处理生物质材料的方法和系统

申请号 CN201380025709.0 申请日 2013-05-16 公开(公告)号 CN104302776A 公开(公告)日 2015-01-21
申请人 国际壳牌研究有限公司; 发明人 C·W·雷德特克; P·G·汉密尔顿; K·M·克莱特曼;
摘要 本 发明 的实施方式提供用于 挥发性有机化合物 和 烃 的有效和经济的产生和回收。一实施方式包含使 生物 质 材料的固体组分与被适应于辅助 糖化 的溶液 接触 ,及使所述至少一种可 发酵 的糖与能利用至少一种可发酵的糖产生烃的 微生物 接触。固体组分通过如下步骤产生:将生物质材料导入无 溶剂 回收系统的隔室,其中所述生物质材料含有一种或更多挥发性有机化合物;使生物质材料与过加热的蒸气流在隔室中接触,以将生物质材料中的至少部分初始液体内容物 气化 ;自被加热的生物质材料分离蒸气组分和固体组分;及保留至少部分气体组分用作过加热的蒸气流的部分。
权利要求

1.处理生物质材料的方法,其包括:
(i)将生物质材料导入无溶剂回收系统的隔室,其中所述生物质材料含有一种或更多挥发性有机化合物
(ii)使生物质材料与过加热的蒸气流在隔室中接触,以将生物质材料中的至少部分初始液体内容物气化,所述过加热的蒸气流包含至少一种挥发性有机化合物;
(iii)自被加热的生物质材料分离蒸气组分和固体组分,所述蒸气组分包含至少一种挥发性有机化合物;保留至少部分气体组分用作过加热的蒸气流的部分;
(iv)自无溶剂回收系统排出固体组分,其中所述固体组分包含木质纤维素材料;
(v)自木质纤维素材料产生至少一种可发酵的糖;以及
(vi)使所述至少一种可发酵的糖与能利用至少一种可发酵的糖产生微生物接触。
2.权利要求1的方法,其中使所述微生物适应于表达下列中的至少一种:脂肪酸还原酶,脂肪合成酶,脂肪酰基转移酶,及醛脱羰基酶。
3.权利要求2的方法,其中所述微生物包含至少一种编码选自下列的基酸序列之一种或更多的核酸:SEQ ID NO:1~SEQ ID NO:4。
4.权利要求3的方法,其中所述微生物是酵母或细菌。
5.权利要求4的方法,其中所述酵母是啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae),且所述细菌是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
6.权利要求2的方法,其中所述微生物还被适应于表达酰基-ACP硫酯酶。
7.权利要求6的方法,其中所述微生物是被遗传修饰以表达外源酰基-ACP硫酯酶的遗传修饰的微生物。
8.权利要求7的方法,其中所述微生物包含至少一种编码SEQ ID NO:5的氨基酸序列的核酸。
9.权利要求2的方法,其中所述微生物还被适应于表达3-脂肪酰-ACP合酶III。
10.权利要求9的方法,其中所述宿主细胞包含编码SEQ ID NO:6的氨基酸序列的至少一种核酸。
11.权利要求2的方法,其中所述微生物还被适应于表达支链酮基脱氢酶复合物。
12.权利要求11的方法,其中所述微生物包含至少一种编码选自下列的氨基酸序列之一种或更多的核酸:SEQ ID NO:7~SEQ ID NO:10。
13.权利要求1的方法,其中使所述微生物适应于表达醛-产生酰基-ACP还原酶和脂肪醛脱羰基酶。
14.权利要求1的方法,其中被导入所述隔室的所述生物质材料从收获的作物的发酵过程得到。
15.权利要求14的方法,其中所述作物选自:高粱甘蔗,玉米,热带玉米,甜菜,能源蔗及其任何组合。
16.权利要求1的方法,其中所述隔室包含内有过加热的蒸气流流动的环形的圆筒形体。
17.权利要求1的方法,其中所述分离步骤通过使用偶联于隔室的旋分离部件完成,其中所述旋风分离部件被配置为自隔室排出分离的固体组分。
18.权利要求1的方法,所述生物质通过如下步骤产生:
向生物质添加至少一种添加的添加剂,其中所述至少一种添加剂包含微生物,且任选地包含酸和/或酶;及
在储存设备中储存制备的生物质材料至少约24小时,以允许自至少部分糖产生至少一种挥发性有机化合物。
19.处理生物质材料的方法,其包括:
使生物质材料的固体组分与被适应于辅助糖化的溶液接触,以及
使所述至少一种可发酵的糖与能利用至少一种可发酵的糖产生烃的微生物接触。
其中所述固体组分由包括下列步骤的方法产生:
将生物质材料导入无溶剂回收系统的隔室,其中所述生物质材料含有一种或更多挥发性有机化合物;
使生物质材料与过加热的蒸气流在隔室中接触,以将生物质材料中的至少部分初始液体内容物气化,所述过加热的蒸气流包含至少一种挥发性有机化合物;
自被加热的生物质材料分离蒸气组分和固体组分,所述蒸气组分包含至少一种挥发性有机化合物;
保留至少部分气体组分用作过加热的蒸气流的部分;
自无溶剂回收系统排出固体组分。

说明书全文

处理生物质材料的方法和系统

[0001] 【相关申请的交叉引用】
[0002] 本申请要求2012年5月17日提交的美国临时申请No.61/648,109,2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/786,844和2013年3月15日提交的美国临时申请No.61/786,860的优先权,它们的公开内容以它们的整体通过引用在本文合并。
【技术领域】
[0003] 本发明的实施方式总的涉及生物质材料的处理和更特别涉及使用容易可利用的可发酵的糖和来自生物质材料中的木质纤维素材料的进一步处理的可发酵的糖生产及回收挥发性有机化合物化合物。【背景技术】
[0004] 此部分旨在介绍可相关于本发明的例示实施方式的本领域的各方面。此讨论被认为辅助提供辅助本发明的特定方面的更佳理解的框架。因此,需知,此部分应这么理解,且不必然承认是任何现有技术
[0005] 随着世界的石油供给持续减少,对于可代替各种石油产品,特别是运输燃料的替代性的材料有增长的需求。显著量的努已被投入开发自化石燃料之外的资源提供能量的新方法和系统。目前,对于自可更新的生物质材料产生生物乙醇和其他运输燃料和化学品进行了诸多努力。一种类型的生物质是植物生物质,其含有高量的化合物,包括糖,淀粉纤维素,木质纤维素,半纤维素。努力已特别聚焦于来自容易可利用的可发酵的糖的乙醇和来自纤维素材料的乙醇。
[0006] 自玉米使用容易可利用的可发酵的糖的常规乙醇产生一般与有价值的食品资源竞争,其可还被越来越更严重的气候条件,诸如旱和涝放大,其负面地冲击每年收获的作物量。来自常规乙醇产生的竞争可抬高食品价格。尽管其他作物已作为用于乙醇产生的生物质材料,它们通常由于该作物的气候需求而不适合于全球实现。例如,乙醇也可自甘蔗有效产生,但仅在世界的特定地区,诸如巴西,具有可支持接近-全年收获的气候。
[0007] 而且,另外的可发酵的糖可游离自木质纤维素生物质,其包含半纤维素,纤维素和更小部分的木质素和蛋白。纤维素包含当它们自细胞壁和含有它们的聚合物释放时可转变为燃料和有价值的化学品的糖。
[0008] 旨在处理木质纤维素生物质的目前的方法限于包括未加工的生物质材料或城市固体废弃物(MSW)的原料。未加工的生物质包括甘蔗蔗渣,森林资源,作物残留物和湿/干收获的能源作物。这些常规原料源在它们可被导入木质纤维素材料的进一步处理之前需要储存,运输,粒径减小,及另外的前端处理。例如,生物质是昂贵的和可导致危害,诸如起火,鼠害,粉尘,不需要的碎片(诸如石)和汉坦病毒。而且,捆及森林资源相比更密的材料在运输上更昂贵,和相比粒径已减少及不需求进一步格式化的材料在操作上更昂贵。MSW还具有与可贡献于差燃料质量险以及健康和安全性风险的受调控的危险的金属的混杂相关的挑战。森林资源,诸如树,运输起来麻烦。而且,森林资源需要剥树皮,切成期望厚度的木片,及洗涤,以去除任何残留的土,污泥等。因此,对克服这些挑战的生物质仍有需求。
[0009] 【发明概述】
[0010] 本发明的实施方式可克服上述挑战以及提供其他优势和特征。在一实施方式中,原料可来自从挥发性有机化合物回收系统出来的固体组分。在该实施方式中,原料已可在加工的系统中流动,其允许原料直接进入反应器而根据期望产生另外的可发酵的糖。本发明的实施方式可提供用于挥发性有机化合物回收设备,以自发酵相回收产物和位置彼此接近的木质纤维素材料设备的进一步处理。进一步处理可产生可转化为烃和/或其他化学品的另外的可发酵的糖。该实施方式可允许自发酵产生挥发性有机化合物和木质纤维素材料的进一步处理,其在其可进入木质纤维素材料的进一步处理的生产流之前减小与其他原料关联的储存,操作及运输成本。该实施方式也可提供已格式化的原料(与常常需要在用于处理木质纤维素材料的生物质设备或在到达用于处理木质纤维素材料的生物质设备之前储存,运输和/或格式化的常规原料成对比)的连续供给,其减少特定关联的成本。
[0011] 当其被运输到用于处理木质纤维素材料的其他位置时,特定实施方式的原料也可具有更低操作及运输成本。不像其他常规原料源,诸如森林资源,特定实施方式的原料以粒子-尺寸减小的预格式化的方式从挥发性有机化合物回收系统出来,其可在原料可进入木质纤维素材料的处理之前减少或消除前端处理成本。本发明的特定实施方式的原料的预格式化的粒度分布相比其他常规原料源处于更密的形式,其可减少运输成本,由于每体积可运输更多这些实施方式的原料。本发明的实施方式可提供不依赖于收获时期而全年可利用的原料供给,特定是由此减少进一步处理植物的储存需求和成本的生物质材料,及不与对于人有价值的食品源竞争。
[0012] 在一实施方式中,制备生物质材料,以产生挥发性有机化合物。通过如下步骤从制备的生物质材料回收挥发性有机化合物:将制备的生物质材料导入无溶剂回收系统的隔室;使生物质材料与过加热的蒸气流在隔室中接触,以气化制备的生物质材料中的至少部分初始液体内容物,所述过加热的蒸气流包含至少一种挥发性有机化合物;自被加热的生物质材料分离蒸气组分和固体组分,其中蒸气组分包含至少一种挥发性有机化合物;及保留至少部分气体组分用作过加热的蒸气流的部分。蒸气组分中的化合物可通过适当的蒸馏过程进一步纯化。将至少部分固体组分进一步处理而产生另外的可发酵的糖。在一实施方式中,进一步处理包含接至少部分固体组分与被适应于辅助糖化的溶液触使而产生另外的可发酵的糖。在一实施方式中,通过使用1种或更多微生物发酵来将另外地产生的可发酵的糖转化为至少一种烃化合物。
[0013] 在一实施方式中,1种或更多生物是适应于产生烃的重组宿主细胞(或微生物),如由PCT申请PCT/EP2013/053600公开,其公开内容通过引用以其整体合并。例如,在一实施方式中,将重组宿主细胞适应于表达下列中的至少一种:脂肪酸还原酶,脂肪合成酶,脂肪酰基转移酶,及醛脱羰基酶,其中至少一种脂肪酸还原酶,至少一种脂肪醛合成酶,及至少一种脂肪酰基转移酶形成脂肪酸还原酶复合物。脂肪酸底物与脂肪醛合成酶的接触形成脂肪酸醛。脂肪酸醛与至少一种醛脱羰基酶的接触形成烃。
[0014] 脂肪酸底物可为脂肪酸,脂肪酰基-ACP(脂肪酰基-酰基载体蛋白)或脂肪酰基-CoA或这些之任何的混合物。脂肪酸还原酶复合物可包含具有酶学委员会(EC)No.1.2.1.50,例如与SEQ ID NO:1(发冷光杆菌(Photorhabdus luminescens)蛋白LuxC)具有至少50%序列同一性的脂肪酸还原酶多肽。另外地或独立地,脂肪酸还原酶复合物可包含具有EC No.6.2.1.19,例如与SEQ ID NO:2(发冷光杆菌(P.luminescens)蛋白LuxE)具有至少50%序列同一性的脂肪醛合成酶多肽。另外地或独立地,脂肪酸还原酶复合物可包含在EC类2.3.1.-中,例如与SEQ ID NO:3(发冷光杆菌(P.luminescens)蛋白LuxD)具有至少50%序列同一性的脂肪酰基转移酶多肽。另外地或独立地,醛脱羰基酶可在EC类4.1.99.5中,例如其可为与SEQ ID NO:4(点形念珠藻(Nostoc punctiforme)醛脱羰基酶蛋白)具有至少50%序列同一性的多肽。在例示实施方式中,使用具有序列SEQ ID NO:1~
4的全部酶。
[0015] 在一实施方式中,制备的生物质通过如下步骤产生:向生物质添加至少一种添加的添加剂,其中所述至少一种添加剂包含微生物,且任选地包含酸和/或酶;及在储存设备中储存制备的生物质材料至少约24小时,以允许自至少部分糖产生至少一种挥发性有机化合物。
[0016] 除了上述特征之外,本发明的实施方式通过克服挑战,诸如储存和运输成本,短收获窗,糖的快速降解,及设备中的大投资,允许自含有可发酵的糖的植物替代性的燃料,诸如乙醇,其他挥发性有机化合物,烃和其他化学品的经济的产生。本文所述的实施方式的方面可应用于任何生物质材料,诸如含有可发酵的糖的植物。本发明的实施方式的特征允许各种植物经济的使用,以产生替代性的燃料和化学品及不限于高粱和遭受类似挑战的其他植物。在本文凸显该挑战性的作物,因为其他方法和系统未能经济上使用这些挑战性的作物产生燃料和化学品。像这样,特别提及高粱不旨在限制,而是例证本发明的实施方式的一个特定应用。
[0017] 本发明的实施方式允许回收设备以受控制的方式不依赖于收获窗全年连续运行,由此增宽放置回收设备和/或处理木质纤维素材料的设备可利用的地理位置,包括具有相对短收获窗的地区。
[0018] 本发明的实施方式的其他优势和特征会自以下详述显而易见。但是,应明白,详述和特定实施例仅指示本发明的优选的实施方式,仅以例证方式给出,由于本发明的精神和范围之内的各种变化和修饰会自此详述对于本领域技术人员而言是显而易见的。【附图说明】
[0019] 这些图例证本发明的实施方式的一些特定方面,不应用于限制或限定本发明。
[0020] 图1是根据本发明的特定方面处理生物质材料的一实施方式的图。
[0021] 图2是根据本发明的特定方面处理生物质材料的另一实施方式的图。
[0022] 图3是根据本发明的方面的固体组分的糖化的特定实施方式的图。
[0023] 图4是根据本发明的特定方面的导入大肠埃希氏菌(E.coli)细胞的遗传元件(实线)的局部详示意图;
[0024] 图5显示根据本发明的特定方面获得的各种大肠埃希氏菌(E.coli)培养物的生长曲线。
[0025] 【发明详述】
[0026] 本发明的实施方式可提供从固体生物质材料以及用于进一步处理木质纤维素材料而产生用于转变进一步发酵的可发酵的糖的原料的乙醇或其他挥发性有机化合物,诸如乙醇和乙酸的有效和经济的产生和回收,包括烃化合物的产生。根据本发明的一方面,制备生物质材料而产生挥发性有机化合物。挥发性有机化合物通过如下步骤回收自制备的生物质材料:将制备的生物质材料导入无溶剂回收系统的隔室;使生物质材料与过加热的蒸气流在隔室中接触,以气化制备的生物质材料中的至少部分初始液体内容物,所述过加热的蒸气流包含至少一种挥发性有机化合物;自被加热的生物质材料分离蒸气组分和固体组分,其中蒸气组分包含至少一种挥发性有机化合物;及保留至少部分气体组分用作过加热的蒸气流的部分。将至少部分固体组分进一步处理而产生另外的可发酵的糖。在一实施方式中,进一步处理使至少部分固体组分与被适应于辅助糖化的溶液接触。在一实施方式中,将另外地产生的可发酵的糖发酵而产生烃。
