[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体E226H及其应用。

[0002] 植酸酶是广泛存在于动物、植物、微生物中的胞外酶，能催化植酸及其盐类水解为肌醇与磷酸(盐)，从而提高植物性饲料中植酸磷和微量元素如锌、铁、铜的利用效率，有利于节约饲料成本，减少磷素对环境影响。工业制粒膨化过程中的高温及动物消化系统中高浓度蛋白酶常会降低植酸酶的生物功能活性。一些自然界中挖掘的植酸酶对蛋白酶敏感或不耐热，难以满足工业生产的需求。通过定点突变改造蛋白的稳定性，可以获得综合酶学性质优良的植酸酶，有利于降低生产成本，提高经济效益。

[0003] 本发明的目的是提供一种胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体。

[0004] 本发明另一目的是提供编码上述胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体基因。

[0005] 本发明的另一目的是提供包含上述胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体基因的重组载体。

[0006] 本发明的另一目的是提供包含上述胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体基因的重组菌株。

[0007] 本发明的另一目的是提供上述胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体的应用。

[0008] 本发明对克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristensenii)来源植酸酶YkAPPA基因进行定点突变，该植酸酶YkAPPA的成熟蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，该成熟蛋白是由如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列编码的。

[0009] SEQ ID NO.1

[0010]MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.

[0011] SEQ ID NO.2

[0012]Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatcgaggtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa

[0013] 本发明采用定点突变的方法，获得了胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的突变体，命名为YkAPPA-E226H，即YkAPPA的第226位的谷氨酸突变为组氨酸。

[0014] 因此根据本发明的胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体YkAPPA-E226H，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示

[0015] SEQ ID NO.3

[0016] MTIAKEYLRLSILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILSRHGVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTPRGAGLVTLMGGFYGDYFRSYGLLPAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFLDGIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHTVEAGVCKLDPEKTHQAVEKRLGGPLNELSQRYAKPFALMGEVLNFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIHVNKEGTKVSLSGPLALSSTLGEIFLLQNSQAMPDVAWNRLSGEENWISLLSLHNAQFDLMAKTPYIARHKGTPLLQQIDTALVLQRDAQGQTLPLSPQTKLLFLGGHDTNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQTMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI[0017] 本发明还提供了编码上述胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体YkAPPA-E226H的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

[0018] SEQ ID NO.4

[0019]Atgacaatagcaaaagaatatctgcggttatccatactcactttggtgctcagtagttttacgctaagtgctgcaccgcttgcagcacaatctaccggttacactttggagcgcgtggtgattttgagccgccacggtgttcgttccccgacgaaacaaacacagttaatgaatgatgttacaccggacaaatggccacaatggccagtaaaagcgggctatttaacgccgcgaggggcaggattagtcactttaatgggcgggttctatggtgattatttccgcagctatgggttgttaccggcggggtgcccggcagacgaatccatctatgtgcaagctgatgttgaccaacgtacccgcttaaccgggcaggcatttctggacggtatagccccggattgcggcctgaaagtacattatcaagctgatttgaaaaaaattgacccattgttccataccgtcgaggcgggggtatgtaaattggacccagagaaaactcatcaggctgttgaaaaacgcttgggtgggccattaaatgaactgagtcaacgctatgccaagccctttgccctgatgggcgaggtgctgaatttttcggcctcaccttattgcaactcactgcaacagaaaggaaaaacctgtgattttgcgacttttgcagcaaatgaaatccatgtaaataaagaagggacaaaagtctcactgagtgggccattggcgctatcatcgacattaggtgaaattttcctattacaaaattcacaggccatgccagatgtcgcctggaaccgtctcagcggtgaagaaaattggatttcattattgtcactgcataatgcacagttcgatttgatggccaaaaccccttatatcgcccggcataaaggaactccgttgttgcaacaaattgatacggcattagtgttgcaacgtgatgctcaggggcaaacactgccgctgtcaccgcaaaccaaattgctgttcctcgggggacatgacaccaatattgccaatattgcgggtatgttaggggccaattggcaattaccgcagcaacctgataataccccgccaggcggagggctagtctttgagctatggcagaatccggataaccatcaacgctatgtggcggtgaaaatgttctatcaaacgatggagcagttgcgcaatgcagataagttagatttgaaaaacaacccggcaagaattgttcccattgctattgaagggtgtgaaaacgagggtgataacaaactttgtcagcttgaaacgttccaaaagaaagtcgcccaagtgatcgagccagcctgccatatttaa

[0020] 将上述编码胃蛋白酶抗性提高且耐热性改良的植酸酶突变体YkAPPA-E226H的编码序列以合适的取向和正确的读码框插入到所述载体上，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。本发明优选的载体为pPIC9γ，改造的植酸酶基因插入到质粒pPIC9γ上的EcoRI和NotI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到各突变体的重组酵母表达质粒。本发明优选的宿主菌为毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115。

[0021] 相比于野生型，本发明的植酸酶突变体YkAPPA-E226H的胃蛋白酶抗性和耐热耐酸性明显改良，在发展节约型饲料酶工业上有很大用途。附图说明

[0022] 图1突变酶YkAPPA-E226H与野生酶YkAPPA的蛋白酶抗性比较；

[0023] 图2突变酶YkAPPA-E226H与野生酶YkAPPA的耐热性比较。

[0024] 实验材料

[0025] 质粒扩增宿主菌大肠杆菌Trans1-t1购自天根。真核表达载体pPIC9γ和表达宿主菌毕赤酵母GS115购自Invitrogen公司。DNA纯化试剂盒购自TaKaRa。Pfu DNA聚合酶、限制性内切酶、T4DNA连接酶购自天根。植酸钠和胃蛋白酶(P0685)购自Sigma。

