯乙烯或聚四氟乙烯制得。
6.权利要求1的方法,其中所述涂覆材料是基于烷的材料、基于含氟聚合物的材料、石油胶、固体石蜡、EPDM或Buna Nitrile或者是嵌入物,所述嵌入物由硅氧烷、EPDM或Buna Nitrile制得或所述嵌入物涂覆有涂覆材料,所述涂覆材料是基于硅氧烷的材料、基于含氟聚合物的材料、石油胶、固体石蜡、EPDM或Buna Nitrile。
7.权利要求6的方法,其中所述基于硅氧烷的材料包括非交联的硅氧烷、甲基硅氧烷、甲基乙烯基硅氧烷或它们的共聚物。
8.权利要求1至6中任一项的方法,其中所述容器是培养皿或多孔板。
9.权利要求1至7中任一项的方法,其中所述水溶液是生物学缓冲液或培养基。
10.权利要求9的方法,其中所述培养基是粘性液体或凝胶。
11.权利要求10的方法,其中所述培养基包括蛋白质、糖蛋白、多糖、甲基纤维素、琼脂、胶原或其他类似的胶凝剂
12.权利要求1的方法,其中采用选自以下的方法将所述涂覆材料涂覆于所述培养容器的内壁表面:
—涂覆或嵌入预先形成的材料;
—使用物理涂覆器涂覆所述材料,随后去除多余的材料;
—通过将所述容器浸没于所述涂覆材料或其溶液中而涂覆,随后干燥;
—涂覆熔融的材料,随后冷却并凝固
—将所述涂覆材料溶于合适的溶剂中并涂覆所述溶液,随后通过蒸发、抽吸、和/或洗涤而去除所述溶剂;
—涂覆当暴露于空气后发生固化的材料;和
—加入所述材料后涂覆导致所述材料固化的因子。

说明书全文

减小液体培养基的弯月面曲率的方法

技术领域

[0001] 本申请涉及改进在培养容器中进行的测定法的方法,所述容器例如为细胞培养板,包括多孔板。

背景技术

[0002] 基于细胞的测定法被广泛用于研究和临床。最常用的方法涉及将液体或半固体营养培养基中的单个细胞或多细胞悬液接种在具有孔的平皿或多孔板内,所述培养基中补充了适当组合的可支持各种细胞增殖、以及在某些情况下可支持细胞分化的成分。在化学和生物学领域,例如基因测序、组合化学、药物研发和蛋白质组学,具有孔的平皿和多孔板被用于处理大批液体样品。
[0003] 实现基于细胞的测定法或其他在培养容器中进行的测定法的自动化可给这一领域带来极大的改善,并能够进行目前手工测定法所不可能实现的高通量筛选。为了促进这些测定法的自动化需要克服的关键性的挑战是开发出特异性标记方法以及去除因液体培养基与测定平皿壁接触处形成弯月面而产生的光干扰。
[0004] 美国专利申请出版物2007/0274871公开了单一结构的孔板,其包含限定出各孔侧壁的连通管第一部分以及限定出壁底的第二部分。第一部分的疏性被选定为具有能够提供大约90度的静态接触的表面能以便抑制弯月面的形成。发明内容
[0005] 本发明公开了用于在培养容器例如多孔板中进行测定并使得此类测定能够实现自动化的方法。本发明的改进包括减少当培养基被置于培养容器中时因形成弯月面所致的光干扰的方法以及用颜色染料或荧光染料标记集落或细胞以便通过手工或自动化方法对细胞类型进行分类的方法。要强调的是,这些改进在生物学和化学领域具有广泛的用途。因此,这些改进适用于所有希望消除弯月面或对细胞进行标记的培养容器和孔板用途。
[0006] 本发明公开了一些用于涂覆培养容器的方法和材料,它们可提供如下表面特性,即可产生大致为90度的动态最小(后退)接触角,和/或增加培养液体在所述表面上的流动性,继而导致弯月面程度减小。上述涂覆物的弯月面减小特性在延长的温育时间后仍很强,且在用于各种容器和多孔板形式时均有效。
[0007] 因此,在一个方面,本申请涉及减小培养容器内的液体培养基的弯月面曲率的方法,包括将涂覆材料涂覆于培养容器的内壁表面,其中所述涂覆材料使得水溶液和培养基产生大约90度的所述容器壁与所述液体之间的后退接触角。
[0008] 在本申请的一个方面,通过涂覆培养容器的内壁而涂覆所述涂覆材料。在另一个方面,所述涂覆材料作为预成型材料,例如作为嵌入物,而施加至所述培养容器的内部。
[0009] 本申请还包括用于容纳液体的容器,所述容器包含位于所述容器的内壁上的涂覆材料,其中所述涂覆材料提供大约90度的所述容器内壁与液体之间的后退接触角。以有效减小细胞培养基的弯月面曲率的方式和量施加所述涂覆材料。
[0010] 本申请还包括本申请的容器用于培养细胞或用于进行基于成像的测定的用途。本申请还对细胞进行成像的方法,包括将所述细胞培养在本申请的容器的细胞培养基内并对所述细胞进行成像。
[0011] 本发明还提供用于将标记剂涂覆于培养容器的表面的方法,该方法对悬浮于培养基内的细胞或其他物质的扰乱极小。采用喷雾器喷枪喷嘴将所述标记剂中性红和荧光标记的针对细胞表面标记物的抗体雾化,并将气溶胶导向培养表面上。这些方法可增强亮视野显微镜和荧光显微镜下细胞的反差,并可通过检测结合的标记物的荧光而辨别细胞类型。由于通过目测观察形态学特征对细胞进行分类是一项费而且主观的方法,进一步造成测定的可变性,因此本发明的标记方法提供了减小测定可变性的可能性并使得能够对细胞或细胞集落进行自动化定量和分类。
[0012] 因此在另一方面,本申请包括标记第一溶液中的细胞的方法,其中通过产生含有至少一种细胞标记剂的第二溶液的小滴并使所述第二溶液的小滴与所述第一溶液的表面相接触而标记第一溶液中的细胞。
[0013] 根据下文的详细描述,本发明的其他特征和优势是显然的。不过应该理解,所给出的详细描述和具体实施例仅是以举例方式给出优选的实施方式,因为根据这些详细描述,属于本发明的实质和范围内的各种变化和改进对于本领域人员而言均是显然的。附图说明
[0014] 图1所示为根据本发明的一个实施方式用于降低弯月面的UHMW孔嵌入物。该图代表的是圆柱状嵌入物的侧向截面。
[0015] 图2所示为处于平坦聚苯乙烯表面上的大致20μL的MethoCult(左)和水(右)的小滴。在小滴与固相基材界面处的小滴表面曲率的近似情况以圆形表示,中心为BC1和BC2。聚苯乙烯表面的平面以线L2表示。液体与表面的接触点以P1和P2标出。计算圆在点P1和P2处的切线与基材平面L2之间的夹角作为接触角。
[0016] 图3是35mm培养皿的壁与培养皿内的半固体培养基的界面的亮视野相差图像。使用倒置显微镜,2.5x物镜获取该图像。从培养皿壁(左)向培养皿中心延伸的暗区证实弯月面引起了光干扰。测量线是在对图像进行空间校正之后的来自图像的弯月面宽度的估计值。图像上方和下方的水平线确定了用于计算光干扰的区域。
[0017] 图4是以Aquasil涂覆的培养皿的皿壁/培养基界面的图像,该图像在培养基加入至培养皿后24小时之内获取。可见弯月面程度显著降低。
[0018] 图5是以SigmacoteTM涂覆的培养皿的皿壁/培养基界面的图像,该图像在培养基加入至培养皿后24小时之内获取。可见弯月面,即紧邻培养皿壁的黑色细带。
[0019] 图6是以Syl-offTM涂覆的培养皿的皿壁/培养基界面的图像,该图像在培养基加入至培养皿后24小时之内获取。可见弯月面程度显著降低。
[0020] 图7是以SurfasilTM涂覆的培养皿的皿壁/培养基界面的图像,该图像在培养基加入至培养皿后24小时之内获取。可见弯月面程度显著降低。
[0021] 图8是以FluoropelTM(Cytonix Inc.)涂覆的培养皿的皿壁/培养基界面的图像,该图像在培养基加入至培养皿后24小时之内获取。涂覆薄层该涂覆材料使得在培养皿壁与培养基之间出现清晰的边界。没有明显的弯月面出现。
[0022] 图9是以石蜡涂覆的培养皿的皿壁/培养基界面的图像,该图像在培养基加入至培养皿后24小时之内获取。石蜡涂层是一可见的不透明区域,具有朝向孔的内侧的明亮边界(箭头)。可见轻微的弯月面,其是紧邻石蜡涂层的微弱暗区。
[0023] 图10是以矿脂涂覆的培养皿的皿壁/培养基界面的图像,该图像在培养基加入至培养皿后24小时之内获取。这种半透明的矿脂涂层在培养皿的培养物表面上是一可见的密度起伏区域。没有明显的弯月面出现。
[0024] 图11显示了动态弯月面程度与静态和动态最小接触角之间的相关性。根据相对于含1%甲基纤维素/IMDM的未处理的聚苯乙烯对照培养皿的光干扰给出弯月面程度。“a”图显示了所有条件下测量的接触角与其弯月面程度之间的关系。“b”图显示了未处理的聚合物表面的静态接触角与所得动态弯月面程度(实心圆圈)之间的关系。将其与动态最小接触角与所得动态弯月面程度(空心方)之间的相关性相比。
