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一种生物酶催化制备氟硝基苯酸的方法
申请号	CN201710926765.1	申请日	2017-10-08	公开(公告)号	CN107475315A	公开(公告)日	2017-12-15
申请人	青岛科技大学;			发明人	李泽雯; 张雪健; 韩玉峰;
摘要	一种用豆荚过氧化物酶催化制备2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸的方法，所用豆荚过氧化物酶来源广，生产成本低，反应条件温和，环境友好，底物转化率高，目标产物选择性好，产率高。
权利要求	1.一种生物酶催化制备氟硝基苯酸的方法，其特征在于用豆荚过氧化物酶催化制备2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸，底物为2-氟-4,6-二羟基苯酸，生产的目标产物为2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸，反应介质为水-异戊醇，其中水相为pH6.9的磷酸盐缓冲液，水相：异戊醇=85:15，将底物溶入异戊醇，然后加入反应器，反应温度49.5-51.5℃，反应时间为8.9- 9.8h，豆荚过氧化物酶浓度为4-5mU/ml，底物浓度为30mM，NaNO2浓度为350mM，H2O2采用流加的加料方式，反应开始时，加入H2O2，使其浓度为8.5mM，启动酶催化反应；然后开始流加，用蠕动泵加入H2O2，使浓度维持在7.5-9.5mM；反应结束后，得到目标产物，用环己烷萃取3次，合并有机相，减压蒸出有机溶剂，得到产物；底物转化率为92.6-93.5%，目标产物产率为 72.4-72.6%。 2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述豆荚过氧化物酶的提取方法为：新鲜大豆荚用粉碎机粉碎后，粒度小于1mm，加5倍大豆荚质量的去离子水室温下浸泡4小时，过滤浸泡液，得到初提液，初提液体积V；搅拌中对初提液加入固体硫酸铵，使成45%饱和度，此时体积为V1；继续搅拌中再加入0.3V的预冷丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液1，对上清液1加入固体硫酸铵，按V1体积计算加到75%饱和度，经5000rpm，10分钟离心；此时，在水相与丙酮相界面处将形成一层沉淀，即沉淀1，取沉淀1，加入沉淀1体积5倍的去离子水溶解沉淀1，超滤脱盐后，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液2，上清液2体积V2，取上清液2，用丙酮分级沉淀：对上清液2先加1.0V2体积预冷丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液3，对上清液3再加0.8V2体积丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到沉淀2；减压抽干沉淀2中的丙酮，加10倍沉淀2体积的去离子水溶解沉淀2，调pH到8.0，加1mol/L硫酸锌，使硫酸锌成0.01mol/L终浓度，经5000rpm，10分钟离心，得上清液4；将上清液4调pH至7，用超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，得到豆荚过氧化物酶粉，酶活为30-40U/mg；用干豆荚也可提取豆荚过氧化物酶，方法如下：干大豆荚，加12倍干大豆荚质量的去离子水浸泡1小时，用粉碎机粉碎后，4℃浸泡过夜，将浸泡液过滤后，得到初提液，初提液体积V；其余步骤同鲜豆荚。
