一种作物壮苗剂及其用途 |
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| 申请号 | CN201710585850.6 | 申请日 | 2017-07-18 | 公开(公告)号 | CN107372509A | 公开(公告)日 | 2017-11-24 |
| 申请人 | 黑龙江省科学院微生物研究所; | 发明人 | 韩增华; 张丕奇; 戴肖东; 高娃; 孔祥辉; 马庆芳; 刘佳宁; 马银鹏; 陈贺; 王晗; 丛燕; | ||||
| 摘要 | 本 发明 一种作物壮苗剂及其用途，其包含有效调节作物生长的含多糖活性成分，所述含多糖活性成分包含来源于桦褐孔菌(Inonotus obliguus(Fr.)Pilat)的含多糖活性成分；其能改善作物的以下性状中的至少一种：促进植株生长、使得 苗床 期作物苗绿苗、壮苗、抗病。本发明的作物壮苗剂中活性成分的多糖含量为0.1-100mg/mL。本发明来源于桦褐孔菌的含多糖活性成分包含桦褐孔菌提取液或 发酵 液。本发明的作物壮苗剂还可包含另外的食药用菌的活性成分。食药用菌选自灵芝、香菇、猴头、虫草、茯苓、猪苓、桑黄、木 耳 、 云 芝中的一种或多种。本发明应用于农业技术领域。 | ||||||
| 权利要求 | 1.作物壮苗剂，其特征在于该作物壮苗剂包含有效调节作物生长的、来源于桦褐孔菌 |
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| 说明书全文 | 一种作物壮苗剂及其用途技术领域[0001] 本发明属于农业技术领域，涉及作物壮苗剂，具体涉及一种作物壮苗剂及其用途。 背景技术[0002] 桦褐孔菌(Inonotus obliguus(Fr.)Pilat)是珍稀的药用真菌。桦褐孔菌又名白桦茸、桦树泪，主要分布于芬兰、波兰、俄罗斯、日本和我国，我国主要分布于黑龙江和吉林一带。桦褐孔菌在野生环境下很少形成子实体，子实体生长缓慢，只有在活的桦树上生长10 ～15年才具有药用价值，并且每两万棵桦树上只有一棵着生桦褐孔菌。因此，桦褐孔菌野生 资源极其珍稀。随着近年来的药用开发，桦褐孔菌的野生资源遭受着掠夺式开发，已面临枯 竭。野生桦褐孔菌价格昂贵，是灵芝的7-8倍，且子实体野生资源有限，日益枯竭。桦褐孔菌含有丰富的多糖、桦褐孔菌素、萜类、甾醇、生物碱、黑色素等活性物质，具有抗癌、降糖、抗衰老、抗病毒、防治艾滋病等作用。民间将桦褐孔菌广泛用于防治消化道疾病、心血管疾病、糖尿病和病毒性疾病。随着人类对菌类药物的重新认识，桦褐孔菌在全球范围内将会有广 阔的开发前景。 [0003] 近年来国内外学者对桦褐孔菌进行了液体发酵方面的研究。现阶段，有关桦褐孔菌的深层发酵配方和发酵方法的研究报道较多，主要是在桦褐孔菌菌丝体的生长、培养条 件以及相关代谢产物(多糖、多酚)等方面进行研究。2004年江玉姬等对桦褐孔菌菌丝体生 长的营养需求和培养条件进行初步研究(江玉姬等，桦褐孔菌的培养特性研究，福建农业学 报，19(2)：92～95，2004)。2006年王振河等利用二次回归预测并试验了不同碳/氮源对菌丝发酵生物量及条件进行研究(王振河等，桦褐孔菌液体深层培养研究，菌物学报，25(3)：461～467，2006)。2008年雷萍等采用L9(34)的正交试验，得到桦褐孔菌液体培养的最优方案 (雷萍等，桦褐孔菌深层发酵培养条件的优化，西北大学学报(自然科学版)，38(6)：967～ 970，2008)。这些报道对桦褐孔菌的发酵配方、发酵技术和代谢产物等开展工作，未涉及针 对胞外β-葡聚糖代谢产物为指标的液体发酵技术，更没有将发酵产物作为壮苗剂用于调节 作物生长、提高经济价值的研究报道。 发明内容[0004] 一方面，本发明提供作物壮苗剂，其包含有效调节作物生长的、来源于桦褐孔菌(Inonotus obliguus(Fr.)Pilat)的含多糖活性成分；在一个实施方案中，其中所述活性成 分能改善作物的以下性状中的至少一种：促进植株生长、使得苗床期作物苗绿苗、壮苗、抗 病。在一个实施方案中，其中桦褐孔菌的活性成分含有桦褐孔菌多糖。 [0005] 在一个实施方案中，本发明的作物壮苗剂是指影响作物(如水稻)生长和分化的制剂，其在使用后可以促进植株生长、使得苗床期作物苗整齐、粗壮、绿苗、壮苗、抗病、须根系发达、增加苗重、增加茎基宽、插秧期提前等。 [0006] 本发明所述的壮苗包括但不限于提高作物苗的株高、植株鲜重、干重以及叶绿素含量(SPAD值，利用叶绿素计(例如，SPAD-502，由KONICA MINOLTA Holdings，Inc.制造)测 得的叶绿素含量)、改善植株的生长性状。 [0007] 在一个实施方案中，本发明的所述作物是单子叶植物，如禾本科作物，如小米、玉米或稻，如水稻；例如可以选自饲料作物、油料作物、谷类作物、水果作物、观赏植物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草料作物、糖料作物、饮料作物、块茎作物、块根作物和森林作物。在一个实施方案中，本发明的作物优选禾本科作物。在另一个实施方案中，本发 明的作物优选为水稻。在又一个实施方案中，本发明的作物优选为玉米。在一些实施方案 中，本发明的作物为转基因作物。在一些实施方案中，本发明的作物为非转基因作物。在一 些实施方案中，转基因作物是指基因组中稳定地整合有编码某种蛋白的某种异源基因的作 物，非转基因作物是指不含异源基因的作物。 [0008] 在一个实施方案中，作物壮苗剂是液体或者固体，例如浓缩液或者干燥的固体如粉末，或者稀释液。在一个实施方案中，作物壮苗剂是用于直接施用给作物的液体或固体。 [0009] 在一个实施方案中，本发明的作物壮苗剂包含(或者是)来源于桦褐孔菌(Inonotus obliguus(Fr.)Pilat)的有效调节作物生长的活性成分。所述来源于桦褐孔菌 (Inonotus obliguus(Fr.)Pilat)的有效调节作物生长的活性成分优选含有桦褐孔菌多 糖。在一个实施方案中，在作物壮苗剂中，桦褐孔菌多糖含量可以为(以作物壮苗剂为基础 计算)0.1-100mg/mL、1-100mg/mL、1-30mg/mL、2-20mg/mL，优选桦褐孔菌多糖含量为0.1、 0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、 55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/mL或者介于它们任何两个数值之间的多糖含量，更优选桦褐孔菌多糖含量为10mg/mL。 [0010] 在一个实施方案中，桦褐孔菌多糖含量是作物壮苗剂在稀释后或者配制成最终施用液时浓度为(以作物壮苗剂为基础计算)0.1-100mg/mL、1-100mg/mL、1-30mg/mL、2-20mg/ mL，优选桦褐孔菌多糖含量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/mL或者介于它们任何两个数值之间的多糖含量，更优选桦褐孔菌多糖含量为10mg/mL。 [0011] 多糖含量可采用本领域技术人员已知的方法测定。优选地，多糖含量测定采用苯酚-硫酸法。苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛 衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。再以比色法测定。 [0012] 在一个实施方案中，植物(如作物)生长调节剂含有桦褐孔菌多糖作为活性成分。在一个实施方案中，优选所述多糖是水溶性多糖，如β-葡聚糖。在一个实施方案中多糖是采用苯酚-硫酸法能测定的多糖。 [0013] 现已明确发现，桦褐孔菌液体发酵的水溶性多糖类以β-葡聚糖(1,3-β-葡聚糖、1,6-β-葡聚糖)为主。 [0014] 在一个实施方案中，来源于桦褐孔菌的含多糖活性成分包含或者是桦褐孔菌提取物，例如桦褐孔菌的水提取物或其浓缩物或干燥产物或其他加工产物。例如桦褐孔菌的水 提取物是用水提取桦褐孔菌菌体得到的产物，可通过例如在加热的条件(如70-100摄氏度， 如80-100、90-100或100摄氏度)下用水提取桦褐孔菌菌体而获得。在一个具体例子中，桦褐 孔菌提取物为提取液。 [0015] 桦褐孔菌提取物可采用本领域技术人员已知的提取方法获得。优选地，将桦褐孔菌烘干至恒重，然后将菌体粉碎，过筛，得桦褐孔菌菌粉，然后将桦褐孔菌菌粉加水在加热 的条件下如70-100(如80-100、90-100或100)摄氏度处理1-5h，提取1-3次，合并提取液；还 可以包括测定多糖含量，稀释至所需多糖含量，获得桦褐孔菌提取液。任选地，还可以包括 对桦褐孔菌提取液进一步加工，如浓缩或者干燥等步骤。 [0016] 在又一个实施方案中，来源于桦褐孔菌的含多糖活性成分包含或是桦褐孔菌发酵液或其浓缩物、干燥产物或提取物或其他加工产物，在一个具体例子中，是桦褐孔菌深层发 酵液；所述发酵液可以含有或不含桦褐孔菌。 [0017] 现已明确发现，桦褐孔菌液体发酵的水溶性多糖类以1,3-β-葡聚糖、1,6-β-葡聚糖为主。 [0018] 桦褐孔菌发酵液可采用本领域技术人员已知的发酵方法获得。优选地，采用深层发酵技术获得桦褐孔菌发酵液。优选地，将桦褐孔菌用cPDA培养基(综合马铃薯葡萄糖琼脂 培养基)培养获得母种，将母种用活化一级种培养基培养获得活化一级种，将活化一级种用 二级种子培养基培养获得二级种子，将二级种子用深层发酵培养基培养至所需多糖含量， 过滤菌丝，将过滤液灭活得到桦褐孔菌发酵液。其中，也可以不进行过滤菌丝的步骤。任选 地，还可以包括将发酵液进一步加工，如浓缩或者干燥等步骤。 [0019] cPDA培养基(综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基)、活化一级种培养基、二级种子培养基、深层发酵培养基的配方为本领域常见配方。在一个实施方案中，将桦褐孔菌用cPDA培养 基(综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基)转接一到三次，每次22-27℃培养8-12天，获得母种块； 在一个具体例子中，将桦褐孔菌用cPDA培养基(综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基)转接两次， 每次25℃培养10天，获得母种块。在一个实施方案中，将配制好的活化一级种培养基装500- 1000mL三角瓶，每瓶装湿料350-650g，高压滤菌薄膜封口，115～121℃灭菌1-2h，冷却，无菌操作接入0.5cm×0.5cm～1.5cm×1.5cm母种块1-3块，22-27℃静止培养至满瓶，为活化一 级种；在一个具体例子中，将配制好的活化一级种培养基装500mL三角瓶，每瓶装湿料450g，高压滤菌薄膜封口，121℃灭菌1.5h，冷却，无菌操作接入1cm×1cm母种块2块，25℃静止培 养至满瓶，为活化一级种。在一个实施方案中，500-1500mL三角瓶中装入二级种子培养基 500-1000mL，高压滤菌薄膜封口，115～121℃灭菌30-60min，冷却，无菌操作接入活化一级 种量3-10％，发酵温度25-30℃，摇床转速80-160r/min，前期静止培养时间1-2d，后期摇床 发酵时间3-5d，为二级种子；在一个具体例子中，1000mL三角瓶中装入二级种子培养基 700mL，高压滤菌薄膜封口，115℃灭菌40min，冷却，无菌操作接入活化一级种量3％，发酵温度27℃，摇床转速130r/min，前期静止培养时间1d，后期摇床发酵时间4d，为二级种子。 [0020] 在一个实施方案中，cPDA培养基(综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基)(/L)：马铃薯100.0-300.0g(浸出汁)，葡萄糖10.0-30.0g，蛋白胨0.1-1.0g，KH2PO4 1.0-5.0g， MgSO4.7H2O 0.5-2.5g，维生素B1 0-15mg，琼脂10-30g，pH自然；在一个具体的例子中，cPDA培养基(/L)：马铃薯200.0g(浸出汁)，葡萄糖20.0g，蛋白胨0.5g，KH2PO4 3.0g，MgSO4.7H2O 1.5g，维生素B110mg，琼脂14g，pH自然。 [0021] 在一个实施方案中，活化一级种培养基：细杂木屑(过10-30目筛，筛孔尺寸：2.000mm-0.600mm)70-90％，麦麸15-25％，石灰0.5-1.5％，石膏0.1-1％，白糖0.5-1.5％，含水量40-70％；在一个具体的例子中，活化一级种培养基：细杂木屑(过20目筛，筛孔尺寸： 0.850mm)87.5％，麦麸20％，石灰1％，石膏0.5％，白糖1％，含水量60％。 [0022] 在一个实施方案中，二级种子培养基：以葡萄糖，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1为原料，其重量百分比分别为碳源0.1～10.0％，氮源0.01～5.0％，磷酸二氢钾0.01～1.0％，硫酸镁0.01～1.0％，维生素B10～0.05‰，培养基初始pH 3-6.0；在一个具体的例子中，二级种子培养基：以葡萄糖，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1为原料，其重量百分比分别为碳源2.0％，氮源0.4％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，维生素B1 0.01‰，培养基初始pH4.5。 [0023] 在一个实施方案中，深层发酵培养基：以麦芽糖，葡萄糖，豆粉(过100-140目筛，筛孔尺寸：0.150mm-0.106mm)，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1为原料，其重量百分比分别为麦芽糖0.5～5.0％、葡萄糖0.1～3.0％，豆粉0.01～2.0％，酵母膏0.01～2.0％，磷酸二氢钾0.01～1.0％，硫酸镁0.01～1.0％，维生素B10～0.05‰，培养基初始pH2～7.0；在一个具体的例子中，深层发酵培养基：以麦芽糖，葡萄糖，豆粉(过120目筛，筛孔尺寸： 0.125mm)，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1为原料，其重量百分比分别为麦芽糖 2.0％、葡萄糖1.0％，豆粉0.2％，酵母膏0.6％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，维生素B1 0.01‰，培养基初始pH4.5。在一个实施方案中，在100～5000L发酵罐中使用深层发酵培养 基，采用装样量2/5～4/5v/v，接种量5～15％(v/v)，发酵温度23～34℃，罐压0.02～ 0.06Mpa，通气量1:0.2～1:0.5v/v.m，发酵时间85～160h，发酵液以胞外多糖含量达0.1- 100mg/mL以上时终止发酵，170目-230目(孔径尺寸：0.090mm-0.063mm)滤膜过滤菌丝，清液 70-100、80-100、90-100、100℃灭活10～20min得桦褐孔菌深层发酵液；在一个具体例子中，在2000L发酵罐中使用深层发酵培养基，采用装样量4/5v/v，接种量0.5％(v/v)，发酵温度 27℃，罐压0.04Mpa，通气量1:0.3v/v.m，发酵时间144h，发酵液以胞外多糖含量达10mg/mL 以上时终止发酵，200目(孔径尺寸：0.075mm)滤膜过滤菌丝，清液100℃灭活15min得桦褐孔 菌深层发酵液。 [0024] 本发明还提供作物壮苗剂，其包含桦褐孔菌提取物，如水提取物或其浓缩物、干燥产物或其他加工产物；在一个实施方案中，作物壮苗剂包含桦褐孔菌发酵液或其浓缩物、干 燥产物、提取物或其他加工产物。作物壮苗剂优选含有桦褐孔菌多糖。 [0025] 在另一个实施方案中，作物壮苗剂还包含另外的食药用菌的活性成分如提取物(如提取液)或发酵液(发酵液可含有或不含食药用菌)。食药用菌选自灵芝、香菇、猴头、虫 草、茯苓、猪苓、桑黄、木耳、云芝等食药用菌中的一种或多种。食药用菌的活性成分如提取物(如提取液)或发酵液(发酵液可含有或不含食药用菌)可采用本领域技术人员已知的方 法获得。 [0026] 另一方面，本发明提供制备作物壮苗剂的方法，包括采用本领域技术人员已知的提取方法获得桦褐孔菌提取物。在一个实施方案中，所述制备方法包括制备桦褐孔菌提取 物，例如桦褐孔菌的水提取物(用水提取桦褐孔菌菌体得到的产物，可通过例如在加热的条 件(如70-100(如80-100、90-100或100)摄氏度)下用水提取桦褐孔菌菌体而获得)；在一个 具体例子中，桦褐孔菌提取物为提取液。 [0027] 在一个实施方案中，本发明提供制备作物壮苗剂的方法，包括采用本领域技术人员已知的发酵方法获得桦褐孔菌发酵液。 [0028] 在一个实施方案中，本发明提供农业组合物，其包含本发明的作物壮苗剂，另外非必须地还可以含有其他农业上有用的成分。 [0029] 另一方面，本发明提供作物壮苗剂用于促进苗床期作物苗绿苗的用途。 [0030] 在一个实施方案中，本发明提供作物壮苗剂用于促进作物生长的用途。 [0031] 在一个实施方案中，本发明提供作物壮苗剂用于促进苗床期作物苗壮苗的用途。 [0032] 在一个实施方案中，本发明提供作物壮苗剂用于促进苗床期作物苗抗病的用途。 [0033] 另一方面，本发明提供促进苗床期作物苗绿苗的方法，包括向作物施用所述作物壮苗剂。 [0034] 在一个实施方案中，本发明提供促进作物生长的方法，包括向作物施用所述作物壮苗剂。 [0035] 在一个实施方案中，本发明提供促进苗床期作物苗壮苗的方法，包括向作物施用所述作物壮苗剂。 [0036] 在一个实施方案中，本发明提供促进苗床期作物苗抗病的方法，包括向作物施用所述作物壮苗剂。 [0037] 在一个实施方案中，施用是浸种。本领域技术人员知晓浸种的具体步骤。在一个实施方案中，浸种是按照每千克种子的具体用量通过浸泡的方式用本发明的作物壮苗剂浸泡 种子。在具体的例子中，根据用量，可将本发明的作物壮苗剂稀释后进行浸种。在一个实施 方案中，浸种的温度为18-26、22-28、24-32摄氏度，浸种的时间为24h-72h。在一个实施方案中，浸种所用的作物壮苗剂中桦褐孔菌多糖浓度为0.1-100mg/mL、1-100mg/mL、1-30mg/mL、 2-20mg/mL，优选桦褐孔菌多糖含量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100mg/mL或者介于它们任何两个数值之间的多糖含量，更优选桦褐孔菌多糖含量为10mg/mL。在一个实施 方案中，按1：50以水稀释作物壮苗剂后与其他浸种剂同时使用，常规浸种管理。 [0038] 在又一个实施方案中，施用是喷施。本领域技术人员知晓喷施的具体步骤。在一个实施方案中，喷施是按照每个苗床的具体施用量通过喷灌设备将本发明的作物壮苗剂喷洒 至作物表面。在具体的例子中，根据施用量，可将本发明的作物壮苗剂稀释后进行喷施。 [0039] 在一个实施方案中，施用是用所述作物壮苗剂对作物的苗床进行喷施。在一个实施方案中，喷施所用的作物壮苗剂中桦褐孔菌多糖浓度为0.1-100mg/mL、1-100mg/mL、1- 30mg/mL、2-20mg/mL，优选桦褐孔菌多糖含量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100mg/mL或者介于它们任何两个数值之间的多糖含量，更优选桦褐孔菌多糖含量为10mg/ mL。在一个具体例子中，按1：10-1000以水稀释作物壮苗剂，10～30g稀释液喷洒1m2苗床的 比例喷洒，在1.5叶、2.5叶、3叶期、4叶期施用。在一个实施方案中，上述施用的作物壮苗剂是多糖含量为1-50mg/ml(如1-30或5-20或10mg/mL)的作物壮苗剂。在另一个实施方案中， 作物壮苗剂可以是固体或者浓缩液体，这时可以将其稀释或配制为多糖含量为1-50mg/mL (如1-30或5-20或10mg/mL)的(液体)作物壮苗剂施用，或者也可以直接施用，直接施用时作 物壮苗剂的施用量参照上述施用量来计算，以保证最终施用的多糖量与上述施用方法相 同。 [0040] 在一个实施方案中，作物壮苗剂的施用量可以是，使得每亩施用的多糖的量为0.05g/亩到300g/亩，例如0.1-200g/亩，0.2-100g/亩，0.5-50g/亩，如0.1、0.2、0.5、1、2、5、 10、20、30、50、80、100、120、150、200、300g/亩或者其中任何两个数值之间的数值范围。对于喷施，作物壮苗剂的施用量可以是，例如，使得每亩施用的多糖的量为，0.05g/亩到20g/亩，例如0.1-10g/亩，0.2-5g/亩，0.5-2g/亩，如0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、3、4、5、8、10、20、30、 50g/亩或者其中任何两个数值之间的数值范围。对于冲施，作物壮苗剂的施用量可以是，例 如，使得每亩施用的多糖的量为，使得每亩施用的多糖的量为1g/亩到300g/亩，例如2- 200g/亩，5-200g/亩，10-100g/亩，20-80g/亩，30-50g/亩，如1、2、5、10、20、30、50、80、100、 120、150、200、300g/亩或者其中任何两个数值之间的数值范围。 [0041] 我国微生物肥料主要以活菌制剂为主，存在有效活菌含量低、杂菌率偏高、有效期短等共性问题，微生物发酵代谢产物为活性物质的生物生长调节剂可以弥补这些不足，桦 褐孔菌液体发酵液是以代谢产物β-葡聚糖为主要活性物质的新型生长调节剂，可以有效解 决这些问题。微生物肥料的成效已得到大家的认可。从战略高度来说，新型稳定微生物制剂 的研发是可持续农业和生态农业的需求，也是我国当前无公害食物和绿色食物生产实际需 求，可削减化肥和农药用量、降低环境污染。水稻是我国主要的粮食作物之一，全国种植面 积达4.3亿亩，用桦褐孔菌肥替代20％化学药剂，其市场占有率也相当可观，由此可见，该项目具有较强的市场竞争力，发展潜力巨大，项目实施后可产生巨大的经济效益。 [0042] 因此，在一个方面，本发明公开了一种利用桦褐孔菌液体发酵菌液生产高含量β-葡聚糖功能性稻米的生产方法，特别是涉及一种桦褐孔菌液体发酵菌液和以发酵液活性物 质用作水稻生长调节剂，通过水稻浸种，苗床喷施，生产β-葡聚糖功能性稻米。发酵菌液主要富含β-葡聚糖、三萜、植物促生长因子，使用后可使苗床期水稻秧苗绿苗、壮秧、抗病，尤为重要的是能改善稻米口感、增香，生产的大米中的“β-葡聚糖”含量高出普通大米3倍以 上。 [0043] 在又一个方面，本发明是以建立高β-葡聚糖代谢产物为目的进行的液体发酵，通过复合碳/氮源合理复方复配，使用最低的营养成分获得高收率活性物质的一种技术，同时 将富含β-葡聚糖的桦褐孔菌发酵液用在水稻浸种、育秧和种植的特定阶段，激活植物免疫 系统，从而达到抗病壮秧、促进植株生长、提高产量和稻米中β-葡聚糖含量，改善稻米口感，使稻米增香，生产具有保健功能的稻米，目前国内尚未见相关报道。因此，研发桦褐孔菌水 稻促生长调节剂，将其用于绿色(有机)和特色水稻种植上具有巨大的经济价值和应用前 景。该项研究将有助于开展药用真菌的大力开发利用，提高人们生活质量，改善人类身体健 康，对将来开展保健食品和抗癌药剂的开发具有重大现实意义。 [0044] 在另一个方面，本发明的桦褐孔菌发酵液在水稻浸种、育秧，将微生物发酵代谢活性物质用作水稻生长调节剂，生产功能稻米，该技术已在保密条件下推广田间试验3年，获 得了苗床壮秧绿苗、提高水稻产量和稻米中β-葡聚糖含量的效果，技术稳定可靠，操作简 单，也是符合无公害和绿色食物生产需求，更是削减化肥和农药用量、降低环境污染的必然 选择。 [0045] 我国黑龙江省水稻种植面积5000万亩以上，气温冷凉和生长期病害致使年减产3％以上，化学农药使用过当可造成人畜伤害，使稻米质量下降。本发明的高活性发酵液应 用可缩短水稻发芽期、壮秧抗病，并能显著提高大米中的“β-葡聚糖”含量，功能大米具有巨大的消费人群，具有巨大的经济价值和发展前景。国内、外首次以发酵液为主液作为水稻生 长调节剂，用于水稻田间试验，取得了良好的效果，在五常、方正等水稻种植户浸种使用后 苗床抗病能力明显增强(未使用水稻稻苗枯萎)，促发芽试验表明，浸种后发芽期至少提前2 天，苗床期秧苗整齐，粗壮，须根系发达较空白增加至少5％，苗重增重8-10％，茎基宽增加量1.4％以上。苗期3叶、4叶使用可提前插秧3-5天，绿苗作用显著。这无疑将药用菌功效成 分扩大化的转移到百姓日常餐桌上，通过三餐温饱实现强身健体，生产的稻米功能显著经 济效益可提升1倍以上，这项应用社会效益显著。在黑龙江省五常、方正、鸡西等水稻主产区推广应用1000公顷，新增总利润4000万元以上。 [0047] 本发明还提供一种桦褐孔菌发酵液水稻苗床壮秧剂的制备方法，包括： [0048] 一、一级菌种的制备： [0049] 将桦褐孔菌接种于cPDA培养基中，25℃培养9～11d活化，得到活化的母种；将木屑-麦麸培养基装入三角瓶中，封口灭菌，然后接种活化的母种，25℃静止培养至满瓶，得到一级菌种； [0050] 二、二级菌种的制备： [0052] 三、在发酵罐中使用深层发酵培养基，装样量为2/5～4/5v/v，接种二级菌种，接种量3～15％(v/v)，发酵温度23～34℃，罐压0.02～0.06MPa，通气量1:0.2～1:0.5v/v.m，发 酵液的胞外多糖含量大于10mg/mL时终止发酵，然后过滤菌丝，清液100℃灭活10～20min， 稀释胞外多糖含量至10mg/mL，得桦褐孔菌发酵液水稻苗床壮秧剂。 [0053] 本发明是以建立高含量多糖代谢产物为目的液体发酵，通过碳/氮源合理复配，使用低营养成分获得高收率目的产物的一种技术，同时将该发酵液在水稻浸种、育秧苗床阶 段使用，使用后达到促发芽、苗绿、秧壮、根系发达，还具有防治立枯病、稻瘟病、疫霉病等水稻病害发生，最终达到增产、大米提质效果。桦褐孔菌发酵液水稻苗床壮秧剂在水稻浸种、 育秧使用田间试验已在保密条件下开展3年，得到了发芽率提高7％以上，发芽时间至少提 前2天，苗床绿苗效果显著，叶绿素含量较未使用提高10-15％，秧苗矮壮，根系发达，须根平均增加2-3根，与对照比没有发生立枯病、稻瘟病、疫霉病等水稻病害的效果。此外该桦褐孔菌发酵液水稻苗床壮秧剂不与其他拌种剂、喷施药剂发生减效反应，使用方法简单，与其他 药剂同时应用省时省力，该制剂是生物制剂，对人、畜无毒副作用，没残留不污染环境，符合绿色农业的要求。 [0054] 本发明涉及的微生物保藏信息：本发明的一种桦褐孔菌菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2014年12月25日，保藏编号为 CGMCCNo.10297。但是，本发明桦褐孔菌菌株并不限于该保藏菌株，而是可以采用任何桦褐 孔菌菌株。 附图说明 [0055] 本发明采用以下附图来举例说明本发明的作物壮苗剂的有益效果，其中菌液1或1号菌液为下文实施例1中的生物菌液1号，菌液2或2号菌液为下文实施例2中的生物菌液2 号，空白为对照组作物。应当理解的是，这些仅用于说明本发明的具体实施方案，并不意图 限制本发明的范围。 [0056] 图1为使用本发明的作物壮苗剂进行浸种后发芽的照片，其中浓度1为1：1000稀释的菌液2、浓度2为1：500稀释的菌液2、浓度3为1：100稀释的菌液2、浓度4为1：50稀释的菌液 2、浓度5为1：25稀释的菌液2。 [0057] 图2为使用本发明的作物壮苗剂进行浸种后苗床抗病的照片。 [0058] 图3为使用本发明的作物壮苗剂进行喷施后苗的对比照片。 具体实施方式[0059] 为了促进对本发明的理解，以下将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述本发明。然而，应当理解的是，这些具体实施方式不意图限制本发明的范围。所描述的实 施方式中的任何改变和进一步的修改，以及本发明的任何进一步应用，均为本领域技术人 员通常会想到的。 [0060] 实施例1 [0061] 桦褐孔菌子实体提取液的制备 [0062] 野生桦褐孔菌购自吉林省长白山地区，将野生桦褐孔菌于60℃烘干至恒重，然后将菌体粉碎，过筛120目(筛孔尺寸：0.125mm)，得桦褐孔菌菌粉。