[0025] 图12显示了含氟聚合物和烷处理聚合物表面对水溶液的表面流动性的影响。以非交联的硅氧烷处理和含氟聚合物处理增加流动性。用液体(1%甲基纤维素)的粘性降低流动性的增加。
[0026] 图13是使用采用组织培养物处理的6孔板的Gelcount获取的图像,其显示了添加TM1.1mL的MethoCult 后出现的围绕圆周的暗圆圈。孔的宽度大约为36mm。
[0027] 图14是采用含MethoCultTM的孔的Gelcount获取的图像,其中涂覆了硅氧烷密封剂的壁在绝大多数圆周周围没有出现相同的暗区。培养基中的许多圆点是在加入孔中之前对MethoCultTM进行处理时引入的气泡。孔的宽度大约为36mm。
[0028] 图15是使用倒置显微镜获取的涂覆了硅氧烷的孔的边缘的图像,所述的孔与图16的孔位于同一24孔板内。该图像显示出孔壁处的暗带小得多(画面左侧)。曝光和照明设置与图16中的图像相同。图像中央的锯齿状垂直线显示该处有使用本发明的方法产生的稠厚的硅氧烷涂层。孔的中央没有涂覆。
[0029] 图16是使用倒置显微镜获取的未处理的24孔板的孔的边缘的图像。该图像显示出从左侧孔壁延伸至孔中央的暗区(图像右侧)。图像的宽度大约为1.3mm。
[0030] 图17的图像显示了具有Buna Nitrile杆密封(026-70D)嵌入物的孔,其中加入了1mL的MethoCultTM。在密封条的边缘与培养基(以虚线标出)之间有清楚的边界。
[0031] 图18的图像显示了具有Buna Nitrile杆密封(025-70D)嵌入物的孔,其中加入了1mL的MethoCultTM。在密封条的边缘与培养基(以虚线标出)之间有清楚的边界。
[0032] 图19的图像显示了具有FDA批准的o形硅环(silicon o-ring)(#123)嵌入物,其中加入了1mL的MethoCultTM。在密封条的边缘与培养基(以虚线标出)之间有清楚的边界。边界处出现光斑的原因可能是由于硅环(silicon ring)的湿化存在轻微的差异,由此产生了小的弯月面效应。
[0033] 图20的图像显示了具有FDA批准的EPDM(70D-026)嵌入物的孔,其中加入了1mL的MethoCultTM。在密封条的边缘与培养基(以虚线标出)之间有清楚的边界。
[0034] 图21的图像显示了具有FDA批准的EPDM(70D-025)嵌入物的孔,其中加入了1mL的TMMethoCult 。在密封条的边缘与培养基(以虚线标出)之间有清楚的边界。
[0035] 图22的图像显示了无嵌入物的孔,其中加入了1mL的MethoCultTM。孔壁与培养基(以虚线标出)之间的边界不清楚,且在培养基中存在具有易变阴影的区域,这对集落计数是不利的。
[0036] 图23是用或未用SigmacoteTM、SurfasilTM和Syl-offTM处理的24孔培养板和96孔培养板的孔的培养皿壁/培养基界面的图像。证实了Syl-offTM和SurfasilTM处理在直径减小的孔中有效地实现减小弯月面,但SigmacoteTM处理可见不同程度的弯月面。
[0037] 图24的照片显示了添加中性红染色剂之前的紧密粒细胞集落(CFU-G)。
[0038] 图25的照片显示了添加中性红染色剂之后的紧密粒细胞集落(CFU-G)。
[0039] 图26的照片显示了添加中性红染色剂之前的分散粒细胞集落(CFU-G)。
[0040] 图27的照片显示了添加中性红染色剂之后的分散粒细胞集落(CFU-G)。
[0041] 图28的照片显示了添加中性红染色剂之前的分散巨噬细胞集落(CFU-M)。
[0042] 图29的照片显示了添加中性红染色剂之后的分散巨噬细胞集落(CFU-M)。
[0043] 图30是35mm培养皿的暗视野图像,显示了培养在MethocultTM半固体培养基内的造血细胞集落。使用放置在培养皿上方的装有大变焦镜头的Lumenera数码相机获取了连续相接的图像。将所获取的图像平铺以建立覆盖整个培养皿的复合图像。可以辨别不同亚类的集落。
[0044] 图31是图30所述的培养皿的荧光图像。使用缀合于FITC的针对细胞表面标记物的抗体标记红系集落。绿色荧光背景是弥漫分布于培养基内的残余未结合检测抗体造成的。调整亮度和对比以增强染色集落的可见度。
[0045] 发明详述
[0046] 当液体被置于紧邻垂直壁时,液/汽表面呈现出代表有关三相(固相、液相和汽相)的理化性质的特征性形状。在这三相的接触点处由液体和固体表面所限定出的角称为“接触角”(θ)。这个角的幅度是由液-汽(LV)界面、液-固(LS)界面、和固-汽(SV)界面的界面自由能(表面张力,γ)确定的。对于理想的均匀表面,接触角的幅度由Young氏方程给出:
[0047] γLVcosθ=γSV-γSL  (1)
[0048] 就本发明的目的而言,液相被认为是水溶液、特别是包含生物聚合物如蛋白质、肽和多糖的粘稠水溶液、或者是细胞培养基。当各侧面均为垂直固体表面时,LV界面根据接触角的幅度而呈现出弯曲的形状。这一表面形状通常称为液相的“弯月面”。生物学中的常规溶液通常均沿其上表面形成显著的弯月面。鉴于如上所述的接触角特性,溶液与其容纳固体界面的表面能通常被认为是确定弯月面形状和幅度的限定特征。不过,除了液体和固体表面的表面能以外,理化特性对确定平静的水性液体的弯月面形状也具有重要作用。此类特性包括(a)固体表面的三维拓扑学,(b)液相的组成,(c)固体表面的物理和化学异质性,以及(d)液体对固体表面的构型改变的诱导性。
[0049] 上述性质c和d通过引起接触角滞后作用而对弯月面形状产生影响,滞后作用被定义为,对于液滴,当液相、固相和汽相的接触点在固体表面上前进和后撤时,所观察到的液滴的最大和最小接触角之间的差异。简言之,当液体在固体表面上前进时,观察到接触角大于当液体从固体表面后撤时的接触角。这些“前进”和“后退”接触角分别被认为是动态最大和动态最小接触角,且它们的差异被称为接触角滞后作用。这种滞后作用是由为克服所述表面上的疏水和亲水域的不均匀性(化学不均匀性)所需的能量所产生的,或者是由为克服所述固体表面上的物理障碍(物理不均匀性,或表面“粗糙性”)所需的能量所产生的。
[0050] 对于化学不均匀性,当水溶液在表面前进时,表面上的疏水域将阻碍溶液的流动,并导致接触角增大,而当溶液从表面后退时,表面上的亲水域将使得液体保持在表面上,导致接触角增大。
[0051] 对于物理不均匀性,表面的细微变化将阻碍溶液的流动,对液体的前进缘产生阻力(由此增加接触角),而当液体后退时阻止液体-固体表面的后退边缘(由此减小接触角)。
[0052] 而与液相接触所引起的固体表面的构型改变给观察到的接触角引入额外的滞后作用。表面构型的改变是聚合物固体表面暴露于液体时,聚合物固体表面上的官能团再定位导致的,以便使得固相和液相之间的表面处的界面张力最小化。这种再定位被认为主要包括分子轴附近表面官能团旋转,而不是聚合物的大分子结构的重排。其结果是已经暴露于液相的固体表面的(即,已经“湿化的”)部分将展现出改变的表面能。对于与固体疏水性聚合物的表面相接触的水性液体,由于疏水部分自表面转开,因此预期湿化表面与非湿化表面相比展现出降低的疏水性。因此,当液相在湿化表面后退时,相对于非湿化表面上的所述液体的静态接触角产生降低的接触角。这进一步促成后退接触角的幅度改变。
[0053] 水溶液的组成很可能影响接触角滞后作用。例如,存在调节液体和固体表面之间的疏水和亲水相互作用的成分或改变液-汽界面和液-固界面的表面能的成分很可能影响滞后作用。存在具有极性和非极性区域的分子例如表面活性剂、磷脂、或脂肪酸,预期可调变固体表面上的疏水和亲水部分和水性液体之间的相互作用。此类分子也可对固相的表面官能团的构型施加不同影响,进一步改变接触角。此外,被增溶的成分可粘附于固体表面,改变其表面能并影响接触角。例如,已经证实含白蛋白的溶液可由于蛋白质吸附于表面上而影响溶液与疏水表面的接触角。此外,水溶液的组成可影响液体的粘度,并因而影响当系统受到物理扰动之后恢复其平衡所需的能量(即高粘性溶液与较低粘度的类似溶液相比使得平衡时的接触角发生改变)。
[0054] 通常通过以下两种方法之一来确定前进和后退接触角:(1)卧滴法(sessile drop method),其中将液相滴放置于固体表面上。在这种情况中,通过增加液滴的体积而得到前进角,并通过从液滴移除体积而得到后退角。(2)Wilhelmy板方法,其中将聚合物表面缓慢浸入液相(产生前进接触角),然后自该表面撤除(产生后退接触角)。这些方法产生不同的绝对接触角,这是因为卧滴法具有静止的水平表面,而Wilhelmy板方法具有运动的垂直表面。
