[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种外泌体快速分离和纯化的试剂盒。

[0002] 外泌体(exosome)是由多种活细胞分泌的囊泡小体，其中含有蛋白质和RNA等多种组分，直径大多介于30～100 nm之间。在电子显微镜下，可见外泌体由双层磷脂分子包裹，形态呈扁形或球形小体，有些为杯状；其在体液中的存在形式以球形结构为主，通常可在蔗糖密度梯度溶液中密度1．13～1.19 g／ml的范围获得富集。目前认为外泌体可由各种类型的细胞分泌，发源于细胞内吞系统中的晚期内体。

[0003] 外泌体在外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等体液中具有很高的丰度，而不同组织来源的外泌体在组成和功能方面存在差异，同时这种差异受到细胞外基质和微环境的动态调控。肿瘤来源或肿瘤相关的外泌体是调控肿瘤发生发展的重要机制，对肿瘤外泌体的分析和检测可以辅助肿瘤的早期诊断、疗效评价和预后分析。此外，外泌体及其修饰加工产物还可以作为基因或药物的有效载体，用于肿瘤治疗。

[0004] 最常用的外泌体纯化手段是超离法，采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时(20小时以上)，且回收率不稳定，纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量。

[0005] 本专利的外泌体分离纯化试剂盒通过高分子过滤柱的原理而制备，是一款可以快速高效地从血清、血浆、细胞培养上清中提取exosome的试剂盒，该试剂盒具有如下特点：操作简单，无需超速离心，1~2小时内即可完成抽提和纯化；纯度高，富集量大，从2~4ml细胞上清液中可获得200~400ng外泌体蛋白或50-200ng外泌体RNA；成本低，稳定性好，便于运输，便于保存；适用于血清、尿液、唾沫、积水等体液以及细胞培养液进行外泌体的抽提和纯化。

[0006] 一种外泌体快速分离和纯化的试剂盒，包括溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和纯化柱，共四部分组成，每种组成的体系或者数量如下：规格 10rnx 40rnx
溶液I 2.5 ml 10 ml
溶液II 2.5 ml 10 ml
溶液III 10 ml 20 ml x 2
纯化柱 10个 40个
溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ按照下文所描述的操作后可以有效的分离外泌体，再通过纯化柱纯化，可以获得高纯度的外泌体颗粒。

[0007] 本发明试剂盒可用于血液、尿液、唾液、积液等体液以及细胞培养液的外泌体提起和纯化。

[0008] 本发明试剂盒可用于人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物体液的外泌体提起和纯化。

[0009] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

[0010] 1.样品前处理：为避免血清中杂蛋白的干扰，建议使用无血清培养基培养48小时后再收集细胞上清液。对于增殖速度较快的细胞，建议对收集后的细胞上清液用无血清培养基进行1:2的稀释。如需对大规模培养的细胞进行检测（例如悬浮细胞），建议先稀释至1*10^5 cells/ml，再取样进行检测。

[0011] 2.操作步骤1)收集2ml细胞上清液；
2)以3,000× g，4°C离心15min，以去除残留细胞或细胞碎片；
3)将上清液转移至干净的10ml玻璃管中，并至于冰上备用；
4)另取一支干净的10ml玻璃管，按照如下比例配制溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合液；
培养上清液体积 混合液总体积 溶液I 溶液II 溶液III
2 ml 0.75 ml 0.125 ml 0.125 ml 0.5 ml
3 ml 1.125 ml 0.187 ml 0.187 ml 0.75 ml
4 ml 1.5 ml 0.25 ml 0.25 ml 1 ml
5)震荡5~10s，混匀；
6)向每2ml上清液中加入0.75ml的上述混合液；
7)盖好管盖，于振荡器上剧烈震荡30s，4℃孵育30min；经处理的样品通常会形成3层或
2层溶液，吸掉上层或下层溶液
8)将剩余样品转入1.5ml的离心管中，以5000x g离心3min，样品将继续呈现出3层，弃掉上清与下层溶液；
9)将剩余样品转入0.5ml的离心管中，重复上述步骤8一次；
10)打开离心管盖，放置10min待自然晾干；
11)加入4倍沉淀体积的1×PBS，反复吹打重悬沉淀，使其完全分散，于水平摇床上孵育
10min（高速，中途可以再进行一次反复吹打）；
12)以5000x g离心5min，将上清液吸出来至于纯化柱中（小心操作，不要吸到沉淀），剩余沉淀于4℃保留；
13)将纯化柱以1000x g离心5min，收集得到的滤过液；
14)上述13所得到的溶液即为溶于PBS的外泌体，可继续用于后续试验或于4℃暂存，如需长期保存请于-80℃冰箱中，建议3个月内使用。

[0012] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

[0013] 用于本发明的待检液体没有特别限制，可以是人源、大鼠、小鼠、兔子等哺乳动物体液、也可以是前述动物细胞的培养液。

[0014] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。