说明书全文	一种生物酶催化制备氟硝基苯酸的方法技术领域 [0001] 本发明属于化工技术领域，特别涉及到使用豆荚过氧化物酶催化制备精细化工中间体2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸的技术。背景技术 [0002] 2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸是一种重要的精细化工中间体，用传统的化学工艺生产该产品，将产生大量的废酸和含有有机物的酸性废水而导致环境污染严重，而且所得产物几乎没有选择性而产生原材料的浪费。现有工艺无法避免强酸所造成设备的腐烛及反应过程中发生多氧化等副产物对反应带来的安全隐患等问题。该类化合物产品生产的资源消耗要远远高于大吨位基础化工产品，各类环境污染安全生产事故更是频繁发生这一现状严重制约了整个产业的可持续发展。做到绿色环保、清洁生产对于企业来说不再是锦上添花，而是关乎生死的一件大事。 [0003] 因此该类产品生产工艺的研究，特别是开发新的生产路线的研究，一直相当活跃，主要围绕着提高产物的选择性和改善反应的环境，减少反应所引起的环境污染。 [0004] 生物酶催化反应具有环境友好、选择性好的特点，目前尚未见用生物酶催化合成该产品的报道。如果能将生物酶用于催化生产该产品，则可能大幅度提高产物的选择性，消除传统反应所引起的环境污染，实现绿色生产该产品。 [0005] 过氧化物酶是氧化还原酶类一种，是一个大家族，包括辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过化氧物酶、微生物过氧化物酶(如氯过氧化物酶)、大豆过氧化物酶等等，被用于催化许多化学反应，可催化H2O2与多种有机、无机氢供体发生氧化还原反应，例如脱甲基反应、环氧化反应、聚合反应、偶联反应等。 [0006] 大豆过氧化物酶，一般是指豆壳过氧化物酶，即由大豆种皮提取的过氧化物酶。实际上，大豆豆荚也含有过氧化物酶，从大豆荚提取的过氧化物酶称之为大豆荚过氧化物酶，或简称为豆荚过氧化物酶。由于豆荚的量多于豆皮，所以，豆荚过氧化物酶的量更大。我们的实验表明，豆壳过氧化物酶与豆荚过氧化物酶在催化反应中，也存在较大的差别。发明内容 [0007] 在H2O,，NaNO2存在下，采用豆荚过氧化物酶催化底物（1），即2-氟-4,6-二羟基苯酸,反应生成（2），即2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸，具体反应式如下：考虑到多种过氧化物酶都可能催化底物，得到我们的目标产物，所以，我们用多种过氧化物酶进行了催化反应实验，以选择最佳的过氧化物酶，所用的酶包括辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、氯过氧化物酶(来自海洋真菌 Caldariomyces fumago)、大豆壳过氧化物酶、豆荚过氧化物酶等。其中辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、氯过氧化物酶(来自海洋真菌 Caldariomyces fumago)、大豆壳过氧化物均可由市场购得，而豆荚过氧化物酶市场没有商品出售，由我们自己从大豆荚提取。 [0008] 从大豆荚提取豆荚过氧化物酶的分离纯化工艺如下。 [0009] 经过大量实验研究，得到优化的豆荚过氧化物酶分离纯化新工艺。新鲜大豆荚10kg用粉碎机粉碎后，粒度小于1mm，加50L去离子水室温下浸泡4小时，浸泡液过滤后，得到初提液，初提液体积V；搅拌中对初提液加入固体硫酸铵，使成45%饱和度，此时体积为V1；继续搅拌中再加入0.3V的预冷丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液1，对上清液1加固体硫酸铵，按V1体积计算到75%饱和度，经5000rpm，10分钟离心；此时，在水相与丙酮相界面处将形成一层沉淀，即沉淀1，取沉淀1，加入沉淀1体积5倍的去离子水溶解沉淀1，超滤脱盐后，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液2，上清液2体积V2，取上清液2，用丙酮分级沉淀：对上清液2先加1.0V2体积丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液3，对上清液3再加0.8V2体积丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到沉淀2。