[0027] 【生物质制备】
[0028] 如本文所用,术语“固体生物质”或“生物质”至少指称生物学物质自活,或最近活体。固体生物质包括可转变为纤维或其他工业化学品,包括生物燃料的植物或动物物质。固体生物质可源于多种类型的植物或树,包括芒,柳枝稷,大麻,玉米,热带杨,柳,高粱,甘蔗,甜菜,及任何能源蔗,及各种树物种,从桉到油棕(棕榈油)。在一实施方式中,固体生物质包含产生至少一种可发酵的糖的植物。固体生物质可包含2种或更多不同植物类型,包括产生可发酵的糖的植物。在优选的实施方式中,不旨在限制本发明的范围,选择高粱,由于其在低产陆地上的高-产率和高糖含量。
[0029] 术语“可发酵的糖”指称可由微生物在厌和/或耗氧条件下用作碳源(例如,戊糖和己糖)而产生有机产物诸如醇,有机酸,酯和醛的寡糖和单糖。该有机产物的产生可通常被称为发酵。产生至少一种可发酵的糖的植物在其生长循环期间的一个时点含有溶解于植物材料的水相的可发酵的糖。产生可发酵的糖的植物的非限制性例包括高粱,甘蔗,甜菜,及能源蔗。尤其是,甘蔗,能源蔗,及当它们接近或在它们的最大潜在可发酵的糖生产(例如,最大可发酵的糖浓度)时,高粱一般在水相中含有约5%~约25%可溶性糖w/w,及具有基于湿重的约60%和约80%之间的水份含量。
[0030] 术语“基于湿重”至少指称包括水作为质量的部分的质量百分率。在优选的实施方式中,糖产生植物是高粱。可使用提供碳水化合物微生物转变为挥发性有机化合物(VOC)的任何物种或各种属高粱。对于使用高粱的实施方式,植物提供特定益处,包括有效利用水,以及旱和热-耐受。这些性质使作物适合于许多地区,包括各种跨陆地区,诸如中国,非洲,澳大利亚及美国,诸如高原,湿地,及跨南德克萨斯的部分。
[0031] 在使用高粱的实施方式中,高粱可包括可收获更高浓度的可发酵的糖的任何变种或变种的组合。具有优选的性质的特定种高粱有时被称为“甜高粱”。高粱可包括可含或可不含有对于支持甘蔗碾磨机操作中的榨汁过程足够的水份的变种。在优选的实施方式中,固体生物质包括由Advanta商业上产生的Sugar T高粱变种和/或Sugar T的雄性亲本(其也是Advanta的可商购的产物)。在优选的实施方式中,使用的作物具有约5~约25白利糖度,优选约10~约20白利糖度,及更优选约12~约18白利糖度。术语“白利糖度”至少在本文指称水溶液中葡萄糖,果糖和蔗糖的含量,其中一度白利糖度是100g的溶液中1g的葡萄糖,果糖和/或蔗糖,及表示以重量百分率计(%w/w)的溶液强度。在另一优选的实施方式中,使用的作物的水份含量是约50%~80%,优选至少60%。
[0032] 在一实施方式中,作物是具有约18的白利糖度值和约67%的水份含量的Sugar T的雄性亲本。在另一实施方式中,作物是约12的白利糖度值和约73%的水份含量的Sugar T。在这些特定实施方式中,白利糖度和水份含量值通过手持式屈光计测定。
[0033] 在将至少一种添加剂(微生物,任选地,酸和/或酶)加入固体生物质之后,其成为制备的生物质材料,其中至少一种添加剂辅助可发酵的糖转变为VOC(诸如乙醇)。如上所述和以下进一步描述,制备的生物质材料可储存特定时间,以允许更多VOC通过转变过程产生。至少一种挥发性有机化合物然后回收自制备的生物质材料。挥发性有机化合物为本领域技术人员所知。美国EPA提供挥发性有机化合物(VOC)的描述,其中之一是任何碳的化合物,排除一氧化碳,二氧化碳,碳酸,金属碳化物或碳酸盐,及碳酸铵,其参与大气光化学反应,除了由EPA指定为具有可忽略光化学反应性的那些之外(见http://www.epa.gov/iaq/voc2.html#definition)。挥发性有机化合物或VOC的另一描述是其组成使它们可能在正常温度和压力的室内大气条件下蒸发的任何有机化合物。此是用于科学文献的VOC的一般定义,及与为室内空气质量使用的定义一致。正常温度和压力的室内大气条件指称通常见于人生活的建筑物的条件范围,由此可依赖于建筑物的类型及其地理位置而改变。一个例示正常室内大气条件由国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)和国家标准和技术学会(NIST)提供。IUPAC的标准是0℃(273.15K,32℉)的温度和100kPa(14.504psi)的绝对压力,及NIST的定义是20℃(293.15K,68℉)的温度和101.325kPa(14.696psi)的绝对压力。
[0034] 由于化合物沸点温度越低,其挥发性通常越高,有机化合物的挥发性有时由它们的沸点定义及分类。因此,VOC可由其沸点描述。VOC是具有在约101.3kPa的标准大气压力测量的约50℃~260℃的沸点范围的任何有机化合物。可从自本发明的实施方式回收的VOC回收和/或进一步处理的许多挥发性有机化合物应用于香料及调味工业。该化合物的例可为酯,,醇,醛,烃和萜烯。以下表1还提供可从自制备的生物质材料回收的VOC回收和/或进一步处理的挥发性有机化合物的非限制性例。
[0035] 表1
[0036]甲醇 乙酸乙酯 乙醛 二乙酰
2,3-戊二酮 苹果酸 丙酮酸 琥珀酸
丁酸 甲酸 乙酸 丙酸
异丁酸 缬草酸 异缬草酸 2-甲基丁酸
己酸 庚酸 辛酸 壬酸
癸酸 丙醇 异丙醇 丁醇
异丁醇 异戊基醇 己醇 酪醇
醇 苯乙基醇 2,3-丁二醇 甘油
酸 乙醇 戊基醇 1,2-丙醇
1-丙醇 2-丁醇 乙酸甲酯 乙酸乙酯
乙酸丙酯 乳酸乙酯 乳酸丙酯 丙酮
甲酸乙酯 n-丙基醇 2-甲基-1-丙醇 2-丙烯-1-醇
2,3-甲基-1-丁醇 3-丁烯-2-醇
[0037] 乙醇是优选的挥发性有机化合物。像这样,许多例特别提及乙醇。但是,此特定提及不旨在限制本发明。需知,本发明的方面也等同应用于其他挥发性有机化合物。另一优选的挥发性有机化合物是乙酸。
[0038] 本发明的实施方式提供固体生物质材料的长期储存而无制备的生物质材料中含有的挥发性有机化合物的显著降解,及它们保证糖保存,以允许VOC的持续的产生。如在此情景中使用,“显著”至少指称当测量制备的生物质材料中挥发性有机化合物的量或浓度时在误差界限之内。在一实施方式中,误差界限是约0.5%。
[0039] 因此,本发明的实施方式允许不依赖于收获时长而连续产生VOC,由此消除或最小化传统实时收获和回收过程中回收植物的时间。像这样,本发明的实施方式允许无对于延长收获季节一般做的妥协(诸如稍微更早收获和晚于峰时间)地在其峰收获作物。即,本发明的实施方式允许以高田地产率和高糖浓度收获,诸如当选择的作物达到了其可转变为挥发性有机化合物的可发酵的糖的峰糖浓度或量时,即便此导致较短收获时期。在一实施方式中,当其是其最大势可发酵的糖浓度的约80%,约85%,约90%,约95%或约100%时,收获或制备固体生物质。像这样,本发明的实施方式,特别是回收期,可无来自担心固体生物质和其中含有的VOC的酸败的时间压力地全年连续操作。本发明的实施方式允许接近或在其最大糖产生潜力时收获固体生物质,而固体生物质材料可在认为含有适合的量的糖的任何时点收获。而且,收获窗依赖于作物类型和地理位置改变。例如,在北美洲高粱的收获窗可跨约1~7个月。但是,在巴西和其他赤道及接近赤道地区,收获窗可达12个月。
[0040] 在使用植物作为固体生物质的实施方式中,固体生物质可使用本领域技术人员知道的任何适合的手段自现场收集或收获。在一实施方式中,固体生物质包含植物的茎组分和叶组分。在另一实施方式中,固体生物质还包含谷粒组分。在优选的实施方式中,固体生物质用饲草青贮饲料收获机(饲草或青贮饲料切割机)收获。青贮饲料或饲草收获机指称用来制造青贮饲料(其是已切成小,及在储存筒仓,青贮饲料贮藏器或在青贮饲料袋中压实在一起的草,玉米或其他植物)的农场设备。青贮饲料或饲草收获机具有切割机构,诸如鼓(刀具头)或有许多刀固定于其的飞轮,其切断及将切断物质转移到容具,所述容具连接到收获机或连接到侧驱动的另一运载体。优选饲草收获机,因为其提供超过甘蔗收获机或干捆的系统的益处。例如,饲草收获机相比甘蔗收获机提供更高密度物质,由此允许收获的物质的更有效运输。在一实施方式中,使用饲草收获机相比用甘蔗收获机收获的具有3 3
约300kg/m 的密度的甘蔗,及对于用甘蔗收获机收获的具有约200kg/m 的密度的高粱,产
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生具有约400kg/m 的堆密度的收获的高粱。一般而言,更高堆密度物质运输起来更廉价,其趋向于限制可获得蔗-收获的作物的地理区域。
[0041] 由此,饲草收获机总体是对于收获选择的生物质,诸如高粱而言,相比蔗收获机或干捆的系统欠昂贵的方式。不被理论束缚,相信节省成本部分是由于由饲草收获机收获的固体生物质的更高物质通量和更高堆密度。固体生物质可切成任何长度。在一实施方式中,收获机的切断长度可为设置为约3mm~约80mm,优选约3mm~约20mm范围,例如约3mm~约13mm切断长度最优选。以这些优选的切断长度,在饲草收获机中有观察不到的水分排出,如此损失最小。当选择切断长度时,收获机提供具有约选择的切断长度的平均尺寸或长度分布的生物质。在一实施方式中,从回收系统出来的固体组分的平均粒度分布可根据期望调整,这可通过调整收获机的切断长度来进行。
[0042] 将至少一种添加剂加入固体生物质,以辅助和/或加快适当的碳水化合物转变为挥发性有机化合物。在已添加选择的添加剂之后,固体生物质可称为制备的生物质材料。在一实施方式中,制备的生物质材料可包含以上所列的产生可发酵的糖的植物的至少一种或任何组合。在优选的实施方式中,选择的添加剂可通过使用收获机在收获期间便利地添加。
[0043] 在一实施方式中,在基于特定地区的生长条件的特定收获窗,诸如在北美洲对于高粱是约1~7个月产生至少约700吨,优选至少约1百万吨,诸如至少1.2百万吨,或更优选约至少5百万吨的制备的生物质材料。
[0044] 可在收获过程期间和/或之后的任何时点添加至少一种添加剂。在使用饲草收获机的优选的实施方式中,在收获过程期间将添加剂加入固体生物质而产生制备的生物质材料。尤其是,饲草收获机被设计用于在收获期间有效添加固体和液体添加剂。如上所述,添加的添加剂包含至少微生物(例如酵母),及任选地,酸和/或酶。在优选的实施方式中,选择的添加剂作为溶液添加。下文还提供潜在添加剂的另外的细节。
[0045] 对于使用饲草收获机或类似设备的实施方式而言,选择的添加剂可在全部期收获期间,诸如在摄入供给辊之前,在摄入期间,在切断时,在切断之后,通过风机,在风机之后,在加速器中,在吊杆(或出料槽)中,和/或在吊杆之后添加。在一添加酸和酶的实施方式中,酸在接近摄入供给辊添加,及将微生物和酶加入吊杆。在特定实施方式中,使用具有约30ft宽头部的V12发动机的Krone Big X饲草收获机。在使用Krone系统的一实施方式中,通过就在供给辊前排出溶液的柔性的管道添加酸作为溶液。以此方式,可视觉监测液体流,其显示酸溶液和固体生物质在切断室之内快速混合。在另一实施方式中,酸的添加也展示为使用Case New Holland FX 58饲草收获机的有活力的实践。在特定实施方式中,使用的饲草收获机可包括用于含有添加剂的机载架,至少待在收获期间添加的选择的添加剂。在另一实施方式中,待在收获期间添加的选择的添加剂可在拖车上拖在收获机之后。例如,在一实施方式中展示,可采用最小干扰收获机的正常操作的装备含有酵母,酶和酸的添加剂溶液的箱的改良的实用拖车,由此基本上维持收获过程的预期的成本和持续时间。例如,当在一实施方式中装备上述特定添加剂时,采用以约4英里/小时行进的青贮饲料收获机的正常收获构型和生物质产率维持约4英里/小时的近似收集速度。
[0046] 在本发明的实施方式中,制备的生物质材料最终运输到储存设备,其中其储存一定时间,以允许自固体生物质的至少部分可发酵的糖产生至少一种挥发性有机化合物。下文进一步提供储存期的细节。在特定实施方式中,选择的添加剂也可在储存设备添加。例如,在一实施方式中,选择的添加剂可在卸载期间或在固体生物质已在储存设备被卸载之后添加。在一实施方式中,用输送系统辅助在储存设备添加选择的添加剂。在储存设备添加到固体生物质的添加剂可为未曾添加的或另外的量的之前添加的。因此,选择的添加剂可因此在自收获过程起始至在储存区或设备储存制备的生物质材料之前的任何点,诸如在材料转移的点添加。
[0047] 如上所述,用于本发明的实施方式的添加剂包含至少微生物和任选地,酸和/或酶。可将选择的添加剂以任何顺序加入固体生物质。在优选的实施方式中,在添加微生物之前将酸加入固体生物质,以引发材料为微生物提供有吸引力的生长环境。
[0048] 在优选的实施方式中,将酸加入,以减小固体生物质的pH至辅助和/或加快选择的本土或添加的微生物生长的范围,其增加乙醇和/或挥发性有机化合物的产生。酸也可停止或减慢消耗旨在随后VOC生产的可发酵的糖的植物呼吸。在一实施方式中,添加酸,直到固体生物质的pH在约2.5和约5.0之间,优选在约3.7~约4.3范围,及更优选约4.2。使用的酸可包括已知道的酸,诸如硫酸,甲酸或磷酸。以下表2提供可个别或组合使用的酸的非限制性例。
[0049] 表2
[0050]硫酸 甲酸 丙酸 苹果酸
磷酸 马来酸 叶酸 柠檬酸
[0051] 在优选的实施方式中,在固体生物质随酸的添加达到了期望的pH之后,添加微生物。在添加剂情景中,微生物至少指称能冲击或影响制备的生物质材料的添加到固体生物质的活体。来自添加的微生物一例示冲击或效应包括提供从各种源,包括纤维素材料的可发酵的糖转变为乙醇或其他挥发性有机化合物的发酵或其他代谢。另一例示冲击或效应可为辅助制备的生物质材料中的纤维素解构为可代谢为乙醇或其他VOC的可发酵的糖的特定酶的产生。由微生物提供的仍另一例示冲击或效应包括可改善可作为动物饲料的最后副产物的质量,由此价值的化合物诸如维生素,辅因子和蛋白的产生。而且,微生物活动为堆提供热。微生物细胞壁或其他分解代谢物或组成代谢物的部分也可提供可由回收单元回收的增值的化学品。这些冲击和效应也可由对于固体生物质天然的微生物提供。
