表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体及应用 |
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| 申请号 | CN201710581129.X | 申请日 | 2017-07-17 | 公开(公告)号 | CN107400676A | 公开(公告)日 | 2017-11-28 |
| 申请人 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所; | 发明人 | 王隆柏; 陈秋勇; 吴学敏; 王晨燕; 周伦江; 车勇良; 刘玉涛; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于分子 生物 学领域，具体涉及一种表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M+N双基因的原核融合表达载体。通过PEDV的M和N基因 片段 ，利用Blunt-E2表达载体，通过无缝克隆技术，构建出表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体，并提供了其在基因工程蛋白重组表达中的应用。本发明是直接将纯化PEDV的M基因片段连接到Blunt-E2 哺乳动物 原核融合表达载体中，不需要连接至单克隆载体PMD19-T中，然后M+Blunt-E2质粒通过同源重组技术，无缝拼接N基因片段，从而获得M+N双基因融合表达载体，其质粒通过PCR技术进行鉴定，测序准确后再 转染 在细胞中获得成功表达。因此，该原核融合表达载体的制备比较其他原核融合表达技术，具有操作步骤简单、反应时间短等特点。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： |
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| 说明书全文 | 表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体及应用技术领域背景技术[0002] 猪流行性腹泻(PED)由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起猪群呕吐、腹泻、脱水及死亡为特征的消化道病毒性疾病。该病于1971年首次在英国报道，我国在1984年证实该病在的存在。自2010年下半年以来，由于传统的PEDV在基因上发生了缺失、插入及变异，导致该病对猪群的致病性增强，造成了大量的猪群发病死亡，损失惨重。目前世界上大多数养猪国家都有发生变异PEDV的报道，尤其以中国、韩国、日本、泰国和美国等国家发病严重，给养猪业造成了巨大的经济损失，并已成为影响全球养猪业健康发展的重要疫病之一。PEDV的基因组长大约在28000bp左右，主要含有4个结构蛋白，分别为S、M、N及E蛋白。目前，已见通过PEDV的单个基因如N、S及M基因段片，通过原核表达方法表达出单基因蛋白，但未见通过PEDV的M和N基因片段，利用pEASY-Blunt-E2原核表达载体，通过无缝克隆技术，构建出PEDV的M+Blunt-E2+N的双基因原核表达载体。因此，一种表达PEDV的M+N双基因原核表达载体的构建，对今后开展该病或其他病原的诊断技术研究，具有重要意义和应用前景。 发明内容[0003] 本发明的一个目的是提供一种表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体的制备方法，以及由该制备方法制备的载体。 [0004] 本发明的另一个目的是提供所述的原核融合表达载体在基因工程蛋白重组表达中的应用。 [0005] 本发明是这样实现的： [0006] 本发明首先提供了一种表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体的制备方法，包括如下步骤： [0007] (1)根据PEDV的M、N基因及pEASY-Blunt-E2表达载体基因的片段序列，设计与合成特异性引物； [0008] (2)以PEDV的cDNA为模板，通过PCR技术分别扩增出M与N基因片段，并进行回收纯化，将纯化的M基因片段连接到pEASY-Blunt-E2表达载体上，构建出M+Blunt-E2质粒； [0009] (3)以M+Blunt-E2质粒为模板，扩增质粒的基因片段，回收纯化M+Blunt-E2基因片段； [0010] (4)采用pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly kit，通过无缝克隆技术将M+Blunt-E2基因与N基因片段进行重组连接，将连接产物再转化至Trans 1-T1感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性的LB培养基进行培养后，提取M+Blunt-E2+N质粒进行测序鉴定，得到表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体。 [0011] 所述PEDV优选变异猪流行性腹泻病毒。 [0012] 其中步骤(1)所述特异性引物序列如下： [0013] M： [0014] M-F:ATGTCTAACGGTTTTATTCC [0015] M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT [0016] E2+M： [0017] E2+M-F:AAGGGCCAATTCCTCGAGCAC [0018] E2+M-R:GACTAAATGAAGCACTTTCT [0019] N(包含载体部分同源臂)： [0020] N-F:GAGAAAGTGCTTCATTTAGTCGCTTCTGTCAGCTTTCAGGAT [0021] N-R:TGCTCGAGGAATTGGCCCTTATTTCCTGTATCGAAGATCTC。 [0022] 其次，本发明提供了由所述制备方法制备的表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体。 [0023] 另外，本发明还提供了所述的表达PEDV的M+N双基因的原核融合表达载体在基因工程蛋白重组表达中的应用。 [0024] 本发明具有如下优点：本发明是直接将纯化PEDV的M基因片段连接到Blunt-E2原核表达载体中，不需要连接至单克隆载体PMD19-T中，然后M+Blunt-E2质粒通过同源重组技术，无缝拼接N基因片段，从而获得M+N双基因融合表达载体。因此，该原核融合表达载体的制备比较其他原核融合表达技术，具有操作步骤简单、反应时间短等特点。附图说明 [0025] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。 [0026] 图1是M基因片段扩增结果。 [0027] 图2是N基因片段扩增电泳图。 [0028] 图3是M+N片段无缝拼接的菌落PCR鉴定结果。 [0029] 图4是所用感受态细胞为Transetta(DE3)在37℃和16℃诱导表达蛋白结果；图中标号表示：1未诱导，2上清(37℃)，3沉淀(37℃)，4上清(16℃)，5沉淀(16℃)。 [0030] 图5是所用感受态细胞为Transetta(DE3)在37℃诱导表达纯化蛋白；图中标号表示：其中1未诱导对照；2上清；3沉淀；4PBS包涵体穿透液；5PBS洗涤后包涵体；6尿素包涵体穿透液；7尿素洗后的包涵体。 [0031] 图6是蛋白WB电泳图。 具体实施方式[0032] 实施例1 [0033] 实施本发明的技术前需要克服以下技术难题： [0034] 引物设计，要根据所表达基因及Blunt-E2载体的基因序列，结合同源重组原理，设计与和合成引物。 [0035] 生物材料来源：pEASY-Blunt E2表达载体、pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly kit均购自北京全式金生物技术有限公司。 [0036] 一、根据GenBank中公开的的猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M和N基因及Blunt-E2+M质粒序列，设计合成相关扩增引物，序列如下表1。 [0037] 表1引物序列 [0038] [0039] 二、RT反应：以PEDV(该病毒株来源于2013年福建某规模猪场发生PEDV的哺乳小猪的小肠，将小肠用PBS液研磨，吸取上清，采用商品化试剂盒提取RNA)的RNA为模板，进行反转录，合成cDNA,其体系如下表2。 [0040] 表2反转录体系 [0041] [0042] 反应条件：25℃10min；50℃30min；85℃5s [0043] 三、M片段的PCR扩增：以cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增体系如下表3。 [0044] 表3 M片段的PCR扩增体系 [0045] [0046] [0047] 反应条件如下： [0048] [0049] 通过1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得目的片段如图1。 [0050] 四、M基因片段连接至E2载体 [0051] 1、连接体系如下：2.0μl M片段，1.0μl Blunt-E2载体，使用ddH2O补齐体积至5.0μl,25℃连接10min； [0052] 2、连接产物转化至Trans1-T1感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min； [0053] 3、42℃热激30s，立即置于冰上2min； [0054] 4、加入平衡至室温的LB培养基，250rpm，37℃培养1h； [0055] 5、4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100μl，轻弹重悬后涂于Amp+抗性平板上，37℃培养过夜； [0056] 6、分别挑单克隆菌株至10μl无菌水中，涡旋混匀后进行PCR鉴定，反应体系如下表4。 [0057] 表4 PCR反应体系 [0058] [0059] [0060] 反应条件如下： [0061] [0062] 7、使用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测，获得目的片段。