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一种检测咖啡驼孢锈菌的LAMP引物组及应用
申请号	CN201710827272.2	申请日	2017-09-14	公开(公告)号	CN107354231A	公开(公告)日	2017-11-17
申请人	中国热带农业科学院环境与植物保护研究所;			发明人	吴伟怀; 易克贤; 汪涵; 贺春萍; 黄兴; 梁艳琼; 习金根; 李锐; 郑金龙;
摘要	本发明公开了一种检测咖啡驼孢锈菌的LAMP引物组及应用。该引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。本检测方法具有较高的灵敏性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物组可以缩短对咖啡驼孢锈菌进行鉴定的时间，较快地鉴定出咖啡驼孢锈菌，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。
权利要求	1.一组检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP引物组，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。 2.一种检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的试剂盒，包括权利要求1所述的LAMP引物组。 3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括PCR反应试剂。 4.权利要求1所述的LAMP引物组以及权利要求2或3所述的试剂盒在检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)中的应用。 5.检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的方法，包括下述步骤： 1)提取待测样品DNA； 2)以待测样品DNA为模板，用权利要求1所述的LAMP引物组进行环介导等温PCR扩增； 3)通过肉眼直接观察反应液产物颜色，或者凝胶电泳检测扩增产物，从而判定样品中是否含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述环介导等温PCR扩增的反应体系为25μL，包括：所述的PCR扩增的反应体系为25μl：ddH2O 3μl；10×Bst-DNA Polymerase Buffer 2.5μl；10mM dNTP 3.5μl；2.5μM的序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸各2μl；20μM的序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸各2μl；25mM Mg2+4μl，10M甜菜碱2μl，8U/μl Bst-DNA Polymerase 1μl；20～30ng/μl的DNA模板1μl。 7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述环介导等温PCR扩增在63-65℃条件下进行。 8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述环介导等温PCR扩增可在63℃条件下进行。 9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述步骤3)，通过2种方法可判断LAMP反应结果：1)反应完，在体系中加0.1μl SYBR Green I，通过肉眼直接观察待测样品反应液颜色变化，如果所述待测样品反应液呈绿色，则说明所述待测样品含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；反之，反应液变为橙色，则说明待测样品不含有咖啡驼孢锈菌；2)将所测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待测样品含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；反之，则说明待测样品不含有咖啡驼孢锈菌。
说明书全文	一种检测咖啡驼孢锈菌的LAMP引物组及应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术领域，具体而言，本发明涉及一种用于检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP引物对、试剂盒及检测方法。背景技术 [0002] 咖啡锈病是一种世界性的真菌病害，分为黄锈病和灰锈病2种类型，其中前者由咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)引起，而后者则由咖啡锈菌(Hemileia cofeicola)引起[Waller JM(1982).Coffee rust-epidemiology and control.Crop Protection 1(4)385-404]。其中由咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)引起的咖啡黄锈病破坏性为最大。