[0001] 本发明属于生物资源精深加工技术领域，具体涉及一种用于微生物培养的脱脂蚕蛹水解物及其制备方法和应用。

[0002] 培养基氮源主要用于微生物菌体细胞生长和含氮代谢物的合成，在微生物培养过程中至关重要。目前，微生物培养最常用的有机氮源是酵母浸粉和蛋白胨，两者价格相对昂贵(其单位价格至少为葡萄糖价格的五倍)(Bioresource Technol,2013,129(2013):351-359)，导致工业发酵运行成本较高，因此急需寻找一种价廉物美的替代氮源。

[0003] 蚕蛹营养价值高，是我国一种来源丰富的特色生物资源。由于蚕蛹脱色脱嗅成本较高，因此深加工技术的层次和质量相对降低，部分蚕蛹仅作为饲料和肥料加以利用。实际上，蚕蛹的蛋白含量高，是一种较为理想的纯天然优质蛋白质，因此脱脂蚕蛹中丰富的氨基酸不仅能为微生物提供氮源，还能促进菌体代谢物的积累，具有开发成为微生物有机氮源的巨大潜能。专利CN 104232549A和专利CN 103540639A公开了陈贵等将脱脂蚕蛹粉先经胃蛋白酶或风味蛋白酶处理、再加碱性蛋白酶或木瓜蛋白酶处理的两步酶解的方法，经超滤等多个步骤制备的蚕蛹浸粉作为培养基氮源，来培养枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等微生物；专利CN104277975A公开了一种脱脂蚕蛹水解液的预处理方法，并将其应用于一些产油微生物。史馨怡等利用超声波强化离子液体-酶法脱脂蚕蛹水解液作为氮源培养产油酵母Yarrowia lipolytica W29，与商品化的酵母浸粉作为氮源的培养基相比，酵母油脂含量提高了1.3倍。此外，专利CN 105124131A公开了一种经脱脂、粉碎、利用氧化钠溶液提取蛋白、大孔树脂吸附处理、调节pH沉淀蛋白等一系列步骤，得到浅黄色无臭脱脂蚕蛹蛋白粉及其制备方法。因此，将脱脂蚕蛹制备成微生物氮源完全可行，但存在预处理过程复杂且脱脂蚕蛹蛋白制备成本高等问题，因此需要建立适合于微生物培养的脱脂蚕蛹水解物预处理新方法。

[0004] 传统的蛋白水解有酸法、碱法和酶法，随着人们对环境保护的认识和酶法水解蛋白工艺及其设备的发展，出现了复合酶法(CN  105124131A)、超声辅助酶法(CN 104673868A)、微波辅助酶法(CN 104673868A)和离子液体-酶法(CN 102796163A)等改进方法，但仍然需要较长的酶解时间(平均约2.5～3h)，另外外源添加物的回收也加大了运行成本和工艺复杂度。因此，研究一种绿色高效的蛋白水解方法具有重要的现实意义。

[0005] 近年来，压热法预处理蛋白获取水解物具有操作简单、回收率高且成本低等优势，具有良好的应用前景。如CN 104830937A公开了一种利用鸡屠宰副产物制备蛋白胨的方法，利用水热法使蛋白快速溶出并溶入汤中，极大地促进了后续酶解汤汁等步骤，获得高收率的蛋白胨。另据报道，利用水热法处理猪皮，在高温高压下制成猪皮水解液过程中温度与压力具有因素协同作用，同时提高两个因素值有效提高了蛋白水解效率(LWT-Food Science and Technology,2017,83:18-25)，表明水热法在制备蛋白水解物方面具有实用性。申请人在预试验中发现：单纯利用复合酶解脱脂蚕蛹，即使延长水解时间制备的水解液作氮源时，在培养基高温灭菌处理时仍会出现大量蛋白成絮状析出的现象，不利于后续微生物培养的营养供给。考虑到高温高压可以使蚕蛹蛋白变性并部分水解，有利于后续酶解，且减短水解时间，而单纯利用水热法只能使很小部分蛋白溶解，因此选择水热法联用酶法来处理脱脂蚕蛹蛋白。该法操作简便，耗时短，产品得率高。更重要的是，脱脂蚕蛹来源广泛、成本低廉，用该方法制备的水解物培养的微生物增殖速度快，数量多，可用于实验室常见微生物的培养。该法有助于推动蚕蛹生物质资源的广泛应用，为今后规模化利用生物质制备微生物氮源以及食品级蛋白水解物提供理论基础和技术支持，具有积极的现实指导意义和社会经济价值。