减压抽干沉淀2中的丙酮，加10倍沉淀2体积的去离子水溶解沉淀2，调pH到8.0，加1mol/L硫酸锌，使硫酸锌成0.01mol/L终浓度，经 5000rpm，10分钟离心，离心后得上清液4；将上清液4调pH至7，用超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，得到豆荚过氧化物酶粉，酶活为30-40U/mg。 [0010] 用干豆荚也可提取豆荚过氧化物酶，方法如下。干大豆荚10Kg，加120L去离子水浸泡1小时，用粉碎机粉碎后，4℃浸泡过夜，浸泡液过滤后，得到初提液体积V。其余步骤同鲜豆荚，不再赘述。 [0011] 使用分光光度法测定豆荚过氧化物酶的酶活性。 [0012] 分别使用10ml，100ml，500ml摇瓶，1L，5L反应器进行了催化反应实验。这里重点介绍1L，5L反应器的反应。 [0013] 1L，5L反应器均为玻璃反应器，反应器有4块挡板，采用锚式搅拌桨，以减少对酶的剪切影响，反应器的装料系数为0.7-0.8。 [0014] 酶催化反应，分为水相与非水相体系。非水相体系包括水-有机溶剂单相体系，水-有机溶剂2相体系，有机溶剂单相体系，反相微乳液，离子液体，高压CO2等，不同体系，对反应的影响很大，转化率，选择性，收率等都相差很大。对于本反应，采用哪种反应体系最佳，必须通过实验才能确定。初步实验表明，对于本反应而言，水相不是最佳的。所以，我们重点在非水相体系进行实验，以选择最佳的反应体系。 [0015] 进一步的实验表明，反相微乳液，离子液体，高压CO2体系不适合本反应。所以，本反应重点研究水-有机溶剂单相体系，水-有机溶剂2相体系，有机溶剂单相体系。 [0016] 有大量的有机溶剂可以组成水-有机溶剂单相体系，水-有机溶剂2相体系，有机溶剂单相体系，例如异丙醇，异丁醇，丙酮，乙酸乙酯，氯仿，甲醇，乙醇，乙醚，吡啶，石油醚，丁酮，苯，甲苯，二甲苯，正丁醇，四氢呋喃THF，环己烷，二甲基甲酰胺DMF,乙腈，二甲亚砜DMSO,己烷，异辛烷，己烷，辛烷，氯苯，二氯苯，二氯甲烷，甲基丁酮，甲基异丁酮，不同的有机溶剂对反应影响很大，转化率，选择性，收率等都相差很大。对于本反应，采用哪种有机溶剂最佳，必须通过实验才能确定。 [0017] 酶催化反应与pH，反应温度有很大关系，同时，也与底物浓度、酶浓度、H2O2浓度,NaNO2浓度直接相关，与反应器的搅拌转速也有较大关系。 [0018] 所以，在进行本反应实验时，要同时综合考虑以下因素：（1）水-有机溶剂单相体系，水-有机溶剂2相体系，有机溶剂单相体系（2）不同有机溶剂种类（3）反应介质pH （4）反应温度（5）底物浓度（6）酶浓度（7）H2O2浓度（8）NaNO2浓度（9）搅拌转速（10）辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、氯过氧化物酶(来自海洋真菌 Caldariomyces fumago)、大豆壳过氧化物酶、豆荚过氧化物酶。不同酶的影响可能是决定性的。 [0019] （11）H2O2加料方式，一次性加入，或分段加入，或流加。 [0020] （12）水-有机溶剂单相体系中水与有机溶剂的比例（13）水-有机溶剂2相体系中水与有机溶剂的比例（14）有机溶剂单相体系中水活度对催化反应的影响显然，在进行系统的大量的实验以前，是不可能预知实验结果的。不可能知道：实验是否能够成功，能否在较高产率下得到目标产物。上述14种组合，实际上是数百种组合，是否有一种组合可以使实验获得成功，得到较高产率目标产物。 [0021] 产物分析，产物用高效液相色谱进行检测。HPLC为Agilent 1200，，二极管阵列检测器，色谱柱为Allsphere Octyl，C18， 5u，250*4.6mm。通过实验，确定的流动相为水/乙腈=60/40，其中水相加入三氟乙酸使其浓度为0.1%v/v，流速0.5ml/min，波长275nm，目标产物的保留时间11.36分钟。通过HPLC分析，即可得到反应产物的转化率，产率。 [0022] 用制备色谱对产物进行分离纯化，得到分离纯化后的产物，用于进行表征。