[0052] 可添加能冲击或影响制备的生物质材料的任何微生物。在优选的实施方式中,微生物可包括青贮饲料,动物饲料,葡萄酒和工业乙醇发酵应用中使用的微生物。在一实施方式中,选择的微生物根据待制造的有机分子的应用和期望的特征包括酵母,真菌和细菌。在优选的实施方式中,酵母是选择的微生物。在另一实施方式中,可加入细菌来制造乳酸或乙酸。也可加入特定真菌来制造这些酸。例如,可加入醋酸醋酸杆菌(Acetobacterium acetii)来产生乙酸;可加入乳杆菌属(Lactobacillus),嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)来产生乳酸;可加入产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes),产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens)和/或产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)来产生琥珀酸;可加入丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)来产生丙酮和丁醇;和/或可加入产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)来产生丁二醇。
[0053] 以下表3提供可个别或组合使用的优选的微生物的非限制性例。
[0054] 表3
[0055]
[0056] 优选的微生物也包括可耐受高乙醇浓度且在其相应微生物群落中是强竞争者的啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)株。微生物可为嗜中温菌或嗜热菌。嗜热菌是在约45℃以上温度最佳生长,且见于全部3个生命界:细菌,古细菌和真核菌的生物。嗜中温菌通常在约20℃和45℃之间是有活性的。在使用啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)株的一实施方式中,株可来自可商购的源诸如自Lesaffre的Biosaf,自Phibro的乙醇红,及Lallamand活化的液体酵母。如果微生物从商业源得到,微生物可根据提供者建议的率添加,其一般基于预期的糖含量每湿吨(水包括在质量计算中)。术语“湿吨”至少指称包括水的质量单位。可根据反应条件调整建议的量。添加的微生物可包含1株或多株的特定微生物。在一实施方式中,微生物以达500mL每湿吨固体生物质的比率添加。在使用可商购的酵母的特定实施方式中,添加约300mL的Lallamand酵母制备物每湿吨固体生物质。在另一实施方式中,可添加另外的酵母株。例如,可以约0.001kg/湿吨~约
0.5kg/湿吨之间,特别约0.1kg/湿吨的比率添加乙醇红。在仍另一实施方式中,另一酵母株,例如,Biosaf,可以约0.001kg/湿吨~约0.5kg/湿吨之间,特别约0.1kg/湿吨的比率添加。需知,可添加其他量的任何酵母株。例如,可添加约10%,约20%,约30%,约40%,约50%,约60%,约70%,约80%,约90%,约1.5倍,约2倍,约2.5倍,或约3倍的提供的量的微生物。
[0057] 在特定实施方式中,还添加酶。酶可为辅助自对于微生物代谢更难的植物材料,诸如不同纤维素材料产生可发酵的糖,和/或改善最后副产物作为动物饲料的价值,诸如通过制造更可消化的饲料的酶。酶也可为抗生素,诸如下文进一步讨论的溶菌酶。添加的酶可包括一种类型的酶或许多类型的酶。酶可来自可商购的酶制备物。辅助使特别难代谢的植物材料转变为可发酵的糖的酶的非限制性例包括纤维素酶,半纤维素酶,阿魏酸酯酶,和/或蛋白酶。另外的例也包括提供或辅助保障自原料产生可发酵的糖,或增加最后供给副产物的价值的其他酶。
[0058] 在特定实施方式中,辅助特别难代谢的植物材料转变为可发酵的糖的酶可由植物本身,例如在植物中产生。可产生可在生长植物中产生的纤维素酶,半纤维素酶和其他植物-聚合物降解酶的植物的例描述于专利公开和专利WO2011057159,WO2007100897,WO9811235和US6818803,这显示,用于解聚合植物细胞壁的酶可在植物中产生。在另一实施方式中,饲料青贮可用于活化该植物产生的酶以及调和生物质用于进一步处理。一例描述于专利公开WO201096510。如果使用,该转基因植物可以任何量包括在收获中。例如,特定实施方式可通过使用特定转基因植物作为唯一原料,或在相同或不同作物之中以散在的方式合并转基因植物来采用在植物中产生的植物中酶。
[0059] 在包括该植物-聚合物降解酶的特定实施方式中,可从植物的纤维素级分产生乙醇。在特定实施方式中,当将Novazymes CTEC2酶以相对于建议的量过量(建议的量的约100倍)加入高粱储存系统时,达到基于初始游离的糖含量约152%的理论乙醇转变效率。
尽管该量的酶可通过使用可商购的制剂添加,但这么做是昂贵的。另一方面,该量的酶可通过生长在生物质作物之中至少散在地产生这些酶的转基因植物来以更成本有效方式获得。
[0060] 自纤维素的乙醇产生在储存期期间(例如,在青贮饲料中)发生,及稳定储存约102天,之后实验终止。此展示,在特定实验条件下,过量该酶活性导致使用可发酵的糖自纤维素至少约52%乙醇产生。不旨在被理论束缚,对于特定实施方式,在实验中在收获期间酸的立即添加可降低pH,由此潜在地诱导酶活性,其如果产生,另外可损伤植物,尽管植物仍生长。
[0061] 在优选的实施方式中,如果添加酶,酶可为纤维素酶制备物的任何家族。在一实施方式中,使用的纤维素制备物是Novozymes Cellic CTec 2或CTec 3。在另一实施方式中,使用纤维溶解酶制备物,特别是,Liquicell 2500。如果使用,为降解种植聚合物添加的酶量可为达到期望的植物材料转变为可发酵的糖的任何量,诸如建议的量。在特定实施方式中,添加约80,000FPU~约90,000,000FPU,优选约400,000FPU~约45,000,000FPU,更优选约800,000FPU~约10,000,000FPU的酶每湿吨生物质。术语“FPU”指称滤纸单位,其至少指称于50℃、在大致pH4.8,在1小时内自50mg Whatman No.1过滤纸块释放2mg的还原糖(例如,葡萄糖)需要的酶量。
[0062] 在特定其他实施方式中,选择的添加的添加剂可包括能减缓或控制细菌生长的其他物质。这些其他物质的非限制性例包括抗生素(包括抗生素酶),诸如Lysovin(溶菌酶)和 (维吉霉素,细菌抑制物)。细菌生长的控制可允许适当的微生物加快和/或提供挥发性有机化合物的产生。抗生素是抑制或杀灭生命的某物的一般术语。抗生素的一例是细菌抑制物。在一实施方式中,使用旨在影响细菌,而非其他微生物的选择性抗生素。选择性抗生素的一例是Lactrol,其影响细菌、但不影响酵母。
[0063] 在特定实施方式中,如果使用,Lactrol可以约百万分之1~百万分之20(ppm)w/v(重量Lactrol每体积液体)的比率添加,如溶解于制备的生物质材料的水相,例如以约5ppm w/v。在使用酶控制细菌生长的一实施方式中,优选使用溶菌酶。溶菌酶可来自商业源。例示可商购的溶菌酶制备物是Lysovin,其是已被宣告容许在食品,诸如葡萄酒中使用的溶菌酶的制备物。
[0064] 酶和/或其他抗生素物质,如果使用,可独立地或结合另一个和/或随微生物添加。在特定实施方式中,也可添加辅助和/或提供挥发性有机化合物产生的作为微生物的营养的其他化合物作为添加剂。以下表4提供其他物质的非限制性例,包括抗生素,其可加入固体生物质。
[0065] 表4
[0066]
[0067] 个别,作为小聚集物或生物膜附接于固体的酵母和其他微生物已显示增加了对抑制性化合物的耐受性。不旨在被理论束缚,长期发酵的部分可为可能的或被该微生物与固体结合增强。像这样,包括对于微生物结合优化的微生物的制备的生物质材料以及可结合微生物的添加剂可经历更大程度的发酵和/或发酵效率。提供和/或辅助长期发酵的物质不同于增加发酵速度的物质。在特定实施方式中,发酵速度增加不如长期发酵(特别是经许多周或月的时期的)那么重要因子。
[0068] 以下提供应用于一个特定实施方式的添加剂的特定量。如果使用,添加酸的比率和量随添加特定酸的特定固体生物质的缓冲能力而改变。在使用硫酸的特定实施方式中,以达约10l/吨湿生物质,例如约3.8l/吨湿生物质的比率添加9.3w/w%硫酸,以达到约4.2的pH。在其他实施方式中,比率会依赖于酸的浓度和类型,液体和其他内容物及特定固体生物质的缓冲能力,和/或期望的pH而改变。在此特定实施方式中,以约3.2g/湿吨固体生物质的比率添加Lactrol。酵母或其他微生物根据自提供者建议的比率,诸如根据预期的糖含量每湿吨添加。在一特定实施方式中,Lallemand稳定化的液体酵母以约18fl盎司每湿吨添加,及Novozymes Cellic CTec2以约20fl盎司每湿吨添加。
[0069] 在优选的实施方式中,在收获期间,根据本发明的上述方面将选择的添加剂加入固体生物质流,以产生制备的生物质材料。优选地,将制备的生物质材料运输到储存设备,以允许制备的生物质材料的碳水化合物转变为期望的量的挥发性有机化合物和/或等待挥发性有机化合物的回收。可使用任何适合的运输方法和/或装置,诸如汽车,火车,等和将制备的生物质材料放置到运输手段的任何适合的方法。可用于运输生物质材料的汽车的非限制性例包括末端-卸载自卸货车,侧方-卸载自卸货车,及自身-卸载青贮饲料货车。在优选的实施方式中,使用青贮饲料货车。在使用饲草收获机收集生物质的实施方式中,该固体生物质的运输相比由常规手段收集的物质的运输更有效,诸如甘蔗坯,因为用饲草收获机切割的固体生物质中堆密度更高。即,切断为更小块的物质相比坯中的物质更稠密地
3 3
填充。在一实施方式中,青贮饲料货车中堆密度的范围在约150kg/m 和约350kg/m 之间变
3
化,例如约256kg/m。因为在特定实施方式中,全部选择的添加剂在收获期间添加,优选到收获机上,微生物可在运输期间与生物质开始相互作用,且以此方式,运输不对总体过程有害。
[0070] 将生物质,无论制备的或非制备的,递送到至少一个储存区或设备。储存设备可位于离收获位点任何距离。如果未曾添加过或如果需要进一步添加另外的量或类型,可添加选择的添加剂而产生制备的生物质材料。在优选的实施方式中,制备的生物质储存在制备的表面上的至少一堆一定时间。设备可合并人造或天然的地形。人造结构可在未起初指定用于青贮饲料的位点包括既有结构,诸如水道和水处理塘。制备的表面的非限制性例包括混凝土沥青,飞灰,或土壤表面。至少一堆可具有任何尺寸或形状,其可依赖于操作条件,诸如可利用的空间,生物质量,期望的储存持续时间,等。
[0071] 可发酵的糖的转变过程是放热反应。但是,过多热可有害于转变过程,如果温度在制备的生物质材料中微生物的致死范围。但是,在使用约700湿吨生物质及堆达约12英尺的一实施方式中,乙醇产生和稳定性是令人满意的。因此更大堆可能不会受扰于过热。在一实施方式中,对于全部类型的微生物,包括嗜热菌,堆的内部部分维持约20℃~约60℃范围的温度。在不采用嗜热菌的一实施方式中,堆的内部部分维持约35℃~约45℃范围的温度。
[0072] 在储存设备储存为至少一堆的制备的生物质材料也可称为湿储存的生物质聚集物。在添加选择的添加剂之后,至少部分固体生物质转化为挥发性有机化合物,诸如糖发酵为乙醇。在一实施方式中,制备的生物质材料储存对于达到厌氧环境足够的时间。在优选的实施方式中,厌氧环境在约24小时内达到。在另一实施方式中,厌氧环境在多于约4小时内达到。在仍另一实施方式中,厌氧环境在达约72小时内达到。
[0073] 堆可为独立式的或以另一结构形成,诸如被设计为接受青贮饲料的青贮饲料贮藏器,包括收集水径流和浸出液的设备,在生物质上方布置防水布,及辅助有效初始青贮饲料货车卸载到贮藏器以及全年生物质移出。个体贮藏器尺寸可为约支持约700湿吨~10,000,000湿吨或更多的每年原料需求的尺寸。例如,储存设备可具有50个贮藏器,其中各个体贮藏器可就总最大约5百万湿吨的储存的材料,在任何一次接受100,000湿吨的制备的生物质材料。在乙醇是选择的挥发性有机化合物的优选的实施方式中,每1湿吨的制备的生物质材料回收约14加仑~约16加仑的乙醇。提供的数是例示的及不旨在限制储存设备可调节的制备的生物质材料的量。
[0074] 在特定实施方式中,储存堆还包括浸出液收集系统。在一实施方式中,收集系统用于移出自储存堆收集的浸出液。例如,浸出液收集系统可适应于在储存时期期间,在特定点自堆移出液体。在另一实施方式中,浸出液收集系统适应于在储存堆中循环液体。例如,循环可涉及取至少部分回收的液体及使其回到堆中,优选在或接近顶部部分。该再循环允许堆中液体的特定部分的更长滞留时间,甚至随制备的生物质材料的回收期开始及制备的生物质材料的非-液体组分的部分被发送到回收单元。更长滞留时间导致更长微生物反应时间,及因此,更高浓度的有机挥发性化合物,诸如乙醇。
[0075] 可如描述采用本领域技术人员知道的任何适合的浸出液收集系统。在特定实施方式中,浸出液收集系统沿着堆的底部,优选位于接近储存堆或贮藏器(如果被使用)的中部包含至少一个槽,其中储存堆以设计为将液体自制备的生物质材料导向槽及出到期望的收集容具或到其他应用的级制备。
[0076] 在另一实施方式中,浸出液收集系统包含一个或更多穿孔的导管,优选由聚氯乙烯(PVC)制造的管,其沿着堆的底部运行,以允许导管中收集的液体自堆导离。
[0077] 在一实施方式中,随制备的生物质材料被加入贮藏器或搁放在制备的表面的上部,在堆上重复驱动拖拉机或其他重器械,以辅助填充。在一实施方式中,制备的生物质材3 3 3
料的填充跨约7lb/ft ~约50lb/ft 每立方英尺。在优选的实施方式中,填充约30lb/ft ~
3 3
约50lb/ft,特别约44lb/ft。在一实施方式中,堆中制备的生物质材料的压实辅助和/或允许在上述优选的时期达到厌氧环境。在另一实施方式中,在实施填充之后或在实施填充期间,将不通透空气的膜(一般适合用途的塑料防水布)放置在堆上。在特定实施方式中,尽可实施地快地将防水布放置在堆上。例如,在24小时时期之内将防水布放置在堆上。
