[0001] 本申请是分案申请，其原申请的国际申请号是PCT/JP2012/079182，国际申请日是2012年11月9日，中国国家申请号为201280050798.X，进入中国的日期为2014年4月16日，发明名称为“肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的制造方法”。

[0002] 本发明涉及基因重组技术在肌肉肌醇的制造中的应用。特别是涉及利用原核微生物的转化体的肌肉肌醇的工业制造方法。本发明进一步涉及新颖的肌肉肌醇衍生物及其制造方法。

[0003] 肌肉肌醇对于多数高等动物来说为必不可缺的物质，因而其作为营养食品、饲料、药品等成分广泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪和胆固醇类的代谢中发挥出重要的作用，在高胆固醇血症等的预防或治疗中是特别有效的。因而，对于以工业规模制造肌肉肌醇的制造工艺提出了多种改良方案。

[0004] 以往，肌肉肌醇是从米糠、玉米浆等直接提取的，但该提取方法中，肌肉肌醇的收率低，并且大量生成杂质，因而肌肉肌醇的精制困难，生产效率极低。因此，还有人提出了对具有肌肉肌醇生产能力的面包酵母进行培养，由该培养物中生成肌肉肌醇的方法，但该方法的生产率仍然较低，在经济上不成立，因而未进行工业实施。

[0005] 因而，对更加有效地生产肌醇的微生物进行了检索。专利文献1公开了可向菌体外分泌肌醇的假丝酵母属酵母的表达及其利用。专利文献2和3分别公开了在上述假丝酵母属酵母中导入可赋予针对葡萄糖代谢抵抗物质和抗生素的耐性的突变的内容。另外，在专利文献4、5和6中还分别公开了通过在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对叔胺、六氯环己烷和十六烷基三甲基铵盐的耐性的突变来提高肌醇的收率的内容。专利文献7中同样公开了在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对6-卤代-6-脱氧葡萄糖的耐性的突变的内容。在专利文献8中还公开了在具有肌醇生产能力的假丝酵母属酵母中导入可赋予针对卤化乙酰甲酸的耐性的突变的内容。

[0006] 进一步地，现有技术还记载了利用基因重组进行的酵母的转化。在专利文献9中公开了下述内容：在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中，肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应，在这一恰当推论下，通过单独利用编码上述肌醇-1-磷酸合成酶的DNA对不具有肌醇分泌能力的假丝酵母属酵母进行转化而对该酵母赋予肌醇生产能力。在专利文献10中公开了通过将置于甘油-3-磷酸脱氢酶基因启动子的调节下的编码肌醇-1-磷酸合成酶的DNA单独导入酵母，来提高该酵母的肌醇生产率的内容。

[0007] 进一步地，专利文献11中还涉及甲醇利用性酵母毕赤酵母进行肌醇生产的内容，其中公开了在该酵母中导入肌肉肌醇-1-磷酸合成酶基因并同时导入肌醇磷酸磷酸酯酶基因的内容，但未明确该追加的肌醇磷酸磷酸酯酶基因导入的意义和效果。

[0008] 因而，关于上述酵母的任一文献均是以在一系列的肌肉肌醇生物合成反应中肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应为前提的，并未暗示存在于肌肉肌醇生物合成通路中的除此以外的酶的重要性。

[0009] 另一方面，对于以大肠杆菌为代表的原核微生物，由于其旺盛的增殖能力及发酵管理中的各种优越性，与酵母相比，其为极富魅力的工业生产用生物。但是，具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的原核微生物尚不为人所知。

[0010] 因而，为了利用原核微生物进行肌肉肌醇的工业生产，在原核微生物宿主内构建外来性的肌肉肌醇生物合成通路为不可缺的。

[0011] 具体地说，为了在原核微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路，下述催化剂活性为必要的：

[0012] 活性1：由适当的碳源生成葡萄糖-6-磷酸的活性；

[0013] 活性2：将葡萄糖-6-磷酸转换为肌肉肌醇-1-磷酸的活性、即肌醇-1-磷酸合成酶活性；和

[0014] 活性3：以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的磷酸酯酶活性。

[0015] 但是，由于作为活性1的生成物的葡萄糖-6-磷酸为原核微生物普遍产生的代谢中间体，因而对原核微生物赋予该活性并非为必须的。此外，对于活性3来说，就本发明人所知，大多数适于通过现有的基因重组方法进行工业生产的原核微生物宿主细胞表达内源性肌醇单磷酸酶、或者具有能够以肌肉肌醇-1-磷酸为底物的通用单磷酸酶活性。此外，若对活性2进行观察，则多为原核微生物不具有肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例。并且，如上所述，在肌肉肌醇生物合成反应中，认为肌醇-1-磷酸合成酶承担控速反应。因而，为了在原核微生物宿主内构建功能性肌肉肌醇生物合成通路，认为在该细胞中导入肌醇-1-磷酸合成酶基因是充分必要的。