[0006] 解决的技术问题：本发明提供一种用于微生物培养的脱脂蚕蛹水解物及其制备方法和应用，旨在压热法预处理蚕蛹渣，以蛋白酶为催化剂制备蛋白水解液，用于微生物培养，旨在提高蚕蛹资源的利用率。

[0007] 技术方案：一种用于微生物培养的脱脂蚕蛹水解物的制备方法，步骤为：(1)在反应釜中按质量体积比Kg/L加入脱脂蚕蛹粉和水，其中脱脂蚕蛹粉:水＝1：(5～50)，于50～500℃温度、压力0.1～11MPa下处理0.1～5h，冷却，备用得预处理的脱脂蚕蛹粉浊液；(2)将脱脂蚕蛹浊液pH值调至5-11，加入蛋白酶，所加酶量为脱脂蚕蛹粉质量的1％～10％，置于
40～70℃中振荡或搅拌反应，在水解过程加酸或加碱溶液维持pH值，酶解0.1～3h后，离心或过滤得脱脂蚕蛹水解液，经干燥得到粉末状固体即脱脂蚕蛹水解物。

[0008] 上述蛋白酶为中性蛋白酶、碱性蛋白酶、风味酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶或枯草杆菌蛋白酶中的至少一种，以上所述酶活力不低于10000U/g。

[0009] 上述制备方法制得的脱脂蚕蛹水解物。

[0010] 上述脱脂蚕蛹水解物在培养细菌、真菌、酵母和微藻中的应用。

[0011] 上述细菌类包括大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、微藻类包括小球藻(Chlorella vulgaris)、寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)和裂殖壶菌(Schizochytriu)、酵母类包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、解脂耶罗维亚酵母(Yarrowia lipolytica)和红酵母(Rhodotorula)和霉菌类宝库卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和土霉菌(Asoergullus terreus)。

[0012] 有益效果：在酶促水解脱脂蚕蛹渣前采用压热法预处理，该法简单快速，对环境友好，不带入任何杂质，提高了后续酶促反应的效率，极大地缩短了水解反应时间，产物得率可达50％以上，将其用于细菌、真菌及微藻等微生物的培养，其生物量、代谢产物等指标均达到或超过使用传统氮源的组合培养基条件下的水平。附图说明

[0013] 图1为本处理体系的流程图；

[0014] 图2为本发明待处理的脱脂蚕蛹粉图；

[0015] 图3为本发明制备的脱脂蚕蛹水解物图。

[0016] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0017] 将干燥蚕蛹粉碎成粉状，以石油醚(沸程60～90)为溶剂，按照1:2(Kg/L)混合，萃取温度保持在50℃，超声处理2h，过程不断搅拌。多次萃取后，过滤，回收溶剂，收集脱脂蚕蛹，自然干燥至恒重，作为粗脱脂蚕蛹粉，备用。

[0018] 其中，脱脂蚕蛹水解物得率的计算方法：

[0019]

[0020] 实施例1蚕蛹脱脂蚕蛹粉压热法预处理

[0021] 将脱脂蚕蛹粉和蒸馏水按1:(10～50)(g/mL)混合，置于反应釜中100Kpa、100℃处理60min，冷却备用得预处理的脱脂蚕蛹粉浊液。将脱脂蚕蛹粉浊液的pH调制10.0，加入脱脂蚕蛹粉质量1～5％的碱性蛋白酶，并且在反应过程中加酸或加碱调节以维持pH值，水解45min，过滤得脱脂蚕蛹水解液，经干燥得到粉末状固体(即脱脂蚕蛹水解物)；经称量和计算，脱脂蚕蛹水解物的得率为48.91％。

[0022] 实施例2蚕蛹脱脂蚕蛹粉压热法预处理

[0023] 将脱脂蚕蛹粉和蒸馏水按1:(10～30)(g/mL)混合，置于反应釜中1000Kpa、300℃处理5min，冷却备用得预处理的脱脂蚕蛹粉浊液。将脱脂蚕蛹粉浊液的pH调制10.0，加入脱脂蚕蛹粉质量1～5％的碱性蛋白酶，并且在反应过程中加酸或加碱调节以维持pH值，水解45min，过滤得脱脂蚕蛹水解液，经干燥得到粉末状固体(即脱脂蚕蛹水解物)；经称量和计算，脱脂蚕蛹水解物的得率为52.93％。