此病在非洲、近东及印度、亚洲、澳大利亚等生产咖啡的地区发生已久，1970年首次出现于西半球，发现于巴西。 [0003] 我国种植咖啡已经有100多年的历史。而最早发生锈病有记载的是在1942-1947年在广西出现锈病的危害。目前在我国咖啡种植面积约200万亩，其中小粒种咖啡种植面积和产量占国内的98％以上[李文伟.云南咖啡产业发展现状及产业提升对策[J].热带农业科技，2009，32(4)：19-22.]。不过，小粒种咖啡容易遭受咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)的致命危害[Wellman FL(1953).The Americas face up to threat of coffee rust.Foreign Agriculture 27(3)1-7.Waller JM(1982).Coffee rust-epidemiology and control.Crop Protection 1(4)385-404]，此病既能严重影响咖啡产量又能严重影响其质量。所以，开展咖啡锈病的预防与防控对于咖啡生产具有十分重要的意义。 [0004] 及时掌握与监测病原菌的适时动态，是有效防控病害的基础环节。传统上，咖啡锈菌的检测与鉴定，依赖常规的形态学并结合传统的鉴别寄主法。该方法需经过病原菌的分离或者直接获得病原菌的孢子，经过形态鉴定，再将获得的病菌回接到原来寄主上，并再次从接种寄主上再分离，若分离到与最初的病原菌则可确定为致病菌。在整个过程中需要具备专业的分类学知识以及丰富的经验。否则，其结果的准确性和可信度易受外界因素的影响，难以满足快速、高通量鉴定与检测的实际需求。事实上，咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)的潜伏期长达20多天，如需要等到孢子堆完全成熟时，通过高倍显微观查孢子形态，并结合孢子颜色以及发病症状，对其加以鉴定时，则需要更多时日。且该方法受到繁殖季节、病原保存、仪器设备等诸多因素的限制。尤其是需要快速以及需要大规模样品鉴定时，更是难以满足需求。 [0005] 近年来随着分子生物学技术的发展，以PCR技术为代表的分子检测方法得到了迅速地发展和应用。与传统技术相比，这类方法普遍具有快速、准确、灵敏且不需要进行病原菌的分离培养的特点，现已广泛应用于病原菌检测与鉴定等方面[Meng,K.et al.(2010)Rapid detection and quantification of zearalenone-producing Fusarium species by targeting the zearalenone synthase gene PKS4.Food Control 21,207–211.Nicolaisen,M.et al.(2009)Real-time PCR for quantification of eleven individual Fusarium species in cereals.J.Microbiol.Meth.76,234–240.]。虽然前期针对咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)设计了传统PCR引物并建立了比较可靠的PCR检测方法。然而，此检测方法仍然存在灵敏度不高，以及需要昂贵的仪器设备，在生产第一线以及基层农技部门推广应用时受到一定限制。 [0006] LAMP(loop-mediated isothermal amplification；环介导等温扩增)技术是日本荣研株式会发明的一种新的核酸扩增技术[Notomi T(2000)Loop-mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Research,28:e63]。该技术采用4条特异引物识别靶序列上6个特异区，所以该技术具有特异性强的特点，并且LAMP核酸扩增是利用DNA链置换聚合酶(BstDNA polymerase)在恒温条件下对靶基因扩增在等温条件下进行，仅需要水浴锅便可满足反应要求，其产物检测亦可用肉眼观察判断，使得该技术同时具有操作简单、快速高效、高灵敏度等特点，使其成为可以替代PCR的新核酸扩增技术。不过，LAMP检测技术设计效果优异的引物是关键，引物设计的不合适，效果也很难达到预期效果。目前还未见有关LAMP检测技术应用于咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)的报道。总之，为了进一步改进与完善咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)的检测技术，迫切需要建立一种简便、快速、且灵敏的检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix Berk.et Br.)的LAMP-PCR方法。发明内容 [0007] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，为了更加快速、准确、实用地检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)。本发明提供一组引起咖啡叶锈病的咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)特异性LAMP分子检测引物，以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的LAMP分子检测方法。 [0008] 本发明首先提供一组用于快速检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的引物组，其特征在于，由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。 [0009] 所述引物组中的外侧正向引物F3的序列如序列表中序列1所示，外侧反向引物B3序列如序列表中序列2所示，内侧正向引物FIP的序列如序列表中序列3所示，内侧反向引物BIP的序列如序列表中序列4所示。具体地，所述引物组的序列如下所示： [0010] 外侧正向引物F3：GGATCTCTTGGCTCTCAC(序列表中序列1)； [0011] 外侧反向引物B3：ACTTAAAGTGTTACTTTGCCTT(序列表中序列2)。 [0012] 内侧正向引物FIP： [0013] GCGTTCAAAAATTCGATGATTCACT-GAAGAACACAGTGAAATGTGAT(序列表中序列3)； [0014] 内侧反向引物BIP： [0015] ATTGCGCCTTTTGGCTATTCC-TAATAACTCTCTCAACACCCTG(序列表中序列4)。 [0016] 本发明的第二个方面是提供一种用于快速检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的试剂盒，其包含本发明的第一个方面所述的引物组。即本发明的第二个方面的试剂盒中包含具有序列表中序列1、序列表中序列2、序列表中序列3以及序列表中序列4所示的核苷酸序列的引物组。 [0017] 本发明的第三个方面是提供如第一个方面所述的引物组或本发明第二个方面所述的试剂盒在快速检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)中的应用。 [0018] 本发明的第四个方面是提供一种用于快速检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP方法，该方法包括使用本发明第一个方面所述的引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组进行PCR扩增的步骤。 [0019] 进一步地，所述方法包括以下步骤： [0020] 步骤1，从样品中提取DNA； [0021] 步骤2，用第一个方面所述的引物组或者本发明第二个方面所述的试剂盒中的引物组进行LAMP-PCR扩增，得到扩增产物； [0022] 步骤3，反应完在体系中加0.1μl SYBR Green I，通过肉眼直接观察样品反应颜色，或凝胶电泳检测扩增产物，从而判定样品中是否含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)。 [0023] 本发明中，提取待测样品的基因组DNA的方法不受特别限制，可以采用任何已知的基因组DNA提取方法或试剂盒进行。 [0024] 本发明中，将所述待测样品的基因组DNA进行PCR扩增的条件不受特别限制。根据本发明的一些具体示例，所述的PCR扩增反应体系为25μl：ddH2O 3μl；10×Bst-DNA Polymerase Buffer 2.5μl(1×Bst-DNA Polymerase Buffer:20mM Tris-HCl，10mM(NH4)2SO4，50mM KCl，2mM MgSO4，0.1％Tween-20，pH8.8@25℃)；10mM dNTP 3.5μl；2.5μM的F3(序列1所示的核苷酸)和B3(序列表中序列2所示的核苷酸)引物各2μl；20μM的FIP(序列表中序列3所示的核苷酸)和BIP(序列表中序列4所示的核苷酸)引物各2μl；25mM Mg2+4μl，10M甜菜碱2μl，Bst 2.0DNA Polymerase 1μl；20～30ng/μl的DNA模板1μl。 [0025] 所述环介导等温扩增可在63℃-65℃条件下进行。 [0026] 所述环介导等温扩增具体可在63℃条件下进行。 [0027] 本发明的引物组是基于实验室自测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)ITS序列(序列表中序列5)于NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行同源性搜索，进而下载与其拥有同源性较高的属(种)菌株ITS序列作多重比较，从而获得咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)ITS序列特异性区域，用于设计LAMP引物。 [0028] 实验证明，在本发明中，对所述一种检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP试剂盒及其专用引物组能特异性的检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)，而从其它供试菌株DNA中不能检测出任何条带，如甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala)、葡萄层锈菌(Phakopsora ampelopsidis Diet&Syd.)。