荧光PCR鉴别羊乳中羊牛成分的组合物、试剂盒和方法 |
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| 申请号 | CN201710531875.8 | 申请日 | 2017-07-03 | 公开(公告)号 | CN107475365A | 公开(公告)日 | 2017-12-15 |
| 申请人 | 中国检验检疫科学研究院; 海普诺凯营养品有限公司; | 发明人 | 吴亚君; 杨艳歌; 侯艳梅; 黄文胜; 刘鸣畅; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及羊乳中羊（ 绵羊 和山羊）、山羊及常见掺伪 牛 （黄牛、牦牛、 水 牛）成分的实时 荧光 PCR方法。本发明还涉及用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物。本发明还涉及包含所述组合物的实时荧光PCR 试剂 盒 。使用本发明的组合物进行实时荧光PCR检测，能够通过简单、快速、特异且灵敏地检测液态羊乳、羊乳粉等羊乳制品中 哺乳动物 羊（绵羊和山羊）、山羊及常见掺伪牛（黄牛、牦牛、水牛）源性成分。 | ||||||
| 权利要求 | 1.通过实时荧光PCR法检测作为哺乳动物内参照的组合物包含哺乳动物内参照寡核苷酸引物对SEQ ID No.1 SEQ ID No.2以及探针SEQ ID No.3 序列。 |
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| 说明书全文 | 荧光PCR鉴别羊乳中羊牛成分的组合物、试剂盒和方法技术领域[0001] 本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于定性检测羊（绵羊和山羊）、山羊、牛（黄牛、牦牛、水牛）成分Taqman实时荧光PCR方法，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒。 背景技术[0002] 羊乳制品的营养价值高，现代营养学的相关研究表明，羊乳含有200多种营养物质和生物活性因子，其蛋白质、矿物质和维生素的总含量均高于牛乳。羊乳中蛋白质凝块细而软，脂肪颗粒较小，易消化吸收，人体对羊乳的吸收率高达94%以上，特别适合婴幼儿、老年人和身体虚弱者饮用。尤其因羊乳中干物质含量比牛乳高约10%，比母乳高约5%，从营养成分组成及基础结构、各营养元素配比到营养特性都与母乳最为接近，因此在婴幼儿食品中优势明显。同时羊乳中不含过敏性蛋白，不易导致过敏等诸多优点，被营养学家推荐为牛乳过敏人群的最佳替代乳品。因此，近年来，羊乳相关产品的流行已渐成趋势，市场上产品种类越来越多，由单一的鲜羊奶发展到羊奶粉制品、液态羊奶制品、果味羊奶、羊奶酪、羊奶片及化妆品羊奶脂等。羊乳的生产加工与销售在国际市场上也日渐风靡，羊乳制品在欧美和澳大利亚等国家已成为人们生活中必不可少的食品，其市场占有率高达80%。 [0003] 然而，乳羊是典型的短日照季节性繁殖动物，3 10月为其产奶期， 且一头乳羊的~日产乳量远低于牛乳，仅为5公斤左右，产量有限，因此羊乳价格远高于牛乳。在经济利益的驱动下，一些不法商贩和企业在羊乳中掺入牛乳以降低成本，牟取暴利。由于牛羊乳成分接近，性质相似，在羊乳中掺入一定量的牛乳很难从感官及常规指标上检测出来。这不仅仅涉及经济、营养价值和食品安全等问题，更直接影响着消费者的健康，同时也扰乱了市场的秩序，制约了羊奶产业的的正常发展。为了保障羊乳及其产品品质， 确保生产厂家及消费者的利益，建立简便、快速、准确的检测羊乳中乳源的技术体系越来越重要。实时荧光PCR技术从基因水平分析物种来源，灵敏度更高、特异性更强，其结果为证明乳品的真伪提供了真实、可靠的依据，该技术方便、准确、迅速，已成为近年来国内外学者研究的热点。 发明内容[0004] 本发明的目的在于，简单、快速、特异且灵敏地检测羊乳制品中的羊、山羊和易掺伪的牛成分，能有效防止羊乳产品中掺杂掺假牛乳，甚至牛源性杂蛋白的造假方式。 [0005] 本发明的发明人根据哺乳生长激素基因GH (growth hormone gene)，设计了能够通用于哺乳动物内参照的实时荧光PCR检测方法；同时分别以GH基因为目标，设计了能特异性检测羊（含绵羊、山羊）、山羊、牛（含黄牛、牦牛、水牛）成分的引物和探针，其中哺乳动物内参照靶序列为66 bp左右，羊靶序列为79 bp，山羊靶序列119 bp，牛靶序列为81 bp，保证能从不同加工程度的乳制品中检测目标动物成分。 [0006] 在本发明的一个方面，提供了通用于哺乳动物成分内参照的寡核苷酸引物上游MGH-F: 5’- CTCAGCAGGGTCTTCACCAACA -3’（SEQ ID No.1），和下游MGH-R: 5’- TGCCTTCCTCTAGGTCCTTCAGC -3’（SEQ ID No.2）。探针为MGH-P: 5’- TGGTGTTTGGCACCTCGGACCGT -3’（SEQ ID No.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。该引物可特异性识别哺乳动物成分的MGH序列，扩增片段长度82 bp。特异性扩增反应条件为：50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环。 [0007] 在本发明的一个方面，还提供了特异性检测羊（山羊、绵羊）成分的特异性寡核苷酸引物上游SGH-F：5’- TGCCAGCCATCTGTTGTTACC -3’（SEQ ID No.4），和下游SGH-R：5’- AAAGGACAGTGGGCACTGGAG -3’（SEQ ID No.5）。探针为SGH-P：5’- CCCGTGCCTTCCTAGACCCTGGAAG -3’（SEQ ID No.6），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。该引物可特异性识别羊（山羊、绵羊）的GH序列，扩增片段长度79 bp。特异性扩增反应条件为：50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环。 [0008] 在本发明的一个方面，还提供了特异性检测山羊成分的特异性寡核苷酸引物上游GGH-F：5’- GGAGGGAACTAAGGACCTCAGTG -3’（SEQ ID No.7），和下游GGH-R：5’- GGTGTGTGGTTCCCCTCACTG -3’（SEQ ID No.8）。