[0078] 在一实施方式中,制备的生物质材料储存至少约24小时和优选至少约72小时(或3天),以允许产生挥发性有机化合物,诸如乙醇。在一实施方式中,制备的生物质材料储存约3天,优选10天,更优选大于10天。在一实施方式中,制备的生物质的储存时期是约1天~约700天,优选约10~700天。在另一实施方式中,生物质材料储存达约3年。在一实施方式中,制备的生物质材料储存对于允许至少约95%的理论产生效率(如通过关联生物化学通路的化学计量评定计算的)的糖向至少一种挥发性有机化合物的转变效率足够的时期。在另一实施方式中,制备的生物质材料储存对于允许至少约100%的糖向至少一种挥发性有机化合物的计算的转变效率足够的时期。在仍另一实施方式中,制备的生物质材料用特定添加剂,诸如酶制备,其允许基于可利用的可发酵的糖的初始量达约150%的理论值的糖向至少一种挥发性有机化合物的计算的转变效率。不旨在被理论束缚,认为,以100%或100%以上的效率,挥发性有机化合物从起初可利用的可发酵的糖和来自制备的生物质材料中的纤维素或其他聚合物材料的可发酵的糖产生,其可通过由应用于生物质的特定添加剂辅助的酶促水解或酸水解达到。
[0079] 产生的挥发性有机产物,诸如乙醇,在储存的制备的生物质材料中f保持稳定储存时期的持续时间。尤其是,制备的生物质材料可储存达700天而无挥发性有机化合物的显著降解。“显著”在此情景中至少指称当测量制备的生物质材料中挥发性有机化合物的量或浓度时在误差界限之内。在一实施方式中,误差界限是0.5%。已显示,在至少约330天后,乙醇在堆中保持稳定而未观察到显著乙醇损失。本发明的实施方式的此方面是重要的,因为其保障至少8个月的稳定的储存,其用仅约4个月的收获窗致使全年VOC产生和回收。本发明的实施方式相比仅能在4个月收获窗/年期间操作的常规实时处理提供显著优势。即,本发明的实施方式允许使用仅4个月收获窗全年操作植物,由此对于与为实时处理使用的相同的尺寸的植物减少资本成本。
[0080] 而且,在采用防水布的一实施方式中,考虑在防水布边缘周围及防水布边缘上放置土壤或其他培养基,以(1)提供压下防水布的重量;及也(2)发挥自堆过滤废气的生物滤器的作用。在该一实施方式中,生物滤器对于有机物和一氧化碳解毒/降解有效。制备的生物质材料也可储存为压缩的模块,驱过堆,贮藏器,筒仓,袋,管或包住的捆或其他厌氧储存系统。
[0081] 在一实施方式中,监测来自制备的生物质材料的堆的废气流,及发现,存在仅小水平的有机物,及也非常低水平的氧化氮。例如,以下表5.1,5.2和5.3显示在本发明的特定实施方式的一个实现的储存期期间收集的各种废气样品的分析。指定“BDL”指称可检测的限以下的量。Summa和Tedlar指称可商购的气体采样容器。
[0082] 表5.1
[0083]容器类型 容器ID %H2 %O2 %N2 %CH4 %CO2 %H2O 标准化的CO2
Tedlar袋 A BDL 1.72 7.84 BDL 95.90 5.23 85.21
Tedlar袋 B BDL 2.30 9.12 BDL 89.97 5.97 82.62
Tedlar袋 C BDL 0.71 3.57 BDL 97.45 5.54 90.18
Tedlar袋 D BDL 0.72 3.18 BDL 97.50 5.97 90.14
Tedlar袋 E BDL 1.86 7.24 BDL 91.75 7.64 83.26

Summa容器 EQ#8 0.01 5.74 22.14 0.07 73.74 5.28 66.84
Summa容器 EQ#13 0.09 3.28 12.89 0.33 84.48 5.66 78.18
Summa容器 EQ#16 0.12 3.30 13.01 0.12 84.65 4.99 78.70
[0084] 表5.2
[0085]
[0086] 表5.3
[0087]
[0088] 本发明的实施方式,尽管相对未含在贮藏器中,应是环境上良性的。即使如此,本发明的特定方面与使用土壤或其他培养基作为在贮藏器周围及贮藏器上放置的生物滤器良好拟合,因为气体自防水布下逃逸性质是辐射状的。像这样,蒸气具有与堆的边缘接触的更高量表面积。在使用生物滤器的实施方式中,蒸气相在进入气氛之前经过接近边缘团放置的生物滤器(诸如土壤或堆肥)释放。生物滤器保留许多潜在环境污染物和由储存堆释放的气味,及其消除或大大减少自储存堆释放的潜在有害废气。
[0089] 在一实施方式中,制备的生物质材料储存直到其含有不多于约80wt%液体。储存制备的生物质材料直到其相比初始含量含有至少约4~约5%更高。在此阶段,湿储存的生物质聚集物仍不被认为是“啤酒”,由于其仍含有超过约20%固体。在一实施方式中,储存制备的生物质材料直到其含有约2wt%和约50wt%之间的乙醇,及优选约4wt%和约10wt%之间的乙醇。液体的平衡主要是水,但可含有许多其他有机化合物,诸如乙酸,乳酸,等。
[0090] 本发明的实施方式允许以相比典型甘蔗榨汁操作更短得多的收获窗收获固体生物质,其允许:
[0091] (1)可放置设备的更大得多的地区,
[0092] (2)当作物具有其最高产生潜力时收获作物,
[0093] (3)在其最高糖浓度潜力收获作物,
[0094] (4)较短收获窗仍经济,以及
[0095] (5)去掉自用于发酵的生物质取汁的需求。
[0096] 【VOC回收】
[0097] 一旦制备的生物质材料已被储存期望的量的时间和/或含有期望的浓度的挥发性有机化合物,诸如乙醇,其可流入用于特定挥发性有机化合物的回收的VOC回收系统。回收系统和储存设备可位于离另一个任何距离。本文所述的系统和方法的实施方式允许二者的地理位置和它们相对于彼此的位置上有弹性。在特定实施方式中,回收系统位于离储存设备约0.5~约2英里。任何适合的方法和/或设备可用于将制备的生物质材料自储存设备转移到回收系统。在一实施方式中,使用进料斗。在一实施方式中,青贮饲料锉,前端装载机或运输装载机,刮扫式输送螺旋或其他螺旋钻系统可用于将制备的生物质材料放进进料斗。材料可直接放入进料斗或其可由输送器系统,诸如带式系统转移到进料斗。含有制备的生物质材料的进料斗可然后被驱动到回收系统。
[0098] 回收系统是无溶剂及使用过加热的蒸气流将制备的生物质材料中的液体气化为气体组分,其可然后收集。超-加热的蒸气是以操作压力被加热到其饱和度温度以上的蒸气。在优选的实施方式中,在回收系统达到稳定状态之后,过加热的蒸气流仅包含之前自制备的生物质材料蒸发的蒸气,从而无其他气体导入,由此减少挥发性有机化合物燃烧和/或挥发性有机化合物的回收的产物流稀释的风险。部分蒸气作为产物移出和余部被再循环回用于将热转移到新鲜收入的制备的生物质材料。余下固体组分自系统排出和可具有各种随后用途。固体组分在特定实例中也可被称为固体产物。超-加热的蒸气直接接触生物质,转移能量及气化那里存在的液体。热或热能源不直接接触制备的生物质材料。由此,VOC回收系统也可被描述为提供“间接”加热接触。
[0099] 为了提供挥发性有机化合物的无溶剂回收,回收系统包含允许过加热的蒸气以连续方式流动,即,作为流的隔室。在一实施方式中,隔室具有环形状。在另一实施方式中,隔室包含旋转鼓。隔室具有制备的生物质材料可进入的入口。在一实施方式中,入口包含耐压旋转螺纹塞或其他类似装置,其可辅助分离制备的生物质材料,以增加暴露于过加热的蒸气流的表面积。
[0100] 在仍另一实施方式中,系统包含在液体气化之前移出制备的生物质材料中的至少部分液体的脱水机构。液体移出可在制备的生物质材料进入隔室之前和/或与此同时发生。来自制备的生物质材料的液体含有至少一种挥发性有机化合物,其可由进一步处理液体,诸如将液体供给到蒸馏柱来回收。液体可直接流向进一步处理单元,诸如蒸馏柱。替代性地或附加性地,系统还包括收集自制备的生物质材料移出的液体的收集单元。收集的液体的任何部分可然后进一步处理。
[0101] 在一实施方式中,脱水机构包含适应于自制备的生物质材料挤压液体的元件。在该一实施方式中,挤压可在制备的生物质材料被供给进隔室的同时实施。例如,入口可包含挤压机构,以自制备的生物质材料随其被导入隔室而挤压液体。替代性地或附加地,挤压可在制备的生物质材料进入隔室之前独立地实施。该挤压机构的非限制性例是螺纹塞供给器。
[0102] 在一实施方式中,液体移出机构包含机械压缩机。机械压缩机的类型的非限制性例包括带式压滤机,V-型压缩机,环式压缩机,螺旋压缩机和鼓式压缩机。在带式压滤机的特定实施方式中,制备的生物质材料被夹入2个多孔带之间,其在辊上及下经过,以将水份挤压出。在另一特定实施方式中,鼓式压缩机包含针对穿孔的鼓对材料施压的在其之内具有旋转压缩机卷的穿孔的鼓。在仍另一实施方式中,在碗式离心机中,材料进入圆锥,旋转碗,在其中固体在周界蓄积。
[0103] 隔室提供过加热的蒸气流可接触制备的生物质材料而气化来自制备的生物质材料的液体的空间。至少部分液体的气化提供制备的生物质材料的气体组分和固体组分。系统还包含分离单元,其中制备的生物质材料的固体组分可从气体组分分离,如此各组分可根据期望移出而用于进一步处理。在一实施方式中,分离单元包含离心收集器。该离心收集器的一例是高效旋风分离设备。在优选的实施方式中,分离单元也作为固体组分的出口。例如,分离单元可自无溶剂回收系统排出固体组分。有气体组分用分离出口,气体组分可自那里从系统出来而用于进一步处理,诸如蒸馏。在一实施方式中,分离单元还偶联于第2耐压旋转阀等而挤出或排出固体组分。在一实施方式中,过加热的蒸气由偶联于热源的热交换元件维持在其饱和温度以上的期望的温度,其中过加热的蒸气不接触热源。热源和系统之间的热转移经向过加热的蒸气的对流发生。在一实施方式中,热源可包括电元件或通过适当的热交换器的热蒸气。在一实施方式中,操作压力在约1psig~约120psig范围。在优选的实施方式中,操作压力在约3psig~约40psig范围。在特别优选的实施方式中,系统以约60psig的操作压力加压而自系统赶出蒸气组分。
[0104] 在一实施方式中,在回收系统起始时,制备的生物质材料被经入口导入隔室。蒸气起初被用作过加热的蒸气,而起初气化制备的生物质材料中的液体。过加热的蒸气连续移动通过隔室。当制备的生物质材料进入过加热的蒸气流时,其变得流化,其中其如流体般流动通过隔室。随制备的生物质材料导入,其与过加热的蒸气流接触。来自过加热的蒸气的热转移到制备的生物质材料及气化制备的生物质材料中的至少部分液体及从固体组分分离,其可仍含有水份。气体组分含有在制备的生物质材料中产生的挥发性有机化合物。在优选的实施方式中,随来自制备的生物质材料的液体开始气化,至少部分气化的液体可随过加热的流体在系统中再循环。即,在任何一个循环期间,至少部分气化的液体保持在隔室中作为过加热的蒸气,代替被收集用于进一步处理,直到下一循环,其中更多制备的生物质材料被补给进系统。
[0105] 在优选的实施方式中,在初始起始过程期间,过加热的流体可根据需要净化,优选连续(间歇性地或恒定地),直到达到稳定状态,其中过加热的蒸气仅包含制备的生物质材料的气化的液体。气体组分和固体组分可经相应出口收集。可经偶联于热源的热交换器向系统连续(间歇性地或恒定)加热,以维持过加热的蒸气的温度,在系统中维持期望的操作压力,或维持目标气化速度。可将系统的各种条件,诸如过加热的蒸气流的流速,压力和温度,调至达到期望的液体和/或挥发性有机化合物移出速度。
[0106] 在一实施方式中,将收集的气体组分冷凝而用于进一步处理,诸如转移到纯化过程,以获得更高浓度的选择的挥发性有机化合物。在优选的实施方式中,收集的气体组分直接补给进蒸馏柱,其提供未用于冷凝气体组分的能量的保存。在另一实施方式中,将气体组分冷凝及作为液体供给到下一纯化步骤。
[0107] 在一实施方式中,在进入回收期之前,制备的生物质材料具有基于生物质材料约至少10wt%和达约80wt%的初始液体含量。在特定实施方式中,初始液体含量是基于生物质材料至少约50wt%。在一实施方式中,初始液体含量包含基于初始液体含量约2~50wt%,及优选约4~10wt%乙醇。
[0108] 在一实施方式中,收集的固体组分含有约5wt%~约70wt%,及优选约30wt%~约50wt%液体,依赖于乙醇移出目标。在另一组分中,收集的气体组分含有约1wt%和约50wt%之间乙醇,优选约4wt%和约15wt%之间乙醇。在一实施方式中,回收系统回收制备的生物质材料中含有的挥发性有机化合物的约50%~约100%。制备的生物质的驻留时间基于许多因素改变,包括挥发性有机化合物移出目标。在一实施方式中,隔室中制备的生物质材料的驻留时间在约1~约10s范围。在一实施方式中,回收系统可操作约0.06barg和约16barg之间。术语“barg”指称巴规格,如本领域普通技术人员明白,及1巴等于0.1兆帕。在一实施方式中,回收系统中的气体具有约100℃~约375℃,特别约104℃~约372℃范围的温度,及从系统出来的固体组分具有小于约50℃的温度。收集的固体组分可用于其他应用。非限制性例包括动物饲料,用于生物质燃烧器的供料,以供给处理能量或产生电,或还利用纤维素乙醇过程(在青贮饲料堆中再发酵,或供给到预处理单元而用于任何纤维素乙醇过程)转变为乙醇,或用于需要木质纤维素生物质的任何其他生物-燃料过程的供料。
[0109] 无溶剂回收系统的操作条件包括温度,压力,流速,及驻留时间中的至少一个。可控制这些条件之任何一个或组合而达到目标或期望的移出目标,诸如移出的初始液体内容物的量或从回收系统出来的分离的液体组分余下的液体的量。在一实施方式中,控制至少一个操作条件,以达到将初始液体内容物的约10~90wt%,优选约45~65wt%,及更优选约50wt%移出。
[0110] 在优选的实施方式中,以恒定压力增加系统温度会导致生物质中的液体更快速气化,由此经给定驻留时间会导致生物质中更高百分率的液体蒸发。需控制从系统出来的蒸气流速,以匹配来自生物质的液体气化速度,以便达到稳定状态和也可用作控制系统压力的机理。增加系统压力会导致更多能量储存在系统中的蒸气相,其可然后用于辅助进一步处理或辅助蒸气移动到下一个下游处理单元。增加系统中生物质驻留时间导致更多热自蒸气相转移到生物质,导致更多液体气化。
[0111] 在特定例示实施方式中,回收系统包含闭合环气动过加热的蒸气干燥器,其可从可商购的源得到。在一实施方式中,闭合环气动过加热的蒸气干燥器是GEA Barr-Rosin TMInc的SSD 模型。其他适合的可商购的设备包括来自GEA Barr-Rosin Inc的过加热的蒸气TM
处理器,SSP ,自几个公司(包括GEA Barr-Rosin Inc.和Dupps)的环式干燥器;自DuppsTM TM
真空干燥器;自DuppsEvactherm 的QuadPass 旋转鼓干燥器,自Eirich的真空过加热的蒸气干燥器;自瑞士Combi Ecodry的使用过加热的蒸气的旋转鼓干燥器;及自Ceramic Drying System Ltd.的真空干燥器。
