一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球 |
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申请号 | CN201710676994.2 | 申请日 | 2017-08-09 | 公开(公告)号 | CN107449905A | 公开(公告)日 | 2017-12-08 |
申请人 | 华中农业大学; | 发明人 | 吴刚; 潘卫东; 华红霞; 王永模; | ||||
摘要 | 本 发明 涉及一种检测 水 稻豇豆胰蛋白酶 抑制剂 的人工微球,检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球,由抗CpTI蛋白多克隆 抗体 包被,微球颗粒200nm,表面载基团为羧基。是用下述方法制备的,根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长CpTI基因表达序列,构建细菌融合表达载体,再通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体中进行细菌表达,用亲合层析柱纯化得GST-CpTI融合蛋白,再将佐剂溶合 抗原 后免疫小鼠,经分离纯化得抗CpTI多克隆抗体,抗体通过化学偶联法偶联活化后得检测CpTI蛋白的人工微球。用于检测+最低 检测限 为CpTI融合蛋白0.2μg/ml,相关系数R2=0.67。 | ||||||
权利要求 | 1.一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球,其特征在于:由抗CpTI蛋白多克隆抗体包被,微球颗粒大小200nm,表面载基团为羧基; |
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说明书全文 | 一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球技术领域背景技术[0002] 蛋白酶抑制剂广泛存在于植物体内,尤其在植物的贮藏器官内含量相当高。在植物体内蛋白酶抑制剂的生物学功能主要有两个方面:①通过与内源蛋白酶相互作用,调控组织细胞内的有关生理生化过程;②防止细胞、组织内的蛋白质成分被外源蛋白酶所降解。其更重要的作用在于作为一种抵御外界植食性昆虫和微生物攻击的化学防卫因子。研究证实,大多数植物来源的蛋白酶抑制剂对植物内源性蛋白酶没有抑制作用,但对外源蛋白酶有特异的抑制活性,这就为通过基因工程提高农作物防卫系统的效能提供了自然进化上的基础。 [0003] 豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)属丝氨酸蛋白酶抑制剂。与Bt毒蛋白相比,其杀虫机理完全不同且具有杀虫广谱,对人畜安全,昆虫不易产生抗性的优点而受到人们的重视。通过转基因技术将CpTI基因导入作物而获得的转基因植株已在我国部分地区得到了大规模的应用,但迄今对于转基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制剂的检测方法不多,且检测灵敏度、检测限和抗干扰能力等亟待提高。目前,有关CpTI抑制剂检测技术的研究报告和相关专利技术国内外报道很少,迫切需要开发高效、准确、快速的新型检测技术和产品。 [0004] CN103160533B公开了一种特异性检测转基因水稻品系科丰6号的标准分子及其应用。所提供的标准分子为环状载体,包括如序列1的第10-101位所示的豇豆胰蛋白酶抑制剂编码基因片段、如序列1的第256-336位所示的苏云金芽孢杆菌杀虫晶体蛋白编码基因片段、如序列1的第191-258位所示的水稻内源基因GOS片段,以及如序列1的第108-184位所示的Ti质粒T-DNA的边界序列片段。 发明内容[0005] 本发明的目的是针对上述现状,旨在提供一种取材简单、操作方便;所制备的人工微球颗粒小,粒径均匀,用于检测CpTI蛋白灵敏度较高,且操作简单、重复性强;检测CpTI融合蛋白最低限为0.2μg/ml的检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球。 [0006] 本发明目的的实现方式为,一种检测水稻豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球,由抗CpTI蛋白多克隆抗体包被,微球颗粒大小200nm,表面载基团为羧基; [0007] 检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球是由下述方法制备的,制备的具体步骤如下: [0008] 1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长CpTI基因表达序列; [0009] 2)构建细菌融合表达载体pGEX-4T-2-CpTI,将CpTI基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶基因融合表达载体中; [0010] 所述构建融合表达载体体pGEX-4T-2-CpTI是pGEX-4T-2-CpTI3; [0011] 3)对表达载体进行细菌表达后,利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合蛋白; [0012] 所述亲合层析柱为Glutathione Sepharose 4B; [0013] 4)将佐剂溶合抗原后免疫小鼠,经分离纯化得到鼠抗CpTI多克隆抗体; [0014] 5)将步骤4)所得鼠抗CpTI多克隆抗体,通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球,得到检测CpTI蛋白的人工微球; [0016] 本发明采用单分散羧基化聚苯乙烯微球为基质材料,用化学偶联方法偶联抗CpTI多克隆抗体获得,取材简单、操作方便;制备方法细致严谨,重复性高;所制备的人工微球颗粒小,粒径均匀,能检测CpTI融合蛋白最低限0.2μg/ml,其相关系数R2=0.67。