[0016] 实际上，非专利文献1公开了肌肉肌醇在大肠杆菌转化体内的生产，但仅在该转化体中导入了肌醇-1-磷酸合成酶基因。

[0017] 专利文献12中还公开了在大肠杆菌宿主细胞中仅导入肌醇-1-磷酸合成酶基因来制作转化体、由此在该转化体内构建外来性肌肉肌醇生物合成通路的内容。但是，该文献的最终目的生成物为D-葡糖二酸，肌肉肌醇是作为中间体生产的。特别要指出的是，该文献中还记载了下述内容：“还应该注意到，本发明中的suhB基因或相同的磷酸酯酶并未过剩表达。但是，在培养产物中未检测出肌肉肌醇-1-磷酸，另一方面却蓄积了肌肉肌醇。因而发明人得出结论，磷酸酯酶活性并未限制通过通路的代谢流(flux)。”(第33页、第2～5行)。

[0018] 因而，现有技术并未公开或暗示肌醇单磷酸酶在通过重组微生物进行肌肉肌醇生产中的决定性作用。

[0019] 现有技术文献

[0020] 专利文献

[0021] 专利文献1：日本特开平8-00258号公报

[0022] 专利文献2：日本特开平8-38188号公报

[0023] 专利文献3：日本特开平8-89262号公报

[0024] 专利文献4：日本特开平9-117295号公报

[0025] 专利文献5：日本特开平10-42860号公报

[0026] 专利文献6：日本特开平10-42882号公报

[0027] 专利文献7：日本特开平10-42883号公报

[0028] 专利文献8：日本特开2000-41689公报

[0029] 专利文献9：日本特开平9-220093号公报

[0030] 专利文献10：日本特开平10-271995号公报

[0031] 专利文献11：日本特开2011-55722号公报

[0032] 专利文献12：WO2009/145838号小册子

[0033] 非专利文献

[0034] 非专利文献1：J.Am.Chem.Soc.1999,Vol.121,3799-3800

[0035] 发明所要解决的课题

[0036] 对于不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的微生物，通过使用与基因重组技术联合的合成生物学方法，其具有容易调节肌肉肌醇生产率的优点。特别是大肠杆菌等原核微生物宿主除了不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路以外，还不具有多数酵母所具有的肌醇同化能力(分解能力)，因而更容易应用合成生物学的方法。此外，对于大肠杆菌来说，由于其迅速的生长能力及发酵管理的容易性，从工业发酵生产的方面考虑其是极富魅力的，同时从应用基因重组技术时的实际成绩、确定的安全性的方面出发也具有优点。

[0037] 因而，本发明所要解决的课题在于对不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物赋予显著得到改善的肌肉肌醇和相关衍生物的生产能力。

[0038] 解决课题的手段

[0039] 如上所述，在迄今为止的任一研究中，均暗示了肌醇-1-磷酸合成酶在肌肉肌醇生物合成反应中承担控速反应的内容。并且，在任一研究中均未对肌醇单磷酸酶活性予以特別关注。

[0040] 但是，本发明人令人吃惊地发现，在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物内导入肌肉肌醇生物合成通路而得到的转化体中，肌醇单磷酸酶活性具有重大的作用。出人预料地，通过增强肌醇单磷酸酶活性，这样的转化体的肌肉肌醇生产能力大幅提高。本发明人进一步发现，在这样的转化体的培养物中表达出了新型的肌肉肌醇衍生物。

[0041] 因而，本发明的第1方面在于：

[0042] (1)一种肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制造方法，其包括下述工序：

[0043] 1)准备转化体的工序，该转化体为不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物的转化体，其至少含有以能够在该转化体内表达的方式导入的编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因，并且具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异；以及

[0044] 2)在适于上述转化体的生长和/或维持的条件下，使该转化体与能够由该转化体转换为肌肉肌醇的碳源进行接触的工序。

[0045] 更特定地说，上述制造方法为使用下述转化体的肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的制造方法，该转化体为具有以能够表达的方式导入到不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物内的编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因的转化体，其特征在于，上述转化体具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

[0046] 上述(1)的培养物中生产的肌肉肌醇衍生物为新颖的化合物，在该衍生物中，葡萄糖与肌肉肌醇呈β1→4键合。因而，本发明的一个方式为：

[0047] (2)如上述(1)所述的制造方法，其中，上述肌肉肌醇衍生物为下述结构式所表示的化合物：

[0048] [化1]

[0049]

[0050] 前面已经对合成生物学方法的应用和发酵生产中的原核微生物、特别是大肠杆菌的优点进行了叙述。因而，本发明的适宜方式包括：

[0051] (3)如上述(1)或(2)所述的制造方法，其中，上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物为原核生物；