[0112] 可作为用于此过程的挥发性有机物回收单元的仍其他类型的间接干燥器是批托架干燥器,间接-接触旋转干燥器,旋转批真空干燥器,及搅拌的干燥器。这些干燥器的基本原理是它们会包括及附接于真空系统而随它们产生自固体移出蒸气(也通过真空降低压力,挥发物更容易移出)。湿固体接触热表面诸如托架或桨,热被转移到湿固体,导致液体蒸发,如此它们可在真空系统中收集及冷凝。
[0113] 图1例证采用过加热的蒸气干燥器的例示VOC回收系统和过程,参考系统100。在特定实施方式中,过加热的蒸气干燥可从GEA Barr-Rosin Inc得到。在图1中,将在青贮饲料堆中固态发酵后含有乙醇和/或其他VOC的制备的生物质材料1通过输入2补给到隔室3。在显示的特定实施方式中,输入2包含螺旋挤出机。如显示于图1,制备的生物质材料1的至少部分液体在进入隔室3之前被移出。脱水机构可为制备的生物质材料1所经过的螺纹塞供料器。自生物质材料1移出的至少部分液体可经流15直接流向蒸馏步骤11而不通过回收系统100。任选地,可偶联于脱水机构的输出的破碎机可用于辅助将脱水的生物质材料导入隔室3。
[0114] 如图1所示,回收系统100包含隔室3,其可被加压,显示为具有适当的直径,长度和形状的导管,其适应于提供期望的操作条件,诸如制备的生物质材料1的驻留时间,向过加热的蒸气热转移,及操作压力和温度。在进入隔室3之后,在稳定状态操作期间,制备的生物质材料1通过系统100,在期望的温度接触过加热的蒸气流及变得流化。如上所述,在优选的实施方式中,过加热的蒸气或其至少部分是自之前供给到用于VOC回收的系统100的制备的生物质材料获得的蒸气组分。流化的生物质以目标流速流动通过隔室3及保持与过加热的蒸气接触对于自制备的生物质材料1蒸发期望的量的液体足够的目标驻留时间。在显示的实施方式中,过加热的蒸气及制备的生物质材料1流动通过系统100由系统风扇
14辅助。系统100可具有1个或更多风扇。过加热的蒸气和生物质材料1的流速或速度可由系统风扇14控制。生物质材料1流动通过隔室3及达到分离单元4,其优选是旋风分离分隔器,在这里生物质材料的蒸气组分和固体组分1彼此分离。如显示,蒸气组分经塔顶馏出物流5自固体组分流离,和生物质材料1的余下部分被认为是固体组分,其自分离单元4作为固体组分7,优选由螺旋挤出机6排出。至少部分排出的固体组分7可用作动物饲料,燃烧器燃料或用于其他生物-燃料过程的生物质原料。例如,至少部分固体组分7可作为用于进一步处理固体组分7中含有的木质纤维素材料的处理400的原料。处理400示于图
3和相应地还在下文讨论。参照图1,部分蒸气组分,指示为流8,被保留及作为用来气化新导入的制备的生物质材料的过加热的蒸气的部分再循环。在显示的实施方式中,流8中的保留的蒸气组分流动通过加热交换器9而将其加热到目标操作温度。热源可包括蒸气,电,热烟道气或本领域技术人员知道的任何其他可应用的加热源。
[0115] 在优选的实施方式中,控制温度,使得系统中的压力维持到目标及存在充足的能量以蒸发期望的量的液体。压力也可由过加热的蒸气流的流速和向热交换器9的热输入控制。优选地,回收系统100连续操作,其中制备的生物质材料1以期望的速度连续补给,及蒸气组分10和固体组分6以连续速度连续移出。在优选的实施方式中,来自一次运行的“新鲜”蒸气组分8以待用作用于下一运行的过加热的蒸气流的目标速度连续保留。任何这些速度是可调整的,以达到期望的操作条件。如提及,系统风扇14使过加热的蒸气流循环通过系统100,和可被调节而获得目标流速或速度。
[0116] 参照图1,蒸气组分流5的余下部分(表示为数字10)流向蒸馏步骤11。依赖于蒸馏构型,蒸气组分部分10在进一步纯化之前可冷凝或优选作为蒸气直接供给到蒸馏柱。在优选的实施方式中,自蒸馏步骤11的蒸馏产物具有约95.6wt%乙醇(乙醇/水共沸物)的乙醇含量,其可使用常见的乙醇脱水技术进一步纯化到约99wt%以上,其显示为步骤12。最终乙醇产物13然后一般将用作用于与汽油混合的生物燃料。
[0117] 图2例证采用过加热的蒸气干燥器的另一例示回收系统和过程,参考系统200,其是由各种生产商提供的环式干燥器的代表。将制备的生物质材料201通过输入202补给到系统200,其优选包含螺旋挤出机。在一实施方式中,制备的生物质材料201的至少部分液体在进入系统200之前移出。脱水机理可为制备的生物质材料201所经过的螺纹塞供料器。自生物质材料201移出的至少部分液体可经流215直接流向蒸馏步骤211而不通过回收系统200。任选地,可用可偶联于脱水机构的输出的破碎机辅助将脱水的生物质材料导入隔室
203。
[0118] 参照图2,回收系统200包含隔室203,其优选包含旋转鼓,所述旋转鼓提供用于VOC回收的目标操作条件,包括制备的生物质材料201的驻留时间,向过加热的蒸气的热转移,及操作压力和温度。在进入隔室203之后,在稳定状态操作期间,制备的生物质材料201通过系统200,以操作温度和流速接触过加热的蒸气流,及变得流化。如上所述,在优选的实施方式中,过加热的蒸气或其至少部分是自之前供给到用于VOC回收的系统200的制备的生物质材料获得的蒸气组分。流化的生物质以目标流速流动通过隔室203及保持与过加热的蒸气接触目标驻留时间而达到来自生物质的液体的目标气化。流化的生物质然后达到分离单元204,其优选是旋风分离分隔器,在这里蒸气组分和固体组分彼此分离。如显示,蒸气组分通过塔顶馏出物流205自固体组分流离,及固体组分207自分离单元204排出。如显示,固体组分207经挤出机206从系统100出来,和其至少部分可作为用于处理400的原料,其进一步处理固体组分207中含有的木质纤维素材料。处理400示于图3和相应地在下文进一步讨论。固体组分207可直接流向处理400。附加地或替代性地,固体组分207可被运输而被补给到处理400。部分蒸气组分,指示为流208,被保留及作为用来气化新导入的制备的生物质材料的部分过加热的蒸气而被再循环。如显示,保留的蒸气组分208流动通过加热交换器209而将其加热到期望的温度。热源或热能源可包括蒸气,电,热烟道气或任何其他期望的加热源。如显示,使用热烟道气。控制温度,使得系统中的压力维持在目标压力及存在充足的能量以蒸发期望的量的液体。压力也可由过加热的蒸气流的流速和向热交换器209的热输入控制。
[0119] 参照图2,蒸气组分流205的余下部分,表示为数字210流向蒸馏步骤。依赖于蒸馏构型,蒸气组分部分210可在进一步纯化之前冷凝或优选作为蒸气直接供给到蒸馏柱。来自蒸馏步骤的产物可还通过使用已知道的过程浓缩。
[0120] 优选地,回收系统200连续操作,其中制备的生物质材料201以期望的速度连续补给,及蒸气组分210和固体组分206以连续速度连续移出。在优选的实施方式中,自一次运行的“新鲜”蒸气组分208以目标速度连续保留而用作用于下一运行的过加热的蒸气流。全部这些速度可调整而达到期望的操作条件。系统风扇214创建过加热的蒸气流的循环环和可被调节而获得目标流速。
[0121] 通过根据本发明的方面使用无溶剂回收系统,系统中热转移的点,即,向系统添加热和向制备的生物质材料热转移,在优选的实施方式中在蒸气相中发生,其提供导致在制备的生物质材料中蒸气相热转移(对流)相比固相热转移(传导)更有效的优势,其是差的导体,因为其具有绝缘性质。如上所述,在特定实施方式中,一旦稳定状态达到,自制备的生物质材料的液体气化的之外,无蒸气在系统中接触制备的生物质材料的固体组分和气体组分,这防止或减少会来自处理蒸气或其他蒸气的添加的稀释,以补加过加热的蒸气流。收集的气体组分可直接补给到用于期望的挥发性有机化合物的分离的蒸馏柱,其可提供显著能量保存。此系统的优势是接触湿固体的蒸气仅是已之前自固体移出的那些蒸气,从而无稀释或爆炸风险,等。
[0122] 【木质纤维素材料的进一步处理】
[0123] 参照图1和2,至少部分固体组分,诸如自回收系统,诸如系统100和200排出的固体组分7和组分207,可作为进一步处理系统400的原料及进一步处理而产生可发酵的糖。作为进一步处理系统400的原料的固体组分可指“基于生物的原料”,“固体组分原料”,或“生物质原料”。进一步处理系统400处理固体组分中的木质纤维素材料而产生可用于随后反应,诸如另外的发酵的可发酵的糖。在优选的实施方式中,进一步处理系统,诸如系统400,位于接近VOC回收系统,诸如系统100或200,及偶联于VOC回收系统,从而自回收系统排出的至少部分固体组分作为原料直接流向进一步处理系统400,其优选以连续或半-连续流模式操作。在该优选的实施方式中,固体组分原料处于夹带的加工系统,在那里其已在加工的系统中流动,代替需要机构而自储存提取及将其导入进一步处理系统。而且,将VOC回收系统偶联于进一步处理系统的实施方式可允许在一个位点,自各种源,例如,容易可利用的可发酵的糖和木质纤维素材料产生挥发性有机化合物,其减少与其他原料源关联的储存,操作及运输成本,其并非已在夹带的系统中。该实施方式也可提供原料的连续供给,该原料粒径已相比常常需要在用于木质纤维素材料的另外的处理的设备或在到达用于木质纤维素材料的另外的处理的设备之前储存,运输和/或尺寸减小的常规原料减少,这减少特定关联的成本。替代性地或附加地,固体组分可运输到位于不同位置的其他进一步处理系统。固体组分可被压粒或进一步格式化而辅助运输和/或减少运输成本。在本发明的实施方式中,固体组分粒径已减小,这相比其他原料源减少粒化或其他格式化过程的成本和困难。
[0124] 在特定实施方式中,进一步处理包含使至少部分固体组分接触被适应于辅助糖化的溶液。术语“糖化”具有其普通含义,至少指称使复杂的碳水化合物(诸如淀粉或纤维素)转变为简单或可发酵的糖的过程。可使用任何糖化过程或糖化过程的任何组合,诸如化学和/或酶促的。图3提供木质纤维素材料的2个例示糖化途径:一个经浓酸水解和另一个经预处理和酶促水解。在优选的实施方式中,糖化过程包含为随后酶促水解而预处理固体组分原料。需知,固体组分原料的预处理也可导致部分或至少一些糖化。预处理优选因为木质纤维素对于酶促水解是顽固性的,因为其结构复杂性。固体组分原料的预处理可一般通过移出半纤维素及使纤维素更可接近纤维素酶来改善其酶促可消化性。各种化学和机械预处理方法涵盖,包括但不限于,稀释酸,热-水,氨,,SPORL,蒸气爆炸,离子液体,organosolv,等,其已良好描述于文献(见,例 如 .Zhu and Pan(2010),Bioresource Technology,101:4992-5002;Hendriks and Zeeman(2009),Bioresource Technology,100:10-18,为全部目的,两个文章的公开内容通过引用以它们的整体在本文合并)。
[0125] 例如,在一实施方式中,预处理包含使用约170℃~约200℃的热水。在另一实施方式中,预处理包含使用高温,稀释-硫酸过程,其将生物质的半纤维素部分有效水解为可溶性糖及暴露纤维素,从而酶促糖化可成功。在一实施方式中,用稀释酸溶液预处理的温度跨约140℃~约170℃。为控制稀释酸预处理条件可采用的参数包括时间,温度和酸负荷。这些常常在被称为组合的严重性因素的数学方程中组合。一般而言,采用越高酸负荷,可在预处理中采用越低温度。相反,使用越低温度,需越长预处理过程。
[0126] 在一实施方式中,进一步处理系统400还包括使至少部分预处理的产物经历酶促水解而产生另外的可发酵的糖。下文还提供关于酶促水解的附加信息。在特定实施方式中,自木质纤维素材料的进一步处理的可发酵的糖可然后通过使用本文所述的各种微生物发酵。例如,使用适应于产生烃的微生物。此可通常指木质纤维素发酵。
[0127] 参照图1和2,在一实施方式中,自木质纤维素发酵的至少部分液体(其含有VOC)可经流430流向蒸气组分10或210和/或上述使用无溶剂回收系统100或200自制备的生物质1或201回收的液体产物15或215的接合蒸馏处理11或211。同样,在进一步处理400中来自木质纤维素发酵的至少部分任何固体材料中的VOC可通过使用无溶剂回收系统
100或200回收,如由流432指示。因此,本发明的特定实施方式可提供自生物质中的容易可利用的可发酵的糖产生VOC,那些VOC的回收,处理来自第1轮发酵和回收的木质纤维素材料,自木质纤维素材料产生另外的VOC,及回收该另外的VOC的整合的总体系统。该系统在那些实施方式中不需要另外的设备成本,由此资本投资,其中相同的设备可用于全部VOC产生。
[0128] 在特别优选的实施方式中,使用包含至少一种α-羟基磺酸的酸溶液。α-羟基磺酸对于将生物质以更低温度,例如,约100℃(对于α-羟基甲磺酸或α-羟基乙烷磺酸)水解为可发酵的糖如戊糖诸如木糖有效,在该过程中产生少至无糠醛。部分纤维素也已显示在这些比较弱条件下水解。已发现,其他多糖诸如淀粉也容易由α-羟基磺酸水解为组分糖。而且,α-羟基磺酸是可逆的而容易可移出的和可再循环的物质,不像无机酸诸如硫酸,磷酸或盐酸。生物质处理中采用的更低温度和压力导致更低设备成本。以此方式预处理的生物质已显示对于另外的糖化,尤其酶介导的糖化高度灵敏。
[0129] 以下通式的α-羟基磺酸:
[0130]
[0131] 其中R1和R2个是氢或具有达约9个碳原子的烃基(可含或可不含有氧),其可在本发明的处理中使用。α-羟基磺酸可为上述的酸的混合物。酸可通常通过使至少一种羰基化合物或羰基化合物的前体(例如,三噁烷和多聚甲醛)与二氧化硫或二氧化硫的前体(例如,硫和氧化剂,或三氧化硫和还原剂)和水,根据以下一般方程1反应来制备。
[0132]
[0133] 其中R1和R2个是氢或具有达约9个碳原子的烃基或其混合物。
[0134] 对于制备α-羟基磺酸有用的羰基化合物的例证性例包括:
[0135] R1=R2=H(甲醛)
[0136] R1=H,R2=CH3(乙醛)
[0137] R1=H,R2=CH2CH3(丙醛)
[0138] R1=H,R2=CH2CH2CH3(n-丁醛)
[0139] R1=H,R2=CH(CH3)2(i-丁醛)
[0140] R1=H,R2=CH2OH(羟乙醛)
[0141] R1=H,R2=CHOHCH2OH(甘油醛)
[0142] R1=H,R2=C(=O)H(乙二醛)
[0143] R1=H,R2= (糠醛)
[0144] R1=H,R2= (水杨醛)
[0145] R1=H,R2= (苯甲醛)
[0146] R1=R2=CH3(丙酮)
[0147] R1=CH2OH,R2=CH3(丙酮醇)
[0148] R1=CH3,R2=CH2CH3(甲基乙基酮)
[0149] R1=CH3,R2=CHC(CH3)2(三甲苯基氧化物)
[0150] R1=CH3,R2=CH2CH(CH3)2(甲基i-丁基酮)