[0024] 实施例3蚕蛹脱脂蚕蛹酶解处理

[0025] 将脱脂蚕蛹粉和蒸馏水按1:(10～30)(g/mL)混合，置于反应釜中210Kpa、121℃处理15min，冷却备用得预处理的脱脂蚕蛹粉浊液。将脱脂蚕蛹粉浊液的pH调制10.0，加入脱脂蚕蛹粉质量1～5％的碱性蛋白酶，并且在反应过程中加酸或加碱调节以维持pH值，水解45min，过滤得脱脂蚕蛹水解液，经干燥得到粉末状固体(即脱脂蚕蛹水解物)；经称量和计算，脱脂蚕蛹水解物的得率为52.97％。

[0026] 实施例4蚕蛹脱脂蚕蛹粉预处理

[0027] 将脱脂蚕蛹粉和蒸馏水按1:(10～30)(g/mL)混合，置于反应釜中210Kpa、121℃处理15min，冷却备用得预处理的脱脂蚕蛹粉浊液。将脱脂蚕蛹粉浊液的pH调制10.0，加入脱脂蚕蛹粉质量1～5％的碱性蛋白酶，并且在反应过程中加酸或加碱调节以维持pH值，水解45min，过滤得脱脂蚕蛹水解液，经干燥得到粉末状固体(即脱脂蚕蛹水解物)；经称量和计算，脱脂蚕蛹水解物的得率为48.67％。

[0028] 实施例5蚕蛹脱脂蚕蛹粉预处理

[0029] 将脱脂蚕蛹粉和蒸馏水按1:(10～30)(g/mL)混合，置于反应釜中210Kpa、121℃处理15min，冷却备用得预处理的脱脂蚕蛹粉浊液。将脱脂蚕蛹粉浊液的pH调制10.0，加入脱脂蚕蛹粉质量1～5％的碱性蛋白酶，并且在反应过程中加酸或加碱调节以维持pH值，水解45min，过滤得脱脂蚕蛹水解液，经干燥得到粉末状固体(即脱脂蚕蛹水解物)；经称量和计算，脱脂蚕蛹水解物的得率为52.68％。

[0030] 实施例6蚕蛹脱脂蚕蛹粉预处理

[0031] 将脱脂蚕蛹粉和蒸馏水按1:(10～30)(g/mL)混合，置于反应釜中210Kpa、121℃处理15min，冷却备用得预处理的脱脂蚕蛹粉浊液。将脱脂蚕蛹粉浊液的pH调制7.0，加入脱脂蚕蛹粉质量1～5％的中性蛋白酶，并且在反应过程中加酸或加碱调节以维持pH值，水解45min，过滤得脱脂蚕蛹水解液，经干燥得到粉末状固体(即脱脂蚕蛹水解物)；经称量和计算，脱脂蚕蛹水解物的得率为48.21％。

[0032] 实施例7蚕蛹脱脂蚕蛹粉预处理

[0033] 将脱脂蚕蛹粉和蒸馏水按1:(10～30)(g/mL)混合，置于反应釜中210Kpa、121℃处理15min，冷却备用得预处理的脱脂蚕蛹粉浊液。将脱脂蚕蛹粉浊液的pH调制8.0，加入脱脂蚕蛹粉质量1～5％的胰蛋白酶，并且在反应过程中加酸或加碱调节以维持pH值，水解60min，过滤得脱脂蚕蛹水解液，经干燥得到粉末状固体(即脱脂蚕蛹水解物)；经称量和计算，脱脂蚕蛹水解物的得率为48.16％。

[0034] 实施例8微生物的培养

[0035] 菌种活化：将保藏的大肠杆菌(ATCC BL21)在37℃下活化，用接种针刮一环经活化的斜面菌种，将其接种于50mL种子液培养基(LB培养基中)，在37℃、150r/min下振荡培养8h，得到种子液；

[0036] 摇床培养：将实施例2中得到的脱脂蚕蛹水解物按15g/L添加量作为唯一氮源，添加到裂殖壶菌的培养基中，按2wt.％的接种量，在37℃、150r/min下振荡下培养12h。

[0037] 培养后处理：培养结束后，离心收集发酵菌体细胞，干燥，测得生物量，最终结果如表1。

[0038] 表1不同氮源培养大肠杆菌生物量情况

[0039]