[0052] (4)如上述(1)或(3)的任一项所述的制造方法，其中，上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物为具有内源性肌醇单磷酸酶基因的微生物；

[0053] (5)如上述(1)或(4)的任一项所述的制造方法，其中，上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物为选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌；以及

[0054] (6)如上述(5)所述的制造方法，其中，上述细菌为大肠杆菌。

[0055] 无论宿主微生物是否具有内源性肌醇单磷酸酶活性，通过在该细胞内过剩生产肌醇单磷酸酶，可增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。可应用各种公知的技术进行肌醇单磷酸酶的过剩生产。因而，本发明包括以下的方式：

[0056] (7)如上述(1)或(6)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述微生物进行下述操作而诱导的：

[0057] a)导入外来肌醇单磷酸酶基因；

[0058] b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；

[0059] c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域导入变异；

[0060] d)利用高表达诱导性外来调节区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域；或者

[0061] e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域缺失；以及

[0062] (8)如上述(7)所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而诱导的。

[0063] 此外，在宿主细胞具有内源性肌醇单磷酸酶基因的情况下，也可利用下述方式来增强该细胞的肌醇单磷酸酶活性。

[0064] (9)如上述(1)或(6)的任一项所述的制造方法，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述微生物进行下述操作而诱导的：

[0065] f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；

[0066] g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；

[0067] h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；

[0068] i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；或者

[0069] j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

[0070] 在本发明的肌肉肌醇的发酵生产中，使用下述碳源作为培养基材为适宜的，该碳源含有适于生成作为肌醇-1-磷酸合成酶底物的葡萄糖-6-磷酸的化合物。进一步地，本发明的制造方法还可以包括下述的附加工序，在该附加工序中，从在与该碳源的接触下进行生长和/或维持的上述转化体的培养物中分离出肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物。因而，本发明的进一步适宜的方式包括：

[0071] (10)如上述(1)或(9)的任一项所述的制造方法，其中，上述碳源包含可在上述转化体内转换为葡萄糖-6-磷酸的化合物；

[0072] (11)如上述(10)所述的制造方法，其中，上述碳源为选自由D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠、废糖蜜以及D-葡萄糖的生物物质组成的组中的1种以上；以及[0073] (12)如上述(1)或(11)的任一项所述的制造方法，其中，该方法进一步包括分离肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物的工序，该肌肉肌醇或肌肉肌醇衍生物是在与上述碳源的接触下进行生长和/或维持的上述转化体的培养物中累积得到的。

[0074] 此外，本发明还谋求用于上述肌肉肌醇的制造方法的转化体。因而，本发明的第2方面在于：

[0075] (13)一种转化体，其为不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物的转化体，该转化体至少含有以能够在该转化体内表达的方式导入的编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因，并且具有对该转化体内的功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

[0076] 更特定地说，上述转化体为具有以能够表达的方式导入到不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物内的编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因的转化体，其特征在于，该转化体具有对功能性肌醇单磷酸酶的过剩生产或肌醇单磷酸酶的活化进行诱导的基因重组或变异。

[0077] 此外，本发明第1方面中记载的方式也适用于本发明的第2方面。这些方式包括：

[0078] (14)如上述(13)所述的转化体，其中，上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物为原核生物；

[0079] (15)如上述(13)或(14)所述的转化体，其中，上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物为具有内源性肌醇单磷酸酶基因的微生物；

[0080] (16)如上述(13)或(15)的任一项所述的转化体，其中，上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的微生物为选自由大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌组成的组中的细菌；

[0081] (17)如上述(16)所述的转化体，其中，上述细菌为大肠杆菌；

[0082] (18)如上述(13)或(17)的任一项所述的转化体，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述微生物进行下述操作而诱导的：

[0083] a)导入外来肌醇单磷酸酶基因；

[0084] b)增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；

[0085] c)在内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域导入变异；

[0086] d)利用高表达诱导性外来调节区域来置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域；或者

[0087] e)使内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域缺失；

[0088] (19)如上述(18)所述的转化体，其中，上述肌醇单磷酸酶的过剩生产是通过对上述微生物导入外来肌醇单磷酸酶基因而诱导的；以及

[0089] (20)如上述(13)或(17)的任一项所述的转化体，其中，上述肌醇单磷酸酶的活化是通过对上述微生物进行下述操作而诱导的：

[0090] f)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；

[0091] g)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；

[0092] h)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；

[0093] i)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；

[0094] j)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

[0095] 本发明的第3方面为被发现在上述转化体的培养物中生产出的新颖的肌肉肌醇衍生物。因而，本发明在于：

[0096] (21)下述结构式所表示的化合物：

[0097] [化2]