[0151] R1,R2=(CH2)5(环己酮)或
[0152] R1=CH3,R2=CH2Cl(氯丙酮)
[0153] 羰基化合物和其前体可为上述化合物的混合物。例如,混合物可为羰基化合物或前体诸如,例如,已知在提升的温度热回复为甲醛的三噁烷或可通过由任何知道的方法醇向醛的脱氢而转变为醛的醇。该自醇转变为醛的一例在以下描述。羰基化合物源的一例可为羟基乙醛和自快热解油产生的其他醛和酮的混合物,诸如描述于“Fast Pyrolysis and Bio-oil Upgrading,Biomass-to-Diesel Workshop”,Pacific Northwest National Laboratory,Richland,Washington,September 5-6,2006。羰基化合物和其前体也可为酮和/或醛与或不与可转化为酮和/或醛的醇的混合物,优选在1~7个碳原子范围。
[0154] 通过组合有机羰基化合物,SO2和水的α-羟基磺酸的制备是一般反应及示于用于丙酮的方程2。
[0155]
[0156] α-羟基磺酸呈现如HCl般强(如果不更强),由于加合物的水溶液已被报道与NaCl反应而游离更弱的酸,HCl(见US 3,549,319)。方程1的反应是真平衡,其导致酸的轻易的可逆性。即,当加热时,平衡移向起始羰基,二氧化硫和水(组分形式)。如果允许挥发性组分(例如二氧化硫)经气化或其他方法离开反应混合物,酸反应完全颠倒和溶液成为有效中性。由此,通过增加温度和/或降低压力,二氧化硫可被馏出和反应由于Le 氏原理完全颠倒,羰基化合物的命运依赖于采用的物质的性质。如果羰基也是挥发物(例如乙醛),此物质也容易在蒸气相中移出。羰基化合物诸如苯甲醛,其在水中略溶,可形成第2有机相及由机械手段分离。由此,羰基可由常规手段,例如热和/或真空,蒸气和氮剥离,溶剂洗涤,离心,等的持续的应用移出。因此,这些酸的形成是随温度升高而可反转的,二氧化硫和/或醛和/或酮可自混合物闪蒸及冷凝或在别处吸收,以便再循环。
已发现这些可反转的酸,其大致如强无机酸般强,在生物质处理反应中有效。已发现这些处理反应产生非常少的不期望的副产物,糠醛,由其他常规无机酸产生的。此外,由于酸通过处理,用碱中和和盐的形成自反应混合物有效移出而基本上避免了复杂下游处理。逆转及再循环这些酸的能力也允许使用相比会另外经济上或环境上实践性的浓度更高浓度。作为直接结果,可降低生物质处理中采用的温度,以减少副产物诸如糠醛或羟甲基糠醛的形成。
[0157] 在一些实施方式中,描述的反应在任何适合的设计的系统中实施,所述系统包括系统包含连续-流(诸如CSTR和插塞流反应器),批,半-批或多-系统容器和反应器和填充床流通反应器。为严格经济活力的原因,本发明通过使用连续-流系统以稳定-状态平衡实行是优选的。与残留的酸留在反应混合物中(<1wt%硫酸)的稀释酸预处理反应成对比,所述过程的一优势是通过使用这些酸(10~20wt%)采用的更低温度导致基本上反应器中更低压力,导致潜在地欠昂贵的处理系统,诸如衬塑料的反应器,双联不锈反应器,及2205型反应器。
[0158] 在一实施方式中(不显示的),可还使处理的木质纤维素材料的至少部分产物流经历酶促水解而产生另外的可发酵的糖。下文还提供关于酶促水解的附加信息。在特定实施方式中,来自木质纤维素材料的进一步处理的可发酵的糖可然后通过使用上述各种微生物发酵而产生多个挥发性有机化合物,包括可转化为烃的烃前体化合物。此可通常被称为木质纤维素发酵。
[0159] 在一些实施方式中,可用多个反应器容器实施水解反应。这些容器可具有能实施水解反应的任何设计。适合的反应器容器设计可包括,但不限于,批,滴流床,顺流,逆流,搅拌箱,或流化床反应器。可采用反应器分期,以达到最佳或期望的经济的溶液。余下生物质原料固体可然后任选地自液体流分离,以允许顽固性固体的更剧烈的处理或直接通入液体流,以进一步处理,其可包括酶促水解,发酵,提取,蒸馏和/或氢化。在另一实施方式中,可随增加的温度特征使用一系列反应器容器,从而在各容器中提取期望的糖级分。各容器的出口可然后在组合流之前冷却,或流可个别补给到用于转变的下一反应。
[0160] 适合的反应器设计可包括,但不限于,可采用反向混合反应器(例如,搅拌箱,气泡柱,和/或喷剂混合的反应器),如果部分消化的基于生物的原料和液体反应培养基的粘度和特征足以在方案中操作,其中基于生物的原料固体悬浮于过量液相(与堆叠的堆消化器相反)。也想得到的是,可随作为固定相有在的生物质和经过该材料的α-羟基磺酸溶液采用滴流床反应器。
[0161] 处理反应产物含有适宜于进一步处理的可发酵的糖或单糖,诸如戊糖和/或己糖。
[0162] 在一实施方式中,流来自任何预处理过程的产物可由其他方法进一步水解,例如由酶将生物质进一步水解成含有戊糖和己糖(例如,葡萄糖)的糖产物及发酵而产生醇,诸如公开于US公开No.2009/0061490和US专利No.7,781,191,其公开内容通过引用在此合并。
[0163] 方法可用任何类型的纤维素酶(无论它们的来源)实施。可使用的纤维素酶的非限制性例包括获自如下来源的那些:曲霉属(Aspergillus),腐质霉属(Humicola)和木霉属(Trichoderma),毁丝霉属(Myceliophthora),金孢子菌属(Chrysosporium)的真菌及芽孢杆菌属(Bacillus),热双歧菌属(Thermobifida)和栖热袍菌属(Thermotoga)的细菌。在一些实施方式中,丝状真菌宿主细胞是支顶孢属(Acremonium),曲霉属(Aspergillus),短梗霉属(Aureobasidium),纤孔菌属(Bjerkandera),拟蜡菌属(Ceriporiopsis),金孢子菌属(Chrysosporium),鬼伞属(Coprinus),革盖菌属(Coriolus),隐球菌属(Cryptococcus),线黑粉菌属(Filibasidium),镰孢属(Fusarium),腐质霉属(Humicola),稻瘟菌属(Magnaporthe),毛霉属(Mucor),毁丝霉属(Myceliophthora),新丽鞭毛菌属(Neocallimastix),链孢霉属(Neurospora),拟青霉属(Paecilomyces),青霉属(Penicillium),白腐真菌属(Phanerochaete),射脉菌属(Phlebia),梨囊鞭菌属(Pyromyces),侧属(Pleurotus),裂褶菌属(Schizophyllum),踝节菌属(Talaromyces),嗜热子囊菌属(Thermoascus),草根霉属(Thielavia),弯颈霉属(Tolypocladium),栓菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。
[0164] 选择纤维素酶剂量,以将预处理的原料的纤维素转变为葡萄糖。例如,适当的纤维素酶剂量可为约0.1~约40.0滤纸单位(FPU或IU)每克纤维素,或它们之间的任何量。术语滤纸单元指称自50mg块的Whatman No.1过滤纸,于50℃,在大致pH4.8,在1小时内释放2mg的还原糖(例如,葡萄糖)需要的酶量。
[0165] 在实践中,水解可在水解系统中实施,其可包括一系列水解反应器。系统中水解反应器的数依赖于反应器的成本,水性浆的体积,及其他因素。用纤维素酶酶促水解产生水性糖流(水解产物),其包含葡萄糖,未转化的纤维素,木质素和其他糖组分。水解可以2阶段实施(见美国专利No.5,536,325,其通过引用在本文合并),或可以单阶段实施。
[0166] 在一实施方式中,包含可发酵的糖的处理的固体组分可然后由1种或更多微生物发酵而产生包含期望的化学品的发酵肉汤。在木质纤维素发酵系统中,许多知道的微生物之任何一种可用于将糖转变为期望的发酵产物。微生物将存在于处理的固体组分或水解产物中的糖,包括但不限于葡萄糖、甘露糖和半乳糖转变为发酵产物。特定发酵产物是烃。但是,可通过添加适当的生物产生其他化合物。
[0167] 在一实施方式中,木质纤维素发酵包含使用适应于产生烃的微生物。该微生物的一例公开于PCT申请PCT/EP2013/053600,其公开内容通过引用并入本文。
[0168] 在一实施方式中,使重组宿主细胞,诸如重组微-生物适应于表达以下酶之至少一种:脂肪酸还原酶(LuxC),脂肪酰基转移酶(LuxD),脂肪醛合成酶(LuxE),及醛脱羰基酶。脂肪酸还原酶,脂肪醛合成酶,脂肪酰基转移酶,及醛脱羰基酶酶的共表达可合称为CEDDEC。至少一种脂肪酸还原酶,至少一种脂肪醛合成酶,及至少一种脂肪酰基转移酶形成脂肪酸还原酶复合物。脂肪酸底物与脂肪醛合成酶的接触形成脂肪酸醛。脂肪酸醛与至少一种醛脱羰基酶的接触形成烃。宿主细胞可为重组体和可,例如,是表达以下这些酶之至少一种,及优选全部的遗传修饰的微生物:脂肪酸还原酶,脂肪醛合成酶,脂肪酰基转移酶,及醛脱羰基酶。这些酶可各由重组宿主细胞,在相同的宿主细胞或分开的宿主细胞之内表达。烃可分泌自其所形成的宿主细胞。产生的烃可包括用于柴油或航空燃料的适当的链长度的烷和烯烃,即十三烷,十五烷,十五碳烯,十六碳烯,十七烷和十七碳烯。
[0169] 在一实施方式中,脂肪酸底物之至少一些可通过使脂肪酰基-ACP与至少一种酰基-ACP硫酯酶接触来获得。术语酰基-ACP硫酯酶是EC类3.1.2.14,能催化自脂肪酰基-ACP释放游离的脂肪酸的酶。酰基-ACP硫酯酶可为,例如,与SEQ ID NO:5(自樟树(Cinnamomum camphora)的硫酯酶蛋白)具有至少50%序列同一性的多肽。
[0170] 在一实施方式中,脂肪酰基-ACP的至少一些可通过使酮基酰基CoA和丙二酰-ACP与至少一种3-酮脂肪酰-ACP合酶III(KASIII)接触来获得。此是EC类2.3.1.180,能催化酮基酰基CoA和丙二酰-ACP反应形成脂肪酰基-ACP的酶。3-酮脂肪酰-ACP合酶III可为与SEQ ID NO:6(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)酶KASIII)具有至少50%序列同一性的多肽。
[0171] 在此实施方式中,酮基酰基-CoA的至少一些可通过使酮酸与支链酮基脱氢酶复合物接触获得。此是能催化酮酸转变为酮基酰基-CoA的酶或酶的复合物。例如,支链酮基脱氢酶复合物可包含EC类1.2.4.4的多肽(例如与SEQ ID NO:7;枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BCKD亚基E1α具有至少50%序列同一性)和还包含EC类1.2.4.4多肽(例如与SEQ ID NO:8;枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BCKD亚基E1β具有至少50%序列同一性)和EC类2.3.1.168多肽(例如与SEQ ID NO:9;枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BCKD亚基E2具有至少50%序列同一性)和EC类1.8.1.4多肽(例如与SEQ ID NO:10;枯草芽孢杆菌(B.subtilis)BCKD亚基E3具有至少50%序列同一性)。在一实施方式中,支链酮基脱氢酶复合物是包含氨基酸序列SEQ ID NO:7~10之全部的单多肽。
[0172] 本文所述的这些其他酶(即,酰基-ACP硫酯酶和/或3-酮脂肪酰-ACP合酶III和/或支链酮基脱氢酶复合物)也可由微-生物表达。优选地,酶是外源的,即,在修饰之前不存在于细胞中,已通过使用诸如在本文所述的微生物方法导入。此外,酶可各由重组宿主细胞,在相同的宿主细胞或分离宿主细胞之内表达。烃可分泌自其所形成的宿主细胞。
[0173] 宿主细胞可由本领域技术人员知道适宜于此目的的任何方式遗传修饰。此包括在可能在宿主细胞之内繁殖的质粒或粘粒或其他表达载体上导入感兴趣的基因。或者,可使质粒或粘粒DNA或质粒或粘粒DNA的部分或线性DNA序列整合进宿主基因组,例如由同源重组。为了实施遗传修饰,DNA可由天然的摄取或由熟知的过程诸如电穿孔介导的导入或转化进细胞。遗传修饰可涉及在导入的启动子控制下基因的表达。导入的DNA可编码可发挥酶的作用或可调控其他基因的表达的蛋白。
[0174] 在一实施方式中,该宿主细胞可包含编码脂肪酸还原酶和/或脂肪醛合成酶和/或脂肪酰基转移酶和/或醛脱羰基酶和/或酰基-ACP硫酯酶和/或3-酮脂肪酰-ACP合酶III和/或支链酮基脱氢酶复合物的核酸序列。编码酶的核酸序列可为外源的,即,不天然存在于宿主细胞中。
[0175] 因此,在一实施方式中,有重组宿主细胞,诸如微-生物,其包含至少种多肽,所述多肽是EC类1.2.1.50的脂肪酸还原酶,例如,具有与SEQ ID NO:1具有至少50%同一性的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:1,28或29),及包含至少一种多肽,所述多肽是EC类6.2.1.19的脂肪醛合成酶,例如,具有与SEQ ID NO:2具有至少50%同一性的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:2,32或33),及包含至少一种多肽,所述多肽是EC类2.3.1.-的脂肪酰基转移酶,例如,具有与SEQ ID NO:3具有至少50%同一性的氨基酸序列(例如,SEQ ID NO:3,30或31)。细胞也可包含至少一种多肽,所述多肽是EC类4.1.99.5的醛脱羰基酶,例如,具有与SEQ ID NO:4具有至少50%同一性的氨基酸序列,或这些序列之任何的功能变体或片段。重组宿主细胞可包含多肽,所述多肽包含SEQ ID NO:1~4之全部和/或与SEQ ID NO:1~3之全部具有至少50%同一性的氨基酸序列(例如,选自SEQ ID NO:28~33的氨基酸序列,如上所述)和与SEQ ID NO:4具有至少50%同一性的氨基酸序列。重组宿主细胞可包含多核苷酸序列SEQ ID NO:11~14和/或序列SEQ ID NO:13和15和/或序列SEQ ID NO:13~16和/或这些特定组合的任何组合。