[0026] 实施例1：突变基因的获得

[0027] 通过Overlap PCR方法对克氏耶尔森氏菌(Yersinia kristeensenii)来源的植酸酶YkAPPA的基因序列(SEQ IDNO.2)进行改造，获得突变基因。该方法以含有野生植酸酶基因YkAPPA的pEASY-T3-YkAPPA重组质粒为模板，通过两轮PCR反应引入突变。其中使用四条引物，包括扩增突变基因完整编码序列的分别带有EcoR I和Not I识别序列的上下游引物(YkAPPA Forward:5’-cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3’和YkAPPA Reverse:5’-gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcga-3’)及在特定位置引入突变的上下游引物(YkAPPA E226H Forward:5’-agcaaatgaaatccatgtaaataaagaag-3’和YkAPPA E226H Reverse:5’-cttctttatttacatggatttcatttgct-3’)。所需的突变基因连接到载体pEASY-T3载体上并经DNA测序证实。

[0028] 实施例2：改造前后的植酸酶的酵母表达载体的构建及其在毕赤酵母中表达与纯化

[0029] 野生植酸酶YkAPPA和突变体YkAPPA-E226H的理论分子量为48.6kDa。野生型植酸酶及其突变体的编码区序列插入到酵母表达载体pPIC9γ的EcoRI和NotI酶切位点之间，并转化到毕赤酵母GS115细胞中，加入终浓度0.5％的甲醇在30℃和220rpm的摇床中振荡培养3天诱导目的蛋白表达。粗酶液经镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱和二乙基氨基乙基(DEAE)柱进行层析纯化。纯化的野生酶和突变酶经10％SDS-PAGE电泳检测为一条约52kDa的条带。

[0030] 实施例3：突变植酸酶与野生酶的酶学性质比较

[0031] 使用硫酸亚铁钼蓝法测定植酸酶活性。将50μL适当浓度酶液加入到950μL 1.5mmol/L植酸钠底物(用pH 4.5和0.25M的NaAc-HAc缓冲液配制)中，在37℃水浴锅中反应
30min，加入1mL 10％三氯乙酸终止反应，最后加入2mL显色液(1％四水合钼酸铵，3.2％浓硫酸，7.32硫酸亚铁)进行显色。在700nm下测定吸光度值衡量释放的无机磷酸盐的量。一个植酸酶活性单位定义为在测定条件下，每分钟释放1微摩尔的磷酸盐所需的酶量。所有反应重复三次。

[0032] (1)胃蛋白酶抗性

[0033] 突变酶与野生酶用不同浓度的胃蛋白酶(0.25M甘氨酸盐酸，pH2)在37℃下处理2h,胃蛋白酶和植酸酶的比例在3-141U/mg之间。对胃蛋白酶处理后的样品用最适pH缓冲液稀释，在37℃和最适pH件下检测胃蛋白酶处理后植酸酶的剩余活性。

[0034] 突变酶与野生酶对不同浓度的胃蛋白酶的抗性结果见图1。野生酶对胃蛋白敏感，当胃蛋白浓度从3U/mg升至141U/mg时，野生酶YkAPPA的酶活基本消失。与野生酶相比，突变酶YkAPPA-E226H的胃蛋白酶抗性明显提高，在141U/mg高浓度胃蛋白处理下突变酶YkAPPA-E226H可保持47.8％的酶活。在28U/mg的胃蛋白酶处理下，突变酶YkAPPA-E226H较野生酶YkAPPA显示了较长的半衰期(表1)。因此，植酸酶YkAPPA的第226位的谷氨酸突变为组氨酸后，提高了植酸酶的胃蛋白酶抗性。

[0035] (2)热稳定性

[0036] 改造前后的植酸酶在不同pH(1-12)和37℃下进行酶促反应30min，测定最适pH。酶液在pH 1-9和37℃下处理1h，研究酶的pH稳定性。所用的缓冲液为：0.1mol/L甘氨酸-盐酸缓冲液，pH1-3；0.1mol/L醋酸钠-醋酸缓冲液，pH3-6；0.1mol/L Tris-盐酸缓冲液，pH7-8；0.1mol/L Bis-Tris-盐酸缓冲液，pH6-7.3；0.1mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，pH8-12。

[0037] 改造前后的植酸酶的pH值特性比较如表1。突变酶YkAPPA-E226H与野生酶具有相似的最适pH，分别为4和4.5。在pH值为1下处理1h，突变酶可保持91.3％活性，而野生酶只能保持63.7％的酶活。因此突变酶较野生酶具有更高的耐酸性。

[0038] 突变酶与野生酶在最适pH和不同温度(30-80℃)下处理30min，确定最适温度。在最适pH和60℃下将酶液处理0，2，5，10，20，30min后测定植酸酶酶的热稳定性。突变酶YkAPPA-E226H的最适温度与野生酶YkAPPA相同，为60℃。突变酶YkAPPA-E226K在60℃处理30min较野生酶有更好的热稳定性，可保持43.9％酶活，而野生酶保持16.1％的酶活(图2)。
在60℃下，突变酶YkAPPA-E226K较野生酶具有更长的热失活半衰期(表1)。因此，植酸酶YkAPPA的第226位的谷氨酸突变为组氨酸不仅提高了植酸酶对胃蛋白酶的抗性，也改良了酶的热稳定性。

[0039] 表1 pH和温度对改造前后的植酸酶的酶活和稳定性的影响的比较[0040]