根据本发明的一些具体示例，本发明提供一种检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP试剂盒及其专用引物组对咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)基因组DNA的最小检测量为10fg，比普通PCR检测方法的灵敏度高1000倍。具有较高的灵敏性，符合日常检测的要求。同时，通过本发明的检测引物可以缩短对咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)进行鉴定的时间，较快地鉴定出咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)，从而克服传统鉴定方法步骤繁琐、鉴定周期长等问题。使用本发明的引物组进行检测，具有灵敏度高、特异性强的特点，且本发明的检测方法具有高效、快速和敏感度高的优点，特别适合于批量检测。附图说明 [0029] 图1为本发明的引物组设计的具体位置。 [0030] 图2为检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP反应温度条件优化结果。A为待测样品反应液颜色反应结果；B为待测样品LAMP产物凝胶电泳结果。其中M为DL2000marker。1为温度54℃；2为温度57℃；3为温度60℃；4为温度63℃；5为温度65℃；6为温度68℃。 [0031] 图3为本发明提供的检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)LAMP引物组特异性检测的结果。A为待测样品反应液颜色反应结果；B为待测样品凝胶电泳检测结果。其中M为DL2000marker；1为ddH2O阴性对照；2～5为分离自我国不同地区的咖啡驼孢锈菌(HVL36,云南麻栗坡县；HVL51，云南麻栗坡县；HVL80，云南保山遮放；HVL91，云南芒市后谷龟岭湖)；6～7，为咖啡炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)；8～9，咖啡锈菌重寄生菌(Mycoparasites on the coffee rust)；10，咖啡褐斑病菌(Cerospora cofeicola Berket Cooke)；11，甘蔗黑粉菌(Ustilago scitaminea)；12，甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)；13，甘蔗镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum)；14，鸡蛋花鞘锈菌(Coleosporium plumierae)；15，甘蔗小球腔菌(Leptosphaeria sacchari)；16；剑麻烟草疫霉(Phytophthora nicotianae Breda)；17，葡萄层锈菌(Phakopsora ampelopsidis Diet&Syd.)。 [0032] 图4为本发明提供的引物组灵敏度检测的结果。A为本发明提供的引物组检测待测样品反应液颜色结果；B为本发明提供的引物组检测待测样品产物凝胶电泳结果。C为对照引物组检测待测样品产物凝胶电泳结果。其中M为DL2000marker；1:ddH2O阴性对照；2～3：咖啡驼孢锈菌基因组DNA模板浓度为10ng/μL；咖啡驼孢锈菌基因组DNA模板浓度为1ng/μL； 6～7：咖啡驼孢锈菌基因组DNA模板浓度为0.1ng/μL；8～9：咖啡驼孢锈菌基因组DNA模板浓度为0.01ng/μL；10～11：咖啡驼孢锈菌基因组DNA模板浓度为0.001ng/μL；12～13：咖啡驼孢锈菌基因组DNA模板浓度为0.0001ng/μL；14～15：咖啡驼孢锈菌基因组DNA模板浓度为 0.00001ng/μL；16～17：咖啡驼孢锈菌基因组DNA模板浓度为0.000001ng/μL。 [0033] 图5为普通PCR检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的灵敏度结果。其中M为DL2000marker；1为ddH2O阴性对照；2～3：咖啡驼孢锈菌基因组DNA为10ng/μL；4～5:咖啡驼孢锈菌基因组DNA为1ng/μL；6～7：咖啡驼孢锈菌基因组DNA为0.1ng/μL；8～9：咖啡驼孢锈菌基因组DNA为0.01ng/μL；10～11:咖啡驼孢锈菌基因组DNA为0.001ng/μL；12～13：咖啡驼孢锈菌基因组DNA为0.0001ng/μL；14～15：咖啡驼孢锈菌基因组DNA为0.00001ng/μL；16～17:咖啡驼孢锈菌基因组DNA为0.000001ng/μL。具体实施方式 [0034] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进步一步地说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。 [0035] 实施例1、检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP组引物制备[0036] 1、引物设计： [0037] 根据本实验克隆所获得的咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)ITS序列(序列表中序列5)与NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)ITS基因序列与其它属或种同源性ITS序列作多重比较，获得特异性区域。