[0055] 为了清楚起见,将在圆筒中讨论液体弯月面的形成,不过,上述接触角和弯月面的各方面适用于多种形状的容器(例如,四边形、圆形、或三角形的管、孔或其他容器)。当水溶液被放置于疏水圆筒内时,弯月面的形状由于液体的水平面在圆筒内升高而由前进接触角决定。对于理想的均匀表面,当液体添加完毕时,弯月面的形状将按照Young氏方程所定义的系统的固有接触角的要求达到平衡。不过,在实际的情况中,不太可能有理想的均匀表面。因此,如果系统不完全静止,则接触角滞后作用将会起作用。容器的任何物理扰动,例如容器运动引起的振动、旋转、或加速/减速,将导致液体平面的运动,而所述三相接触线(即,固相、液相和汽相的交汇点)将发生前进和后退接触角的循环。继这一循环之后,新的平衡接触角建立,但不是由Young氏理想接触角所代表,而是由湿化表面上的后退接触角代表。目前仍没有统一的理论能够精确模拟复杂系统中的这种接触角,因此最好经验性地确定不同系统的后退接触角以及所产生的弯月面(见下文的实施例)。
[0056] 总之,在由固体表面所容纳的典型水溶液的完全静止的系统中,弯月面形状由Young氏方程所预测的固有接触角所限定。不过,此类静态系统在常规的实验任务中实际上不可能出现,特别是因为涉及溶液的操作通常需要在添加至容器中之后进行物理混合。在更加常见的情况中,液面受到物理扰动,弯月面形状易受接触角滞后作用、容器内壁表面的拓扑学和水溶液组分的影响。系统的后退接触角因此被认为是弯月面形状和幅度的首要指标。因此,尽管90度的固有接触角是完全静态系统中完美的平坦弯月面的特征,但在受到物理扰动的系统(在绝大多数实际情况中经常遇到的情况)中则需要90度的后退接触角来维持平坦的弯月面。
[0057] 目前的测定容器和孔板的一个局限性在于,培养皿或孔周边处的介质弯月面在板的周边附近引起光学变形。使用可见光显微镜在可见光透射或暗视野模式或在荧光模式在这一区域中很难看到细胞或集落。使用照相机和静止光学元件或使用移动光学元件如扫描仪所获取的图像会显示出弯月面效应。人脑的图形识别能力可处理不同背景,且观察者能够鉴定出图像中或显微镜下的实体。但是,在没有弯月面的情况下更容易鉴定出实体。此外,在可变背景中基于计算机的图像分析的难度大大增加,这是因为常规的方法利用背景和前景之间的强度或亮度差异来辨别物体。因此,对于对培养孔或培养容器中的细胞和其他实体进行手工或自动成像而言,消除弯月面引起的光干扰均具有优势。这种优势可延及其中进行光学或分光光度测定或观测的任何测定法,这包括例如基于荧光、UV光、红外光和可见光的测定法。
[0058] 已经发现,如果培养容器的垂直壁表现出的表面能可导致大约90度的固有接触角,可使得培养基的弯月面幅度最小化,这继而可减少通常见于培养容器边缘附近的暗缘。此外,已经发现,对培养容器内的常规水溶液和培养基的物理扰动导致形成弯月面。这是因为接触角滞后作用通常在水溶液和固体表面的界面处出现。减少培养容器边缘的弯月面的另一个效应是可使得培养基以及悬浮于培养基中的任何细胞在容器内的分布更加平均。例如,对于半固体培养基中的CFC分析(例如,ClonacellTM或MethoCultTM),集落均匀分布于培养基中。但是,弯月面增加了靠近孔壁或培养皿壁区域的培养基的厚度,导致从顶部或底部观察细胞时,壁附近的细胞或集落的浓度明显更高。壁附近的浓度更高也给通过不同成像模式来鉴定细胞和集落造成困难。
[0059] 也已经发现,如果处理培养容器的壁以提供大约90度的后退接触角,所述表面的降低弯月面的特征在物理扰动和温育延长的情况中均稳定。这可提高手工操作者和自动系统辨别培养容器边缘附近的实体的能力。
[0060] 因此,在一个方面,本申请涉及减小培养容器内的液体培养基的弯月面曲率的方法包括将涂覆材料涂覆于培养容器的内壁表面,其中所述涂覆材料使得水溶液和培养基产生大约90度的所述容器壁与所述液体之间的后退接触角。
[0061] 在本发明的一个实施方式中,涂覆材料使得水溶液和培养基产生大约75度至大约110度、大约80度至大约110度、适宜地为大约85度至大约105度的后退接触角。在一个实施方式中,后退接触角也称为动态后退接触角。在本发明的一个实施方式中,涂覆材料抑制水溶液或细胞培养基中的分子组分的粘附,由此防止所述涂层的表面特性的改变。
[0062] 容器的"内壁表面"至少指的是与液体、特别是形成弯月面处的液体的最前缘相接触的容器侧壁上的区域。也可在容器的整个表面区域涂覆涂覆材料。
[0063] 可采用任何合适的方法将涂覆材料涂覆于容器壁,例如可使用选自一下的方法:
[0064] —施加或嵌入预先形成的材料(有或没有粘合剂);
[0065] —使用物理涂覆器涂覆所述材料,随后去除多余的材料;
[0066] —通过将所述容器浸没于所述涂覆材料或其溶液中而涂覆,随后干燥;
[0067] —涂覆熔融的材料,随后冷却并凝固
[0068] —将所述涂覆材料溶于合适的溶剂中并涂覆所述溶液,随后通过蒸发、抽吸、和/或洗涤而去除所述溶剂;
[0069] —涂覆当暴露于空气后发生固化的材料;和
[0070] —加入所述材料后涂覆导致所述材料固化的因子。
[0071] 或者,如果涂覆材料具有足够的强度,可使用涂覆材料制备部分或整个培养容器。
[0072] "物理涂覆器"指的是能够用于将涂覆材料涂覆于容器的任何装置。例如,物理涂覆器可以是无尘(lint-free)材料,例如无尘巾,可以使用其本身或者附于合适的涂覆器装置上。
[0073] 一旦材料被涂覆后,可将其放置一段足够的时间,必要时可去除入口(例如使用清洁的物理涂覆器)并使材料固化,例如通过在合适的温度下温育合适的时间。本领域人员能够基于容器的类型的涂覆材料的性质确定固化条件。例如聚苯乙烯容器可在大约50℃至100℃的温度温育,而PTFE容器可在更高的温度温育,例如大约150℃至大约250℃。临用前将容器冷却至室温。
[0074] 涂覆所述涂覆材料至使用所述容器的时间取决于涂覆方法。以预先形成的材料制备的容器可立即使用。以需要去除溶剂或需要固化的材料制备的容器在任何情况下可需要数分钟至数日,这取决于材料、涂覆方法和环境条件,这应该是本领域人员已知的。
[0075] 在本发明的一个实施方式中,将预先形成的涂覆材料制成适合于容器内径的嵌入物。在另一个实施方式中,嵌入物由任何合适的耐久性、非反应性材料制备。在另一个实施方式中,预成型材料涂覆有疏水材料,导致以普通的水溶液和培养基产生大致90度的后退接触角。
[0076] 涂覆材料是任何可以被粘附于培养容器以便以普通的水溶液和培养基产生大约90度的动态最小(后退)接触角的材料。有潜力的涂覆材料包括,但不限于,以下一或多种:
[0077] -液体硅烷化剂,例如甲基硅氧烷、甲基乙烯基硅氧烷和甲基全氟丁基乙基硅氧烷以及它们的共聚物的溶液;
[0078] -含氟聚合物类,包括低沸点氟溶剂中的含氟聚合物溶液;
[0079] -固体石蜡;
[0080] -聚烯蜡;
[0081] -动物和昆虫蜡,包括蜂蜡、虫胶蜡、鲸蜡、羊毛脂;
[0082] -植物蜡,包括蜡果杨梅蜡、小烛树蜡、巴西棕榈蜡、海狸香、西班牙草蜡、日本蜡、希蒙得木油、小冠椰子蜡和米糠蜡;
[0083] -矿物蜡,包括地蜡(ceresin)、montan、地蜡(ozocerite)和泥炭
[0084] -蜡样饱和脂肪酸类,包括月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、花生酸、二十二酸、廿四酸(tetracosanic acid)、二十四烷酸(lignoceric acid)、廿六酸和三十酸;
[0085] -非蜡样饱和脂肪酸类,包括酪酸、已酸、辛酸和癸酸;
[0086] -蜡样不饱和脂肪酸类,包括巴豆酸、落花生油酸、十六烯酸、鲸酸、反油酸、异油酸、erudic acid、顺芜酸和异芥子酸;
[0087] -非蜡样不饱和脂肪酸类,包括油酸、亚油酸、α-亚油酸、花生四烯酸、二十五烯酸、二十二碳六烯酸和芥酸;
[0088] -蜡样脂肪族醇类,包括1-十四醇、1-十五醇、1-十六醇、1-十七醇、1-十八醇、1-十九醇、1-二十醇、1-二十一醇、1-二十二醇、1-二十三醇、1-二十四醇、1-二十五醇、1-二十六醇、1-二十七醇、1-二十八醇、1-二十九醇、1-三十醇、1-三十一醇、1-三十二醇、1-三十三醇和1-三十四醇;
