一种肉牛脂肪颜色性状的分子标记方法 |
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| 申请号 | CN201710678279.2 | 申请日 | 2017-08-09 | 公开(公告)号 | CN107354216A | 公开(公告)日 | 2017-11-17 |
| 申请人 | 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所; | 发明人 | 徐磊; 贾玉堂; 赵栓平; 周小双; 李赛明; 杨秀娟; | ||||
| 摘要 | 本 发明 公开了一种肉 牛 脂肪 颜色 性状的分子标记方法。该方法包括了牛基因组DNA的提取、β胡萝卜素9’，10’双加 氧 酶(BCO2)基因第3外显子引物设计、体外扩增和基因型检测4个步骤。本发明可以用于牛的育种中脂肪颜色性状的辅助选择，可实现种牛的早期选种，运用该基因聚合方法可以经过一个世代就可以将BCO2基因的优良基因型稳定下来，即经一个世代的选育即将一个肉牛品系的脂肪颜色性状的优良基因达到纯合，大大缩短了世代间隔，加快选择 进程 。本发明操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增 片段 长度较短(525bp)，扩增较容易，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种肉牛脂肪颜色性状的分子标记方法，包括以下步骤： |
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| 说明书全文 | 一种肉牛脂肪颜色性状的分子标记方法技术领域[0001] 本发明涉及一种肉牛脂肪颜色性状的分子标记方法。 背景技术[0002] 脂肪颜色是高档牛肉最直观的指标之一，也是各国牛肉分级的最重要组成 部分。1995年Hayes在澳大利亚曾报道过在出口的胴体中黄色脂肪会降低10％ 的等级，如果有 50％的黄脂，每年会减少澳大利亚肉牛业920万美元的收入； 我国刘晓牧等在山东省部分屠宰企业的调查，每公斤高档牛肉中，黄色脂肪的 肉价格比白色脂肪低40元左右。根据相关报道牛肉黄脂主要是脂肪组织中的 β-类胡萝卜素所导致的，类胡萝卜素是在植物中发现的一组化学复合物，在 脂肪中占数量优势的是β-胡萝卜素和叶黄素，胡萝卜素有很多种不同的同质 异构体，全反式β-胡萝卜素是在饲料作物中最常见的异构体，也是牛体内循 环中主要的类胡萝卜素。近年中，对可能与牛肉脂肪颜色相关联的候选基因的 QTL进行的检测，并没有发现有效的QTL。Kruk的研究认为在Jersey牛β-胡 萝卜素的沉积引起黄脂的过程中有一个主效基因在起作用，但却没有找出这个 主效基因。由于β-胡萝卜素是牛肉黄脂的主要贡献者，可以对β-胡萝卜素代 谢中的酶进行研究来探索牛肉黄脂的遗传机制。发明人在对β-胡萝卜素代谢 过程中主要的降解酶β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)的研究中发现，该 酶的一个突变可以显著影响该基因的表达，进而影响牛肉的脂肪颜色。因而通 过使用分子标记对该突变进行检测，可以对肉牛的脂肪颜色改善进行预测。 [0003] 现行的对肉牛脂肪颜色进行检测并无特殊的方法，主要是对屠宰后的肉牛 胴体体表脂肪直接用色差仪进行检测，进而评定其脂肪等级。 [0004] 常规的肉牛脂肪颜色检测需要进行屠宰，所以在肉牛的育种生产中很难采 用，所需要的成本太高，而且无法在肉牛育种中对脂肪颜色性状进行选择。 发明内容[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种肉牛脂肪颜色性状的分子标记方法。 该方法实现了对肉牛β胡萝卜素9’，10’双加氧酶((beta-carotene oxygenase 2，缩写为BCO2)基因第3外显子突变体的检测。 [0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是，一种肉牛脂肪颜色性 状的分子标记方法，包括以下步骤： [0007] (1)牛基因组DNA的提取； [0008] (2)β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显子引物设计，所 述引物为SEQ ID No.1所示的上游引物及SEQ ID No.2所示的下游引物； [0009] (3)体外扩增 [0010] 采用聚合酶链式反应，得到牛β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因 第3外显子的体外扩增产物； [0011] (4)基因型检测 [0012] 采用限制性内切酶酶切反应，得到酶切产物；对酶切产物进行多态位点限 制性片段酶切多态性(RLFP)检测，选择其中条带为GG型个体留种； [0013] 牛β胡萝卜素9',10'双加氧酶(BCO2)基因第3外显子Bsr1限制性内切 酶酶切可以检测出共存在3种基因型(GG基因型为391和134bp，AA基因型 为391、107和27bp，AG基因型为391、134、107和27bp)，M泳道为50bp loader Marker。 [0014] 作为优选，体外扩增为聚合酶链式反应，具体操作步骤如下： [0015] (5)配制聚合酶链式反应体系 [0016] 由4×dNTP2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2μl、10mmol/ml上游引物和 10mmol/ml下游引物各0.5μl、10U/μl Taq聚合酶0.4μl、浓度50ng/μl 的牛基因组DNA溶液2μl、含20mmol/l氯化镁(MgCl2)的10×聚合酶链式 反应(PCR)缓冲液2.5μl，加水17.1μl至终体积25μl；并混合均匀，制 得25μl聚合酶链式反应体系； [0017] (6)降落式聚合酶链式反应条件 [0018] 将25μl聚合酶链式反应(PCR)体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条 件如下： [0019] ①95℃预变性4分钟， [0020] ②95℃变性30秒， [0022] ④72℃延伸30秒， [0023] ⑤重复第②～④步骤，重复10个循环，每循环的退火温度降低1℃。 [0024] ⑥进入正常循环，95℃变性30秒， [0025] ⑦退火温度50℃30秒， [0026] ⑧72℃延伸30秒， [0027] ⑨重复第⑥～⑧步骤，重复24个循环， [0028] ⑩72℃延伸5分钟，最后降温至4℃保存，得到牛β胡萝卜素9’，10’ 双加氧酶(BCO2)基因第3外显子的体外扩增产物；所述体外扩增产物的牛β 胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显子第111位碱基由G突变为A。 [0029] 作为优选，基因型检测的具体操作如下： [0030] (7)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP) 检测[0031] 由于牛β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显子第111位碱 基由G突变为A，导致了一个Bsr1限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶 切反应操作步骤是：取牛β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显 子的体外扩增产物10μl于聚合酶链式反应(PCR)管中，分别加入10U/μl 的Bsr1限制性内切酶1μl，Bsr1限制性内切酶缓冲液2μl，加水7μl，混 匀，温度37℃反应3小时，得到酶切产物； [0032] (8)多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测 [0033] 将酶切产物用2.5％琼脂糖凝胶电泳1小时，电泳条件：常温，电压120V， 得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因 型，牛BCO2基因第3外显子Bsr1限制性内切酶酶切成像图中可以检测出共存 在3种基因型(GG基因型为391和134bp，AA基因型为391、107和27bp，AG 基因型为391、134、107和27bp，且27bp一般凝胶像中无法显示)，M泳道为 50bp loader Marker；AA基因型个体为脂肪颜色性状优良基因型，选择其中 条带为AA型个体留种，可提高牛脂肪颜色性状得分，提高选留群体的脂肪白 度。 [0034] 本发明的有益效果是： [0035] 可以用于牛的育种中脂肪颜色性状的辅助选择，可实现种牛的早期选种， 甚至在牛刚出生时就可准确地进行选留，运用该基因聚合方法可以经过一个世 代就可以将BCO2基因的优良基因型稳定下来，即经一个世代的选育即将一个 肉牛品系的脂肪颜色性状的优良基因达到纯合，而常规育种方法要经过大量的 生产性能测定和后裔测定，并且要继代选育多个世代以上才能达到需要的效 果，大大缩短了世代间隔，加快选择进程。 [0036] 该方法操作简便，聚合酶链式反应过程中条件要求不高，扩增片段长度较 短(525bp)，扩增较容易，提高了扩增效率及判断基因型的准确性。 