利用在线软件Primer-Primer Explore(Fujitsu Ltd.,Toky,Japan)(http://primer explorer.jp/e/)围绕特异性区域及其侧翼序列(6)进行引物设计。 [0038] 以序列表中序列6为模板设计本发明的引物组，分别为： [0039] F3上游引物序列：GGATCTCTTGGCTCTCAC(自序列表中序列6的5’端第20-38位核苷酸，即序列表中序列1)； [0040] B3下游引物序列为：ACTTAAAGTGTTACTTTGCCTT(自序列表中序列6的5’端第203-224位核苷酸，即序列表中序列2)； [0041] FIP引物序列＝F1C(自序列表中序列6的5’端第89-114位核苷酸)+F2(自序列表中序列6的5’端第45-66位核苷酸)： [0042] GCGTTCAAAAATTCGATGATTCACT-GAAGAACACAGTGAAATGTGAT(序列表中序列3)； [0043] BIP引物序列＝B1C(自序列表中序列6的5’端第117-147位核苷酸)+B2(自序列表中序列6的5’端第169-190位核苷酸的反向互补序列) [0044] ATTGCGCCTTTTGGCTATTCC-TAATAACTCTCTCAACACCCTG(序列表中序列4)。 [0045] 上述引物设计的具体位置详见图1。 [0046] 2、引物合成 [0047] 将设计好的上游引物F3、B3、FIP以及BIP引物，委托英潍捷基(上海)贸易有限公司广州合成部合成。 [0048] 实施例2、LAMP检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)最佳反应温度条件筛选[0049] 利用实施例1制备所得引物组，以咖啡锈菌菌株DNA为模板进行LAMP扩增。 [0050] 其中，PCR扩增的反应体系为25μl，具体如下： [0051] [0052] [0053] 将上述25μl LAMP反应体系迅速置于不同温度(54℃、57℃、60℃、63℃、65℃、68℃)下进行LAMP反应，反应1h后，置于85℃8min，终止反应。 [0054] 通过2种方法可判断LAMP反应结果：1)反应完成后在每个反应体系中加入0.1μl SYBR Green I，通过肉直接观察待测样品反应液颜色，如果所述待测样品反应液呈绿色，则说明所述待测样品含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；反之，反应液变为橙色，则说明待测样品不含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；2)将所测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，并在凝胶成像仪下观察结果，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待测样品含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；反之，则说明待测样品不含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)。具体结果如图2。如图2A所示，待测样品反应液在在60℃、63℃、65℃温度条件下均有浅绿色至深绿色。其对应产物经2％的琼脂糖凝胶分离后显示，在63℃、65℃两个温度下其梯状条带较为明显(图2B)。优选63℃为利用本发明所提供的引物组进行LAMP反应的最优温度。 [0055] 实施例3：检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP引物组的特异性[0056] 利用实施例1制备所得引物组，以4株分离自我国不同地区的咖啡驼孢锈菌(HVL36,云南文山麻栗坡县；HVL51，云南麻栗坡县；HVL80，云南保山遮放；HVL91，云南芒市后谷龟岭湖)；2株咖啡炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)；2株咖啡锈菌重寄生菌(Mycoparasites on the coffee rust)；1株咖啡褐斑病菌(Cerospora coffeicola Berket Cooke)；以及甘蔗黑粉菌(Ustilago scitaminea)；甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala H.&P.Syd.)；甘蔗镰形炭疽菌(Colletotrichum falcatum)；鸡蛋花鞘锈菌(Coleosporium plumierae)；甘蔗小球腔菌(Leptosphaeria sacchari)；剑麻烟草疫霉(Phytophthora nicotianae Breda；葡萄层锈菌(Phakopsora ampelopsidis Diet&Syd.)各1株。为实验材料进行LAMP反应，分析本发明所提供的引物组的特异性。上述菌株均按常规方法于上述地区采集，并鉴定。 [0057] 采用真菌DNA提取试剂盒(E.Z.N.A Fungal DNA kit,Omega公司，美国)提取上述菌株的DNA，其中，咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)、甘蔗黑顶柄锈菌(Puccinia melanocephala)；甘蔗屈恩柄锈菌(Puccinia kuelmi；)、葡萄层锈菌(Phakopsora ampelopsidis Diet&Syd.)