[0001] 本发明涉及医学检测领域，更具体的涉及一种用于检测胃癌的试剂盒。

[0002] 胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一。在不少地区恶性肿瘤死亡统计报告中，胃癌居第一位或第二位。胃癌的发病年龄以40～60岁之间为最多见，一般男性多于女性，男女之比大约为3：1或2：1。胃癌多发生在胃窦部，特别是沿胃小弯侧。由于胃癌在发病的早期一般没有什么明显症状或体征，常常容易与胃炎、胃溃疡相混淆，没能引起足够的重视，延误了治疗的时机，使胃癌进一步扩展。胃癌分为乳头状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、未分化癌等。其中，印戒细胞癌是一种含有大量黏液的特殊胃癌类型，由于细胞中充满了黏液，把细胞核挤向了细胞的一侧，使其外形酷似一枚戒指，故得其名。胃印戒细胞癌是高度恶性肿瘤之一，约占胃癌的9.9％，具有侵袭力强，病程进展快，恶性程度高的特点。胃印戒细胞癌是胃肠恶性肿瘤中预后最差的，发展很快。如果及时发现，还可以做根治性切除的话，5年生存率可以达到25％。但如果发现时已经侵犯周围器官或已经转移，预期生存时间在半年左右。因此如果能够在发病早期及时的诊断出胃印戒细胞癌将大大提高患者的治疗效果，而现有的常规检测方法均无法有效的在早期检测出胃印戒细胞癌，因此迫切的需要提供一种早期诊断胃印戒细胞癌的方法。

[0003] 本发明的目的是提供一种用于检测胃癌的试剂盒，具体来说是一种检测胃印戒细胞癌的试剂盒。

[0004] 本发明的一个技术方案是提供一种用于检测胃癌的试剂盒，其包含特异性检测miRNA-6738-5p的试剂。

[0005] 优选的，所述试剂包括反转录引物、正向引物、反向引物，所述反转录引物序列如SEQ ID NO：1所示，所述正向引物的序列如SEQ ID NO：2所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO：3所示。

[0006] 本发明的另一个技术方案是提供SEQ ID NO：1-3在用于制备检测胃癌的试剂盒中的用途。

[0007] 发明人在前期的细胞学试验中，通过差显表达的方法发现miRNA-6738-5p的表达量与胃印绒细胞癌密切相关，miRNA-6738-5p的高表达预示着胃印绒细胞癌的发生，为了进一步证实该结论，发明人又通过临床样本统计学实验进一步证实了该相关性。

[0008] 本发明的试剂盒可以有效的检测胃印绒细胞癌，所述试剂盒可快速实现miRNA的定量检测，从而达到快速有效的检测胃印绒细胞癌的目的。附图说明

[0009] 图1引物的扩增曲线

[0010] 图2临床标本中胃印绒细胞癌与正常对照组之间外周血miRNA-6738-5p的表达水平比较图

[0011] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

[0012] 实施例1样本收集

[0013] 收集50例胃印绒细胞癌和25例正常人群血液，所有标本均来自苏州大学第一附属医院和苏州大学第二附属医院，标本收集时间为2015年10月至2017年6月。上述标本的收集均通过苏州大学第一附属医院伦理审查委员会和苏州大学第二附属医院伦理审查委员会的批准，所有受试者均签署了知情同意书。

[0014] 实施例2样品总RNA的提取

[0015] 1.血清总RNA的提取

[0016] 1)将临床收集的血液标本0.25ml，加入3倍体积TRIzol(0.75ml)，充分振荡混匀。

[0017] 2)将匀浆样品在15-30℃放置5min。

[0018] 3)离心10min(12000rpm，4℃)，取上清。

[0019] 4)加0.2ml氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

[0020] 5)离心15min(12000rpm，4℃)。把上层水相(约500μl)转移到新管中。

[0021] 6)在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置30min。

[0022] 7)离心10min(12000rpm，4℃)，去上清。离心后RNA在管侧和管底形成胶状沉淀。

[0023] 8)加入1ml 75％乙醇洗涤沉淀。

[0024] 9)离心3min(5000rpm，4℃)。倒出液体，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出。

[0025] 10)室温放置晾干，加入30μl无RNA酶的水，充分溶解。

[0026] 11)紫外分光光度计检测测量所提取RNA的浓度和纯度。

[0027] 12)电泳检测：琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，电泳结果显示总RNA均有清晰的28s和18s条带，RNA完好无降解，质量符合进一步反转录实验要求。

[0028] 2.miRNA逆转录

[0029] 使用天根公司FastQuant RT Kit快速反转录试剂盒合成第一链cDNA[0030] 1)将模板RNA在冰上解冻；5×gDNA Buffer、FQ-RT Primer Mix、10×Fast RT Buffer、无RNA水在室温解冻，解冻后迅速置于冰上。

[0031] 2)按下表基因组DNA的去除体系配制混合液，彻底混匀。简短离心，并置于42℃，孵育3min。然后置于冰上放置。

[0032] 基因组DNA的去除体系

[0033]组成成分 使用量
5×gDNABuffer 2μl
TotalRNA 1μl
无RNA酶水 7μl

[0034] 3)按下表反转录反应体系配制混合液。

[0035] 反转录反应体系:

[0036]

[0037] 上表中反转录引物序列为：

[0038] CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGCCCCTGTG(SEQ ID NO:1)。

[0039] 同时反转录U6，其反转录引物RT-U6序列为:CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT(SEQ ID NO:4)。

[0040] 4)将反转录反应中的混合液，加到基因组去除步骤的反应液中，充分混匀。

[0041] 5)42℃，孵育15min。

[0042] 6)95℃，孵育3min之后放于冰上，得到cDNA。

[0043] 实施例3荧光定量PCR检测胃印绒细胞癌组和对照组miRNA的表达

[0044] 1)荧光定量PCR

[0045] 试剂盒采用天根公司的FastFire qPCR PreMix(SYBR Green)。首先，融解FastFire qPCR PreMix，模板，引物和无RNA酶水，并将所有试剂在室温下溶解并彻底混匀。接下来配置荧光定量PCR体系。

[0046] 荧光定量PCR体系

[0047]

[0048] miRNA表达检测每个样品设置3个平行反应，以snRNA U6作为内参。

[0049] 上表中正向引物序列为：ACACTCCAGCTGGGCGAGGGGTAGAAGAGCA(SEQ ID NO:2)。

[0050] 上表中反向引物序列为：TGGTGTCGTGGAGTCG(SEQ ID NO:3)。

[0051] 同时以U6作为内参，正向引物：GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT(SEQ ID NO:5)；反向引物：CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT(SEQ ID NO:6)。

[0052] 荧光定量PCR程序：

[0053]

[0054] 引物的扩增曲线见图1。

[0055] 2)统计学分析

[0056] 采用GraphPad5.0软件进行分析。统计学分析方法组间采用t检验，p<0.05定为有统计学意义。分析胃印绒细胞癌与正常对照组之间外周血miRNA-6738-5p的表达水平，结果显示胃印绒细胞癌中miRNA-6738-5p的表达明显高于正常组织，具体见图2。

[0057] 上述临床实验表明，通过检测miRNA-6738-5p的表达水平可以有效的检测胃印绒细胞癌。