精确称取桦褐孔菌菌粉 500g，按1:40体积料水比加入蒸馏水。于100℃下煮2.5h，提取2次，合并提取液，测定多糖含量(多糖含量测定采用苯酚-硫酸法)，加水稀释至多糖含量10mg/mL，为生物菌液1号。 [0063] 实施例2 [0064] 桦褐孔菌深层发酵液的生产 [0065] 菌种制备：将保藏编号为CGMCC No.10297的桦褐孔菌菌株(本发明还可以使用其他桦褐孔菌菌株)用cPDA培养基(综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基)转接两次，每次25℃培养 10天，获得母种块。cPDA培养基(/L)：马铃薯200.0g(浸出汁)，葡萄糖20.0g，蛋白胨0.5g，KH2PO4 3.0g，MgSO4.7H2O 1.5g，VB110mg，琼脂14g，pH自然。活化一级种培养基：细杂木屑(过20目筛，筛孔尺寸：0.850mm)87.5％，麦麸20％，石灰1％，石膏0.5％，白糖1％，含水量 60％。将配制好的活化一级种培养基装500mL三角瓶，每瓶装湿料450g，高压滤菌薄膜封口， 121℃灭菌1.5h，冷却，无菌操作接入1cm×1cm母种块2块，25℃静止培养至满瓶，为活化一 级种。二级种子培养基：以葡萄糖，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1为原料，其重量百分比分别为碳源2.0％，氮源0.4％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，维生素B1 0.01‰，培养基初始pH4.5。1000mL三角瓶中装入二级种子培养基700mL，高压滤菌薄膜封口，115℃灭 菌40min，冷却，无菌操作接入活化一级种量3％，发酵温度27℃，摇床转速130r/min，前期静止培养时间1d，后期摇床发酵时间4d，为二级种子。 [0066] 深层发酵培养基：以麦芽糖，葡萄糖，豆粉(过120目筛，筛孔尺寸：0.125mm)，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1为原料，其重量百分比分别为麦芽糖2.0％、葡萄糖1.0％，豆粉0.2％，酵母膏0.6％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，维生素B1 0.01‰，培养基初始pH4.5。在2000L发酵罐中使用深层发酵培养基，采用装样量4/5v/v，接种量0.5％(v/ v)，发酵温度27℃，罐压0.04MPa，通气量1:0.3v/v.m，发酵时间144h，发酵液以胞外多糖含量达10mg/mL以上时终止发酵，200目(孔径尺寸：0.075mm)滤膜过滤菌丝，清液100℃灭活 15min得桦褐孔菌深层发酵液。 [0067] 上述处理后的桦褐孔菌深层发酵液加水稀释至工作液中多糖含量为10mg/mL，为生物菌液2号。 [0068] 实施例3 [0069] 浸种对种子发芽的影响 [0070] 按1：25、1：50、1：100、1：500、1：1000以水稀释生物菌液1号和生物菌液2号后与其他浸种剂同时使用，常规浸种管理。以水作为空白对照。生物菌液2号的代表性结果如图1所示。 [0071] 结果显示，用水以1：25、1：50、1：100、1：500稀释本发明的作物壮苗剂均能够促进发芽，尤其是用水以1：25、1：50稀释本发明的作物壮苗剂促进发芽的能力更为显著。 [0072] 本实施例还发现采用本发明的作物壮苗剂浸种后种子的发芽期提前2天。 [0073] 实施例4 [0074] 浸种后苗床抗病的效果 [0075] 按1：50以水稀释生物菌液1号和生物菌液2号后与其他常规浸种剂同时使用，常规浸种管理。以水作为空白对照。观察苗床抗病的效果。生物菌液2号的代表性结果如图2所 示。 [0076] 结果显示，以本发明的作物壮苗剂浸种处理后，苗床期秧苗整齐，粗壮，抗病能力优异，而未使用水稻稻苗枯萎。 [0077] 对苗进行其他测量，结果表明，本发明的作物壮苗剂处理后苗床期秧苗须根系发达较空白增加5％，苗重增重10％，茎基宽增加为1.4％。 [0078] 实施例5 [0079] 喷施对苗床期秧苗的影响 [0080] 按1：100稀释生物菌液1号和生物菌液2号，10g稀释液喷洒1m2苗床的比例喷洒，在1.5叶、2.5叶、3叶期、4叶期施用。生物菌液2号的代表性结果如图3所示。 [0081] 结果显示，施用后秧苗整齐，粗壮，须根系发达，在苗期3叶、4叶使用可提前插秧4天，绿苗作用显著。 [0082] 实施例6 [0083] β-葡聚糖含量测定 [0084] 按谷物及其制品中β-葡聚糖含量的测定国家标准NY/T 2006-2011方法测定实施例3中水稻生产的稻米的β-葡聚糖含量。简言之，取50g以上样品，使用粉碎机粉碎，混匀后于广口瓶中密闭保存。精确称取待测样品0.10000g，放入玻璃试管底部。向待测样品试管中 添加0.2mL 50％乙醇溶液，于旋涡混合仪上剧烈振荡数秒，沸水浴中继续保持2min，同前振 荡处理。试管在50℃水浴中保温5min，添加0.2mL地衣聚糖酶溶液，剧烈振荡数秒；加盖试管塞，50℃水浴继续保温60min；其间将试管取出，振荡处理3～4次。取出试管，向其中添加5mL 200mmol/L乙酸钠缓冲液，混合均匀，室温下冷却5～10min；离心(1000g，10min)，取上清液，备用。分别准确移取0.1mL上清液至3支试管的底部，向其中2支试管中分别添加0.1mLβ-葡 聚糖苷酶溶液；另一支试管中添加0.1mL 50mmol/L乙酸钠缓冲液，作为反应空白，将上述试 管在50℃保温10min。