[0098]

[0099] 进一步还确认到，本发明的新颖的肌肉肌醇衍生物通过能够催化β-糖苷键的水解反应的酶(EC 3.2.1.21等)而容易地分解成葡萄糖与肌肉肌醇。该酶分解能够通过利用该酶对上述(1)中得到的培养物进行直接处理、利用该酶对该培养物的粗制物进行处理、或者利用该酶对分离出的本发明的肌肉肌醇衍生物进行处理的任一种手段来达成。因而，本发明的第4方面在于：

[0100] (22)一种肌肉肌醇的制造方法，其特征在于，利用能够催化β-糖苷键的水解反应的酶将上述(21)的肌肉肌醇衍生物分解，生成肌肉肌醇。

[0101] 进一步地，本发明谋求含有本发明的新颖的肌肉肌醇衍生物的组合物。例如，肌肉肌醇作为营养食品、饲料、药品等的成分得到广泛利用。但是，在环境中，存在有同化肌肉肌醇的酵母、芽孢杆菌属细菌和肠内细菌等。因而，将肌肉肌醇作为营养食品、饲料、药品等中所用的组合物加以利用时，优选保护肌肉肌醇免受上述的肌肉肌醇同化性细菌等的影响直至发挥出其生理作用。从而，本发明的第5方面在于：

[0102] (23)一种组合物，其含有上述(21)的肌肉肌醇衍生物。

[0103] 发明的效果

[0104] 根据本发明，能够利用微生物培养技术有效达成肌肉肌醇的工业生产。此外，本发明提供新颖的肌肉肌醇衍生物。本发明的新颖的肌肉肌醇衍生物容易转换为肌肉肌醇，对于同化肌肉肌醇的微生物等具有抵抗性。附图说明

[0105] 图1示出了INO1基因的编码区域(序列编号1)。

[0106] 图2示出了suhB基因的编码区域(序列编号3)。

[0107] 图3示出了本发明肌肉肌醇衍生物的生产例。图中箭头表示含有本发明肌肉肌醇衍生物的级分。是利用将KS-G(保护柱)、Sugar KS-801和Sugar KS-802(均为商品名，昭和电工株式会社制造)联结得到的HPLC(移动相：水、柱温度：70℃、流速：1mL/min、检测器：RI)进行分析的结果。

[0108] 图4为本发明肌肉肌醇衍生物的1H-NMR光谱。

[0109] 图5为本发明的肌肉肌醇衍生物的13C-NMR光谱。

[0110] 图6示出了本发明肌肉肌醇衍生物利用β-葡糖苷酶进行的分解例。是利用使用了Shodex Asahipak NH2P-50 4E(商品名、昭和电工株式会社制造)的HPLC(移动相：水/乙腈＝25/75、柱温度：40℃、流速：0.8mL/min、检测器：RI)进行分析的结果。

[0111] 本发明的课题是通过在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物内导入肌肉肌醇生物合成通路而得到的转化体中、即在不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的宿主微生物中导入该酶的外来基因而得到的转化体中，增强肌醇单磷酸酶的活性而得到解决的。需要说明的是，在本说明书中，“外来”或“外来性”这一术语表示的是，在转化前的宿主微生物不具有要由本发明导入的基因的情况下；在实质上不表达由该基因编码的酶的情况下；以及该酶的氨基酸序列由不同的基因编码、但在转化后不表达相匹配的内源性酶活性的情况下，向宿主中导入基于本发明的基因或核酸序列。

[0112] 如上所述，对于本发明的宿主微生物的“不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的”这一特性，由于能够在该宿主细胞内新构建肌肉肌醇生物合成通路(即，无现有内源性通路的影响)，因而在合成生物学方法的应用中是极富魅力的。所示例出的原核微生物为埃希氏菌、假单胞菌、芽胞杆菌、地芽胞杆菌、甲烷单胞菌、甲基芽孢杆菌、嗜甲基菌、精蛋白杆菌、甲基球菌、棒状杆菌、短杆菌、发酵单胞菌和李斯特氏菌属的细菌。工业发酵生产中适宜的原核微生物的非限定性示例包括大肠杆菌、芽胞杆菌属细菌、棒状杆菌属细菌、发酵单胞菌属细菌。大肠杆菌由于其迅速的生长能力和发酵管理的容易性的原因是本发明中特别优选的宿主微生物的示例。

[0113] 此外，能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以为通常含义下的野生型菌株，或者也可以为营养要求性变异株、抗生素耐性变异株。进一步地，能够作为本发明的宿主细胞使用的细胞株可以已经被转化从而使之具有与上述变异相关的各种标记基因。这些变异或基因能够提供对于本发明转化体的制作、维持、管理有益的性质。优选的是，通过使用显示出对于氯霉素、氨苄青霉素、卡那霉素、四环素等抗生素的耐性的菌株，能够简便地进行本发明的肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的生产。