[0089] -非蜡样脂肪族醇类,包括1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、1-壬醇、1-癸醇、1-十一醇、1-十二醇和1-十三醇;
[0090] -固体材料,包括含有六氟丙稀(HFP)和1,1-二氟乙烯(VDF或VF2)的共聚物、全四氟乙烯(PTFE)或四氟乙烯(TFE)、1,1-二氟乙烯(VDF)和六氟丙稀(HFP)的三元共聚物的材TM料以及全氟甲基乙烯基醚(PMVE)、硅(商品名Viton ,来自Dupont  Performance Elastomers);Buna Nitrile(也称标准级腈)、氟硅、氯丁橡胶、乌拉坦、HSN(Highly Saturated Nitrile)、硅氧烷橡胶和三元乙丙橡胶(EPDM)。
[0091] 还包括上述所列脂肪酸与任何合适的脂肪族醇类或甾醇类如胆固醇或与甘油形成的各种酯。
[0092] 在适当的实施方式中,涂覆材料是基于硅氧烷的材料、基于含氟聚合物的材料、石油胶、固体石蜡、EPDM或Buna Nitrile或者是嵌入物,所述嵌入物由硅氧烷、EPDM或Buna Nitrile制得或所述嵌入物涂覆有涂覆材料,所述涂覆材料是基于硅氧烷的材料、基于含氟聚合物的材料、石油胶、固体石蜡、EPDM或Buna Nitrile。在另一适当的实施方式中,基于硅氧烷的材料包括非交联的硅氧烷、甲基硅氧烷或甲基乙烯基硅氧烷或其共聚物。
[0093] 本发明的方法特别适用于粘性水溶液或凝胶。粘性指的是溶液具有的粘度或对流动的阻力大于水的粘度,或大于大于1mPa.s、适当地大于大约5mPa.s、且直至高达大约4000mPA.s。在本发明的一个实施方式中,所述粘性水溶液是常规用于细胞培养或基于细胞的测定法的任何此类溶液,例如,生物学缓冲液和可支持细胞生长的任何培养基,包括但不限于Iscove改良伊格尔培养基(Iscove's modified Eagle's Medium,IMDM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's Medium,DMEM)、Hank氏平衡盐溶液、基于甲基纤维素的培养基(例如MethoCultTM)、基于琼脂的培养基、基于胶质的培养基和基于胶原的培养基。在本发明的另一个实施方式中,所述粘性水溶液是包含以下物质的溶液,生物大分子例如蛋白质、糖蛋白、肽、多糖和/或寡核苷酸、和/或水溶性聚合物例如聚烯烃二醇类(polyalkylene glycols)。在本发明的另一个实施方式中,溶液是包含可改变容器内壁的表面特性的分子的溶液,因此当壁被溶液湿化后可改变壁的接触角。
[0094] 本申请还包括用于容纳液体的培养容器,例如细胞培养容器,其上涂覆了材料,其中所述涂覆材料提供大约90度的所述容器壁与所述液体之间的后退接触角。培养容器可以是任何容器,包括但不限于,培养皿或多孔板的孔。在本发明的一个实施方式中,容器由聚苯乙烯、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯、聚碳酸酯、聚氯乙烯或其他类似固体聚合物基材制得。
[0095] 涂覆所述涂覆材料的方式和量可通过产生能够实现大约90度、适当地大约75度至大约110度、更适当地大约80度至大约110度、甚至更适当地大约85度至大约105度的后退接触角的表面能,从而有效地降低细胞培养基或其他普通水溶液的弯月面的曲率。在一个实施方式中,后退接触角也称为动态后退接触角。
[0096] 本申请还包括本发明的容器用于培养细胞或用于进行基于成像的测定法的用途。基于成像的测定法可以是生物学和化学领域使用的任何测定法,例如,集落形成细胞(CFC)分析法、基因测序、组合化学、药物研发和蛋白质组学。
[0097] 本发明还包括对细胞进行成像的方法,包括将细胞培养在本发明的容器内的细胞培养基中并对所述细胞进行成像。
[0098] 在本发明的一个实施方式中,使用可见光、紫外光、红外光和/或荧光对细胞进行成像或基于成像的测定,特别是使用可见光。可使用例如暗视野模式、亮视野模式、相差或干涉相差(differential interference contrast)进行可见光成像。在另一个实施方式中,通过手工成像或自动化成像。在本发明的另一实施方式中,被成像的细胞位于细胞集落中。
[0099] 细胞在半固体培养基中的三维分布造成难以在不扰动细胞的情况下添加试剂。例如,为了提高荧光或可见光显微镜中细胞相对于背景的反差,加入染料标记细胞可能是有利的。典型地,使用加样器将用于活细胞的染料加至液体悬浮培养物中。但对于半固体培养基例如MethoCultTM或ClonaCellTM(Stemcell Technologies Inc)而言这是不能接受的,这是因为添加点的对流流动会扰动或破坏细胞。染料还会停留在培养基的一处,这样染料只能通过扩散才能在培养物中分布,因为这种测定法中所使用的1%甲基纤维素的对流流动极小(如果有的话)。在标准的液体悬浮培养物中,对流混合对于标记试剂的均匀分布的重要性超过扩散。因此,本领域需要改进向半固体培养基中添加染料的方法。
[0100] 已经发现,与使用加样器的常规添加方式相比,将细胞染色剂气雾化可使之分布得更加均匀,速度也更慢。这是有利的,因为在细胞被染色的同时它们的形态不会被破坏。
[0101] 因此,在另一实施方式中,本发明提供标记第一溶液中的细胞的方法,其中通过产生含有至少一种细胞标记剂的第二溶液的小滴并使所述第二溶液的小滴与所述第一溶液的表面相接触而标记第一溶液中的细胞。可使用产生沉降于培养基表面上的精细小滴的方法将液体均匀分布于孔或培养皿内的培养基表面上,而不会破坏培养基内的细胞集落。
[0102] 细胞标记剂可以是能够与细胞相互作用以改变细胞与背景的反差的任何化合物。例如,细胞标记剂可以是结合细胞成分的可见光染料或结合特异性细胞表面抗原的缀合抗体或与细胞成分反应并可通过可见光或荧光而被检测的化合物。
[0103] 可见光染料可以是任何吸收可见光谱并在结合于细胞后改变细胞的颜色的染料。一些染料的实例包括但不限于,中性红、俾士麦棕(Bismarck brown)和尼罗蓝。
[0104] 一些可缀合于抗体的荧光实体的实例包括但不限于,荧光素、四甲基罗丹明异硫氰酸酯、藻红蛋白、多甲藻素-叶绿素-蛋白复合物(PerCP)、Cy3、Cy5、C5.5、Cy7、德克萨斯红、Alexa 488、Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 405、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 500、Alexa Fluor 514、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 610、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 635、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、Alexa Fluor 700和Alexa Fluor 750以及量子点(quantum dots)。
[0105] 与细胞成分发生反应的化合物的实例包括但不限于,四唑化合物例如3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(Yellow MTT)、MitoTracker Green FM、MitoTracker Deep Red 633、Hoechst 33342、黄绿素AM、钙黄绿素红-橙AM、Lavacell(Active Motif,CA)、Cell TraceTM TR甲酯、LysoTracker Red DND-99。
[0106] 所述含有细胞的第一溶液是粘性液体或凝胶,其含有但不限于,甲基纤维素、琼脂、明胶或胶原,作为细胞培养基的成分。
[0107] 细胞培养基可以是任何能够支持细胞生长的培养基,包括但不限于,Iscove改良伊格尔培养基(IMDM)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)和Hank平衡盐溶液。
