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一种细胞周期阻滞剂6BAR在人乳腺癌细胞中的应用
申请号	CN201710445304.2	申请日	2017-06-15	公开(公告)号	CN107326010A	公开(公告)日	2017-11-07
申请人	大连理工大学;			发明人	王黎; 程娇; 崔昌浩; 林凡琳; 张瀚文; 于冬丽; 邓营营;
摘要	本发明提供了一种细胞周期阻滞剂6BAR在人乳腺癌细胞中的应用，属于生物化学与分子生物学技术领域。一种细胞周期阻滞剂6BAR在人乳腺癌细胞株中的应用，步骤如下：(1)细胞复苏；(2)细胞培养；(3)药物配制；(4)处理细胞；(5)检测细胞增殖抑制率；(6)检测细胞周期。本发明的数据建立在核苷类似物可干扰肿瘤细胞的DNA合成和DNA合成中需要的嘌呤、嘧啶、嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成抑制了肿瘤细胞的存活和复制的基础之上。
权利要求	1.一种细胞周期阻滞剂6BAR在人乳腺癌细胞株中的应用，其特征在于，步骤如下： (1)细胞复苏：将装有冻存人乳腺癌细胞株MCF7的冻存管从-80℃冰箱中取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻微摇动，待液体融化；将冻存管中的人肺癌细胞株A549悬浮于含有10％灭活胎牛血清的无菌RPMI 1640培养液的离心管中，1000rpm，5min离心，离心结束后，弃上清，轻轻弹起细胞，再次入无菌RPMI 1640培养液与离心管中，把细胞悬浮起来，转移到培养瓶中左右轻轻摇动，使培养瓶中的细胞均匀分布，得到复苏的人乳腺癌细胞株MCF7； (2)细胞培养：将复苏的人乳腺癌细胞株MCF7置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，10h后观察细胞，若已贴壁，将培养液全部吸出，再次加入等量的RPMI 1640培养液；待细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次； (3)药物配制：6BAR先用0.1％DMSO溶解，继续用无菌RPMI 1640培养基将用0.1％DMSO溶解好的6BAR稀释，使6BAR溶液的母液浓度达到1mM，继续用无菌RPMI 1640培养基将溶解好的6BAR溶液的母液稀释至浓度为1μM-500μM，过滤除菌，室温保存； (4)处理细胞：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，细胞计数后，稀释，稀释细胞密度为3×104～5×104个/ml，吹打混匀，将细胞接种于96孔板中，每孔取100μl人乳腺癌细胞株MCF7，12h后，待细胞贴壁后，设置7组实验，每组4个复孔，第1组：空白对照组；第2组：0.1％DMSO组；第3组：100μΜ6BAR组；第4组：50μΜ6BAR组；第5组：10μΜ6BAR组；第6组：5μΜ6BAR组；第7组：1μΜ6BAR组；分别向各组中加入10μl对应的药物，轻轻混匀后，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育2天，检测细胞增殖抑制活性； (5)检测细胞增殖抑制率：将步骤(4)处理后的细胞，置于浓度为5％CO2、相对湿度为 90％、温度为37℃的培养箱中孵育48h，各4个复孔；采用MTT 试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加20μl MTT溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育3h，测定490nm处各组细胞的吸光度，记录数据； (6)检测细胞周期：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，细胞计数后，取适量细胞进行稀释，稀释细胞密度为1×105～1.5×105个/ml，吹打混匀，将细胞接种于6孔板中，每孔取 2ml人乳腺癌细胞株MCF7，12h后，待细胞贴壁后，设置空白对照组和10μΜ6BAR组，向10μΜ 6BAR组中加入6BAR，使6BAR的浓度为10μΜ，轻轻混匀后，置于浓度为5％CO2、相对湿度为 90％、温度为37℃的培养箱中孵育36h，用15ml离心管分装成两个样品，按照细胞周期与凋亡检测试剂盒说明书固定细胞并配制碘化丙染色缓冲液，12h后，每个样品中加入PBS洗多次，重悬细胞，每个样品加入所需碘化丙染色缓冲液37℃避光孵育30min，最后用PBS洗两次；300目筛网过滤后用BD FACSCalibur流式细胞仪上机检测。