分别移取3.0mL葡萄糖氧化酶-过氧化物酶-缓冲液混合物至各试管 (包括2个测试样(每种米分别2个测试样)、1个反应空白、3个D-葡萄糖标准工作溶液、1个试 剂空白)，50℃反应20min；取出试管，冷却至室温。以试剂空白调零，于510nm处测定吸光值。 计算样品中的β-葡聚糖含量。以上测定方法中所用试剂配制方法及计算方法见谷物及其制 品中β-葡聚糖含量的测定国家标准NY/T 2006-2011方法。 [0085] 结果显示，喷施生物菌液1号或生物菌液2号后，稻米中β-葡聚糖含量为6.1-6.4％，与空白对照处理组相比至少提高3倍。 [0086] 实施例7 [0088] 取实施例4-5中秧苗长成的水稻所生产的稻米做出的饭进行口感风味品尝实验。品尝人数共100人(18-28岁的男性和女性各50人)，分别对用实施例4-5所生产的稻米做出 的饭进行品尝(品尝稻米样品均为收获的米一周内获得的新鲜稻米)。采用不记名打分制， 满分10分，分数高则表示效果好，并对是否喜欢产品程度进行总体评价。 [0089] 结果显示，90人以上的品尝者认为经本发明的作物壮苗剂处理后所获得的大米与对照处理的常规施肥处理的水稻所生产的大米相比口感更有嚼头，并且与对照相比，作物 壮苗剂处理后所获得的大米闻起来和吃起来米香味更浓。 [0090] 实施例8 [0091] 食药用菌提取液的制备 [0092] 野生灵芝购自吉林省长白山地区，将野生灵芝于60℃烘干至恒重，然后将菌体粉碎，过筛120目(筛孔尺寸：0.125mm)，得灵芝粉。精确称取灵芝粉500g，按1:40体积料水比加入蒸馏水。于100℃下煮2.5h，提取2次，合并提取液，测定多糖含量，加水稀释至多糖含量 10mg/mL，为灵芝提取液。 [0093] 将本实施例获得的灵芝提取液与实施例1的生物菌液1号混合，得到本发明的一种替代作物壮苗剂。 [0094] 其他食药用菌如香菇、猴头、虫草、茯苓、猪苓、桑黄、木耳、云芝等食药用菌中的一种或多种的提取液也参照上述制备方法进行生产，并且将如此获得的一种或多种提取液与实施例1的生物菌液1号混合，得到本发明的另外的作物壮苗剂。 [0095] 实施例9 [0096] 食药用菌发酵液的生产 [0097] 吉林省长白山地区的野生灵芝学名为松杉灵芝，栽培户已经从野生松杉灵芝中分离和制作了原种。本实施例将该原种用cPDA培养基(综合马铃薯葡萄糖琼脂培养基)转接两 次，每次25℃培养10天，获得母种块。cPDA培养基(/L)：马铃薯200.0g(浸出汁)，葡萄糖 20.0g，蛋白胨0.5g，KH2PO4 3.0g，MgSO4.7H2O 1.5g，VB110mg，琼脂14g，pH自然。活化一级种培养基：细杂木屑(过20目筛，筛孔尺寸：0.850mm)87.5％，麦麸20％，石灰1％，石膏0.5％，白糖1％，含水量60％。将配制好的活化一级种培养基装500mL三角瓶，每瓶装湿料450g，高 压滤菌薄膜封口，121℃灭菌1.5h，冷却，无菌操作接入1cm×1cm母种块2块，25℃静止培养 至满瓶，为活化一级种。二级种子培养基：以葡萄糖，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1为原料，其重量百分比分别为碳源2.0％，氮源0.4％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，维生素B1 0.01‰，培养基初始pH4.5。1000mL三角瓶中装入二级种子培养基700mL，高压滤菌 薄膜封口，115℃灭菌40min，冷却，无菌操作接入活化一级种量3％，发酵温度27℃，摇床转速130r/min，前期静止培养时间1d，后期摇床发酵时间4d，为二级种子。 [0098] 深层发酵培养基：以麦芽糖，葡萄糖，豆粉(过120目筛，筛孔尺寸：0.125mm)，酵母膏，磷酸二氢钾，硫酸镁，维生素B1为原料，其重量百分比分别为麦芽糖2.0％、葡萄糖1.0％，豆粉0.2％，酵母膏0.6％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，维生素B1 0.01‰，培养基初始pH4.5。在2000L发酵罐中使用深层发酵培养基，采用装样量4/5v/v，接种量0.5％(v/ v)，发酵温度27℃，罐压0.04MPa，通气量1:0.3v/v.m，发酵时间144h，发酵液以胞外多糖含量达10mg/mL以上时终止发酵，200目(孔径尺寸：0.075mm)滤膜过滤菌丝，清液100℃灭活 15min后加水稀释至工作液中多糖含量为10mg/mL，为灵芝发酵液。 [0099] 将本实施例获得的灵芝发酵液与实施例2的生物菌液2号混合，得到本发明的又一种替代作物壮苗剂。 [0100] 其他食药用菌如香菇、猴头、虫草、茯苓、猪苓、桑黄、木耳、云芝等食药用菌中的一种或多种的发酵液也参照上述制备方法进行生产，并且将如此获得的一种或多种发酵液与实施例2的生物菌液2号混合，得到本发明的另外的作物壮苗剂。 [0101] 实施例10 [0102] 采用与实施例3相似的步骤对实施例8和9所获得的作物壮苗剂进行试验，结果表明，用实施例8和9所获得的作物壮苗剂进行浸种处理后的水稻生长性状整体优于对照组； 相比对照，上述作物壮苗剂处理促进发芽，浸种后发芽期提前至少2天。 [0103] 采用与实施例4相似的步骤对实施例8和9所获得的作物壮苗剂进行试验，结果表明，实施例8和9所获得的作物壮苗剂处理后秧苗整齐，粗壮，抗病能力优异。 [0104] 采用与实施例5相似的步骤对实施例8和9所获得的作物壮苗剂进行试验，结果表明，实施例8和9所获得的作物壮苗剂施用后秧苗整齐，粗壮，须根系发达，在苗期3叶、4叶使用可提前插秧3-5天，绿苗作用显著。 [0105] 通过实施例6的测定方法测量通过施用实施例8和9所获得的作物壮苗剂后得到的稻米中β-葡聚糖含量。结果显示，施用实施例8和9所获得的作物壮苗剂后，稻米中β-葡聚糖含量相比对照组至少提高了3倍。 [0106] 通过实施例7的米饭口感和风味品尝实验对通过施用实施例8和9所获得的作物壮苗剂后得到的稻米所做出的米饭进行口感风味品尝测试。结果表明，与对照相比，施用实施 例8和9获得的作物壮苗剂后，米饭口感更有嚼头、闻起来和吃起来更加香甜。 [0108] 本说明书中引用的所有出版物和专利申请通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体地和单独地指明通过引用并入。此外，本文所述的任何理论、机制、 证明或发现旨在进一步增强对本发明的理解，并且不意图以任何方式将本发明限制到这样 的理论、机制、证明或发现。尽管已经在附图和前面的描述中详细地示出和描述了本发明， 但是本发明应当被认为是说明性的而不是限制性的。 [0109] 本发明还涉及如以下段落所示的实施方案： [0110] 段落1.作物壮苗剂，其包含有效调节作物生长的、来源于桦褐孔菌(Inonotus obliguus(Fr.)Pilat)的含多糖活性成分； [0111] 在一个实施方案中，其中所述活性成分能改善作物的以下性状中的至少一种：促进植株生长、使得苗床期作物苗绿苗、壮苗、抗病；在一个实施方案中，其中桦褐孔菌的活性成分含有桦褐孔菌多糖。 [0112] 段落2.段落1的作物壮苗剂，其中所述作物是单子叶植物，如禾本科作物，如小米、玉米或稻，如水稻；例如可以选自饲料作物、油料作物、谷类作物、水果作物、观赏植物、蔬菜作物、纤维作物、香料作物、坚果作物、草料作物、糖料作物、饮料作物、块茎作物、块根作物和森林作物，优选谷类作物，更优选水稻。 [0113] 段落3.段落1或2的作物壮苗剂，其中活性成分的多糖含量为0.1-100mg/mL、1-100mg/mL、1-30mg/mL、2-20mg/mL，优选活性成分的多糖含量为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、 85、90、95、100mg/mL或者介于它们任何两个数值之间的多糖含量。 [0114] 段落4.段落1-3任一项的作物壮苗剂，其中来源于桦褐孔菌的含多糖活性成分包含(或者是)桦褐孔菌提取物，例如桦褐孔菌的水提取物(用水提取桦褐孔菌菌体得到的产 物，可通过例如在加热的条件(如70-100(如80-100、90-100或100)摄氏度)下用水提取桦褐 孔菌菌体而获得)；在一个具体例子中，桦褐孔菌提取物为提取液。 [0115] 段落5.段落4的作物壮苗剂，其中桦褐孔菌提取液是通过以下方法获得的：将桦褐孔菌烘干至恒重，然后将菌体粉碎，过筛，得桦褐孔菌菌粉，然后将桦褐孔菌菌粉加水在加 热的条件下如70-100(如80-100、90-100或100)摄氏度处理1-5h，提取1-3次，合并提取液； 还可以包括测定多糖含量，稀释至所需多糖含量，获得桦褐孔菌提取液。 [0116] 段落6.段落1-3任一项的作物壮苗剂，其中来源于桦褐孔菌的含多糖活性成分包含(或者是)桦褐孔菌发酵液，在一个具体例子中，是桦褐孔菌深层发酵液；所述发酵液可以 含有或不含桦褐孔菌。 [0117] 段落7.段落6的作物壮苗剂，其中采用深层发酵技术获得桦褐孔菌发酵液。 [0118] 段落8.段落7的作物壮苗剂，其中桦褐孔菌发酵液是通过以下方法获得的：将桦褐孔菌用cPDA培养基培养获得母种，将母种用活化一级种培养基培养获得活化一级种，将活 化一级种用二级种子培养基培养获得二级种子，将二级种子用深层发酵培养基培养至所需 多糖含量，过滤菌丝，将过滤液灭活得到桦褐孔菌发酵液。 [0119] 段落9.段落6-8任一项的作物壮苗剂，其中不进行过滤菌丝的步骤。 [0120] 段落10.段落1-9任一项的作物壮苗剂，其还包含另外的食药用菌的活性成分如提取物(如提取液)或发酵液(发酵液可含有或不含食药用菌)。 [0121] 段落11.段落10的作物壮苗剂，其中食药用菌选自灵芝、香菇、猴头、虫草、茯苓、猪苓、桑黄、木耳、云芝中的一种或多种。 [0122] 段落12.制备段落1-11的作物壮苗剂的方法，包括制备桦褐孔菌提取物，例如桦褐孔菌的水提取物(用水提取桦褐孔菌菌体得到的产物，可通过例如在加热的条件(如70-100 (如80-100、90-100或100)摄氏度)下用水提取桦褐孔菌菌体而获得)；在一个具体例子中， 桦褐孔菌提取物为提取液。 [0123] 段落13.制备段落1-11的作物壮苗剂的方法，包括制备桦褐孔菌发酵液。 [0124] 段落14.段落1-11的作物壮苗剂用于促进苗床期作物苗绿苗的用途。 [0125] 段落15.段落1-11的作物壮苗剂用于促进作物生长的用途。 [0126] 段落16.段落1-11的作物壮苗剂用于促进苗床期作物苗壮苗的用途。 [0127] 段落17.段落1-11的作物壮苗剂用于促进苗床期作物苗抗病的用途。 [0128] 段落18.促进苗床期作物苗绿苗的方法，包括向作物施用段落1-11的作物壮苗剂。 [0129] 段落19.促进作物生长的方法，包括向作物施用段落1-11的作物壮苗剂。 [0130] 段落20.促进苗床期作物苗壮苗的方法，包括向作物施用段落1-11的作物壮苗剂。 [0131] 段落21.促进苗床期作物苗抗病的方法，包括向作物施用段落1-11的作物壮苗剂。 [0132] 段落22.段落18-21任一项的方法，其中施用是浸种处理。 [0133] 段落23.段落18-21任一项的方法，其中施用是喷施。 |
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