取阳性菌落送测序公司测序准确，再将目的质粒作为模板进行PCR扩增，获得线性载体。 [0063] 五、M+E2片段的PCR扩增 [0064] 以M+E2质粒为模板，进行扩增，扩增体系如下表5。 [0065] 表5扩增体系 [0066] [0067] 反应体系如下，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，获得目的条带。 [0068] [0069] 六、N片段的PCR扩增 [0070] 以PEDV的cDNA为模板，进行扩增，扩增体系如下表6。 [0071] 表6扩增体系 [0072] [0073] [0074] 反应体系如下,使用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,获得目的片段[0075] 1320bp，如图2。 [0076] 七、纯化片段 [0077] 分别胶回收纯化PCR扩增的N片段和PCR扩增的M+E2片段，采用纯化试剂盒进行纯化。 [0078] 八、无缝拼接 [0079] 1.以pEASY-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit推荐体系进行重组反应，连接体系如下：2×Assembly Mix 5μl；纯化回收N片段2μl；纯化回收E2+M片段3μl；于PCR仪中50℃连接15min； [0080] 2.连接产物全部转化Trans 1-T1感受态细胞中； [0081] 3.42℃热激30s，冰上静置2min，加入400μl LB培养基中，37℃200rpm摇菌1h； [0082] 4.取摇好的菌液4000rpm离心1min后弃部分上清，取菌株吹悬后涂于含Amp+抗性的LB平板上，在37℃培养箱里培养过夜； [0083] 5.18h后从培养箱中取出平板，随机挑取转化后生长的感受态，提取质粒进行菌落PCR鉴定阳性单克隆，获得目的片段1998bp，如图3； [0084] 6.阳性克隆摇菌后测序，同源性在99％以上，说明拼接重组准确。 [0085] 九、大提质粒 [0086] 取测序正确M+E2+N的活菌经过活化后转接入LB氨苄抗性培养基，放[0087] 入摇床37℃、200rpm培养16h后，收集菌液提取质粒。 [0088] 十、原核蛋白表达 [0089] 1.取构建好的M+E2+N基因转化Transetta(DE3)感受态细胞，冰上放置30分钟，42℃热激45秒，冰上放置2分钟后加无抗性LB培养基37℃摇床复苏30分钟。 [0090] 2.将复苏后的感受态细胞5000rpm离心2分钟，弃去450μl培养基，利用剩余培养基重悬菌体并均匀涂布于卡那抗性的平板上，放置于37℃培养过夜。 [0091] 3.挑取Transetta(DE3)克隆各一个到2ml卡那抗性的LB培养基中，37℃摇床摇过夜。 [0092] 4.按1：100比例将摇过夜菌液接种于2ml卡那抗性LB培养基，接种9管，37℃摇床培养。 [0093] 5.待OD600值达到0.5左右，将Transetta(DE3)菌种分别按照37℃(加0.25μg/ml IPTG)、16℃(0.25μg/ml IPTG)温度摇床培养。 [0094] 6.37℃培养的细菌在加入IPTG 4.5小时后收集菌液于1.5ml EP管中，16℃培养的细菌在加入IPTG后培养过夜(约16小时)收集菌液，5000rpm离心3分钟，弃上清后加入500μl的1*PBS重悬，放置于冰水混合物上，用25％功率超声破碎10分钟(超声3秒间歇3秒)，使菌液透亮。 [0095] 7.超声后的菌液12000rpm离心5分钟，将上清移入新的EP管中，沉淀用500μl的1*PBS重悬，分别取50μl上清和50μl沉淀重悬液，加入10μl蛋白上样缓冲液，煮沸10分钟。 [0096] 8.将蛋白样品跑12％SDS-PAGE(上样量5μl)，之后进行考染，获得表达目的蛋白，片段大小在75KD左右如图4。 [0097] 十一、WB再次验证目的蛋白的表达情况 [0098] 1.蛋白浓度测定，采取后包涵体洗涤方法对提取蛋白进行纯化后，得到片段大小在75KD左右，如图5。测定蛋白浓度为0.55mg/ml。 [0099] 2.使用分离胶浓度为10％的胶进行SDS-PAGE电泳，上样品为12ug,200V恒压电泳45min。 [0100] 3.转膜：使用PVDF膜进行转膜，100V恒压转膜1h。 [0102] 5.一抗孵育：使用0.5％TBST稀释一抗(兔抗高免血清)，稀释比例为1:4000，4℃过夜孵育。 [0103] 6.洗涤：使用TBST洗涤4次，每次10min。 [0104] 7.二抗孵育：使用0.5％TBST稀释二抗(抗兔HRP酶)，稀释比例1:4000，室温晃动孵育2h。 [0105] 8.显色：使用TBST洗4次，每次10min，采用化学发光成像仪进行检测。结果获得目的片段，大小在75KD左右如图6，表达蛋白对PEDV兔抗高免血清具有反应，说明表达的蛋白具有免疫原性。 [0106] 虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。 |
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