说明书全文	一种细胞周期阻滞剂6BAR在人乳腺癌细胞中的应用技术领域 [0001] 本发明涉及细胞分裂素N6-benzyladenosine(6BAR)作为一种细胞周期阻滞剂对人乳腺癌细胞株抗肿瘤作用，属于生物化学与分子生物学技术领域。背景技术 [0002] 乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，据世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer,IARC)统计，2015年全球女性乳腺癌新发病例达155万左右，占全部女性恶性肿瘤发病的25％左右；因乳腺癌死亡占所有女性恶性肿瘤死亡的15％左右，占所有女性死亡的2％。与其他大多数国家一样，乳腺癌已成为了中国女性最常见的癌症，在上海等东部沿海城市，乳腺癌已超越肺癌成为女性发病率最高的癌症；目前每年中国乳腺癌新发数量和死亡数量分别占全世界的12.2％和9.6％。临床上用于治疗乳腺癌的常规药物虽然对治疗起到重要作用，但却存在着明显的毒副作用。经大量实践证明，运用现代技术，从天然产物中获得的天然活性物质的活性成分能治疗乳腺癌，同时减轻放化疗的毒副作用。因此，寻找有效提高治疗效率，毒副作用小的天然药物来治疗乳腺癌是十分必要的。 [0003] 细胞分裂素CK(cytokinin)是二十世纪五十年代年被发现的一类植物激素，它在植物的生长发育中起决定性作用，天然存在的细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物，是其嘌呤N6位置上的H被其它基团取代形成的。常见的天然存在的细胞分裂素有：玉米素(Zeatin,ZT)、玉米素核苷(Zeatin riboside,ZR)、二氢玉米素(dihydrozeatin,dHZT)、异戊烯基腺苷(isopentenyl adenosine,i6A)。目前越来越多的研究发现，CK不仅调节植物的生长发育同时对动物细胞的增值和分化也起到很重要的影响。 [0004] N6-benzyladenosine(6BAR)是存在于植物中的细胞分裂素(CK)的一种核苷形式，俗名为6-苄基腺苷，分子式为C17H19N5O4,分子量为357.36。核苷类似物是一类重要的抗癌化疗剂，包括各种嘌呤和嘧啶核苷的衍生物，核苷类似物家族主要是一类抗代谢物，通过干扰肿瘤细胞的DNA合成和DNA合成中需要的嘌呤、嘧啶、嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成抑制了肿瘤细胞的存活和复制必不可少的代谢途径，以及以细胞内的酶、核酸为作用靶而产生细胞毒性。近年来，随着核苷转移子、核苷代谢过程中的酶以及核苷的抗癌机制的不断深人的研究，核苷类抗癌化疗利取得了很大进展.从而猜测6BAR也可以干扰或者直接作用于蛋白质、核酸的生物合成，而干扰肿瘤细胞和病毒复制，在抗肿瘤和抗病毒方面发挥着重要的作用。当用6BAR处理人乳腺癌细胞株后导致细胞周期不同程度的受阻和(或者)凋亡。发明内容 [0005] 本发明针对上述现有技术，本发明提供了6BAR在人乳腺癌细胞株中抗肿瘤的应用。 [0006] 本发明的技术方案： [0007] 一种细胞周期阻滞剂6BAR在人乳腺癌细胞株中的应用，步骤如下： [0008] (1)细胞复苏：将装有冻存人乳腺癌细胞株MCF7的冻存管从-80℃冰箱中取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻微摇动，待液体融化；将冻存管中的人肺癌细胞株A549悬浮于含有10％灭活胎牛血清的无菌RPMI 1640培养液的离心管中，1000rpm，5min离心，离心结束后，弃上清，轻轻弹起细胞，再次入无菌RPMI 1640培养液与离心管中，把细胞悬浮起来，转移到培养瓶中左右轻轻摇动，使培养瓶中的细胞均匀分布，得到复苏的人乳腺癌细胞株MCF7； [0009] (2)细胞培养：将复苏的人乳腺癌细胞株MCF7置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中培养，10h后观察细胞，若已贴壁，将培养液全部吸出，再次加入等量的RPMI 1640培养液；待细胞长至培养瓶底面积的70％～80％传代1次； [0010] (3)药物配制：6BAR先用0.1％DMSO溶解，继续用无菌RPMI 1640培养基将用0.1％DMSO溶解好的6BAR稀释，使6BAR溶液的母液浓度达到1mM，继续用无菌RPMI 1640培养基将溶解好的6BAR溶液的母液稀释至浓度为1μM-500μM，过滤除菌，室温保存； [0011] (4)处理细胞：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，细胞计数后，稀释，稀释细胞密度为3×104～5×104个/ml，吹打混匀，将细胞接种于96孔板中，每孔取100μl人乳腺癌细胞株MCF7，12h后，待细胞贴壁后，设置7组实验，每组4个复孔，第1组：空白对照组；第2组：0.1％ DMSO组；第3组：100μΜ 6BAR组；第4组：50μΜ 6BAR组；第5组：10μΜ 6BAR组；第6组： 5μΜ 6BAR组；第7组：1μΜ 6BAR组。