[0114] 在面向合成生物学的本发明中，为了在宿主细胞中构建新的肌肉肌醇生物合成通路，对于上述不表达内源性肌醇-1-磷酸合成酶的宿主微生物导入外来肌醇-1-磷酸合成酶基因。肌醇-1-磷酸合成酶基因为已知的(例如，基因库登录号.AB032073、AF056325、AF071103、AF078915、AF120146、AF207640、AF284065、BC111160、L23520、U32511)，它们均可在本发明的目的中使用。特别是酵母来源的INO1基因(序列编号1)是广为人知的肌醇-1-磷酸合成酶基因的示例，也能够在本发明中适宜地使用。但是，能够用于本发明的肌醇-1-磷酸合成酶基因并不限于酵母来源的基因，其可来源于其它真核微生物或此外的生物、或者可以为人工合成的基因，只要在上述宿主微生物细胞内能够实质性地表达肌醇-1-磷酸合成酶活性即可。

[0115] 从而，对于能够用于本发明目的的肌醇-1-磷酸合成酶基因，只要在上述宿主微生物细胞内能够实质性地表达肌醇-1-磷酸合成酶活性，可以具有能够在自然界发生的全部变异、或者具有人工导入的变异和修饰。例如，已知在编码特定氨基酸的各种密码子中存在冗余密码子(redundancy)。因此，在本发明中也可利用最终可翻译成相同氨基酸的代替密码子。即，由于基因编码的简并，因而编码某一特定氨基酸时可使用2个以上的密码子，因此氨基酸序列可利用任意1组类似的DNA低聚核苷酸进行编码得到。虽然仅这组唯一的成员与天然型酶的基因序列相同，但即便是不匹配的的某DNA低聚核苷酸，在适当的严谨条件下(例如，3xSSC、68℃杂交、2xSSC、0.1％SDS和68℃清洗)也能够与天然型序列杂交，能够对编码天然型序列的DNA进行鉴定、分离，进一步还可将这样的基因用于本发明中。特别是已知大部分生物优选使用特定密码子(最佳密码子)的子集(Gene、Vol.105、pp.61-72、1991等)，因而根据宿主微生物进行“密码子最佳化”在本发明中也是有用的。

[0116] 并且，在本发明中，也可通过将肌醇-1-磷酸合成酶基因以“表达盒”的形式导入到宿主微生物细胞内来更为稳定地得到高水平的肌醇-1-磷酸合成酶活性，这对本领域技术人员来说是可以理解的。在本说明书中，“表达盒”是指含有与表达对象的核酸或表达对象的基因功能性结合的对于转录和翻译进行调节的核酸序列的核苷酸。代表性地，本发明的表达盒以功能性结合的状态在编码序列的5’上游含有启动子序列、在3’下游含有终止子序列、根据情况进一步含有通常的调节元件，在这样的情况下，表达对象的核酸或表达对象的基因以“能够表达的方式导入”到宿主微生物中。

[0117] 关于启动子，不论是结构性启动子还是调节启动子，均被定义为使RNA聚合酶与DNA结合、引发RNA合成的DNA序列。强启动子是指高频引发mRNA合成的启动子，在本发明中也适于使用。可根据该宿主细胞的性质等使用lac系、trp系、TAC或TRC系、λ噬菌体的主要操纵子和启动子区域、fd包覆蛋白质的调节区域、针对糖酵解系酶(例如，3-磷酸甘油酸激酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、谷氨酸脱羧酶A、丝氨酸羟甲基转移酶的启动子等。除了启动子和终止子序列以外，可作为其它调节元件的示例举出的序列为选择标记、扩增信号、复制起点等。适宜的调节序列例如记载于“Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185”、Academic Press(1990)中。

[0118] 上述说明的表达盒嵌入到例如由质粒、噬菌体、转座子、IS元件、噬粒、粘粒、或者线状或环状DNA等构成的载体中，使其插入到宿主微生物中。优选质粒和噬菌体。这些载体在宿主微生物中可自体复制，也可通过染色体复制。适宜的质粒例如为：大肠杆菌的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI；杆菌的pUB110、pC194或pBD214；棒状杆菌属的pSA77或pAJ667等。除它们以外，能够使用的质粒等还记载于“Cloning Vectors”、Elsevier、1985中。表达盒向载体中的导入可通过包括利用适当的限制酶切割、克隆化以及连接的惯用方法进行。

[0119] 如上述那样构建出具有本发明的表达盒的载体后，作为将该载体导入到宿主微生物中时能够适用的方法，例如使用共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等惯用的克隆化法和转染法。它们的示例记载于“分子生物学的最新实验计划(Current Protocols in Molecular Biology)”，F.Ausubel等，Publ.Wiley Interscience，New York，1997；或Sambrook等，“分子克隆：实验室手册”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中。