[0040] 实施例9微生物的培养

[0041] 菌种活化：将保藏的酿酒酵母(BY4742)在YPD斜面培养基中28℃下活化48h；

[0042] 摇床培养：用接种针刮一环活化菌种接种于50mL种子液培养基(YPD培养基中)，在28℃、150r/min下振荡培养24h，得到种子液；

[0043] 将实施例2中得到的脱脂蚕蛹水解物按30g/L添加量作为唯一氮源，添加到裂殖壶菌的培养基，按10wt.％的接种量，在28℃、150r/min下振荡下培养48h。

[0044] 发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，干燥、测得生物量，结果如表2。

[0045] 表2不同氮源培养酿酒酵母生物量情况

[0046]

[0047] 实施例10微生物的培养

[0048] 菌种活化：将保藏的红酵母(江苏科技大学保藏)在PDA斜面培养基中28℃下活化48h；

[0049] 摇床培养：用接种针刮一环活化菌种接种于50mL种子液培养基(YPD培养基中)，在28℃、150r/min下振荡培养36h，得到种子液；

[0050] 将实施例2中得到的脱脂蚕蛹水解物按30g/L添加量作为唯一氮源，添加到裂殖壶菌的培养基，按10wt.％的接种量，在28℃、150r/min下振荡下培养96h。

[0051] 发酵后处理：发酵后处理及其产物提取、测定与计算均参照文献(食品科学,2009,30(15):176-179)，最终结果如表3。

[0052] 表3不同氮源培养红酵母生物量及类胡萝卜素产量情况

[0053]

[0054] 实施例11微生物的培养

[0055] 菌种活化：将保藏的解脂耶罗维亚酵母Yarrowia lipolytica W29(ATCC 20794)在28℃下活化，用接种针刮一环经活化的斜面菌种，将其接种于50mL种子液培养基(YEPD培养基中)，在28℃、150r/min下振荡培养24h，得到种子液；

[0056] 摇床培养将实施例2中得到的蛋白水解物按2.0g/L添加量作为唯一氮源，添加到裂殖壶菌的培养基中，按10wt.％的接种量，在28℃、150r/min下振荡下培养96h。

[0057] 发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，干燥、研磨后用有机溶剂提取油脂、用气相色谱仪测脂肪酸组成，最终结果如表4和表5。

[0058] 表4不同氮源培养Yarrowia lipolytica W29生物量及产油情况

[0059]

[0060] 注：表中培养基两种氮源用量以及碳源用量都经过实验优化所得。

[0061] 表5不同氮源培养获得Yarrowia lipolytica W2油脂中各脂肪酸含量( n＝3)[0062]

[0063] 注：UFA:不饱和脂肪酸；其中不饱和脂肪酸包括C16:1、C18:1、C18:2和C18:3；SFA:饱和脂肪酸；在Yarrowia lipolytica W2中饱和脂肪酸包括C16:0和C18:08[0064] 实施例12微生物的培养

[0065] 菌种活化：将保藏的裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21(ATCCMYA-1381)在25℃下活化，用接种针刮一环经活化的斜面菌种，将其接种于50mL种子液培养基(790+培养基中)，在25℃、150r/min下振荡培养24h，得到种子液；

[0066] 摇床培养将实施例4中得到的蛋白水解物按18g/L添加量作为唯一氮源，添加到裂殖壶菌的培养基，按10wt.％的接种量，在26℃、150r/min下振荡下培养120h。

[0067] 发酵后处理：发酵结束后，离心收集发酵菌体细胞，干燥、研磨后用有机溶剂提取油脂、用气相色谱仪测脂肪酸组成，最终结果如表6和表7。

[0068] 表6不同氮源培养Schizochytrium limacinum SR21生物量、油脂产量及DHA生产情况

[0069]

[0070] 注：表中培养基两种氮源用量以及碳源用量都经过实验优化所得。

[0071] 表7不同氮源对Schizochytrium limacinum SR21油脂中各脂肪酸含量( n＝3)

[0072]

[0073]

[0074] 注：UFA:不饱和脂肪酸；其中不饱和脂肪酸包括C18:3、C20:5、C22:5和C22:6；SFA:饱和脂肪酸；在裂殖壶菌中饱和脂肪酸包括C14:0、C15:0、C16:0、C17:0和C18:0。