[0108] 可以采用本领域已知的技术产生小滴,包括利用喷雾器或利用喷墨技术制备的气溶胶小滴。喷雾器利用文丘里效应从液体产生气溶胶。当在培养基表面上方产生气溶胶时,一部分气溶胶小滴会沉降到培养物表面上方。产生气溶胶的另一常见产品是喷枪。喷枪典型地也利用文丘里效应,产生夹带于气流中的气溶胶。喷墨打印机利用不同的机制产生精细的墨水小滴,其不需要气流,是另一种将液体均匀地输送至半固体培养基表面而不破坏集落的有前途的方式。无气喷嘴也可产生气溶胶。
[0109] 本发明的方法特别适合于集落形成细胞(CFC)分析。造血CFC分析法建立已经30余年,其在研究和临床上被广泛用于定量多能前体细胞和红系、粒细、单核巨噬细胞和巨核细胞途径的单系定向前体细胞。最常用的方法涉及将半固体营养培养基内的单细胞悬液接种在培养皿或多孔板内,所述培养基中补充了合适的细胞因子组合,可支持各种前体细胞增殖和分化成为含有可识别的子代的不同集落。可使用光学显微镜,基于对集落内的成熟细胞的形态学识别而对CFC进行原位分类和计数。获得的集落的数量应该与接种的细胞悬液的CFC含量成线性比例,条件是所接种的细胞的数量要足够低。通常,在“最佳”测定条件下,与那些含有单系细胞的集落相比,含有两系或多系细胞的集落(混合集落)起源于更加原始的前体细胞。不成熟的前体细胞越多,则产生的集落越大,且需要更长的培养时间集落内的细胞才能成熟。
[0110] CFC分析有多种用途。其在建立干细胞富集策略和其他离体操作中用于测定前体细胞数量,用于鉴定刺激性和抑制性生长因子,和用来评价用于移植的骨髓、脐带血和动员的外周血样品的造血增殖潜力。由于这种分析是评价各种造血细胞类型的分裂和分化能力的基准功能性分析,其一直作为特别有效的手段用于评价各种离体操作对造血移植物的质量的影响,所述的离体操作包括T细胞耗竭、HSC和前体细胞富集、基因治疗和冻存。CFC分析也用于在移植后监测造血植入物,并用于测试新的治疗剂的潜在的造血系统毒性。以其目前的形式,CFC分析已经被认可,可在脐带血库和其他细胞处理实验室用于确定移植物的前体细胞含量。
[0111] 在药物研发过程中用于毒性测试时,与那些测定对连续细胞系的增殖、代谢或存活的影响的分析法相比,集落形成细胞分析更加可靠和信息丰富。前体细胞培养1至2周可增殖成集落,因此可了解生长动力学情况,使得它们比仅仅测定死细胞的分析法具有更高的敏感性。此外,可培养多种前体细胞类型,这样可检测系列特异性并鉴定特定的靶群体。
[0112] 可使用来自不同动物物种的细胞,这样可使人注意到人类与临床前试验物种之间的潜在差异。在进行体内研究之前,可使用小鼠或大鼠细胞来进一步细化剂量并减少临床前毒理学试验所需的动物数量。可使用人类细胞确定从动物模型外推而得到的人类数据的准确性。由此可以降低I期临床试验的起始剂量的不确定性,并减少以无效剂量治疗的患者的数量。这些分析法有助于填补动物模型与临床试验之间的缺口。
[0113] CFC分析目前的局限性在于需要对剂量进行主观分类和定量。这是一个耗时的、具有可变性的过程,人力成本很高。实现此类分析的自动化可给该领域带来巨大的改进,并使得目前的手工分析法所无法实现的高通量筛选成为可能。实现该分析自动化的关键性挑战在于建立集落的特异性标记方法,并消除培养基与分析用培养皿的壁相遇处形成弯月面所产生的光干扰。本发明的方法可克服这些问题。
[0114] 就理解本说明书的范围而言,在此使用的术语“包含”及其变化形式是开放式的术语,其指明存在所述的特征、元件、组分、组、整体和/或步骤,但不排除还存在其他未提及的特征、元件、组分、组、整体和/或步骤。上述含义也适用于具有类似含义的术语,例如“包括”、“具有”以及它们的变化形式。最好,在此使用的程度术语例如“基本上”、“大约”和“大致”指的是被修饰的术语具有合理的偏差量,以至于不会显著改变最终的结果。这些程度术语应该被解释为包括被修饰的术语的至少±5%的偏差,除非这一偏差可能否定其所修饰的术语的含义。
[0115] 以下非限制性实施例用于举例阐述本发明:实施例
[0116] 实施例1-给表面“擦上(Wipe-on)”/“擦去(wipe-off)”施用涂覆剂
[0117] 采用这种方法来处理聚苯乙烯培养表面(Greiner 657102和627102)和PTFE表面(TeflonTM),使用不同的涂覆剂,例如硅烷化剂(Syl-offTM(Dow Corning Q2-7785),AquasilTM(Pierce 42799)和SurfasilTM(Pierce 42800))、含氟聚合物类(FlouropelTM涂层,Cytonix corp.)和普通石油胶(白矿脂,USP)。如下施用涂覆剂:
[0118] ·以涂覆剂湿润无尘巾并用力擦拭培养表面,在所述表面上产生涂覆剂厚膜(“擦上”)。
[0119] ·将膜在环境条件下(18至25℃,相对湿度50至70%(RH))放置达60分钟,然后使用清洁无尘巾以平滑的动作轻柔摩擦所述表面,以去除过量的涂覆剂。这一“擦去”步骤留下涂覆剂薄膜,肉眼隐约可见。
[0120] ·将处理后的表面在60至85℃温育30至120分钟(对于聚苯乙烯材料)或190至210℃(对于PTFE表面)。处理后的表面冷却至环境条件,然后评价涂层特性。
[0121] 考虑用于涂层评价的特性为最大和最小(经前进和后退确定)接触角以及固有静态接触角(认为是前进和后退接触角的平均值)、液体在涂覆表面上的流动、弯月面宽度、以及弯月面形成所造成的光干扰。
[0122] 实施例2-涂覆涂覆剂的浸没法
[0123] 通过浸没法以硅烷化剂(SigmacoteTM(Sigma SL2))或含氟聚合物类(FlouropelTM涂层,Cytonix corp.)处理PTFE或聚苯乙烯表面,方法如下:
[0124] ·将涂覆剂置于合适大小的玻璃容器内。或者,如果待涂覆的是培养皿或容器的表面,涂覆剂直接放置于培养皿或容器内。
[0125] ·将待涂覆的表面完全浸没于涂覆剂中。
[0126] ·从涂覆剂中取出表面(或对于培养皿或容器,从所述表面取出涂覆剂),并调整方向使得过量涂覆剂从表面流去。
[0127] ·在环境条件下通过蒸发作用使溶剂干燥。或者,在自然干燥之前用非吸附性材料(例如,乳胶手套)轻轻擦拭所述表面,可使得涂覆剂更好地覆盖所述表面。
[0128] ·将处理后的表面在60至85℃温育30分钟。
[0129] 实施例3-在聚苯乙烯培养孔中构建物理壁特征
[0130] 用硅、EPDM和Buna Nitrile形成具有平滑垂直表面的孔嵌入物。嵌入物的外径使得当其嵌入6-孔聚苯乙烯多孔板内时能够与孔壁完全贴合(图1)。
[0131] 实施例4-以不同的表面测定液滴的接触角
[0132] 为了定量三相(固相基材-水性液体-空气)接触线处的接触角,将20μL的液体小滴缓慢置于表面上。使用Lumenera数码相机和0.6x放大镜头获取停留在所述表面上的小滴的侧方图像。镜头的方向为水平面对液滴,其水平与固体表面平齐。使用置于不透明漫射体后的琥珀色LED制造逆光来提供照明。图像捕获条件保持恒定设置(增益1,曝光0.3s,获取分辨率2080X1536)。通过在放置液滴的2至5s内(体积的缓慢滴加完成至小滴在表面上使接触线前移)获取的图像确定前进接触角。通过在增加小滴体积至40μL之后然后移除20μL使接触线在表面上后退所获取的图像确定后退接触角。图像也在小滴操作2至5s内获取。
[0133] 通过分析侧方图像确定接触角。简言之,通过小滴与基材的接触点划一条直线(L1),由此建立图像的水平面(小滴基线)(图2)。通过位于小滴左侧边缘和右侧边缘与所述表面的接触点附近的小滴周边点画出最符合的圆(BC1)。该曲线意在与接触点附近的小滴曲率最符合。参照点(P1)位于L1与BC1的交叉点。L1与曲线在P1处的切线之间的角被认为是接触角。
[0134] 计算出的前进和后退接触角的平均值是静态接触角。动态最小接触角被认为是后退接触角。
[0135] 实施例5-测定表面流动性
[0136] 将20μL的液滴置于表面上,并通过添加(前进接触线)和移除(后退接触线)体积为20μL的液体而使其发生动态体积改变,通过其接触直径的改变程度而定量确定表面流动性。从按照实施例4所述获取的侧方图像和小滴与表面的左侧接触点与右侧接触点之间的距离的测定值来确定接触直径。计算前进小滴和后退小滴之间的直径改变百分数。后退体积之后恢复至最初的小滴直径代表高表面流动性。因此,直径改变的%与表面流动性反向相关。
[0137] 实施例6-测定弯月面宽度和高度