所用设备为PrepChromaster-5000型多合一中压制备色谱系统，生产厂家为上海科哲生化科技有限公司。 [0023] 对分离纯化的产物进行了核磁分析，核磁仪器型号：BRUKERAV500核磁共振波谱仪。 [0024] 通过大量的实验，我们最终确定，采用水-有机溶剂2相体系，有机溶剂为异戊醇。反应过程如下（1L反应器）：在1L反应器中，用豆荚过氧化物酶进行生物催化反应，底物为2-氟-4,6-二羟基苯酸,目标产物为2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸；反应介质为水-有机溶剂2相体系，其中水相为pH6.9的磷酸缓冲液，有机溶剂为异戊醇，水相/有机相=85/15，反应液体积为700-750ml，将底物溶入异戊醇，然后加入反应器，反应温度49.5-51.5℃，反应时间为8.9-9.8h，反应器搅拌桨转速为420-450rpm，豆荚过氧化物酶浓度为4-5mU/ml，底物浓度为30mM，NaNO2浓度为350mM，H2O2采用流加的加料方式，反应开始时，加入H2O2，使其浓度为 8.5mM，启动酶催化反应；然后开始流加，用蠕动泵加入H2O2，使浓度维持在7.5-9.5mM；反应结束后，得到目标产物2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸，用环己烷萃取3次，合并有机相，减压蒸出有机溶剂，得到产物，取样用甲醇溶解，用HPLC检测分析，根据分析结果，计算出底物转化率、目标产物ee及产率。用制备色谱对产物进行分离纯化，得到分离纯化后的产物，用于核磁分析。 [0025] 实验结果表明，底物转化率为92.6-93.5%，目标产物产率为72.4-72.6%。 [0026] 纯化后产物的核磁数据：1HNMR（500MHz，CDCl3），δ：10.48-12.49（s，3H,OH）6.61（s，1H,Ar-H）；13CNMR（125MHz，CDCl3）δ：169.75, 164.40, 157.51, 152.67, 124.58, 101.99, 101.70 我们还进行了大量的其他条件组合的实验，其效果均不及本组实验条件组合。 [0027] 具体实施方式 [0028] 实施例1制备豆荚过氧化物酶。 [0029] 新鲜大豆荚10kg用粉碎机粉碎后，粒度小于1mm，加50L去离子水室温下浸泡4小时，浸泡液过滤后，得到初提液，初提液体积V；搅拌中对初提液加入固体硫酸铵，使成45%饱和度，此时体积为V1；继续搅拌中再加入0.3V的预冷丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液1，对上清液1加入固体硫酸铵，按V1体积计算加到75%饱和度，经5000rpm，10分钟离心；此时，在水相与丙酮相界面处将形成一层沉淀，即沉淀1，取沉淀1，加入沉淀1体积5倍的去离子水溶解沉淀1，超滤脱盐后，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液2，上清液2体积V2，取上清液2，用丙酮分级沉淀：对上清液2先加1.0V2体积预冷丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到上清液3，对上清液3再加0.8V2体积丙酮，经5000rpm，10分钟离心，得到沉淀2。减压抽干沉淀2中的丙酮，加10倍沉淀2体积的去离子水溶解沉淀2，调pH到8.0，加1mol/L硫酸锌，使硫酸锌成0.01mol/L终浓度，经5000rpm，10分钟离心，得上清液4；将上清液4调pH至7，用超滤脱盐浓缩，冷冻干燥，得到豆荚过氧化物酶粉，酶活为30-40U/mg；用干豆荚也可提取豆荚过氧化物酶，方法如下：干大豆荚，加12倍干大豆荚质量的去离子水浸泡1小时，用粉碎机粉碎后，4℃浸泡过夜，将浸泡液过滤后，得到初提液，初提液体积V；其余步骤同鲜豆荚。 [0030] 所得到的豆荚过氧化物酶用于生物催化。 [0031] 实施例2用豆荚过氧化物酶催化制备2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸。 [0032] 在1L反应器中，用实施例1的豆荚过氧化物酶进行生物催化反应，底物为2-氟-4,6-二羟基苯酸，生产的目标产物为2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸，反应介质为水-异戊醇，其中水相为pH6.9的磷酸盐缓冲液，水相：异戊醇=85:15，将底物溶入异戊醇，然后加入反应器，反应温度49.5-51.5℃，反应时间为8.9-9.8h，反应器搅拌桨转速为420-450rpm，豆荚过氧化物酶浓度为4-5mU/ml，底物浓度为30mM，NaNO2浓度为350mM，H2O2采用流加的加料方式，反应开始时，加入H2O2，使其浓度为8.5mM，启动酶催化反应；然后开始流加，用蠕动泵加入H2O2，使浓度维持在7.5-9.5mM；反应结束后，得到目标产物2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸，用环己烷萃取3次，合并有机相，减压蒸出有机溶剂，得到产物。实验结果为，底物转化率为 92.6-93.5%，目标产物产率为72.4-72.6%。 [0033] 纯化后产物的核磁数据：1HNMR（500MHz，CDCl3），δ：10.48-12.49（s，3H,OH）6.61（s，1H,Ar-H）；13CNMR（125MHz，CDCl3）δ：169.75, 164.40, 157.51, 152.67, 124.58, 101.99, 101.70 实施例3 用市场购买的辣根过氧化物酶、乳过氧化物酶、氯过氧化物酶(来自海洋真菌 Caldariomyces fumago)、大豆壳过氧化物酶作为催化剂，制备2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸。 [0034] 催化反应的条件同实施例2，但是反应温度及pH根据不同的酶调整，实验结果为，底物转化率为21-70%、产率为17-55%。可见，只有豆荚过氧化物酶催化效果最佳。 [0035] 实施例4采用水-有机溶剂单相体系，有机溶剂单相体系，其他条件同实施例2。实验结果为，底物转化率为13-42%、产率为10-31%。可见，只有水-有机溶剂2相体系反应效果最佳。 [0036] 实施例5不同H2O2加料方式对催化反应的影响。 [0037] 采用一次性加入，或分2段加入，或3段加入，或分4段加入等，效果均不及流加方式，实验结果为，底物转化率为21-65%、产率为16-49%。 [0038] 实施例6不同有机溶剂种类对催化反应的影响。 [0039] 除了异戊醇以外，采用多种有机溶剂进行实验，包括异丙醇，异丁醇，正戊醇，氯仿，甲醇，乙醇，乙醚，吡啶，石油醚，丁酮，苯，甲苯，二甲苯，正丁醇，四氢呋喃THF，环己烷，二甲基甲酰胺DMF,乙腈，二甲亚砜DMSO,异辛烷，己烷，辛烷，氯苯，二氯苯，二氯甲烷，甲基丁酮，甲基异丁酮。实验结果为，底物转化率为0-62%、产率为0-47%。 [0040] 实施例7酶浓度对反应的影响。 [0041] 采用1-2mU/mL的豆荚过氧化物酶浓度进行实验，其他条件同实施例2. 实验结果为，底物转化率为24-69%、产率为18-47%。 [0042] 实施例8反应温度对反应的影响。 [0043] 反应温度分别为25-46℃，58-65℃，其他条件同实施例2. 实验结果为，底物转化率为9-65%、产率为8-46%。 [0044] 实施例9反应介质pH对反应的影响。 [0045] 反应介质pH分别为4-6.1,7.4-8.2，其他条件同实施例2.实验结果为，底物转化率为0-59%、产率为0-57%。 [0046] 实施例10搅拌转速对反应的影响。 [0047] 搅拌转速分别为200-330rpm，550-650rpm，其他条件同实施例2.实验结果为，底物转化率为48-75%、产率为46-72%。 [0048] 实施例11在5L反应器中用豆荚过氧化物酶催化制备2-氟-4,6-二羟基-3-硝基苯酸。 [0049] 反应器体积由1L改变为5L，装料量、H2O2加料量做相应改变，其他条件同实施例2，所得的实验结果与实施例2相同。

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