具体实施方式[0037] 为了实现对肉牛β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显子突 变体的检测，本实施例提供了一种肉牛脂肪颜色性状分子标记方法。 [0038] 本实施例设计了肉牛BCO2基因第3外显子引物，建立了第3外显子w80x 位点突变体的检测方法，并分析了其多态性与脂肪颜色性状之间的相关性，确 立了影响脂肪颜色的优良基因型，用于对肉牛脂肪颜色性状的选择，解决了传 统的选种方法的盲目性大，选种准确性低的问题。 [0039] 本实施例肉牛脂肪颜色性状的分子标记方法的具体操作步骤如下： [0040] 1、牛基因组DNA的提取； [0041] 2、β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显子引物设计，所述 引物为上游引物和下游引物，其序列如下： [0042] 上游引物：5’-AACCCATCCCACTTCCTTATCT-3’， [0043] 下游引物：5’-GCTGAAATCAAACCCCAAAG-3’； [0044] 3、体外扩增 [0045] 采用聚合酶链式反应，得到牛β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因 第3外显子的体外扩增产物，具体操作步骤如下： [0046] (1)配制聚合酶链式反应体系 [0047] 由4×dNTP2.5mmol/l脱氧核苷三磷酸2μl、10mmol/ml上游引物和 10mmol/ml下游引物各0.5μl、10U/μl Taq聚合酶0.4μl、浓度50ng/μl 的牛基因组DNA溶液2μl、含20mmol/l氯化镁(MgCl2)的10×聚合酶链式 反应(PCR)缓冲液2.5μl，加水17.1μl至终体积25μl；并混合均匀，制 得25μl聚合酶链式反应体系； [0048] (2)降落式聚合酶链式反应条件 [0049] 将25μl聚合酶链式反应(PCR)体系放入聚合酶链式反应仪器，反应条 件如下： [0050] ①95℃预变性4分钟， [0051] ②95℃变性30秒， [0052] ③退火温度60℃30秒， [0053] ④72℃延伸30秒， [0054] ⑤重复第②～④步骤，重复10个循环，每循环的退火温度降低1℃。 [0055] ⑥进入正常循环，95℃变性30秒， [0056] ⑦退火温度50℃30秒， [0057] ⑧72℃延伸30秒， [0058] ⑨重复第⑥～⑧步骤，重复24个循环， [0059] ⑩72℃延伸5分钟，最后降温至4℃保存，得到牛β胡萝卜素9’，10’ 双加氧酶(BCO2)基因第3外显子的体外扩增产物；所述体外扩增产物的牛β 胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显子第111位碱基由G突变为A。 [0060] 4、基因型检测 [0061] 采用限制性内切酶酶切反应，得到酶切产物；对酶切产物进行多态位点限 制性片段酶切多态性(RLFP)检测，选择其中条带为GG型个体留种。 [0062] 基因型检测的具体操作如下： [0063] (1)限制性内切酶酶切反应，多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP) 检测[0064] 由于牛β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显子第111位碱 基由G突变为A，导致了一个Bsr1限制性内切酶的酶切多态性位点，具体酶 切反应操作步骤是：取牛β胡萝卜素9’，10’双加氧酶(BCO2)基因第3外显 子的体外扩增产物10μl于聚合酶链式反应(PCR)管中，分别加入10U/μl 的Bsr1限制性内切酶1μl，Bsr1限制性内切酶缓冲液2μl，加水7μl，混 匀，温度37℃反应3小时，得到酶切产物； [0065] (2)多态位点限制性片段酶切多态性(RLFP)检测 [0066] 将酶切产物用2.5％琼脂糖凝胶电泳1小时，电泳条件：常温，电压120V， 得到含酶切产物的凝胶；将含酶切产物的凝胶置于凝胶成像系统下观测基因 型。 [0067] 牛BCO2基因第3外显子Bsr1限制性内切酶酶切成像图中可以检测出共存 在3种基因型(GG基因型为391和134bp，AA基因型为391、107和27bp，AG 基因型为391、134、107和27bp，且27bp一般凝胶像中无法显示)，M泳道为50bp loader Marker；AA基因型个体为脂肪颜色性状优良基因型，选择其中 条带为AA型个体留种，可提高牛脂肪颜色性状得分，提高选留群体的脂肪白 度。 [0069] |
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