发光蛋白marker的制备方法 |
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| 申请号 | CN201710708173.2 | 申请日 | 2017-08-17 | 公开(公告)号 | CN107383208A | 公开(公告)日 | 2017-11-24 |
| 申请人 | 天德悦(北京)生物科技有限责任公司; | 发明人 | 方卫斌; 张海灵; | ||||
| 摘要 | 本 发明 提供了一种预染发光蛋白marker的制备方法，其步骤包括：获取proteinA基因、proteinG基因、MBP基因，小鼠和兔源 抗体 的重链恒定区基因(CH基因)，根据预染发光蛋白marker中各蛋白大小对上述基因进行切割或组合；表达蛋白，纯化，将不同分子量的蛋白按照一定比例混合，得到发光蛋白marker。本发明的发光蛋白marker可以识别不同来源的一抗或二抗，增加了蛋白的结合位点，使光 信号 增强。本发明的发光蛋白marker不需要加入额外的抗体，只需与一抗二抗同时孵育后就可在X胶片上曝光显示；发光蛋白可结合来源于人、大鼠、小鼠、兔等物种的IgG或抗兔和小鼠的二抗；与其他公司的发光marker相比，具有更宽的指示范围，分子量从16kDa到200kDa。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种发光蛋白marker的制备方法，其步骤包括： |
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| 说明书全文 | 发光蛋白marker的制备方法技术领域背景技术[0002] 蛋白质marker作为一种蛋白质分子量大小的标准被广泛应用于蛋白质电泳中。它是由已知的不同分子量大小的蛋白或多肽组成的混合物。蛋白marker分为普通marker，预染marker和发光marker。普通marker条带只有经过考马斯亮蓝染色后才能看到，因此只能用于 [0003] SDS-PAGE电泳中。Western Blot需要一种用来跟踪检测阳性抗原信号和转膜效率的标尺，于是产生了预染蛋白Marker。预染蛋白Marker是将普通蛋白marker中的每个蛋白(或多肽)经过化学修饰，与一种蓝色或其他颜色的染料共价偶联而成。预染蛋白marker的出现给WesternBlot带来了极大便利，研究者在转膜后，可根据膜上蓝色(或其他颜色)蛋白marker的大小来确定目的条带的大概位置，从而对膜进行剪切等处理。但是，预染蛋白Marker无法在胶片上曝光，曝光信号需要根据膜上的预染蛋白Marker来判断，另外预染蛋白Marker经过化学修饰后在SDS-PAGE电泳过程中迁移率发生改变，分子量信息不再准确，往往导致Western Blot结果判断出现较大偏差。 [0004] 发光Western Blot Marker是专门为Western Blot试验设计的分子量标准。在western blot实验中，marker条带可特异性结合一抗或者二抗，使蛋白样品和蛋白marker经化学发光检测后，能够同时在X光片上显示出来。 [0005] 目前市面上已有可用于曝光的发光marker，不同公司采用了不同的技术。CST公司的发光marker是纯化的蛋白与生物素共价结合的混合物，抗生物素HRP抗体在Western blot中用来检测生物素化蛋白梯子。Thermo等大多数公司采用能够结合抗体IgG的蛋白组成发光marker的成分。 [0006] 但是，目前的产品都存在一定的不足，生物素化的蛋白marker需要加入抗生物素-HRP抗体或链酶亲和素-HRP，这使得实验操作变得繁琐。ProteinA和ProteinG对不同物种抗体的结合有选择性，导致对于某些抗体不能在X胶片上显示出来。而且，目前大多可曝光marker的指示范围有限，对于大分子量的蛋白不能起到明确的指示作用。 发明内容[0007] 本发明旨在提供一种无需加入额外试剂的发光蛋白marker的制备方法。 [0008] 本发明的目的通过以下技术方案实现： [0009] 一种发光蛋白marker的制备方法，其步骤包括： [0010] A、获取proteinA基因、proteinG基因、MBP基因，小鼠和兔源抗体的重链恒定区基因(CH基因)，根据NCBI注释确定proteinA、proteinG的IgG Binding domain，根据预染发光蛋白marker中各蛋白大小对proteinA基因、proteinG基因、MBP基因、CH基因进行切割或组合，切割过程中保留蛋白的Binding domain； [0011] B、将切割或组合后的proteinA、proteinG、MBP以及CH基因连接在表达载体上分别进行表达纯化，得到纯化的蛋白； [0012] C、将不同分子量的蛋白按照一定比例混合，得到发光蛋白marker。 [0013] 优选的，所述表达载体为pET21a或pET28a。 [0014] 优选的，所述宿主细胞为E.coli。 [0015] 优选的，所述蛋白marker分子量从16kDa到200kDa。 [0016] 本发明的发光蛋白marker是由能够结合抗体IgG的proteinA、proteinG或ProteinL，以及能被二抗结合的兔源或鼠源抗体Fc区基因融合表达而成，从而使marker中的蛋白可以识别多种不同来源的一抗或二抗，增加了蛋白的结合位点，使光信号增强。本发明的发光蛋白marker不需要加入额外的抗体，如抗生物素抗体-HRP或链酶亲和素-HRP，只需与一抗二抗同时孵育后就可在X胶片上曝光显示；发光蛋白可结合来源于人、大鼠、小鼠、兔等物种的IgG或抗兔和小鼠的二抗；与其他公司的发光marker相比，具有更宽的指示范围，分子量从16kDa到200kDa。附图说明 [0017] 图1为发光蛋白marker曝光后的电泳图。 [0018] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不应视为限制本发明的范围。 具体实施方式[0019] 实施例一 [0020] 1、合成金黄色葡萄球菌免疫球蛋白G结合蛋白A(proteinA)和链球菌免疫球蛋白G结合蛋白G(proteinG)的全基因序列；购买质粒pFUSEss-CHIg-rG*03(InvivoGen,Catalog#pfusess-rchg)和pFUSEss-CHIg-mG2b(InvivoGen,Catalog#pfusess-mchg2b)作为兔源抗体重链恒定区基因(rFc)和小鼠源抗体的重链恒定区基因(mFc)PCR模板；自构建的pET28a-his-MBP载体为MBP序列PCR模板。 [0021] 2、pET28a-his-MBP载体构建 [0022] 根据pMal-C2T(GenBank:JF795283.1)中的MBP核酸序列设计his+MBP+多克隆序列(SEQ ID NO.9)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并构建成pET28a-his-MBP多克隆载体。 [0023] 3、根据发光marker中各条带分子量大小设计不同的基因片段组合，具体组合见表1： [0024] 表1发光蛋白marker条带组成 [0025] [0026] 注：pA:proteinA [0027] pG:proteinG [0028] 根据上表中各基因片段设计引物，如表2： [0029] 表2引物设计表 [0030] [0031] [0032] 4、以表1中所述基因为模板，用表2中的引物通过PCR扩增相应的核酸片段，然后通过琼脂糖凝胶电泳分离回收特定的目的片段；将各片段按照表1中的组合进行酶切和连接；回收连接产物，与相应的载体酶连后转入大肠杆菌DH5α，得到各表达质粒。 [0033] 5、将测序正确的表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，进行蛋白的诱导表达。具体的实验操作可参考《分子克隆手册》。 [0034] 6、不同分子量的蛋白的分离纯化 [0035] 载体为pET21a的质粒表达的蛋白用镍离子亲和层析纯化；载体为pET28a-his-MBP的质粒表达的蛋白用麦芽糖亲和层析纯化。具体各种亲和层析柱纯化的操作方法和流程可以参照蛋白纯化实验手册执行。 [0036] 7、可发光蛋白marker的获得 |
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