[0120] 本发明人令人吃惊地发现，在不具有内源性肌肉肌醇生物合成通路的宿主微生物内导入肌肉肌醇生物合成通路而得到的转化体中，肌醇单磷酸酶活性具有重大作用。如上所述，在迄今为止的任一研究中，均未对肌醇单磷酸酶活性予以特別关注。但是，出人意料地，通过增强肌醇单磷酸酶活性，这样的转化体的肌肉肌醇生产能力大幅提高。此外，这样的转化体以实质量生产出了本发明的肌肉肌醇衍生物。

[0121] 因而，本发明的一个方式包括：在由上述编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因转化得到的宿主微生物细胞中进行肌醇单磷酸酶的过剩生产。

[0122] 对于本发明中谋求的肌醇单磷酸酶，除了对肌醇-1-磷酸显示出高底物特异性外，还显示出了可作用于广泛的底物的磷酸单酯水解酶活性，从而包括实质上能够水解肌醇-1-磷酸的蛋白质。作为代表性的肌醇单磷酸酶，例如已知有肌醇-1-单磷酸酶，大量生物来源的该基因(suhB基因)在基因库登录号ZP＿04619988、YP＿001451848等中公布。特别是大肠杆菌来源的的suhB基因(序列编号3：AAC75586(MG1655))的使用在以大肠杆菌为宿主细胞的情况下较为方便。

[0123] 本领域技术人员容易理解，在肌醇-1-磷酸合成酶基因中记载的变异、修饰和密码子最佳化及表达盒、启动子等调节序列和质粒等以及基于此的转化的说明对于本发明的所有肌醇单磷酸酶基因是适用的。从而可知，本发明中的肌醇单磷酸酶的过剩生产可通过利用外来肌醇单磷酸酶基因的表达盒对上述宿主微生物进行转化而达成。

[0124] 进一步认为，大量微生物细胞表达本发明中谋求的肌醇单磷酸酶活性(即，具有编码肌醇单磷酸酶活性的内源性基因)。因而，本发明中的肌醇单磷酸酶的过剩生产还可通过进行下述操作而诱导：增加内源性肌醇单磷酸酶基因的拷贝数；在内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域导入变异；利用高表达诱导性外来调节区域置换内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域；以及使内源性肌醇单磷酸酶基因的调节区域缺失。具体地说，为了达成肌醇单磷酸酶的过剩表达，可通过进行下述操作来达成：利用含有内源性肌醇单磷酸酶基因或含有在该内源性基因的编码化区域添加了适当的调节区域而得到的表达盒的构建体对上述宿主微生物进行转化，使该转化体内的该肌醇单磷酸酶基因的拷贝数与原来的宿主细胞相比实质上增加；对于具有内源性肌醇单磷酸酶基因的原来的宿主细胞，通过公知的基因重组技术实施染色体的变异、添加和缺失；或者使用诱变剂等在染色体中随机导入变异。可以使用公知的SDS-PAGE分析法等对肌醇单磷酸酶的过剩生产进行确认。

[0125] 进一步地，用于增强肌醇单磷酸酶活性的本发明的其它方式包括：在由上述编码肌醇-1-磷酸合成酶的外来基因转化得到的宿主微生物细胞中诱导肌醇单磷酸酶的活化。为进行该目的，可示例出下述的方法：1)在内源性肌醇单磷酸酶基因中导入变异；2)置换内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分或全部；3)使内源性肌醇单磷酸酶基因的一部分缺失；4)使降低肌醇单磷酸酶活性的其它蛋白质减少；和/或5)使降低肌醇单磷酸酶活性的化合物的生成减少。

[0126] 关于用于增强上述肌醇单磷酸酶活性的1)～5)的方法，具体地说，通过在对肌醇单磷酸酶的基因实施变异、添加或缺失后对该基因所编码的肌醇单磷酸酶的活性进行评价，从而得到肌醇单磷酸酶活性得到增强的肌醇单磷酸酶。

[0127] 对于如上所述得到的转化体、例如利用具有外来肌醇-1-磷酸合成酶基因的表达盒和肌醇单磷酸酶基因的表达盒的载体(各表达盒可以配置在不同或相同载体上)进行转染而得到的转化体，为了进行本发明肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物生产，可在适于上述转化体的生长和/或维持的条件下进行培养和维持。来源于各种宿主微生物细胞的转化体所用的适宜的培养基组成、培养条件、培养时间对于本领域技术人员为已知的。

