一种用于高效纯化相互作用蛋白的克隆载体 |
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| 申请号 | CN201710606252.2 | 申请日 | 2017-07-24 | 公开(公告)号 | CN107400678A | 公开(公告)日 | 2017-11-28 |
| 申请人 | 中山大学孙逸仙纪念医院; | 发明人 | 尹东; 胡开顺; 李瑜; 严海燕; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开一种用于高效纯化相互作用蛋白的克隆载体。所述的克隆载体是含有IRDR-L-IRDR-R盒的双 链环 状质粒，所述IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、启动子、SFB纯化标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列、attR2序列、筛选基因序列和IRDR-R序列。本发明的质粒载体带有转座酶识别序列，基于转座酶的方法能快速、安全的建立蛋白过表达稳定株，并利用SFB标签高效纯化靶蛋白及其相互作用蛋白，进而进一步通过质谱分析鉴定。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种用于高效纯化相互作用蛋白的克隆载体，其特征在于： |
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| 说明书全文 | 一种用于高效纯化相互作用蛋白的克隆载体技术领域背景技术[0002] 在基因组学时代，基因功能分析是其重要的遗传学分支。在细胞或动物水平上，利用过表达载体人为上调目的基因的表达是研究基因功能的重要手段之一。目前根据基因在细胞过表达的时效性可以将细胞分为瞬转株或稳转株。稳转株是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定表达，同时经过抗生素加压筛选，最终得到能够稳定表达蛋白的细胞株。相比瞬转株而言，稳转株在很大程度上方便实验研究和降低频繁转染的成本。当前常用的稳定系构建的方法主要有两种，一种是基于病毒整合的原理，该种方法需要人工制备病毒，因而操作繁琐，且存在安全隐患；另一种是基于非同源重组随机整合，由于其整合效率非常低，导致筛选周期长，外源片段表达效率低，因而逐渐被淘汰。近年来，一种称为“睡美人”的转座系统逐渐进入研究人员的视野，该系统采用“剪切粘贴”的转座机制，由转座酶识别靶目标序列两端特异的反向重复序列(ITRS)，将靶目标序列整合至宿主基因组DNA中。使用转座技术构建基因过表达稳定株具有操作简单、试验周期短、效率高等明显优势。 [0003] 在蛋白相互作用研究领域，免疫共沉淀结合质谱技术(Co-IP/MS)是常用的捕获与诱饵蛋白相互作用分子的技术手段之一，然而其缺点是假阳性多，难于量化，不能满足大规模蛋白质研究的需要。串联亲和纯化结合质谱技术(TAP/MS)很好的解决了上述缺点，该技术通过在诱饵蛋白的一端嵌入一种特殊设计的蛋白标签，经过多步亲和纯化后得到更加接近自然状态下的特定复合物，能够在真实的生理条件下研究蛋白质的相互作用，在一定程度上打破了蛋白质组学研究的瓶颈。在实际的科学研究中，为了挖掘更加丰富的信息和数据，在使用串联亲和纯化结合质谱技术时，往往需要109个数量级或更多的细胞。因而一种带TAP纯化标签的稳定过表达质粒载体在蛋白相互作用研究领域是一个强有力的研究工具。 发明内容[0004] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种用于高效纯化相互作用蛋白的克隆载体。该克隆载体基于转座子原理可快速建立过表达稳定系。 [0005] 本发明的另一目的在于提供上述克隆载体在蛋白相互作用研究领域中的应用。 [0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现： [0007] 本发明提供的一种用于高效纯化相互作用蛋白的克隆载体，其克隆方法是基于Gateway技术的，该载体含有attR1和attR2重组位点，attR1重组位点上游有一段SFB纯化标签序列，在attR1和attR2之间含有反向选择性标记基因(counter-selectable marker gene)，此外还包括筛选基因。 [0008] 所述的克隆载体是含有IRDR-L-IRDR-R盒的双链环状质粒，所述IRDR-L-IRDR-R盒包括IRDR-L序列、启动子、SFB纯化标签序列、attR1序列、反向选择性标记基因序列、attR2序列、筛选基因序列和IRDR-R序列。 [0009] 所述的IRDR-L序列为SEQ ID NO：1中自5′端第9102位～9328位碱基的反向互补序列；所述的IRDR-R序列为SEQ ID NO：1中自5′端第5956位～6183位碱基。 [0010] 所述的启动子是CAG启动子，其序列为SEQ ID NO：1中自5′端第1位～1132位碱基。 [0011] 所述的SFB纯化标签序列为SEQ ID NO：1中自5′端第1172位～1426位碱基。 [0012] 所述的attR1序列为SEQ ID NO：1中自5′端第1436位～1560位碱基；所述的attR2序列为SEQ ID NO：1中自5′端第3016位～3140位碱基的反向互补序列。 [0013] 在本发明中，术语“SFB纯化标签序列”是指S-Flag-SBP标签，其中S能与S protein beads结合、SBP能与Streptavidin conjugated beads结合、Flag能与Flag抗体结合。 [0014] 所述的反向选择性标记基因是指自杀基因ccdB，其序列为SEQ ID NO：1中自5′端第2670位～2975位碱基。 [0015] 所述的筛选基因包括抗性和荧光筛选基因。 [0016] 所述的抗性筛选基因是指嘌呤霉素(puromycin)抗性基因，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第3689位～4288位碱基。 [0017] 所述的荧光筛选基因是指绿色荧光蛋白(GFP)基因，其序列为SEQ ID NO.1中自5′端第4929位～5663位碱基。 [0018] 所述的克隆载体pSM1.1-SFB-GFP的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。 [0019] 所述的克隆载体在蛋白相互作用研究领域中的应用。 [0020] 此外本发明还提供了pSM1.1-SFB-GFP载体建立过表达稳定系的方法及应用，包括以下步骤： [0021] (1)获取需要克隆的目的基因蛋白编码区(CDS)序列； [0022] (2)设计上下游接头引物扩增目的基因； [0023] (3)与入门载体pDONR221进行Gateway BP重组反应，将目的基因克隆至入门载体； [0024] (4)将带有目的基因的入门载体与终载体pSM1.1-SFB-GFP进行Gateway LR重组反应，将目的基因克隆至pSM1.1-SFB-GFP载体上； [0025] (5)将带有目的基因的pSM1.1-SFB-GFP载体与转座酶质粒SB100X共转染宿主细胞，使目的基因整合至宿主细胞基因组中； [0026] (6)使用嘌呤霉素筛选得到过表达目的基因的稳转细胞株，扩大培养； [0027] (7)收集培养的细胞，在非变性状态下裂解细胞，离心抽取蛋白； [0029] (9)用生物素(Biotin)竞争性洗脱目的蛋白及其蛋白复合物； [0030] (10)使用S蛋白磁珠(S protein beads)进一步纯化目的蛋白复合物； [0031] (11)将纯化目的蛋白样品进行蛋白质谱分析。 [0032] 本发明的思路是：在带有转座元件的质粒载体上引入了SFB纯化标签，构建了与Gateway兼容的克隆载体，将转座酶技术与串联亲和纯化质谱进行了整合，提供了一种快速、经济的纯化相互作用蛋白的新渠道。 [0033] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果： [0034] (1)本发明的质粒载体带有转座酶识别序列，能方便、快速、安全的建立蛋白过表达稳定株。 [0035] (2)本发明的质粒载体是包括嘌呤霉素(puromycin)筛选抗性和绿色荧光蛋白(GFP)标签，便于稳定株的筛选。 [0036] (3)本发明的质粒载体表达的蛋白带有SFB标签，通过串联亲和纯化，有效的减少非特异性蛋白的结合。 [0038] 图1是pSM1.1-SFB-GFP质粒载体结构示意图。 [0039] 图2是通过免疫印迹(Western Blot)的方法检测pSM1.1-SFB-GFP-FBXW7过表达稳定株中SFB-FBXW7的表达水平。 [0040] 图3是在荧光显微镜下观察pSM1.1-SFB-GFP-FBXW7过表达稳定株中带绿色荧光的细胞比例。 [0041] 图4是银染检测亲和串联纯化后与SFB-FBXW7相互作用的蛋白复合物。 [0042] 图5是蛋白质谱鉴定亲和串联纯化后与SFB-FBXW7相互作用的蛋白。 [0043] 图6是通过免疫共沉淀的方法对蛋白质谱结果中的γ-catenin蛋白做进一步实验验证。 具体实施方式[0044] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 [0045] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。 [0046] 本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。 [0047] 本发明实施例中所述的pSM1.1-SFB-GFP质粒载体结构示意图，如图1所示。 [0048] 实施例1 [0049] 本实施例以E3泛素连接酶FBXW7(Gene Bank登录号：NM_001349798.1)为目标蛋白，以宫颈癌细胞系HeLa为模型，构建了pSM1.1-SFB-GFP-FBXW7稳定过表达的HeLa细胞，结合TAP/MS技术鉴定到了84个与FBXW7相互作用的蛋白。 [0050] 1.1pSM1.1-SFB-GFP-FBXW7质粒载体的构建 [0051] (1)设计FBXW7克隆引物序列pDONR221-FBXW7-F和pDONR221-FBXW7-R，交由华大基因公司合成，引物序列如下： [0052] p D O N R 2 2 1 - F B X W 7 - F ： 5 ′ -GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACCATGAATCAGGAACTGCTCTCTGT-3′； [0053] p D O N R 2 2 1 - F B X W 7 - R ： 5 ′ -GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTAGTATTACTTCATGTCCACATCAAAGT-3′。 [0054] (2)以cDNA文库为模板，使用FBXW7克隆引物作为PCR引物，扩增FBXW7基因的蛋白编码区，使用Qiagen PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物得到attB1-FBXW7-attB2PCR产物。 [0055] (3)以pDONR221为入门载体，使用invitrogen公司的Gateway BP反应试剂盒将FBXW7克隆至pDONR221中，并测序验证。 [0056] (4)以pSM1.1-SFB-GFP为目的载体，使用invitrogen公司的Gateway LR反应试剂盒将FBXW7克隆至pSM1.1-SFB-GFP载体中，并将该过表达载体命名为pSM1.1-SFB-GFP-FBXW7。 [0057] 1.2FBXW7稳定过表达HeLa细胞的构建 [0058] (1)选取生长状态良好的HeLa细胞，用胰酶消化并计数，吸取200万个细胞种板至6cm细胞培养皿中。 [0059] (2)第二天待细胞完全贴壁后，使用lipo2000共转染5μg pSM1.1-SFB-GFP-FBXW7和5μg SB100X转座酶质粒于HeLa细胞中，转染后36小时，使用含有终浓度为2μg/mL嘌呤霉素的培养基筛选稳定株，筛选周期约为4天左右。 [0060] (3)筛选完成后，在荧光显微镜下观察，如图3所示：可见大于95％细胞带有绿色荧光，表明该质粒具有非常高的整合效率。 [0061] (4)收取一部分细胞，抽取蛋白，经免疫印迹(Western Blot)验证，如图2所示：该细胞系稳定过表达SFB-FBXW7。 [0062] 1.3FBXW7蛋白复合物的串联亲和纯化及鉴定 [0063] (1)大量培养SFB-FBXW7稳定过表达的HeLa细胞，收取109个细胞，加入10mL NETN细胞裂解液，置于冰上裂解30分钟，12000转离心20分钟，吸取蛋白上清。 [0064] (2)向蛋白上清中加入400μL亲和链霉素磁珠(Streptavidin conjugated beads)，4度摇床旋转孵育过夜。 [0065] (3)使用磁力架收集亲和链霉素磁珠，并用NETN细胞裂解液洗涤磁珠3～5次，以去除非特异性结合蛋白。 [0066] (4)使用含有2mg/mL生物素的NETN细胞裂解液4度旋转摇床竞争性洗脱磁珠5小时，使FBXW7蛋白及其相互作用蛋白溶解于上清中，收集上清，再重复洗脱2-3次，合并收集的上清。 [0067] (5)使用100μL的S蛋白磁珠(S protein beads)与洗脱液4度孵育过夜，再次纯化富集FBXW7蛋白复合物。 [0068] (6)收集S蛋白磁珠，加入50μL 1×SDS上样缓冲液，煮沸后取部分样品做银染检测，如图4所示：与对照组相比，FBXW7串联亲和纯化后富集到大量的相互作用蛋白。 [0069] (7)剩下样品做蛋白质谱分析，得到84个相互作用蛋白，结果如图5所示。 [0070] (8)根据质谱结果提示FBXW7与γ-catenin相互作用，为了验证结果的可靠性，如图6所示，我们进一步通过外源免疫共沉淀方法证实FBXW7与γ-catenin确实存在相互作用，以上结果证明本发明所述质粒pSM1.1-SFB-GFP能高效纯化目的蛋白及其相互作用的分子。 [0071] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 |
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