一种新型溶菌酶制剂及其制备方法 |
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| 申请号 | CN201710852051.0 | 申请日 | 2017-09-19 | 公开(公告)号 | CN107475221A | 公开(公告)日 | 2017-12-15 |
| 申请人 | 青岛农业大学; | 发明人 | 黄国清; 肖军霞; 王海鸥; 张志凯; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种新型溶菌酶制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备澄清的鸡蛋清溶液；(2)配制聚阴离子多糖溶液；(3)分别调节鸡蛋清、聚阴离子多糖溶液至相同pH值，将鸡蛋清与聚阴离子多糖溶液充分混合，搅拌，使鸡蛋清中的溶菌酶与聚阴离子多糖通过静电吸引相互作用形成溶菌酶-聚阴离子多糖复合物沉淀；(4)离心收集溶菌酶-聚阴离子多糖复合物沉淀，经干燥得到溶菌酶制剂。本发明采用聚阴离子多糖和溶菌酶通过静电吸引相互作用产生沉淀的原理来达到溶菌酶分离和制剂的目的，该制剂既可以保持溶菌酶在贮藏加工过程中的 稳定性 ，还具有良好的靶向释放性能。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种新型溶菌酶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种新型溶菌酶制剂及其制备方法技术领域[0001] 本发明属于蛋白酶制剂制备技术领域，具体涉及一种新型溶菌酶制剂及其制备方法。 背景技术[0002] 溶菌酶又称胞壁质酶，能选择性地分解微生物细胞壁成分，且本身无毒无害，因而是一种天然的安全性能很好的杀菌剂、防腐剂，可广泛应用于食品防腐、医药制剂、日用化工等行业。溶菌酶存在于蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中。人乳汁、泪液及唾液中的溶菌酶活力约为蛋清中溶菌酶活力的3倍，但鸡蛋清中溶菌酶的含量最丰富(约为3mg/mL)。 [0003] 溶菌酶的分离和纯化的方法主要有硫酸铵沉淀法、亲和层析法、离子交换法和凝胶层析法等。硫酸铵沉淀法虽然纯度高、设备简单、操作方便，但是所获得的溶菌酶含盐量高，需多次盐析盐溶才能获得高纯度产品；亲和层析法分离溶菌酶也是一种有效的手段，亲和层析法分离具有较高的选择性，可以从蛋清中分离出溶菌酶，但由于亲和柱造价高，制作困难等缺点使其应用受到限制；离子交换法分离出的样品比较集中、样品回收率高、活性保持良好、分离周期相对较短，但要采用大量的盐溶液作为洗脱剂将溶菌酶洗脱出来，再通过透析法去除盐离子后才能得到较高纯度的溶菌酶；凝胶层析法处理能力比较小，柱材装柱要求也很高，稍有结构不均或裂痕都会影响到样品的分离效果，因此凝胶层析法一般不单独用于溶菌酶的纯化，而往往作为一种二级纯化手段来制备少量高纯度蛋清溶菌酶。 [0004] 林柳风(溶菌酶/果胶复合体系的构建及其在营养与药物递送体系中的应用研究，华中农业大学硕士学位论文，2015年6月)研究了溶菌酶与果胶之间的相互作用，并利用溶菌酶与果胶在pH10.7、80℃的水浴锅中加热30min得到溶菌酶/果胶纳米凝胶来负载茶多酚，可有效改善茶多酚的稳定性以及提高负载量等。