附图说明 [0017] 图1A是羧基化聚苯乙烯化学结构图, [0018] 图1B是羧基化聚苯乙烯微球扫描电镜, [0019] 图2是CpTI基因原序列全长图谱, [0020] 图3是以E.coli为表达宿主优化后的CpTI基因序列图谱, [0021] 图4是菌落PCR验证CpTI基因插入片段电泳图谱, [0022] 图5是质粒XbaⅠ酶切电泳图谱, [0023] 图6是CpTI表达载体测序图谱, [0024] 图7A、B是GST-CpTI融合蛋白做SDS-PAGE、Western Blotting分析图谱,[0025] 图8是抗血清效价测定图, [0026] 图9是人工增强比浊法检测CpTI融合蛋白结果图, [0027] 图10A是CpTI融合样品图, [0028] 图10B是CpTI融合样品比色分析图, [0029] 图11是检测出CpTI融合蛋白样品结果图。 具体实施方式[0030] 本发明的检测豇豆胰蛋白酶抑制剂的人工微球是由下述方法制备的,制备的具体步骤如下: [0031] 1)根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰并构建全长CpTI基因表达序列; [0032] 构建全长CpTI基因表达序列的具体步骤如下: [0033] ①设计全长CpTI基因序列,结果如图2所示; [0034] ②根据原核细胞表达的优先密码子重新修饰,采用全基因合成技术构建全长CpTI基因,共333对碱基,克隆至载体pGEM-T Easy,结果如图3所示; [0035] ③通过菌落PCR验证CpTI基因片断插入的正确性,结果如图4所示; [0036] ④将克隆CpTI基因菌实施扩增培养,提取质粒后进行酶切和琼脂糖电泳分析,结果如图5所示; [0037] ⑤DNA测序,保证基因的全部序列100%准确,结果如图6所示。 [0038] 2)构建细菌融合表达载体pGEX-4T-2-CpTI,将CpTI基因片段通过限制酶切割插入谷胱甘肽-S-转移酶(GST)基因融合表达载体中; [0039] 所述构建融合表达载体体pGEX-4T-2-CpTI是pGEX-4T-2-CpTI3; [0040] 所述对表达载体进行细菌表达的步骤是: [0041] ①将融合表达载体pGEX-4T-2-CpTI转化大肠杆菌株细胞,细胞生长条件为230转/分,温度37℃; [0042] ②当菌体生长OD595值为0.5-0.8时,加入1.0mM的诱导剂IPTG,在25℃诱导3小时;在4℃时,以5,000×g离心5分钟,收集菌体; [0043] ③菌体经PBS缓冲液清洗3次后,超声破碎,破碎细胞在4℃时,以14,000×g离心1小时,收集上清液。 [0044] 3)对表达载体进行细菌表达后,利用亲合层析柱纯化获得GST-CpTI融合蛋白。 [0045] 是将步骤2)收集的上清液循环通过Glutathione Sepharose 4B亲合层析柱,4℃过夜,未结合蛋白用10倍床体积的1×PBS冲洗;结合的GST-CpTI融合蛋白用洗脱液洗脱并收集、保存。 [0046] 对表达和纯化提取的GST-CpTI融合蛋白做SDS-PAGE和Western Blotting分析,结果如图7A、B所示。 [0047] 4)将佐剂溶合抗原(GST-CpTI融合蛋白)后免疫小鼠,经分离纯化得到鼠抗CpTI多克隆抗体; [0048] 具体步骤是: [0049] ①将GST-CpTI融合蛋白抗原与弗氏佐剂混合后,充分乳化,采用背部多点注射法BALB/c小鼠;每次的抗原量约10μg,三次,每次两周后经尾动脉取血检测抗体效价; [0050] ②以适宜浓度的抗原包被酶标板,100μl/孔,4℃过夜; [0051] ③用0.1M,pH=7.4的磷酸缓冲液洗涤后,加入待检的血清样品,100μl/孔,37℃1小时;设阴性对照孔; [0053] ⑤对制备的抗GST-CpTI融合蛋白抗体,经ELISA法检测,抗体能与GST-CpTI,GST蛋白特异性结合,其相关系数达到显著水平,效价>1:8000,结果如图8所示。 [0054] 5)将步骤4)所得鼠抗CpTI多克隆抗体,通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球,得到检测CpTI蛋白的人工微球。 [0055] 通过羧基-氨基化学偶联法偶联活化微球的制备和检测步骤如下: [0056] ①将单分散羧基化聚苯乙烯微球用活化剂EDC(碳化二亚胺)活化,然后加入保护剂Sulfo-NHS,使检测CpTI蛋白的人工微球形成稳定的活泼酯中间体; [0057] ②在活泼酯中间体中加入抗CpTI蛋白多克隆抗体,温育1-2小时; [0058] ③用0.1M,pH=7.4的磷酸缓冲液洗涤后,收集检测CpTI蛋白的人工微球; [0059] ④通过由上海寰熙医疗器械有限公司生产的CA-1680型生化分析仪(如图9所示),采用人工增强比浊法,检测CpTI融合蛋白样品,图10A是CpTI融合样品图,[0060] 图10B是CpTI融合样品比色分析图。 [0061] ⑤经生化分析仪检测,用于检测CpTI蛋白的人工微球最低检测限为CpTI融合蛋白0.2μg/ml,其相关系数R2=0.67,结果如图11所示。 [0062] 由此可见,本发明所制备的用于检测CpTI蛋白的人工微球检测灵敏度较高,且操作简单、重复性强,显示了良好的应用前景。 |