一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基 |
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| 申请号 | CN201610398249.1 | 申请日 | 2016-06-07 | 公开(公告)号 | CN107475184A | 公开(公告)日 | 2017-12-15 |
| 申请人 | 广州美萨生物科技有限公司; | 发明人 | 杨旅军; | ||||
| 摘要 | 本 发明 涉及一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，包括下列成分：重组人胰岛素：1~100ug/ml； 碱 性 成 纤维 细胞 生长因子：1~50ng/ml；人转 铁 蛋白：1~50ug/ml；亚硒酸：1~80ug/ml；丝 氨 酸：1~300ug/ml氯化胆碱：1~200ug/ml；腺嘌呤：1~60ug/ml；单乙酰胺：1~100ug/ml；磷酰 乙醇 胺：0.01~10mmol/ml；三碘甲状腺氨酸:1~50pg/ml；胎 牛 血清：1~50ul/ml。本发明的培养基具有细胞保持良好干细胞特性、 细胞增殖 能 力 更强的特点；降低了干细胞对胎牛血清的依赖，也减轻了胎牛血清对干细胞特性和分化的不利影响，减少胎牛血清，更加符合临床应用。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，其特征在于，包括下列成分： |
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| 说明书全文 | 一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基技术领域[0001] 本发明涉及干细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的低血清培养基。 背景技术[0002] 间充质干细胞【mesenchymal stem cells,MSC】是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞，MSC最初在骨髓中发现，因其具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。如间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。 [0003] 细胞培养在干细胞冻存中广泛应用。在传统培养过程中通常需要添加一定量的胎牛血清, 在实际应用中，血清的添加存在如下缺点：（1) 干细胞对胎牛血清存在依赖性； （2)血清易受病毒、支原体或其他病原体的污染； （3）胎牛血清对干细胞特性和分化有不利影响； （4) 对于规模化生产，大量血清的存在增加生产后期纯化的难度，增加工艺流程、提高生产成本，回收率降低； 部分血清成分难以彻底去除，严重影响最终产品质量，具有安全隐患。 [0004] 当前也有一些公司开发的新一代无血清培养基，如Invitrogen 开发MSC SFM XenoFree 无血清培养基、加拿大stemcell 公司开发了MesenCultTM-XF Medium 无血清培养基、BD 公司开发的BDMOSAICTM Hmsc SF Medium 和CellGenix 开发的Serum-free MSC Medium 等。但这些培养基价格昂贵，在培养MSC 过程中都需要使用附属产品进行细胞培养瓶的包被处理。 发明内容[0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，包括下列成分，以浓度计： 重组人胰岛素： 1~100ug/ml； 碱性成纤维细胞生长因子： 1~50ng/ml； 人转铁蛋白： 1~50ug/ml； 亚硒酸： 1~80ug/ml； 丝氨酸： 1~300ug/ml； 氯化胆碱： 1~200ug/ml； 腺嘌呤： 1~60ug/ml； 单乙酰胺： 1~100ug/ml； 磷酰乙醇胺： 0.01~10mmol/ml； 三碘甲状腺氨酸: 1~50pg/ml； 胎牛血清： 1~50ul/ml。 [0007] 作为优选，本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，包括下列成分，以浓度计：重组人胰岛素： 1~50ug/ml； 碱性成纤维细胞生长因子： 1~20ng/ml； 人转铁蛋白： 1~20ug/ml； 亚硒酸： 1~30ug/ml； 丝氨酸： 1~150ug/ml； 氯化胆碱： 1~100ug/ml； 腺嘌呤： 1~30ug/ml； 单乙酰胺： 1~20ug/ml； 磷酰乙醇胺： 0.05~1mmol/ml； 三碘甲状腺氨酸： 1~20pg/ml； 胎牛血清： 1~30ul/ml。 [0008] 更有选地，本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，包括下列成分，以浓度计：重组人胰岛素： 5ug/ml； 碱性成纤维细胞生长因子： 4ng/ml； 人转铁蛋白： 5ug/ml； 亚硒酸： 6.84ug/ml； 丝氨酸： 105ug/ml； 氯化胆碱： 89.3ug/ml； 腺嘌呤： 12.2ug/ml； 单乙酰胺： 14ug/ml； 磷酰乙醇胺： 0.1mmol/ml； 三碘甲状腺氨酸： 13.46pg/ml 胎牛血清： 20ul/ml。 [0009] 优选的，所述的一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，还包括基础培养基，所述基础培养基为高糖DMEM 培养基。 [0010] 优选的，所述的一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基在人脂肪间充质干细胞和人脐带间充质干细胞培养中的应用。 [0011] 本发明的有益效果为：1、本发明培养基在通用型DMEM培养基的基础上，添加十余种促进细胞生长的物质，降低了干细胞对胎牛血清的依赖，也减轻了胎牛血清对干细胞特性和分化的不利影响，减少或彻底去除胎牛血清，更加符合临床应用。 [0012] 2、对比通用型间充质干细胞培养基（DMEM, 添加10%FCS）,上述培养基具有细胞保持良好干细胞特性、细胞增殖能力更强的特点；3、与国外某知名低血清培养基相比，培养最常使用的人脂肪来源干细胞/人脐带间充质干细胞，在细胞形态和增殖能力方面，都表现出了优势； 4、本发明培养基生产成本可以控制在国外同类型培养基价格1/10左右； 5、在培养基中加入单乙酰胺、氯化胆碱，有助于新的细胞的分裂合成。在细胞的活动中，细胞会通过单乙酰胺激酶以单乙酰胺为底物合成磷酰乙醇胺，通过胆碱激酶将胆碱转化为磷酸胆碱，同时单乙酰胺也是糖基磷脂酰肌醇的组成部分，糖基磷脂酰肌醇是细胞表面蛋白黏附的必须物质；三碘甲状腺氨酸，刺激RNA多聚酶I和II的合成，增加蛋白质的合成；丝氨酸，参加嘌呤和嘧啶的生物合成，是多种氨基酸（甘氨酸、半胱氨酸等）和叶酸的前体。 [0014] 具体实施方式：下面结合实施例对本发明进行详细的描述，但它们不是对本发明的进一步限制。 [0015] 实施例一本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，包括下列成分，以浓度计： 重组人胰岛素： 5ug/ml； 碱性成纤维细胞生长因子： 4ng/ml； 人转铁蛋白： 5ug/ml； 亚硒酸： 6.84ug/ml； 丝氨酸： 105ug/ml； 氯化胆碱： 89.3ug/ml； 腺嘌呤： 12.2ug/ml； 单乙酰胺： 14ug/ml； 磷酰乙醇胺： 0.1mmol/ml； 三碘甲状腺氨酸： 13.46pg/ml 胎牛血清： 20ul/ml。 [0016] 实施例二：本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，包括下列成分，以浓度计： 重组人胰岛素： 1ug/ml； 碱性成纤维细胞生长因子： 20ng/ml； 人转铁蛋白： 50ug/ml； 亚硒酸： 1ug/ml； 丝氨酸： 150ug/ml； 氯化胆碱： 1ug/ml； 腺嘌呤： 60ug/ml； 单乙酰胺： 20ug/ml； 磷酰乙醇胺： 0.05mmol/ml； 三碘甲状腺氨酸： 1pg/ml 胎牛血清： 1ul/ml。 [0017] 实施例三：本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，包括下列成分，以浓度计： 重组人胰岛素： 50ug/ml； 碱性成纤维细胞生长因子： 50ng/ml； 人转铁蛋白： 1ug/ml； 亚硒酸： 80ug/ml； 丝氨酸： 300ug/ml； 氯化胆碱： 100ug/ml； 腺嘌呤： 1ug/ml； 单乙酰胺： 1ug/ml； 磷酰乙醇胺： 10mmol/ml； 三碘甲状腺氨酸： 20pg/ml 胎牛血清： 50ul/ml。 [0018] 实施例四：本发明所述的一种用于培养人间充质干细胞的低血清培养基，包括下列成分，以浓度计： 重组人胰岛素： 100ug/ml； 碱性成纤维细胞生长因子： 1ng/ml； 人转铁蛋白： 20ug/ml； 亚硒酸： 30ug/ml； 丝氨酸： 1ug/ml； 氯化胆碱： 200ug/ml； 腺嘌呤： 30ug/ml； 单乙酰胺： 100ug/ml； 磷酰乙醇胺： 0.01mmol/ml； 三碘甲状腺氨酸： 50pg/ml 胎牛血清： 30ul/ml。 [0019] 实施例四：脐带间充质干细胞在培养基中传代培养培养基1（普通培养基）：UltraCULTURE Serum-free Medium（LONZA）； 培养基2（普通培养基+2%FBS）：UltraCULTURE Serum-free Medium+2%FBS ； 培养基3：DMEM+2%FBS ； 培养基4：本发明实施例一间充质干细胞的低血清培养基 操作步骤： 1、将脐带间充质干细胞种植到4个培养容器中，培养容器为底部面积75平方厘米的培养瓶，分别加入培养基1、培养基2、培养基3和培养基4，将培养基与脐带间充质干细胞悬液充分混匀后，将4个细胞培养瓶放入到37℃、CO2 浓度为5% 的细胞培养箱中进行培养，传代； 2、在细胞培养的第13天，将细胞培养瓶中的细胞收获，用0.25%的胰酶消化2min，之后将间充质干细胞吹打下来并用个对应培养基终止消化； 3、将步骤2得到的间充质干细胞以200g 的速度离心5min，收集间充质干细胞用10ml 的磷酸盐缓存溶液重悬后，再以200g 的速度离心5min，得到的细胞用10ml 的磷酸盐缓存溶液混匀； 4、对第4、8、13天细胞进行细胞计数和细胞活率计算，同时观察第2、4、8、13天细胞形态和融合度，结果如表1~5所示： 表1 第2天细胞形态学观察及鉴定结果 表2 第4天细胞形态学观察及鉴定结果 表3 P4传P5细胞形态学观察及鉴定结果 表4 第8天细胞形态学观察及鉴定结果 备注：P5细胞01、04做鉴定，02、03不继续做对比实验，细胞形态如附图1、2所示。同时， 01、04传P6，0.5*106 /瓶传代。 [0020] 表5 第13天细胞形态学观察及鉴定结果由以上数据可看出，P4代以后，实施例1本发明培养基在细胞形态上、增殖效率有明显 6 的优势，特别在P6代，收集细胞数达到5.8*10 ，活率达到93%，细胞保持良好干细胞特性、细胞增殖能力更强。 [0021] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 |
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