这篇论文的主要研究材料是溶菌酶结晶体，在蛋白质等电点附近时加热(80℃)使溶菌酶变性聚集形成球状纳米凝胶，加热过程中溶菌酶表面的正电荷区域虽然能与果胶负电荷结合，但主要是利用溶菌酶与果胶之间存在的静电排斥作用来阻止变性的溶菌酶形成大颗粒，并且加热过程容易导致部分溶菌酶的酶活性降低。 [0005] 许威(溶菌酶/多糖组装行为及调控，华中农业大学博士学位论文，2015年12月)将黄原胶、溶菌酶溶液pH均调至11.8，按照不同质量比混合搅拌1h后，80℃加热30min，自然冷却至室温后过0.8μm滤膜除去杂质后即得到黄原胶/溶菌酶纳米凝胶；然后再以黄原胶/溶菌酶纳米凝胶为水相，以液体石蜡为油相，分别以不同油/水体积比混合，在6000r/min条件下均质5min制备Pickering乳液。该技术研究的主要对象仍然是溶菌酶结晶体，而溶菌酶在等电点(约为11)以上带负电荷，与黄原胶通过静电排斥作用以共溶的形式存在；通过加热作用促进溶菌酶变性后与黄原胶形成复合纳米凝胶，因此并不是通过静电吸引相互作用形成的。该论文同时也研究了卡拉胶/溶菌酶相互作用，但是卡拉胶需要在70℃下加热搅拌孵育30min后才能使用，而溶菌酶母液在室温条件下搅拌2h才能使用。室温下的溶菌酶母液以不同卡拉胶/溶菌酶配比(3：1、2：1、1：1、1：2、1：3)逐滴加入卡拉胶溶液并搅拌10min后制备卡拉胶/溶菌酶复合物，在pH6.8的条件下形成可溶性复合物，但是复合物中的溶菌酶的空间构象发生明显改变，分子疏水区部分基团暴露于分子表面，复合物中溶菌酶的活性下降为原来的四分之一。该技术中的制备环境温度均为室温，卡拉胶需要加热搅拌，而且需要将溶菌酶逐滴加入卡拉胶溶液中，制备条件复杂，导致复合物中溶菌酶的活性大大下降。 [0006] 费国琴等(响应面分析法优化微生物溶菌酶微胶囊制备工艺，费国琴等，食品科学，第35卷第4期，第11-15页，2014年)将微生物溶菌酶与海藻酸钠混合成均匀溶液，通过蠕动泵之末端针孔匀速滴入到一定质量浓度的氯化钙和壳聚糖的混合醋酸溶液中，待全部滴完后继续静置于其中固化，随后用蒸馏水洗涤2次，用纱布沥干，平铺于直径为10cm的玻璃皿中预冻6h后进行冷冻干燥，即得到溶菌酶微球。该技术利用海藻酸钠与二价金属离子Ca2+反应可形成微球的原理对溶菌酶进行包埋，同时海藻酸钠、壳聚糖也能通过静电吸引作用在微球表面形成复合膜，溶菌酶与海藻酸钠之间是否发生相互作用对包埋没有影响；但是，钙化的海藻酸钠微球粒径大、稳定性差，容易在多离子作用或在钙离子扩散而钾、钠离子大量聚集时变软出现“漏酶”现象；并且，包埋过程在酶分离工序完成后进行，需要在原有的酶生产流程上添加额外的工艺，造成包埋技术成本较高；而且，通过这种技术包埋制备的酶制剂在使用时，由于酶被包埋在基质中而无法实现酶的缓释和控释，因此只能应用于具有良好扩散性的液体食品中，无法在粘度较大的液体及固态食品中发挥作用。 [0007] 近年来，溶菌酶来源不足，价格不断上涨，禽蛋加工企业在生产加工过程中产生大量的破损蛋、废蛋清、蛋壳等，利用这些物料提取溶菌酶不仅可以很大程度地提高企业的经济效益、增加禽蛋加工产品的附加值，而且可以缓解市场溶菌酶供应不足的局面。所以，如何安全有效地从蛋清中分离和纯化溶菌酶，并在制备酶制剂过程中保证溶菌酶的高酶活力，成为亟待解决的问题。因此，探索一种操作步骤简单、成本低廉、无污染、稳定性高且具有控释功能的溶菌酶制剂及其制备方法，对于扩大溶菌酶的应用范围具有重要意义。 发明内容[0008] 针对现有技术中溶菌酶制剂存在的上述问题，本发明提供了一种新型溶菌酶制剂及其制备方法。 [0009] 为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现： [0010] (1)将新鲜鸡蛋破壳分离蛋清，加入去离子水，缓慢搅拌均匀，过滤去除不溶物得滤液；调节滤液pH值至4.5，4℃下静置4h后离心去除不溶物，收集上清液得到澄清的鸡蛋清溶液； [0011] (2)配制1％-2％(w/v)聚阴离子多糖溶液，于4℃过夜充分水合； [0012] (3)分别调节鸡蛋清溶液、聚阴离子多糖溶液至相同pH值，将鸡蛋清与聚阴离子多糖溶液充分混合，搅拌反应，使鸡蛋清中的溶菌酶与聚阴离子多糖通过静电吸引相互作用形成溶菌酶-聚阴离子多糖复合物沉淀； [0013] (4)离心收集溶菌酶-聚阴离子多糖复合物沉淀，经干燥得到溶菌酶制剂。 [0014] 进一步，所述步骤(1)中，在冰浴条件下将鸡蛋清与去离子水按照质量比1:1-2混和，玻璃棒轻轻搅拌以不起泡为宜，双层尼龙布过滤取得滤液。 [0015] 进一步，所述步骤(1)中用醋酸溶液调节滤液pH值至4.5；4℃下静置4h后，在4℃下10000r/min离心20min去除不溶物，收集上清液得到澄清的33.3％-50％(w/w)鸡蛋清溶液。 [0016] 进一步，所述步骤(2)中的聚阴离子多糖为海藻酸钠、羧甲基壳聚糖中的一种或两者混合物。 [0017] 进一步，所述步骤(3)中采用醋酸溶液或氢氧化钠溶液分别将鸡蛋清溶液和聚阴离子多糖溶液pH值调至3.0-5.0；将鸡蛋清与聚阴离子多糖溶液充分混合，保持鸡蛋清与聚阴离子多糖的质量比25-100:1；所述搅拌反应条件为冰浴下搅拌反应30-60min。 [0018] 进一步，所述步骤(4)中采用4000r/min离心20min，收集溶菌酶-聚阴离子多糖复合物沉淀。 [0020] 进一步，所述步骤(4)中溶菌酶-聚阴离子多糖复合物沉淀中的酶活回收率为68.3％-87.5％，蛋白质分离纯化倍数为1.72-3.21。 [0021] 进一步，根据本发明的新型溶菌酶制剂的制备方法制备得到溶菌酶制剂。 [0022] 进一步，在模拟胃液中2h后，未包埋的溶菌酶活性保留率为35.1％，所述溶菌酶制剂活性保留率为75.2％-83.3％；所述溶菌酶制剂在人工模拟胃液中2h后的释放率为37.5％-42.2％，再置于人工模拟肠液中4h后，总释放率为87.6％-92.8％。 [0023] 与现有技术相比，本发明的优点和有益技术效果是： [0024] (1)现有的专利技术均是采用常规的沉淀法、离子交换法或凝胶层析法来分离鸡蛋清及鸡蛋壳中的溶菌酶。而本发明在鸡蛋清中添加适当的聚阴离子多糖，通过调节鸡蛋清与多糖比例、混合溶液pH等来形成不溶性聚电解质复合物，经过干燥即得溶菌酶制剂，不仅能够达到浓缩分离溶菌酶的目的，而且还可以同时提高酶的稳定性并获得所需的控释性能，可弥补现有溶菌酶制剂技术的不足，因此，在新型食品酶制剂的开发中具有良好的应用潜力。 [0025] (2)现有的研究报道均是采用溶菌酶结晶体与多糖之间的相互作用研究，虽然少数涉及到了静电吸引相互作用，但并未利用该原理从鸡蛋清中来分离和纯化溶菌酶，也未制备多糖-溶菌酶制剂。因为鸡蛋清成分复杂，含有大量的杂蛋白干扰，需要选择与溶菌酶结合特异性比较强的多糖，才能成功的将溶菌酶从鸡蛋清中分离出来。 [0026] (3)本发明通过聚电解质间静电吸引相互作用来制备溶菌酶制剂，此方法无需任何有机溶剂、催化剂或化学交联剂，具有安全性高、生物相容性好、工艺简单、成本低廉等显著优点，因此，通过聚电解质复合物来制备溶菌酶制剂可提高溶菌酶的热稳定性，延长其贮藏期和使用期，可提高处理加工食品的生产效率，降低成本。 [0027] (4)本发明在制备溶菌酶制剂过程中无需加热，能够提高溶菌酶-聚阴离子多糖复合物沉淀中的酶活回收率，减少酶制剂产品中的酶活损失，因此，通过本发明的方法制备获得的酶制剂产品中酶活力高。 [0028] (5)本发明制备的溶菌酶粒径小，安全性强，酶稳定性高，不仅可用于液体食品，还可用于粘度较大的液体及固态食品，并且本发明的制备条件简单易操作，设备投入少，易于工业化生产。 [0029] 综合上述，本发明采用聚阴离子多糖和溶菌酶，通过静电相互吸引作用产生沉淀的原理来达到溶菌酶分离和制剂的目的，该酶制剂剂型既可以保持溶菌酶在贮藏加工过程中的稳定性，还能保持溶菌酶具有良好的靶向释放性能。本发明的制备方法操作简单，安全性好，生产成本低，专一性较强，酶活回收率高，设备投入少，易于工业化生产。附图说明 [0030] 结合附图阅读本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。 [0031] 图1为本发明的流程示意图。 具体实施方式[0032] 2％(w/v)聚阴离子多糖溶液：准确称取2g聚阴离子多糖，加入适量的去离子水，用恒温磁力搅拌器搅拌至充分溶解，用去离子水定容至100mL，得到2％聚阴离子多糖储备液，放置于4℃冰箱过夜充分水合。使用前用去离子水稀释至所需浓度。 [0033] 用于制备2％(w/v)聚阴离子多糖溶液的聚阴离子多糖为海藻酸钠、羧甲基壳聚糖中的一种或两者混合物。 [0034] 实施例1 [0035] (1)将新鲜鸡蛋破壳分离蛋清，冰浴条件下将蛋清与去离子水按照质量比1:1混和，玻璃棒轻轻搅拌以不起泡为宜，双层尼龙布过滤得滤液。采用2mol/L醋酸溶液调节滤液pH值至4.5，4℃下静置4h后，4℃下10000r/min离心20min，取上清液得到澄清的50％(w/w)鸡蛋清溶液。 [0036] (2)采用2mol/L醋酸溶液分别将50％(w/w)鸡蛋清溶液和2％海藻酸钠溶液pH值调至4.0，鸡蛋清溶液和海藻酸钠溶液按照体积比1:1混合，保持鸡蛋清与海藻酸钠的质量比25:1，于冰浴下搅拌反应60min，鸡蛋清中的溶菌酶与海藻酸钠通过静电吸引相互作用形成溶菌酶-海藻酸钠复合物沉淀；4000r/min离心20min，收集溶菌酶-海藻酸钠复合物沉淀，冷冻干燥得到溶菌酶制剂。该条件下溶菌酶-海藻酸钠复合物沉淀中的溶菌酶酶活回收率为 87.5％，蛋白质分离纯化倍数为3.21。 [0037] (3)在模拟胃液中2h后，未包埋的溶菌酶活性保留率为35.1％，所述溶菌酶制剂活性保留率为83.3％，溶菌酶制剂活性保留率比未包埋时明显提高。所述溶菌酶制剂在人工模拟胃液中2h后的释放率为37.5％，再置于人工模拟肠液中4h后的总释放率为87.6％。 [0038] 实施例2 [0039] (1)将新鲜鸡蛋破壳分离蛋清，冰浴条件下将蛋清与去离子水按照质量比1:1混和，玻璃棒轻轻搅拌以不起泡为宜，双层尼龙布过滤得滤液。采用2mol/L醋酸溶液调节滤液pH值至4.5，4℃下静置4h后，4℃下10000r/min离心20min，取上清液得到澄清的50％(w/w)鸡蛋清溶液。 [0040] (2)采用1mol/L氢氧化钠溶液将50％(w/w)鸡蛋清溶液pH值调至5.0，采用2mol/L醋酸溶液将2％海藻酸钠溶液pH值调至5.0，鸡蛋清溶液和海藻酸钠溶液按照体积比4:1混合，保持鸡蛋清与海藻酸钠的质量比100:1，于冰浴下搅拌反应30min，鸡蛋清中的溶菌酶与海藻酸钠通过静电吸引相互作用形成溶菌酶-海藻酸钠复合物沉淀；4000r/min离心20min，收集溶菌酶-海藻酸钠复合物沉淀，真空干燥得到溶菌酶制剂。