[0176] 重组宿主细胞可还包含:至少一种EC类3.1.2.14的酰基-ACP硫酯酶(例如,具有与SEQ ID NO:5或其功能变体或片段之任何具有至少50%同一性的氨基酸序列);和/或至少一种EC类2.3.1.180的3-酮脂肪酰-ACP合酶III(例如,具有与SEQ ID NO:6或其功能变体或片段之任何具有至少50%同一性的氨基酸序列);和/或至少一种支链酮基脱氢酶复合物,所述酶复合物包含EC类1.2.4.4,2.3.1.168和1.8.1.4的酶(例如,包含1种或更多各与SEQ ID NO:7~10或其功能变体或片段之任何具有至少50%同一性的氨基酸序列);和/或至少一种编码这些酶和/或这些的功能片段或变体中的至少一种的多核苷酸。细胞也可修饰为产生增加的水平的可由脂肪酸还原酶和脂肪醛合成酶和脂肪酰基转移酶用作底物而形成脂肪醛(其可然后由脱羰基酶转化为烃)的脂肪酸。重组宿主细胞也可包含一种或更多将烃运输出细胞的运输蛋白。
[0177] 图4是示意图,其详示导入大肠埃希氏菌(E.coli)细胞而产生预定烷的遗传元件(实线),它们与内源性基因(虚线)和新代谢通路的关系(箱表示基因而圆形表示代谢中间体。代谢物的关键字:ILV,异亮氨酸,亮氨酸和缬氨酸;MDHLA,甲基-丁烷/丙酰-二氢硫辛酰胺-E。基因的关键字:ilvE,内源性支链氨基酸氨基转移酶;E1α和E1β,来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的支链α酮基酸脱羧酶/脱氢酶E1α和β亚基;E2,来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的二氢硫辛酰转酰酶;E3,来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的二氢硫辛酰胺脱氢酶(为由E1亚基使用而环化硫辛酰胺-E);KASIII,来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的酮基-酰基合酶III(FabH2);accA至accD,内源性乙酰-CoA羧基化酶基因;fabH,内源性β-酮脂肪酰-ACP合酶III;tesA,内源性长链硫酯酶;硫酯酶,来自樟树(C.camphora)的肉豆蔻酰-酰基载体蛋白硫酯酶;luxD,来自发冷光杆菌(P.luminescens)的酰基转移酶;luxC和luxE,来自发冷光杆菌(P.luminescens)的脂肪酸还原酶和酰基-蛋白合成酶;AD,来自点形念珠藻(N.punctiforme)的醛脱羰基酶)。
[0178] PCT/EP2013/053600展示了本文所述的烃的产生的特定方面,包括经蓝细菌烷生物合成通路使外源脂肪酸转变为烷,经FAR/NpAD通路产生烷和烯烃;大肠埃希氏菌(E.coli)中樟脑FatB1硫酯酶基因的表达增加十四酸的库尺寸,大肠埃希氏菌(E.coli)细胞中十三烷的产生;大肠埃希氏菌(E.coli)中分支的脂肪酸的产生,及大肠埃希氏菌(E.coli)细胞中分支的十五烷的产生。
[0179] 可将适合的多核苷酸由同源重组导入细胞和/或可形成包含多核苷酸序列SEQ ID NO:11~25或其补体中的至少一种的表达载体的部分。该表达载体形成本发明的第3方面。用于构建该表达载体的适合的载体为本领域所熟知(例是以上提及的)和可排列以包含可操作地连接于1个或更多表达控制序列的多核苷酸,由此对于在宿主细胞,上述例如微-生物中表达需要的酶有用。
[0180] 在一些实施方式中,重组体或遗传修饰的宿主细胞,如贯穿此说明书提及的,可为选自下列的任何微-生物或微-生物的部分:真菌(诸如糖酵母属(Saccharomyces)的成员),原生生物,藻,细菌(包括蓝细菌)和古细菌。细菌可包含革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌和/或可选自:埃希氏菌属(Escherichia),芽孢杆菌属(Bacillus),乳杆菌属(Lactobacillus),红球菌属(Rhodococcus),假单胞菌属(Pseudomonas)或链霉菌属(Streptomyces)。蓝细菌可选自:细长聚球藻(Synechococcus elongatus),集胞藻属(Synechocystis),海洋原绿球藻(Prochlorococcus marinus),多变鱼腥藻(Anabaena variabilis),点形念珠藻(Nostoc punctiforme),青紫粘杆菌(Gloeobacter violaceus),蓝丝菌属(Cyanothece sp.)和聚球藻属(Synechococcus sp.)。适合的微-生物(或其他表达系统)的选择在本领域技术人员的常规能力之内。特别适合的微-生物包括例如大肠埃希氏菌(Escherichia coli)和啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0181] 在本发明的相关的实施方式中,脂肪酸还原酶和/或脂肪醛合成酶和/或脂肪酰基转移酶和/或醛脱羰基酶和/或酰基-ACP硫酯酶和/或3-酮脂肪酰-ACP合酶III和/或支链酮基脱氢酶复合物或这些之任何的功能变体或功能片段可在非-微-生物细胞中表达,所述非-微-生物细胞诸如培养的哺乳动物细胞或植物细胞或昆虫细胞。哺乳动物细胞可包括CHO细胞,COS细胞,VERO细胞,BHK细胞,HeLa细胞,Cvl细胞,MDCK细胞,293细胞,3T3细胞和/或PC12细胞。
[0182] 重组宿主细胞或微-生物可用于表达上述酶,然后由本文提及的标准方法获得无细胞的提取物。常规方法和技术解释详见,例如,Sambrook等人(参考号17,见下文)。
[0183] 本说明书中提到的氨基酸和核苷酸序列利于说明书结束部分的表7。术语"多核苷酸","多核苷酸序列"和"核酸序列"在本文互换使用。术语“多肽”,“多肽序列”和“氨基酸序列”也同样在本文互换使用。由本发明包括的其他序列提供于序列表
[0184] 酶研究委员会(EC)编号(也在本文被称为“类”),贯穿此说明书,在其可利用的资源“酶命名法”(1992,包括Supplements 6-17),例如,http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/,根据国际生物化学与分子生物学联合会(NC-IUBMB)的命名委员会称呼。这是基于由各酶类催化的化学反应的数值分类方案(参考文献19)。
[0185] 术语“脂肪酸还原酶复合物”表示能催化游离的脂肪酸,脂肪酰基-ACP或脂肪酰基-CoA转变为脂肪醛的酶复合物。一般而言,复合物包含脂肪酸还原酶和脂肪醛合成酶和脂肪酰基转移酶。术语“脂肪醛合成酶”表示EC类6.2.1.19,能催化酰基-蛋白硫酯自脂肪酸和蛋白形成的酶。术语“脂肪酸还原酶”表示EC类1.2.1.50酶,能催化长链醛自脂肪酰基-AMP(脂肪酰基-一磷酸腺苷)或脂肪酰基-CoA形成的酶。脂肪酰基-AMP是在此偶联的反应中由脂肪醛合成酶形成的中间体。脂肪酸还原酶的一例是具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的多肽;脂肪醛合成酶的一例是具有氨基酸序列SEQ ID NO:2的多肽。其他适合的脂肪酸还原酶多肽具有与SEQ ID NO:1具有至少50%同一性的氨基酸序列,例如,SEQ ID NO:28或29;其他适合的脂肪醛合成酶多肽具有与SEQ ID NO:2具有至少50%同一性的氨基酸序列,例如,SEQ ID NO:32或33。
[0186] 术语“脂肪酰基转移酶”表示EC类2.3.1.-,能催化脂肪酰基-ACP,酰基-CoA和其他活化的酰基供体的酰基部分转移到在转移酶上的丝氨酸的羟基的酶,之后酯通过水解转变为脂肪酸。脂肪酰基转移酶的一例是具有氨基酸序列SEQ ID NO:3的多肽。其他适合的脂肪酰基转移酶多肽具有与SEQ ID NO:3具有至少50%同一性的氨基酸序列,例如SEQ ID NO:30或31。
[0187] 术语“醛脱羰基酶”表示EC类4.1.99.5,能催化脂肪醛转变为烃,例如烷,烯烃或其混合物的酶。醛脱羰基酶的一例是具有氨基酸序列SEQ ID NO:4或与SEQ ID NO:4具有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽。
[0188] 脂肪酸是具有长的未分支的或分支的脂肪尾的羧酸。脂肪酸可包含饱和的脂肪酸和/或含有1,2,3个或更多双键的不饱和的脂肪酸。1种或更多脂肪酸,脂肪酰基-ACP或脂肪酰基-CoA可,例如,包含4个或更多碳原子,例如,8个或更多碳原子,10个或更多碳原子,12个或更多碳原子,或14个或更多碳原子。脂肪酸也可包含,例如,30个或更少碳原子,例如,26个或更少碳原子,25个或更少碳原子,23个或更少碳原子,或20个或更少碳原子。脂肪酸可,例如,源于三酰基甘油或磷脂,或可由细胞,和/或由在本文别处描述的机理新制造。
[0189] 在特定实施方式中,可使用本文所述的多肽的变体。如本文所用,“变体”是指序列之内的1个或更多氨基酸被其他氨基酸代替而不同于其所来源的碱基序列的氨基酸序列的多肽。例如,SEQ ID NO:1的变体可具有与SEQ ID NO:1具有至少约50%同一性的氨基酸序列,例如,至少约55%,60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%或约100%同一性的氨基酸序列。变体和/或片段是与具有本文所述的非-变体氨基酸序列的酶具有类似或相同功能酶活性特征的变体序列的功能变体/片段(且这是贯穿此说明书使用的术语“功能变体”的含义)。
[0190] 例如,SEQ ID NO:1的功能变体与SEQ ID NO:1具有类似或同一脂肪酸还原酶特征,由上述NC-IUBMB的酶命名法分类进酶EC类1.2.1.50。一例可为,由SEQ ID NO:1的功能变体,在非变体SEQ ID NO:2的存在下,将游离的脂肪酸转变为脂肪醛的转变率可与当使用具有氨基酸序列SEQ ID NO:1的酶,在非变体SEQ ID NO:2的存在下达到的相同的或近似,例如至少约60%,70%,80%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或至少约100%转变率。转变率可当使用变体多肽时改善,从而达到大于100%非变体转变率的转变率。可对本文提及的其他酶同样进行百分率序列同一性和比较性功能变体活性的相当的分析。
[0191] 例如,脂肪酰基转移酶SEQ ID NO:3的变体可具有与SEQ ID NO:3具有至少约50%同一性的氨基酸序列,是被分类进EC 2.3.1.-的功能变体;脂肪酰基-ACP,酰基-CoA和其他活化的酰基供体的酰基部分转移到转移酶上丝氨酸的羟基,之后酯通过水解转变为脂肪酸的率,可为相同的或近似,例如当使用SEQ ID NO:3时达到的至少约60%,70%,80%,90%或95%率。
[0192] SEQ ID NO:28和29可为SEQ ID NO:1的功能变体的例,如本文定义。SEQ ID NO:32和33可为SEQ ID NO:2的功能变体的例,如本文定义。SEQ ID NO:30和31可为SEQ ID NO:3的功能变体的例,如本文定义。
[0193] 本文提及的酶的NC-IUBMB分类总地列于下表6。
[0194] 表6
[0195]
[0196] 因此,本文以上提及的SEQ ID NO氨基酸序列或基因之任何的功能变体或片段是保持在与利于表1的非-变体序列相同的酶类别(即,具有相同的EC数)的任何氨基酸序列。本领域技术人员熟知确定是否酶落入特定类别之内的方法,本领域技术人员无需使用发明的技能即可确定酶类别。适合的方法可,例如,从国际生物化学与分子生物学联合会得到。
[0197] 氨基酸被具有广泛地类似性质的不同氨基酸取代时,该氨基酸取代可被认为是“保守性的”。氨基酸被不同类型的氨基酸取代是非-保守性取代。
[0198] “保守性取代”是指氨基酸被相同的类的另一氨基酸取代,其中类被定义如下:
[0199]类 氨基酸例
非极性的 A,V,L,I,P,M,F,W
不带电的极性的 G,S,T,C,Y,N,Q
酸性的 D,E
碱性的 K,R,H。
[0200] 如本领域技术人员所熟知,由保守性取代改变多肽的一级结构可不显著地改变该多肽的活性,因为被插入序列的氨基酸的侧链可能与已被取代出的氨基酸侧链形成类似键和接触。这在取代在确定多肽的构象中是关键的区中时甚至也是如此。
[0201] 只要这些不间断多肽的酶活性,非-保守性取代也是可能的,如在本文别处定义。酶的取代的版本必需保留使得它们保持与处于非-取代的酶相同的酶类的特征,如通过使用以上讨论的NC-IUBMB命名法确定。
[0202] 广泛地讲,只要不改变多肽的生物学活性,相比保守性取代更少的非-保守性取代也是可能的。任何取代(及,的确,任何氨基酸缺失或插入)效应的确定在本领域技术人员的整体常规能力之内,本领域技术人员可容易确定是否变体多肽保留本发明的酶活性。例如,当确定是否多肽的变体落入本发明的范围之内(即,是“以上定义的功能变体或片段”)时,本领域技术人员会确定是否变体或片段保留参照在本文别处提及的NC-IUBMB命名法定义的底物转变酶活性。全部该变体在本发明的范围之内。
[0203] 除了本文公开的那些之外,使用标准遗传密码,本领域技术人员可容易想出及生产编码多肽的其他核酸序列。核酸序列可为DNA或RNA,且其中其是DNA分子,其可例如包含cDNA或基因组DNA。核酸可含在表达载体之内,如在本文别处描述。
[0204] 根据本发明的另一方面,发酵产生烃包括使用适应于表达产生醛的酰基-ACP还原酶和脂肪醛脱羰基酶酶中的至少一种的重组微生物。产生醛的酰基-ACP还原酶和脂肪醛脱羰基酶酶的基因优选来自蓝细菌,诸如点形念珠藻(Nostoc punctiforme)。产生醛的酰基-ACP还原酶和脂肪醛脱羰基酶的非-限制例描述于Schirmer A,et al.,Microbial biosynthesis of alkanes.Science 329(5991):559-562(2010),其公开内容通过引用以其整体在本文合并。共表达产生醛的酰基-ACP还原酶和脂肪醛脱羰基酶酶可通常指称NpARAD或NpAR/NpAD。
[0205] 本发明的实施方式包括编码本文所述的多肽的变体核酸序列。关于核酸序列,术语“变体”是指任何自或向多核苷酸序列1个或更多核苷酸的取代,变异,修饰,取代,缺失或添加,提供得到的由多核苷酸编码的多肽序列,呈现至少与由碱基序列编码的多肽相同或近似的酶促性质。术语包括等位基因变体和也包括与在本文描述的多核苷酸序列基本上杂交的多核苷酸(“探针序列”)。该杂交可在低和高严格度条件或在低和高严格度条件之间发生。总而言之,低严格度条件可定义为洗涤步骤在比探针序列的计算的或实际熔解温度(Tm)(例如,约环境实验室温度至约55℃)低约40~48℃的温度,在0.330~0.825M NaCl缓冲溶液中发生的杂交,而高严格度条件涉及在比探针序列的计算的或实际Tm(例如,约65℃)低约5~10℃的温度,在0.0165~0.0330M NaCl缓冲溶液中洗涤。缓冲溶液可为,例如,SSC缓冲剂(0.15M NaCl和0.015M柠檬酸三钠),低严格度洗涤在3×SSC缓冲剂中发生,和高严格度洗涤在0.1×SSC缓冲剂中发生。核酸序列的杂交中涉及的步骤已描述于例如Sambrook等人。