[0138] 通过在与培养皿的涂覆了硅氧烷的壁的界面处(见图3,例如未处理的孔表现出弯月面)获取测试溶液的液体表面的亮视野图像来确定弯月面宽度。使用倒置显微镜(Zeiss AxiovertTM 40CFL)和Fuji FinepixTM S2数码相机通过2.5x放大物镜和2.5x照相机目镜获取图像。通过对这些图像进行空间校准并使用数字图像处理方法测定暗区而确定弯月面的宽度。
[0139] 通过获取培养皿的侧方图像来观察侧方弯月面,以确定弯月面高度。使用Canon PowershotTM A75照相机获取置于黑色背景前的培养皿的图像。通过对这些图像进行空间校准并使用数字图像处理方法测定弯月面的垂直尺度而确定可见弯月面的高度。
[0140] 实施例7-使用不同表面为显微镜测定弯月面光干扰
[0141] 使用如实施例4所获取的图像,通过对根据图像亮度进行修正的暗区的亮度谱进行积分而定量弯月面造成的光干扰。从在未处理的聚苯乙烯培养皿中由1%甲基纤维素/IMDM形成的弯月面获得经积分的像素亮度值,对其进行标准化后的百分数作为光干扰。
[0142] 实施例8-硅氧烷表面处理对前进接触角的影响
[0143] 如实施例1所述以SurfasilTM和Syl-offTM处理聚苯乙烯表面。此外,如实施例2所述以SigmacoteTM处理聚苯乙烯和PTFE(TeflonTM)表面。如实施例4所述测定硅化处理后的表面的前进接触角,结果概括于表1。
[0144] 表面与水的接触角通常大于与MethocultTM的接触角,但未处理的PTFE是例外,对于后者而言,两种液体的接触角相似。SigmacoteTM处理没有可感知地改变聚苯乙烯与TM TM TMMethocult 或水的接触角;但是以Sigmacote 处理PTFE显著降低了其与Methocult 和水的接触角。SurfasilTM明显降低了聚苯乙烯与MethocultTM和水的接触角,而Syl-offTM明显增加了聚苯乙烯与两种液体的接触角。
[0145] 实施例9-硅氧烷表面处理对弯月面程度的影响
[0146] 如实施例1所述以AquasilTM、SurfasilTM和Syl-offTM处理聚苯乙烯表面。此外,如实施例2所述以SigmacoteTM处理聚苯乙烯和PTFE(TeflonTM)表面。将MethoCultTM半固体培养基(StemCell Technologies,Vancouver,Canada)加至经涂覆的培养皿中,并通过倾斜和旋转培养皿使之分布在整个培养皿中,造成动态弯月面形成。将培养皿在37℃的湿化培养箱中温育1到10天不等。如实施例6和7所述测定硅化处理对弯月面宽度、高度和光干扰(统称弯月面程度)的影响。结果概括于表1和表2。
[0147] 使用SigmacoteTM给PTFE施加硅氧烷涂层显著降低了观察到的弯月面,而未处理的PTFE与未处理的聚苯乙烯对照相比没有表现出弯月面程度降低。
[0148] 发现对聚苯乙烯施加各种硅氧烷涂层极大地降低或消除了弯月面宽度和光干扰。表面被处理一天后,将MethocultTM加至孔或培养皿中。通过测定光干扰,此时弯月面的降低范围为,相对于未处理对照培养皿,可见弯月面降低50%至降低>95%(见图3–未处理,图4–AquasilTM,图5–SigmacoteTM,图6–Syl-offTM,图7–SurfasilTM)。各种涂层的弯月面降低效率排位如下:1.Syl-offTM,2.SurfasilTM,3.AquasilTM,4.SigmacoteTM。
[0149] 在37℃、5%CO2的湿化培养箱中温育10天的过程中发现,对于SigmacoteTM、SurfasilTM和AquasilTM处理的表面,测定到的弯月面幅度在温育的前4天内增大,但Syl-offTM处理的表面没有增大。以擦上法进行Syl-offTM处理在所有实验条件下均有效消除了弯月面。这些结果提示,对于许多涂层而言,对MethocultTM的弯月面降低效应仅仅是暂时的。
[0150] 实施例10-全氟碳聚合物涂层对弯月面特性的影响
[0151] 按照实施例2所述的浸没法,用全氟碳聚合物(FluoropelTM,Cytonix Corp.)涂覆聚苯乙烯培养皿(35mm Greiner,627102)。施加全氟碳后,令表面在60℃固化5分钟,随后在TM环境温度和湿度下干燥>1小时。向涂覆后的培养皿中加入1至2mL的MethoCult 半固体培养基,并使其在环境温度和湿度下平衡至少2小时,随后在37℃、5%CO2的湿化培养箱中10天。
如实施例6和7所述定量弯月面特性。全氟碳涂层的效应显示于图8。涂层使得弯月面宽度极大降低(<0.01mm,而未处理培养皿为2.4mm),而光干扰降低至低于未处理培养皿的1%。该涂层的弯月面降低特性在延长的温育过程中保持稳定,10天后没有发现弯月面程度进一步增加(表2)。
[0152] 实施例11-固体石蜡涂层对弯月面特性的影响
[0153] 以固体石蜡(3134熔点)涂覆聚苯乙烯培养皿(35mm Greiner,627102)。通过将石蜡熔融并在加热气流下预加热培养皿来涂覆蜡涂层。将液体石蜡填入预热的培养皿,并将过量的石蜡从孔里倾析出去。垂直方向转动培养皿,使得石蜡随着培养皿的冷却而固化为均匀的涂层。使用细胞刮刀去除培养皿底部的将过量石蜡。
[0154] 将2mL的MethoCultTM半固体培养基加至涂覆了石蜡的培养皿中,并在湿化培养箱中37℃温育。如实施例6和7所述在温育1、4和10天后定量弯月面特性。石蜡涂层的效应见图9。石蜡涂层极大地降低了弯月面宽度(0.33mm,而未处理的培养皿为2.1mm),而光干扰降低,为未涂覆培养皿的大约10%。发现所测量到的弯月面幅度在温育的前4天内增加,在第
10天稳定在未处理培养皿的大约一半(表2)。
[0155] 实施例12-矿脂涂层对弯月面特性的影响
[0156] 通过如实施例1所述的擦上/擦去方法,用石油胶(100%白矿脂,USP)涂覆聚苯乙烯培养皿(35mm Greiner,627102)。涂覆后,令表面在70℃固化30分钟。将1至2mL的MethoCultTM半固体培养基加至涂覆后的培养皿中,并使其在环境温度和湿度下平衡至少2小时。如实施例6和7所述定量弯月面特性。矿脂涂层的效应显示于图10。涂层使得弯月面宽度极大降低(<0.01mm,而未处理培养皿为2.4mm),而光干扰降低至低于未处理培养皿的1%(表2)。
[0157] 实施例13-聚合物固体表面的静态和动态接触角和全氟碳和硅氧烷涂层的效应[0158] 如实施例4所述测量若干聚合物固体表面的前进和后退接触角,所述聚合物固体表面涂覆了硅氧烷(Syl-offTM,Dow Corning)或含氟聚合物(FlouropelTM,Cytonix Inc.)涂覆剂,或未加处理。通过实施例1所述的擦上法施加硅氧烷涂层,而通过实施例2所述的浸没法施加含氟聚合物涂层。评价的表面包括聚苯乙烯(PS)、聚四氟乙烯(PTFE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚醚醚(polyetheretherketon,PEEK)和高强度硅氧烷橡胶薄膜(McMaster)。测定与水和若干水溶液的接触角,水溶液包括IMDM、含有0.26%、1%或2.6%甲基纤维素的IMDM、磷酸缓冲盐溶液(PBS)、和含有2%胎血清的PBS(PBS+2%FBS)。完整的结果概括于表3,其中显示了各种处理的和未处理的表面与不同水溶液的静态接触角(CA)和动态最小接触角(DM CA)。突出显示了获得使得弯月面消除的接触角的条件。
[0159] 未处理的聚合物塑料固体表面趋向于与绝大多数所测试的水溶液展现出85至105度之间的静态接触角。类似地,交联硅氧烷聚合物(高强度硅氧烷橡胶,McMaster)趋向于与所测试的多种水溶液展现出大约90度的静态接触角。不过,未处理的塑料和硅氧烷橡胶表面依水溶液特性的不同而展现出宽范围的动态最小(后退)接触角。水和简单离子水溶液(PBS,IMDM)趋向于形成90至105度范围内的动态最小(后退)角。相反,未处理表面的动态最小(后退)接触角对于粘性水溶液(含有0.26%至2.6%的甲基纤维素)或含有大分子如蛋白质的溶液(含有2%胎牛血清的PBS)低于85度。
[0160] 光滑聚合物薄膜(PS、PP、PTFE、PEEK、PVC)含氟聚合物涂层(FluoropelTM,Cytonix Inc.)和高强度硅氧烷橡胶表面有效地将动态最小接触角增加至85至105度之间。类似地,这些表面上的非交联硅氧烷薄膜涂层(Syl-offTM,Dow Corning)有效地将动态最小接触角增加至85度以上。