探针为GGH-P：5’- CCTTATTCGGAACCCTCCCCACCCCA -3’（SEQ ID No.9），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。该引物可特异性识别山羊的GH序列，扩增片段长度119 bp。特异性扩增反应条件为：50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环。 [0009] 在本发明的一个方面，还提供了特异性检测牛（黄牛、水牛、牦牛）成分的特异性寡核苷酸引物上游BGH-F：5’- GTTGCCAGCCATCTGTTGTTTG -3’（SEQ ID No.10），和下游BGH-R：5’- ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG -3’（SEQ ID No.11）。探针为BGH-P：5’- TCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGG -3’（SEQ ID No.12），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。该引物可特异性识别山羊的GH序列，扩增片段长度81 bp。特异性扩增反应条件为：50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环。 [0010] 在本发明的另一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。，所述组合物包含选自以下（1）至（4）中的任意一组或多组引物和探针序列：（1）哺乳动物内参照基因寡核苷酸引物对SEQ ID No.1 SEQ ID No.2以及探针SEQ ID ~ No.3 序列； （2）羊特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.4 和SEQ ID No.5 以及探针SEQ ID No.6 序列； （3）山羊特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.7 和SEQ ID No.8 以及探针SEQ ID No.9 序列； （4）牛特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.10 和SEQ ID No.11 以及探针SEQ ID No.12 序列。 [0011] 在一个实施方式中，哺乳动物内参、羊、山羊实时荧光PCR扩增条件是50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，45个循环。牛实时荧光PCR扩增条件是50℃ 2 min；95℃预变性 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40个循环，为优选地，本发明所使用的实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。 [0012] 在本发明中，羊含山羊和绵羊两个属，牛含黄牛、牦牛、水牛三个种。 [0013] 在本发明的另一个方面，提供了用于哺乳动物成分检测试剂盒，羊成分实时荧光PCR特异性检测试剂盒，山羊成分实时荧光PCR特异性检测试剂盒，牛成分实时荧光PCR特异性检测试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。 [0015] 在一个实施方案中，本发明的哺乳动物通用内参照引物分别根据哺乳动物GH基因保守序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含哺乳通用内参照扩增山羊、绵羊、牛靶序列均为: CTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCCTGGTGTTTGGCACCTCGGACCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCA (SEQ No.13)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于是实时荧光PCR检测哺乳动物内参照通用引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测哺乳动物成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。 [0016] 在另一个实施方案中，本发明的羊特异性引物分别根据羊（山羊和绵羊）GH序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含羊特异性扩增靶序列为: TGCCAGCCATCTGTTGTTACCCCTCCCCGTGCCTTCCTAGACCCTGGAAGGTGCCACTCCAGTGCCCACTGTCCTTTCC (SEQ No.14)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于是实时荧光PCR检测羊特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测羊成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。 [0017] 在另一个实施方案中，本发明的山羊特异性引物分别根据山羊GH序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含山羊特异性扩增靶序列为: CAATGGGAGGGAACTGAGGACCTCAGTGGTATTTTATCCAAGTAAGGATGTGGTCAGGGGAGTAGAAATGGGGGTGTGTGGGGTGGGGAGGGTTCCGAATAAGGCAGTGAGGGGAACCACACACCAGCTTAGACCCGGG (SEQ No.15)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于是实时荧光PCR检测山羊特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测山羊成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。 [0018] 在另一个实施方案中，本发明的牛特异性引物分别根据牛GH序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含牛特异性扩增靶序列为: GTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAAT (SEQ No.16)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于是实时荧光PCR检测山羊特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测山羊成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。 [0019] 在一个实施方案中，所述实时荧光PCR检测方法中哺乳动物（以牛为例）成分的绝对灵敏度最低为10 pg/μL，羊（以山羊为例）成分的绝对灵敏度最低为10 pg/μL，山羊成分的绝对灵敏度最低为1 pg/μL，牛成分的绝对灵敏度最低为10 pg/μL。 [0021] 再在一方面，本发明提供了所述组合物或所述试剂盒在鉴别羊乳及其制品中羊、山羊、牛成分的应用。 [0022] 实时荧光定量PCR即在常规PCR方法的基础上，加入荧光标记的探针或者荧光染料，随着PCR产物的积累，探针或染料发出的荧光信号增强，而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每产生一条DNA链，就有一个荧光分子形成，整个PCR反应过程随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct (cycle threshold, Ct )值。Ct值，即PCR扩增过程中扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数，它与模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，模板DNA量越多，荧光达阈值的循环数越少，即Ct值越小，从而实现对起始模板定量及定性的分析，从而可检测待测成分。 [0023] 本发明的通过引物或探针与模板的特异性杂交来鉴别模板的实时荧光PCR 检测方法特异性高，假阳性低；可采用完全闭管检测，无需PCR后处理，避免了交叉污染和假阳性，缩短了反应时间。检测PCR扩增后的荧光，放大了反应信号，灵敏度大大提高。本发明的方法巧妙地运用了PCR 技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。使用本发明的实时荧光PCR检测方法，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上羊乳及乳制品中羊、山羊、牛成分的定性检测。附图说明 [0024]图1是利用实时荧光PCR检测哺乳动物内参照引物探针通用性时，哺乳动物出现的典型 的扩增曲线。1-16分别为：猪、马、驴、骆驼、马鹿、山羊、绵羊、黄牛、水牛、牦牛、狗、兔、狐狸、水貂、狍、大鼠，17-22为阴性对照和空白对照，顺序为：鸡、鸭、鹌鹑、火鸡、鱼、无菌水，每个样品2个平行。 [0025] 图2是羊引物探针特异性实时荧光PCR检测结果。图中1为山羊，2为绵羊，3-22依次为猪、马、驴、骆驼、马鹿、黄牛、水牛、牦牛、狗、兔、狐狸、水貂、狍、大鼠、鸡、鸭、鹌鹑、火鸡、鱼、无菌水，每个样品2个平行。 [0026] 图3是山羊引物探针特异性实时荧光PCR检测结果。图中1为山羊，2-22依次为绵羊、猪、马、驴、骆驼、马鹿、黄牛、水牛、牦牛、狗、兔、狐狸、水貂、狍、大鼠、鸡、鸭、鹌鹑、火鸡、鱼、无菌水，每个样品2个平行。 [0027] 图4是牛引物探针特异性实时荧光PCR检测结果。图中1为黄牛，2为牦牛，3为水牛，4-22依次为猪、马、驴、骆驼、马鹿、山羊、绵羊、狗、兔、狐狸、水貂、狍、大鼠、鸡、鸭、鹌鹑、火鸡、鱼、无菌，每个样品2个平行。 [0028] 图5是哺乳动物内参照引物探针实时荧光PCR绝对灵敏度检测结果（以牛DNA为模板）。1-5分别表示DNA浓度为100 ng/μL，10 ng/μL，1 ng/μL，0.1 ng/μL，0.01ng/μL，每个稀释度3个平行。 [0029] 图6是羊引物探针实时荧光PCR绝对灵敏度检测结果，其中图6A是以山羊DNA为模板得到的扩增曲线，图6B是以绵羊DNA为模板得到的扩增曲线。1-6分别表示DNA浓度为100 ng/μL，10 ng/μL，1 ng/μL，0.1 ng/μL，0.01ng/μL，0.001ng/μL，每个稀释度3个平行。 [0030] 图7是山羊引物探针实时荧光PCR绝对灵敏度检测结果。1-5分别表示DNA浓度为100 ng/μL，10 ng/μL，1 ng/μL，0.1 ng/μL，0.01ng/μL，每个稀释度3个平行。 [0031] 图8是牛引物探针实时荧光PCR绝对灵敏度检测结果。1-5分别表示DNA浓度为100 ng/μL，10 ng/μL，1 ng/μL，0.1 ng/μL，0.01ng/μL，每个稀释度3个平行。 [0032] 图9是使用牛引物探针对羊乳粉中掺杂牛乳粉牛成分检测的相对灵敏度。1-5分别表示体积比为0.1%，1％，10％，50％，100％比例混合的牛脱脂乳粉/山羊脱脂乳粉混合样品。 [0033] 图10是使用牛引物探针对羊乳粉中添加牛乳糖成分检测的相对灵敏度。1-5分别表示体积比为0.1%，1％，10％，50％，100％比例混合的牛乳糖/山羊全脂乳粉混合样品。 [0034] 图11是使用牛引物探针对羊乳粉中添加牛乳清成分检测的相对灵敏度。1-5分别表示体积比为0.1%，1％，10％，50％，100％比例混合的牛乳清/山羊乳清粉混合样品。 具体实施方式[0036] 实施例1虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不 偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。 |
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