[0128] 培养基可以为含有1种以上的碳源、氮源、无机盐、维生素以及必要时的微量元素或维生素等微量成分的天然、半合成、合成培养基。但是，不消说所使用的培养基必须适当满足所要培养的转化体的营养要求。进一步地，为了使上述转化体与能够由该转化体转换为肌肉肌醇和肌肉肌醇衍生物的碳源进行接触，本发明的培养基应该含有可最终作为肌肉肌醇生产的底物使用的碳源、即可在转化体内转换为葡萄糖-6-磷酸的化合物。碳源可以为D-葡萄糖、蔗糖、寡糖、多糖、淀粉、纤维素、米糠、废糖蜜，进而可以为含有D-葡萄糖的生物物质。作为适宜的生物物质，可示例出玉米分解液或纤维素分解液。此外，在转化体表达有用附加形状的情况下、例如在具有针对抗生素的耐性标记的情况下，培养基可以含有相应的抗生素。由此使发酵中的杂菌所致的污染风险降低。

[0129] 在宿主微生物无法同化上述的纤维素或多糖类等碳源的情况下，可通过实施在该宿主微生物中导入外来基因等公知的基因工程方法使其适应于使用这些碳源的肌肉肌醇生产中。作为外来基因，可以举出例如纤维酶基因或淀粉酶基因等。

[0130] 培养可以为分批式也可以为连续式。并且，在任一情况下，均可为在适当的培养时刻补给所追加的上述碳源等的形式。此外，培养应在维持适宜的温度、氧浓度、pH等的条件下继续进行。来源于一般的微生物宿主细胞的转化体的适宜培养温度通常为15℃～45℃、优选为25℃～37℃的范围。宿主微生物为好氧性的情况下，为了确保发酵中的适当的氧浓度，需要进行振荡(烧瓶培养等)、搅拌/通气(发酵罐培养等)。这些培养条件可由本领域技术人员容易地设定。

[0131] 由上述培养物精制肌肉肌醇的方法对于本领域技术人员是公知的。在为原核微生物宿主细胞的转化体的情况下，肌肉肌醇在培养上清中或菌体内存在，必要时可由培养菌体进行提取。在由培养菌体提取的情况下，例如，可对培养物进行离心分离、将上清与菌体分离，利用均质器并同时利用表面活性剂、有机溶剂、酶等破坏菌体。作为由培养上清以及必要时还由菌体提取液精制肌肉肌醇的方法，可以举出：在实施了利用通过pH调整等进行的蛋白质沉淀的除蛋白处理、通过利用活性炭的杂质吸附进行的去除、通过利用离子交换树脂等的离子性物质的吸附进行的去除之后，将干燥得到的固体从例如水-乙醇系中进行再结晶。当然也可根据制品的目的纯度省去部分工序、或者实施色谱法等追加精制工序，这自不言说。

[0132] 另外，还可进一步从在适当条件下进行培养得到的上述培养物中得到本发明的新颖的肌肉肌醇衍生物。代表性的本发明的肌肉肌醇衍生物被称为1-4-O-β-D-吡喃葡萄糖肌肉肌醇，具有下述结构。

[0133] [化3]

[0134]

[0135] 上述的肌肉肌醇衍生物通过将本发明的转化体在能够生成比较大量的肌肉肌醇(例如约30g/L～120g/L的程度)的培养基内进行培养来生产是有利的。即，对于本发明的转化体，与本发明的肌肉肌醇衍生物相比，其通常生产更大量的肌肉肌醇。但是，如下述的实施例所示，根据添加在培养基中的葡萄糖的量的不同，本发明的转化体不仅可生产更大量的肌肉肌醇，而且还可生产肌肉肌醇衍生物，因而这样的培养条件也适于得到本发明的肌肉肌醇衍生物。

[0136] 本发明的肌肉肌醇衍生物可通过按照肌肉肌醇中的上述方法由培养物中进行粗精制。例如，可通过对培养上清进行活性炭处理、接着利用离子交换树脂(阳离子交换树脂和阴离子交换树脂)进行处理来对本发明的肌肉肌醇衍生物进行粗精制。

[0137] 但是，由于上述粗精制物含有本发明的肌肉肌醇衍生物与肌肉肌醇这两者，因而在本发明的肌肉肌醇衍生物的分离中，需要从中分离出肌肉肌醇。例如，在上述粗精制的培养液含有大量的肌肉肌醇的情况下，可通过对该粗精制液进行减压浓缩使肌肉肌醇的一部分析出，通过过滤等去除。进而，向该滤液中添加乙醇时，可使残余的肌肉肌醇析出(析晶)。因而，在适当地反复进行基于乙醇的析晶时，可得到所期望纯度的本发明的肌肉肌醇衍生物。或者可在进行析晶的同时或单独通过色谱法、例如通过使用SUGAR KS-801和SUGAR KS-
802以及Shodex Asahipak NH2P-50 4E(均为商品名，昭和电工株式会社制造)的制备型HPLC等分别得到本发明的肌肉肌醇衍生物与肌肉肌醇。