分别向各组中加入10μl对应的药物，轻轻混匀后，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育2天，检测细胞增殖抑制活性； [0012] (5)检测细胞增殖抑制率：将步骤(4)处理后的细胞，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育48h，各4个复孔；采用MTT 试剂盒进行检测，每孔细胞悬液中加20μl MTT溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育3h，测定490nm处各组细胞的吸光度，记录数据； [0013] (6)检测细胞周期：将处于对数生长期的细胞用胰酶消化，细胞计数后，取适量细胞进行稀释，稀释细胞密度为1×105～1.5×105个/ml，吹打混匀，将细胞接种于6孔板中，每孔取2ml人乳腺癌细胞株MCF7，12h后，待细胞贴壁后，设置空白对照组和10μΜ6BAR组，向10μΜ6BAR组中加入6BAR，使6BAR的浓度为10μΜ，轻轻混匀后，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育36h，用15ml离心管分装成两个样品，按照细胞周期与凋亡检测试剂盒说明书固定细胞并配制碘化丙染色缓冲液，12h后，每个样品中加入PBS洗多次，重悬细胞，每个样品加入所需碘化丙染色缓冲液37℃避光孵育30min，最后用PBS洗两次；300目筛网过滤后用BD FACSCalibur流式细胞仪上机检测。 [0014] 本发明的有益效果：本发明的数据建立在核苷类似物可干扰肿瘤细胞的DNA合成和DNA合成中需要的嘌呤、嘧啶、嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的合成抑制了肿瘤细胞的存活和复制的基础之上。附图说明 [0015] 图1为不同浓度6BAR对人乳腺癌细胞株增殖的抑制作用。 [0016] 图2为6BAR对人乳腺癌细胞株MCF7细胞周期的影响。2(a)对照组。2(b)10μΜ6BAR处理36h后MCF7细胞的细胞周期。具体实施方式 [0017] 以下结合附图和技术方案，进一步说明本发明的具体实施方式。 [0018] 本发明使用的细胞、试剂盒以及试剂：人乳腺癌细胞株MCF7，胎牛血清、双抗(青霉素/链霉素)，RPMI 1640培养基，MTT试剂盒，细胞周期与凋亡染色试剂盒，6BAR。 [0019] 实施例1 [0020] 6BAR对人乳腺癌细胞株MCF7的体外增殖抑制活性：将复苏的人乳腺癌细胞株MCF7培养于含有10％FBS灭活胎牛血清、1％青霉素/1％链霉素(双抗)的无菌RPMI1640培养液中，置于悬浮细胞瓶中，在37℃、5％CO2及饱和湿度下的培养箱中培养，细胞长至70％-80％左右传代1次。继续培养得到生长状态活跃的人乳腺癌细胞株MCF7，收集细胞。将处于对数生长期的5×103个细胞接种于每孔含有100μlRPMI 1640培养液的96孔板中，按照实验需求，处理组分别加入10μl的100μM、50μM、10μM、1μM浓度6BAR，放入培养箱中孵育2天，各4个复孔。采用MTT试剂盒进行检测，每孔细胞中加20μl MTT溶液，置于37℃，CO2培养箱中孵育3h。测定490nm处各组细胞的吸光度，记录数据，采用重复测量资料的方差分析方法来分析各组数据，结果如图1所示。图1可见，施用不同浓度的6BAR对人乳腺癌细胞株MCF7的增殖速率显著低于对照组，表明6BAR可以抑制人乳腺癌细胞株MCF7的增殖速率。 [0021] 实施例2 [0022] 6BAR诱导MCF7细胞凋亡：将处于对数生长期上述培养的细胞用胰酶消化，细胞计数后，取适量细胞进行稀释，稀释细胞密度为1×105～1.5×105个/ml，吹打混匀，将细胞接种于6孔板中，每孔取2ml人乳腺癌细胞株MCF7，12h后，待细胞贴壁后，设置空白对照组和10μΜ6BAR组，向10μΜ 6BAR组中加入200μl100μΜ 6BAR(工作浓度为10μΜ6BAR)，轻轻混匀后，置于浓度为5％CO2、相对湿度为90％、温度为37℃的培养箱中孵育36h，用15ml离心管分装成两个样品，按照细胞周期与凋亡检测试剂盒说明书固定细胞并配制碘化丙染色缓冲液，12h后，每个样品中加入10mlPBS洗两次，重悬细胞，每个样品加入500μl碘化丙染色缓冲液37℃避光孵育30min，最后用PBS洗两次；300目筛网过滤后用BD FACSCalibur流式细胞仪上机检测；结果如图2所示，图2可见，与对照组相比，施加6BAR可以导致导致DNA合成受阻，细胞周期阻滞在S期。从而在体外对人乳腺癌细胞株MCF7具有很强的毒性和促凋亡作用。当用6BAR处理人乳腺癌细胞株MCF7后导致细胞周期受阻和(或者)凋亡。

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