[0206] 一般而言,核酸序列变体与本发明的核酸序列具有约55%或更多共同的核苷酸,更一般具有60%,65%,70%,80%,85%或甚至90%,95%,98%或99%或更大序列同一性。
[0207] 本发明的变体核酸可为就在特定宿主细胞中表达密码子-优化的。
[0208] 氨基酸序列之间的序列同一性可通过比较使用自美国生物技术信息中心(NCBI),Bethesda,Maryland,USA,例如经http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi可利用的Needleman-Wunsch全局序列比对工具,使用默认参数设置(对于蛋白比对,空位值存在:11,延伸:1)的序列比对来确定。此说明书中提及的序列比较和百分率同一性已通过使用此软件确定。当比较与,例如,SEQ ID NO:1的序列同一性水平,这一般应相对于SEQ ID NO:1的全长进行(即,使用全局比对方法),以避免导致高总体同一性评定的高同一性重叠的短区。例如,具有,例如,5个氨基酸的短多肽片段可与在SEQ ID NO:1的全体之内的
5个氨基酸区具有100%同一序列,但此不提供100%氨基酸同一性,除非该片段形成在相当于SEQ ID NO:1中的位置的其他位置也具有同一氨基酸的更长序列的部分。当比较的序列中的相当的位置被相同的氨基酸占据,则分子在该位置同一。将比对作为同一性百分率评分是在由比较的序列共享的位置同一氨基酸数的函数。当比较序列时,最佳比对可需要将间隔导入一个或更多序列,以考虑序列中可能的插入和缺失。序列比较方法可采用空位罚分,从而,被比较序列中相同数的同一分子,序列比对具有尽可能的少的间隔,反映2个比较的序列之间更高亲缘关系,会达到相比具有许多间隔的更高的分值。最大百分率同一性的计算涉及最佳比对的产生,考虑空位罚分。如上所述,百分率序列同一性可通过使用Needleman-Wunsch全局序列比对工具,使用默认参数设置确定。Needleman-Wunsch算法公开于J.Mol.Biol.(1970)vol.48:443-53。
[0209] 在本文描述的方法,载体和宿主细胞中使用的多肽和多核苷酸序列显示于序列表。
[0210] 表7:本申请中包括的序列的鉴定
[0211]
[0212] 为了辅助对本发明的实施方式的更佳理解,给出一些实施方式的特定方面的下列实施例。下列实施例绝不应被认为限制或限定本发明的整个范围。【实施例】
[0213] 下列实施例全部使用如以下描述获得的固体组分。
[0214] 【生物质制备】
[0215] 在此例中,将各种新鲜切断的高粱样品与表8中列出的各种添加的组分混合及储存于青贮饲料袋中约20天。特定添加剂和相应添加率显示于表9。
[0216] 表8
[0217]2011实验 含酸
实验# 1
估计的质量 450kg
水份含量 76%
储存方法 青贮饲料袋
酵母 Lallemand液体酵母
细菌抑制物 Lactrol
纤维素至葡萄糖 Novozymes Cellic CTec2
切割尺寸 3mm
结果(加仑乙醇/初始干度量tonne) 50
储存天数 ~20
[0218] 表9
[0219]添加剂 添加率
LACTROL 3.2g/湿吨
Lallemand稳定化的液体酵母 18fl盎司/湿吨
Novozymes Cellic CTec2 20fl盎司/湿吨
9.3%浓硫酸 3.8L/湿吨
[0220] 【VOC回收】
[0221] 通过使用GEA SSDTM作为无溶剂回收单元回收自此实施例的制备的生物质材料的VOC。下表10提供下列特定性质:(i)供给进无溶剂回收单元的制备的生物质材料,(ii)从无溶剂回收单元出来的固体组分,及(iii)无溶剂回收单元的操作条件。
[0222] 表10
[0223]样品
供给组合物
供给中的液体(%) 80.2%
固体组分
固体组分(产物)中的液体(%) 31.4%
固体组分(产物)温度(F) 90
操作条件
加热器温度(F) 516
供给速度(lb/min.) 5.30
蒸发速度(lb/min) 3.93
饱和度温度(F) 287
固体组分生产率(lb/min.) 1.03
在入口的蒸气温度(F) 428
排气温度(F) 370
操作压力(psig) 40
[0224] 【进一步处理:糖化】
[0225] 向4l瓶添加2160.02g的去离子水和混合540.12g的40wt%HESA而形成8.5wt%HESA溶液。向1加仑装备DiComp IR探针的Parr Instruments C276高压釜放置433.82g的实施例C的固体组分。固体组分估计具有289.67g的骨干燥的生物质(BDBM)。酸溶液轻轻倾倒在反应器中的湿生物质上。反应器含有包含与7.3wt%HESA溶液接触的大致9.53wt%干生物质的混合物(基于总反应器内容物)。
[0226] 将反应混合物加热到120℃及保持所述的时间。起初以100rpm搅拌反应器内容物,但随反应热至120℃,内容物变稀,及搅拌速度是增加到250,然后400rpm。将反应器于120℃保持1小时。中止加热。将反应器用慢氮流净化几分钟,以消除气顶中的任何二氧化硫。反应器冷却到室温及再用氮净化一次。
[0227] 将反应器内容物转移到Buchner漏斗,和在Whatman 541硬化的无灰185mm过滤纸上真空过滤。从反应器内容物除去尽可能多的液体。获得移出的滤出液和液体的累积重量。然后将滤出液由HPLC分析和通过与存在于生物质中的前体的量比较计算自生物质的物质的回收。基于生物质中可利用的葡萄糖的理论量,回收的葡萄糖的%是11.3%。基于生物质中可利用的木糖的理论量,回收的木糖的%是91%。
[0228] 还使处理的样品经历酶促水解。将来自HESA处理的144g的物质用500mL去离子水洗涤3次。在第1次洗涤之后,将物质的pH调至10。然后排出液体,及添加水,及将pH调至5.6。在1L的水中添加约144g的洗涤的物质,50g的CTEC2纤维素酶。将溶液于53℃振摇3天,在该时间含量被测量为:纤维二糖:1.93g/L,葡萄糖:52.6g/L,木糖:6.12g/L,阿拉伯糖:0g/L,甘油:1.4g/L,乙酸:0.92g/L,乙醇:0.0g/L。
[0229] 【发酵】
[0230] 然后发酵水解混合物(或水解产物),其中将水解产物加入生长各种大肠埃希氏菌(E.coli)培养物的培养基中,以取代葡萄糖含量。将大肠埃希氏菌(E.coli)培养物适应于共表达脂肪酸还原酶,脂肪醛合成酶,脂肪酰基转移酶,及醛脱羰基酶酶(CEDDEC)或NpARAD。作为参照,无这些外源基因(BL21)的大肠埃希氏菌(E.coli)宿主细胞也生长。
[0231] 使携带pACYCDuet NpAR/AD,pACYCDuet CEDDEC的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21*(DE3)细胞或无载体对照在含34μg/mL氯霉素作为可选择的标志物的LB培养基中,于37℃,自甘油浓储物,伴随恒定振摇(225rpm)生长过夜。自大肠埃希氏菌(E.coli)BL21*(DE3)对照细胞略去氯霉素。用200μL的过夜起始培养物接种20mL的含有指示的抗生素,及如下制备的以下培养基:修饰的最小培养基,不含酵母提取物*及含3%葡萄糖碳源,用滤器灭菌的水解混合物取代至1%的最终,总碳(纤维二糖+葡萄糖+木糖+甘油+乙酸)浓度。此可指标准LB培养基。此外,将携带pACYCDuet CEDDEC的大肠埃希氏菌(E.coli)BL21*(DE3)细胞接种于含酵母提取物(MYE)及含3%葡萄糖碳源的修饰的最小培养基作为阳性对照。使各处理的3个重复生长。此可指LB-MYE培养基。
[0232] 【FAR/NpAD(CEDDEC)质粒的构建】
[0233] 列于下表2的氨基酸序列经逆翻译及为在大肠埃希氏菌(E.coli)中表达而密码子-优化,提供也显示于表2的核酸序列:
[0234] 表11
[0235]GenBank **登录号No. 序列名称 SEQ ID NO 密码子-优化的核酸SEQ ID NO
AAD05355.1 脂肪酸还原酶 1 11
AAD05359.1 LuxE E 2 12
P19197.1 LUXD1_PHOLU 3 13
[0236] **序列可自GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)检索。GenBank是NIH遗传序列数据库。Genbank位于美国生物技术信息中心,美国国家医学图书馆,8600 Rockville Pike,Bethesda MD,20894 USA。
[0237] 在插入pACYCDuet-1(商业上可获自Merck,具有序列SEQ ID NO:16的最终构建体)的3-基因操纵子(SEQ ID NO: 15)中合成为大肠埃希氏菌(E.coli)密码子-优化的luxC,luxE和luxD基因,随后用限制酶NcoI和NotI(商业上可获得)消化,并连接到pCDFDuet-1MCS1(商业上可获自Merck)。
[0238] 从点形念珠藻(N.punctiforme),使用FAST-DNA SPIN试剂盒(商业上可获自MP Biomedicals)提取基因组DNA。将培养物,以4500rpm,于4℃离心2min,使120mg的沉淀重悬浮于1ml的缓冲剂细胞裂解/DNA增溶溶液(CLS-Y)。将样品用MP Biomedicals FastPrep-24(FASTPREP是商标)仪器,使用裂解基质A(也MPBiomedicals),以6.0m/s的速度设置均质化40s。根据生产商的使用说明实施全部随后步骤。在此过程后,将基因组DNA用苯酚-氯仿提取(使用三(羟甲基)氨基甲烷、pH7.5缓冲的50%苯酚、48%氯仿、2%异戊醇溶液)进一步纯化,随后用乙醇和乙酸钠进行DNA沉淀。最后的DNA样品调整(使用水)到8纳克/微升(ng/μl)的浓度。将编码NpAD(醛脱羰酶)的基因,采用8ng的蓝细菌基因组DNA作为模板,用PHUSION高保真DNA聚合酶(PHUSION是商标,可商购自New England Biolabs)扩增。
[0239] 使用的引物是CATATGCAGCAGCTTACAGACCAAT(SEQ ID NO:26)和CTCGAGTTAAGCACCTATGAGTCCGTAGG(SEQ ID NO:27),允许使用NdeI和XhoI位点(加下划线的)直接克隆进MCS2(MCS是多克隆位点的缩写)。
[0240] 将质粒使用生产流程(如上为在大肠埃希氏菌(E.coli)中重组酶的表达所述)转化进TOP10感受态大肠埃希氏菌(E.coli)细胞(商业上可获自Invitrogen),通过使用Qiagen miniprep试剂盒(纯化的质粒)纯化,及由聚合酶链反应(PCR)或限制消化研究插入。由纯化的质粒的DNA测序(商业上可获自Geneservice,U.K.)确认编码NpAD的核酸序列SEQ ID NO:13存在于pACYCDuet-1 luxCED和pCDFDuet-1 luxCED中。
[0241] 用类似技术构建NpARAD表达质粒。使含有FAR/NpAD(CEDDEC)表达质粒,NpARAD表达质粒,或无表达质粒(BL21)的大肠埃希氏菌(E.coli)培养物接种及生长于标准LB培养基至少6小时。此外,使含有FAR/NpAD(CEDDEC)的大肠埃希氏菌(E.coli)培养物也生长于LB-MYE培养基至少6小时。下表12显示在细菌培养物的生长期间,在各时间点,在OD600nm处的光学读数。
[0242] 表12
[0243]接种后hr CEDDEC NpARAD BL21 CEDDEC(MYE)
2 0.24 0.24 0.33 0.03
3.5 0.95 0.93 1.13 0.31
6 0.73
[0244] 图5显示这些不同大肠埃希氏菌(E.coli)培养物的生长曲线:CEDDEC,NpARAD,BL21和CEDDEC(MYE),其是在LB-MYE培养基中生长的含有CEDDEC表达质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)。如所示,含有FAR/NpAD(CEDDEC)和NpARAD表达质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)培养物的生长相当地稳健,与无任何表达质粒的标准培养物基本上相同。此显示,在水解混合物中的葡萄糖可被微生物利用,且水解混合物对于微生物不是毒性的。
[0245] 尽管未为烃提取和检测收获培养物,基于由含有FAR/NpAD(CEDDEC)和NpARAD表达质粒的大肠埃希氏菌(E.coli)培养物产生烃的PCT/EP2013/053600所证实,特别是鉴于该稳健的生长,预期此实施例的培养物会提供类似结果。烃可由以下方法提取及检测。
[0246] 可将8ml的细菌培养物与8ml的乙酸乙酯混合,及于室温(约20℃)和480rpm温育2小时,以辅助烃提取。在提取之后,样品可于室温(约20℃),700x重力离心5分钟而导致相分离,及可将6ml的顶相转移到新鲜管形瓶。可在氮流下干燥乙酸乙酯,和随后可将残留物溶于225ml二氯甲烷(DCM)。可通过使用装备ZB1-MS柱的追踪气相色谱-质谱仪(GC/MS)2000(Thermo Finnigan)(商业上可获自Zebron)实施烃和挥发性化合物的分离和鉴定。
[0247] 本领域技术人员考虑本说明书后会明晰本发明的各种方面的进一步修饰和替代性的实施方式。因此,本说明书应解释为仅是例证性的及旨在教导本领域技术人员实施本发明的一般方式。需知,在本文中显示的及描述的本发明的形式应被认为是目前优选的实施方式。要素和材料可用在本文例证的及描述的那些代替,部分和过程可逆转,及本发明的特定特征可独立地利用,全部对于看到本发明的此描述的本领域技术人员会是显而易见的。可在本文所述的要素中进行改变而不脱离本发明的精神和范围,如描述于以下权利要求
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