[0161] 实施例14-动态系统与静态系统中与聚合物表面的弯月面特性
[0162] 检测了未处理的或涂覆了含氟聚合物的35mm培养皿(Greiner 627102)以及含有未处理的PTFE嵌入物的或涂覆了硅氧烷的PTFE嵌入物的35mm培养皿;含有未处理的PEEK嵌入物、涂覆了硅氧烷或含氟聚合物的PEEK嵌入物、和含有涂覆了含氟聚合物的PVC嵌入物的35mm培养皿中的弯月面特性。采用浸没法(实施例2)将含氟聚合物涂层(FluoropelTM,Cytonix Inc)涂覆于表面,采用擦上法(实施例1)涂覆非交联的硅氧烷涂层(Syl-offTM,Dow Corning)。添加足以在培养皿中产生大致2至3mm的液面的体积的水溶液。对于静态弯月面测定,将液体逐渐加至培养皿的中央,直至培养皿壁上的液面达到大致2mm的高度。所有静态测定均在对培养皿没有任何物理扰动的情况下完成。在旋转培养皿使得液面在培养皿的壁表面上下移动之后进行动态弯月面测定。加入液体之后立即进行弯月面测定,然后在静态温育9天之后再次测定。采用实施例6所述的方法完成弯月面宽度和高度测定。通过实施例7所述的方法确定弯月面造成的光干扰。结果概括于表4,其显示了各种处理的和未处理的表面与不同水溶液在静态和动态环境中以及温育9天后的弯月面形成情况。弯月面程度以宽度(mm)和光干扰表示。突出显示了观察到显著弯月面降低的条件。表面涂层的弯月面降低效应在整个9天的温育期中一直保持。
[0163] 未处理的和没有预先湿化的聚合物表面在静态系统中趋向于展现出与测试的水溶液没有显著的弯月面。此外,当水性液体是水或简单离子水溶液(IMDM)时,对未处理的表面进行动态操作没有造成显著的弯月面。不过,对于粘性水溶液(1%甲基纤维素/IMDM)或含有蛋白质的溶液(PBS+2%FBS),对含有未处理的聚合物表面的培养皿进行动态操作造成显著的弯月面。
[0164] 培养皿的PS、PEEK或PVC壁表面的薄膜含氟聚合物涂层(FluoropelTM,Cytonix Inc)有效地消除了在动态系统中观察到的与所测试的粘性和含蛋白质的水溶液的弯月面。类似地,具有非交联的硅氧烷(Syl-offTM,Dow Corning)的PTFE或PEEK嵌入物薄膜涂层有效地防止了与所测试的粘性和含蛋白质的水溶液(1%甲基纤维素/IMDM和PBS+2%FBS)形成显著的弯月面。这些处理的和未处理的表面的弯月面特性在9天的静态温育过程中保持稳定(表4)。
[0165] 实施例15-弯月面程度与静态和动态最小接触角之间的关系
[0166] 考虑到实施例13和14所提供的数据,建立了接触角与弯月面程度之间的关联性。图11a和11b给出了这些关系。图11a显示了在所有条件下所测定到的接触角与它们相应的弯月面程度(如光干扰所表示)之间的关系。该图中,静态和动态接触角测定与相应的静态和动态弯月面程度相配对。图11b中,黑圈表示对未处理的表面以及它们所产生的动态弯月面程度(如光干扰所表示)所测定到的静态接触角。空心方块代表动态接触角与它们所产生的动态弯月面程度之间的关系。
[0167] 75至110度范围内的接触角在相同的物理条件下(静态或动态)产生可忽略的或不明显的弯月面。75度以下的接触角导致形成具有明显光干扰的弯月面(图11a)。大致110度和更大的接触角产生凸起的弯月面(肉眼观察),其表现为光干扰略增加。图11a还显示了大多数聚合物表面与水溶液的静态接触角大于85度,而在动态条件下主要观察到小于85度的接触角。
[0168] 75至110度范围内的动态最小接触角导致无显著的弯月面。在静态和动态系统中均保持动态最小接触角与弯月面程度之间的这种相关性。这在图11a和11b中是显然的。动态条件下(空心方块),大致85至105度之间的接触角导致低于20%的光干扰。不过,对于未处理的聚合物表面(实心圆圈),静态接触角与弯月面程度之间没有关系,而大致75至105度之间的静态接触角导致弯月面,光干扰为大致100%(图11b)。
[0169] 这些相关性证实,弯月面的显著降低需要75至110度范围内的动态最小接触角,而这一范围内的静态接触角不能有效预防对含有粘性或含蛋白质的水溶液的培养皿进行动态操作引起的弯月面形成。
[0170] 实施例16-表面处理对水溶液的流动性的影响
[0171] 如实施例12所述确定表面流动性,以通过体积变化使小滴的周边发生一个前进和后退循环之后小滴直径的改变程度表示。图12给出了不同水溶液在具有含氟聚合物和硅氧烷涂层的表面上的小滴直径变化百分数。通过实施例2的浸没法将含氟聚合物涂层(FluoropelTM,Cytonix Inc)涂覆于表面,通过实施例1的擦上法涂覆硅氧烷涂层(Syl-offTM,Dow Corning)。图中的值是在具有或不具有上述涂层的多种聚合物表面上观察到的流动性的平均值,这些聚合物包括聚苯乙烯、聚丙烯、聚氯乙烯、聚醚酮和聚四氟乙烯。
[0172] 尽管因聚合物基材的不同而观察到流动性具有可变性,但平均来看,含氟聚合物涂层使得小滴直径的改变程度有所降低,而在硅氧烷涂层则显著降低。水和IMDM在处理的和未处理的表面上的流动性之间的差异最大,在硅氧烷和含氟聚合物涂层上观察到最大的流动性。加入蛋白质(2%FBS)或增加粘度(1%甲基纤维素)降低涂覆表面的流动性,不过硅氧烷涂层与未处理的表面相比保留了显著更高的流动性。粘性或含蛋白质溶液在涂覆表面上的流动性增加被认为可通过使得三相接触线恢复至其具有最小能量输出的平衡状态而增强弯月面降低效应。因此,具有高流动性的表面可允许重力和表面能将固相-液相-汽相接触线快速恢复至接近其平衡接触角,由此减小液面动态扰动而形成的弯月面。
[0173] 实施例17-孔壁硅氧烷涂层对透射光扫描获取的图像的影响
[0174] 将一层硅氧烷密封剂(Dow Corning)涂覆于标准6-孔组织培养处理板(Corning,#3516)的孔壁。每孔加入大约1.5mL的基于甲基纤维素的细胞培养基(MethoCultTM4434,Stemcell Technologies,Canada)。壁上涂覆了硅氧烷的孔内弯月面显然较不明显。使用扫描装置(Gelcount,Oxford Optronix,England)获取了不具有疏水性硅氧烷涂层(图13)和具有疏水性硅氧烷涂层(图14)的壁的图像。不具有涂层的孔由于甲基纤维素培养基的弯月面的折射而在边缘附近具有暗缘,而具有疏水涂层的孔的边缘的影响则可以忽略。在通常条件下,由于弯月面的影响,更难以辨认培养皿边缘附近的集落。
[0175] 实施例18-孔壁硅氧烷涂层对透射光显微镜获取的图像的影响
[0176] 使用细胞刮刀(Falcon)将一层硅氧烷密封剂(Dow Corning Silastic Type A#3233880-1101)涂覆于24-孔未处理组织培养板(Corning)的4、5和6列的所有孔的壁上。将相对薄层的硅氧烷涂覆于壁上,但这样做时一些硅氧烷密封剂粘附于孔的底部,形成环状。
TM
在图15中间,该环看起来为锯齿状垂直线。将250μL的MethoCult 加入至同一板上的涂覆和未涂覆的孔内。当在Axiovert 40CFL(Zeiss)上采用亮视野显微镜观察时,孔边缘处的弯月面的暗效应在涂覆孔和未涂覆孔之间存在明显的不同。图15和图16显示了Fuji FinepixTM S2获取的图像,设置为1/8s曝光,恒定聚光器照明,5x放大物镜和2.5x照相机目镜。在涂覆有疏水硅氧烷层的孔与未涂覆的孔之间,弯月面对达到照相机的光的光学影响存在显著的不同。在不具有硅氧烷涂层的孔中,光亮度的降低从孔壁延伸了至少1.3mm(图16)。在未涂覆的孔中观察到的光学影响干扰了对生长于MethoCultTM中的集落的计数和鉴定。
[0177] 实施例19-不同壁材料对透射光显微镜获取的图像的影响
[0178] 为了检测不同壁材料对弯月面的影响,将硅、EPDM和Buna Nitrile(均为疏水材料)的环(Able O-Rings and Seals)置于组织培养处理的6孔板(Corning Catalog#3516)的孔中。所述环的外径接近于孔的内径。然后添加1mL的MethoCultTM(#4434)。所有的环均降低了弯月面并基本上消除了通常见于孔的周边的暗区。采用如图14所述相同的方法和设备获取环或孔的内缘处的图像。图17至图21显示了在放置了环的含有MethoCultTM的孔的边缘处获取的图像。环看起来为图像左侧的弯曲黑线。如图22所示,与不具有环状嵌入物的孔的图像亮度相比,所有具有环的孔的图像亮度均相对均一。有两个孔的环在孔的周边不同位置处从底部翘起。这导致壁与培养基之间的边界不是很清楚。将环压下去之后边界又变得清楚。