、鸡蛋花鞘锈菌(Coleosporium plumierae)直接用其孢子(采集已严重发锈病叶片，于实验室利用接种刀片刮下其表面附着的孢子堆而得到)提取DNA，其它菌株则采用菌丝体提取。 [0058] 采用LAMP引物组进行PCR扩增验证实验，以ddH2O为阴性对照。 [0059] 其中，PCR扩增的反应体系如下： [0060] [0061] 将上述25μl LAMP反应体系迅速置于63℃，反应1h后，置于85℃8min，终止反应。 [0062] 通过2种方法可判断LAMP反应结果：1)反应完成后在每个反应体系中加入0.1μl SYBR Green I，通过肉眼直接观察待测样品反应颜色，如果所述待测样品反应液呈现绿色，则说明所述待测样品含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；反之，则说明待测样品不含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；2)将所待测样品的环介导等温扩增反应产物进行琼脂糖电泳检测，如果观察到典型的连续梯状条带，则说明所述待测样品含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)；反之，则说明待测样品不含有咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)。具体结果如图3。试验结果与设计预期的相吻合，待测样品反应液中只有模板为咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)DNA的4个反应液中呈现出绿色，其它反应液中呈现橙色(图3A)；其对应产物经2％的琼脂糖凝胶分离后显示，引物组仅能从模板为咖啡驼孢锈菌DNA的产物中检测出典型的连续梯状条带，而从其它菌株DNA中均未检测出任何条带(图3B)，表明引物组可特异性地检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)。 [0063] 实施例4：检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的LAMP引物组的灵敏性[0064] 利用实施例1制备所得引物组，将咖啡驼孢锈菌菌株基因组DNA浓度调整为10ng/μL，按10的数量级逐步向下稀释至10-6ng/μL作为模板，进行LAMP-PCR扩增，分析本发明所提供的引物组的灵敏度。PCR体系和反应程序与实施例2相同，PCR产物用2.0％的琼脂糖凝胶电泳检测。结果见图4。当待测样品反应液中模板DNA浓度大于或等于0.00001ng/μL时其对应反应液均呈现绿色，浓度为0.000001ng/μL以及模板为H2O时，其反应液均呈橙色(图4A)；其对应产物经2％的琼脂糖凝胶分离后显示，引物组能从模板大于或等于0.00001ng/μL的产物中检测出典型的连续梯状条带，而从浓度为0.000001ng/μL以及模板为H2O时反应产物中检测不出任何条带(图4B)。结果表明，本发明引物组可特异性地检测咖啡驼孢锈菌基因组DNA浓度≥10fg。按照上述相同的方法对发明人筛选的另外几组LAMP引物进行灵敏度试验，结果表明，同区域其他组LAMP引物检测灵敏度均达不到本发明引物，最低检测限比本发明上述引物最低检测限高100倍，其中如图4C所示，是如下引物序列的检测结果： [0065] F3：ACTTTTAACAATGGATCTCTTGG； [0066] B3：TAACTCTCTCAACACCCTG； [0067] FIP：GATTCACTGAATTCTGCAATTCACA-CTCTCACATCGATGAAGAACA； [0068] BIP：ATCGAATTTTTGAACGCATATTGCG-CCTTTCATACTCTCAAACAGGT。 [0069] 实施例5：普通PCR检测咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的灵敏性结果。 [0070] 利用本发明中外侧正向引物F3以及外侧反向引物B3为引物，进行普通PCR扩增，以检测对咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)的灵敏性。 [0071] 其中，PCR扩增的反应体系如下： [0072] [0073] [0074] PCR扩增的反应条件为：94℃3分钟；94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；12℃保存。 [0075] PCR扩增产物用质量百分比浓度为2％琼脂糖凝胶电泳分析，电泳条件为135V，28min。具体结果如图5所示，当咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)DNA浓度大于或等于 10pg时，利用引物对F3/B3可以特异性的扩增得到203bp的DNA条带，但当浓度小于10pg后，则扩增不到条带，由此表明，普通PCR可以检测到咖啡驼孢锈菌(Hemileia vastatrix)基因组DNA浓度≥10pg。 [0076] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

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