该条件下溶菌酶-海藻酸钠复合物沉淀中的溶菌酶酶活回收率为78.9％，蛋白质分离纯化倍数为2.26。 [0041] (3)在模拟胃液中2h后，未包埋的溶菌酶活性保留率为35.1％，所述溶菌酶制剂活性保留率为76.3％，溶菌酶制剂活性保留率比未包埋时明显提高。所述溶菌酶制剂在人工模拟胃液中2h后的释放率为39.6％，再置于人工模拟肠液中4h后的总释放率为92.8％。 [0042] 实施例3 [0043] (1)将新鲜鸡蛋破壳分离蛋清，冰浴条件下将蛋清与去离子水按照质量比1:2混和，玻璃棒轻轻搅拌以不起泡为宜，双层尼龙布过滤得滤液。采用2mol/L醋酸溶液调节滤液pH值至4.5，4℃下静置4h后，4℃下10000r/min离心20min，取上清液得到澄清的33.3％(w/w)鸡蛋清溶液。 [0044] (2)采用2mol/L醋酸溶液分别将33.3％(w/w)鸡蛋清溶液和1％羧甲基壳聚糖溶液pH值调至3.0，鸡蛋清溶液和羧甲基壳聚糖溶液按照体积比2:1混合，保持鸡蛋清与羧甲基壳聚糖的质量比66.7:1，于冰浴下搅拌反应40min，鸡蛋清中的溶菌酶与羧甲基壳聚糖通过静电吸引相互作用形成溶菌酶-羧甲基壳聚糖复合物沉淀；4000r/min离心20min，收集溶菌酶-羧甲基壳聚糖复合物沉淀，喷雾干燥得到溶菌酶制剂。该条件下溶菌酶-羧甲基壳聚糖复合物沉淀中的溶菌酶酶活回收率为68.3％，蛋白质分离纯化倍数为2.05。 [0045] (3)在模拟胃液中2h后，未包埋的溶菌酶活性保留率为35.1％，所述溶菌酶制剂活性保留率为75.2％，溶菌酶制剂活性保留率比未包埋时明显提高。所述溶菌酶制剂在人工模拟胃液中2h后的释放率为42.2％，再置于人工模拟肠液中4h后的总释放率为89.3％。 [0046] 实施例4 [0047] (1)将新鲜鸡蛋破壳分离蛋清，冰浴条件下将蛋清与去离子水按照质量比1:2混和，玻璃棒轻轻搅拌以不起泡为宜，双层尼龙布过滤得滤液。采用2mol/L醋酸溶液调节滤液pH值至4.5，4℃下静置4h后，4℃下10000r/min离心20min，取上清液得到澄清的33.3％(w/w)鸡蛋清溶液。 [0048] (2)采用2mol/L醋酸溶液分别将33.3％(w/w)鸡蛋清溶液和1％羧甲基壳聚糖溶液pH值调至4.0，鸡蛋清溶液和羧甲基壳聚糖溶液按照体积比1:1混合，保持鸡蛋清与羧甲基壳聚糖的质量比33.1:1，于冰浴下搅拌反应50min，鸡蛋清中的溶菌酶与羧甲基壳聚糖通过静电吸引相互作用形成溶菌酶-羧甲基壳聚糖复合物沉淀；4000r/min离心20min，收集溶菌酶-羧甲基壳聚糖复合物沉淀，真空干燥得到溶菌酶制剂。该条件下溶菌酶-羧甲基壳聚糖复合物沉淀中的溶菌酶酶活回收率为73.7％，蛋白质分离纯化倍数为1.72。 [0049] (3)在模拟胃液中2h后，未包埋的溶菌酶活性保留率为35.1％，所述溶菌酶制剂活性保留率为80.1％，溶菌酶制剂活性保留率比未包埋时明显提高。所述溶菌酶制剂在人工模拟胃液中2h后的释放率为41.3％，再置于人工模拟肠液中4h后的总释放率为90.5％。 [0050] 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。 |
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