[0179] 所述环在环壁正上方均产生了清晰的培养基图像。壁与培养基之间的边界非常清晰,比使用硅氧烷密封剂的实施例17和实施例18涂覆的孔壁还要清晰很多。这种改善可能部分归因于这些材料具有光吸收特性。环状材料抑制了来自孔壁的透明塑料的任何反射光或折射光。
[0180] 实施例20-硅氧烷聚合物涂层对各种多孔板格式中的弯月面特性的影响[0181] 在未处理的具有不同直径的聚苯乙烯培养孔中保持弯月面程度。结果是,在较小的培养孔中,与弯月面成比例的光干扰增加。例如含有MethoCultTM培养基的6孔板中,弯月面覆盖了大致23%的孔表面积,而在96孔板中,弯月面覆盖了83%的孔表面,仅能够对孔的中央进行无障碍的显微镜分析。在各种多孔板格式中降低弯月面具有广泛的用途。在本实施例中,用各种硅烷化剂涂覆24和96孔聚苯乙烯培养板(Costar 3473和3370)。通过部分填充的方式给孔涂覆SigmacoteTM(Sigma SL2),并使之与聚苯乙烯表面接触~10min,然后吸去多余试剂,将剩下的溶剂干。通过部分填充的方式给孔涂覆Syl-offTM(Dow Corning Q2-7785)和SurfasilTM(Pierce 42800),并使之与聚苯乙烯表面接触~10min。然后用加样器吸去多余试剂,并用无尘巾擦拭培养孔。通过风干蒸发残余溶剂。在72℃的干燥箱中温育3小时使得硅氧烷涂层固化。将50和150μL的MethoCultTM(Stemcell Technologies H4434)分别加至24和96孔板中。环境条件下平衡30分钟,然后如实施例6和7所述定量弯月面程度(宽度和光干扰)。
[0182] 硅氧烷涂层的效应概括于表5。Syl-offTM和SurfasilTM硅氧烷处理在所有情况中显著降低了弯月面程度。见图25。Syl-offTM几乎消除了弯月面,是优选的处理方法。用所述涂覆方法进行SigmacoteTM处理没有可感知地减小弯月面,仍有明显的光干扰。在96孔板格式中,SigmacoteTM处理在孔的周边产生了不均匀的弯月面减小(图23)。通过进一步改进涂覆方法该处理可能是有效的。
[0183] 实施例21-通过气溶胶将染料输送至集落及其对集落与背景的反差的影响[0184] 染料中性红(Sigma,MO)以气溶胶的形式施加于生长在35mm培养皿(Greiner 627102)、6孔板或24孔板(Corning)内的MethoCultTM中的集落,使用的是商品化的用于输送药物的喷雾器(InspirationTM Respironics Model 626 Compressor Nebulizer)。将至少
2mL的溶液(0.2%w/v的染料)移至雾化室。喷雾器将染料雾化,染料被气流携带着沿一段长度的管路送至培养皿(Tygon)。管路的开口端延伸至各个培养皿或孔,以便将气溶胶导向培养基的表面。给各个孔或培养皿施加染料的时间取决于其表面积和所需的染色亮度。对于
35mm培养皿或6孔板的孔,通过在施加前后显微镜下观察进行定性判断,发现施加染料1分钟产生了最大的反差增加。对于24孔板的孔,为大约20秒。通过在孔或板的表面上来回移动管路而均匀地施加染料。加入染料后温育20分钟,然后通过光学显微镜检查集落。
[0185] 通过将染料雾化,可使之分布更加均匀,与使用加样器添加相比,分布的速度也更慢。这使得集落被染色时集落的形态学不会被明显扰动。图24至图29的照片是利用倒置光学显微镜以透射模式获取的,其显示了添加染料前后的髓系集落。将背景亮度调整至相似水平以便更好地比较处理的和未处理的集落,除此以外,未对数码照片进行其他操作。加入染料后各个细胞更加清晰,边界更加锐利(图25、图27和图29)。尽管一些细胞和细胞聚集体的相对位置发生了微小的改变,特别是在图26与图31之间,但添加染料没有改变集落的总体形态,在各种情况中,添加染料前后的同一个集落均可被识别。
[0186] 尽管所使用的是对溶酶体进行染色的普通染料,但也可以使用无需对细胞膜进行透化处理即可使用的其他染色试剂,例如针对细胞表面标记物的免疫荧光染料或对细胞内染色的活细胞染料,例如钙黄绿素AM、钙黄绿素红-橙AM、Lavacell(Active Motif,CA)、Cell TraceTMBODIPYTM  TR甲酯、LysoTracker Red DND-99、Heochst 33342、TubulinTracker Green、ER-Tracker Red、尼罗蓝、尼罗红和俾士麦棕。
[0187] 实施例22-使用免疫荧光染料和荧光性细胞内代谢物中间体对造血前体细胞亚型的特异性染色
[0188] 针对造血前体细胞的细胞表面标记物的荧光标记的抗体可通过缀合异硫氰酸荧光素(FITC)而产生,并可从多种商业途径获得。针对红细胞的细胞表面标记物的抗体(小鼠抗人抗糖蛋白A,Stemcell Technologies 10423)在PBS中稀释至浓度在20至70μg/mL之间,并通过喷洒于培养基表面而将该溶液施加于35mm细胞培养皿(Greiner 627102),培养皿中含有人造血前体细胞的成熟集落。将该抗体溶液加载于喷枪(KopyKake C3000GV),使用蠕动(Rainin,model RP-1)以恒定速度喷洒标记物,以便从喷枪喷嘴形成恒定和均匀的喷洒模式。在培养物表面喷洒,直至所有的染料――通常为200至300μL之间的溶液(含有4至20μg的标记抗体)――施加完毕。与实施例21所述的使用雾化器输送染料一样,使用喷枪输送染料没有对集落形态造成可感知的扰动。施加荧光染料之后,将培养皿温育在37℃、5%CO2的湿化培养箱内大致18小时。
[0189] 使用连接于放大倍率设置为0.9x的Meiji大变焦镜头的Lumenera Infinity 2-3相机获取染色的培养皿的暗视野图像和荧光图像。使用暗视野光源(Meiji Techno PBH)提供照明,并使用自动镜台(Maerzhauser,Germany)获取覆盖整个培养皿的相邻视野的连续图像。使用图像处理软件(ImageProTM,MediaCybernetics)将各个图像接片形成整个培养皿的单个图像。使用蓝色LED光源(Luxeon Lumineds)和激发器(Chroma,HQ470/40x)以及双带通发射滤镜(Chroma 59004m)激发FITC。
[0190] 图30的暗视野图像显示了多个清晰的各种类型造血前体细胞的集落。在同一方向上显示了相应的FITC染色的培养皿(图31)。FITC标记的集落与需要清晰分辨的背景之间产生了足够的反差,而更大的未标记的集落呈现为暗区,并在暗淡的绿色背景中形成剪影。因此,这种标记方法适合于通过数码图像分析法对各种集落类型进行分离。例如,可使用数码图像处理软件针对各种物理和光学特性对标记的集落进行检测、计数和分析。
[0191] 作为另一种替代性的方法可使用喷墨技术例如普通的喷墨打印机以细雾的方式施加染料。可将染料加载于墨盒内,打印机会以均匀和非常确定的方式将染料“打印”在孔内,打印的颜色越黑相当于加入的体积越多。香水喷雾器也可形成可用体积的气溶胶。
[0192] 尽管参照目前被认为优选的实施例描述了本发明,但应该理解本发明并不局限于这些实施例。相反,本发明旨在包括被所附权利要求书所覆盖的实质和范围内的各种改动和等同的形式。
[0193] 通过引用将所有的上述出版物、专利和专利申请以其全部内容并入本申请,如同对各个单独的所述出版物、专利或专利申请的全部内容进行引用一样。
[0194] 表1
[0195]
[0196] 表2
[0197]
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[0199]
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[0201]
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[0203]
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