[0138] 还确认到本发明的肌肉肌醇衍生物可由具有β1→4键的水解能力的β-葡糖苷酶容易地分解，生成相应摩尔数的葡萄糖与肌肉肌醇。在利用β-葡糖苷酶等对本发明的肌肉肌醇衍生物进行酶分解时，例如可向由水或缓冲液(乙酸缓冲液、磷酸缓冲液等)制备的本发明的肌肉肌醇衍生物的溶液中添加适当量的酶，利用适于该酶反应的条件和时间对该溶液进行培养。能够在这样的目的中有利地使用的β-葡糖苷酶有市售，它们均可使用，例如可利用曲霉属的霉来源的纤维二糖酶(SIGMA社)。所添加的酶量可参考厂家指示同时基于本发明的肌肉肌醇衍生物在溶液中的浓度等来适当确定。此外，反应时的pH通常为pH 4.0～9.0的范围，但必要时可以为所使用的酶的最佳pH。另外，反应时的温度也可为所使用的酶的最佳温度范围，例如可为约20℃～50℃左右的范围。关于反应时间，可定量追踪本发明肌肉肌醇衍生物的分解率，使其为大致全部的本发明肌肉肌醇衍生物转换为肌肉肌醇的时刻。

[0139] 需要说明的是，如上所述，对于本发明的转化体，由于在典型的培养条件下其在生产肌肉肌醇的同时还以显著少于肌肉肌醇的量生产本发明的肌肉肌醇衍生物，因而不消说，可直接利用上述酶对该转化体的培养物进行处理、或者在以活性炭处理程度对该培养物进行粗精制后进行酶处理，从而将本发明的肌肉肌醇衍生物转换为肌肉肌醇，由此进一步提高肌肉肌醇的生产率。或者可以在分离出本发明的肌肉肌醇衍生物之后利用β-葡糖苷酶进行处理，得到肌肉肌醇。此时，本发明的肌肉肌醇衍生物对于能够利用肌肉肌醇的偏好菌(偏在菌)(酵母、枯草杆菌、肠内细菌)为抵抗性的，因而直至使用为止(或者至表现出生理作用为止)，将肌肉肌醇以本发明的肌肉肌醇衍生物的形态保存，该优点是本领域技术人员可以理解的。

[0140] 因而，将本发明的肌肉肌醇衍生物作为药品、食品、化妆品等的有效成分或功能性成分使用也是其潜在用途之一。即，如上所述，肌肉肌醇对于多数高等动物来说为必不可缺的物质，因而其作为营养食品、饲料、药品等的成分广泛使用。例如，已知肌肉肌醇在脂肪或胆固醇类的代谢中发挥出重要的作用，在高胆固醇血症等的预防或治疗中是特别有效的。并且，由于本发明的肌肉肌醇衍生物可容易地被酶分解生成肌肉肌醇，因而期待本发明的肌肉肌醇衍生物在生物体内被酶分解产生肌肉肌醇，将本发明的肌肉肌醇衍生物本身添加到药品等中为本发明颇令人感兴趣的利用方式。

[0141] 例如，含有本发明的肌肉肌醇衍生物作为有效成分的医药组合物可以制成片剂、粉末、颗粒、胶囊、糖衣片、液剂、或者糖浆等口服给药剂型，或者也可制成注射剂、点滴剂、栓剂、经皮或吸收剂等非口服给药剂型。可使用与这些制剂相应的各种载体。例如，作为口服剂的载体，可以举出赋形剂(例如乳糖、白糖、葡萄糖、甘露醇、红藓醇、木糖醇、麦芽糖醇、山梨糖醇、各种淀粉、结晶纤维素、粉末纤维素等)、粘合剂(例如糊精、阿拉伯胶、藻酸钠、聚乙烯吡咯酮、聚乙烯醇、甲基纤维素、羟基丙基纤维素、低置换度羟丙基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、滑润剂(例如硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石等)、流动性促进剂(例如含水二氧化硅、轻质硅酸酐、二氧化钛等)、着色剂。

[0142] 医药组合物的给药量没有特别限定，例如，一般来说，对于成人，可以每1天以1次到分数次给予0.01mg～2000mg的有效成分。给药频率可以为每月1次到连日给药，优选为1次/周到3次/周、或5次/周、或者连日给药。1天给药量可根据给药期间以及给药频率以及患者的年龄、体重、身体健康程度及所要治疗的疾病或其严重程度等一起进行适当增减。

[0143] 被提供了以上说明的本领域技术人员可充分实施本发明。下面出于进一步说明的目的提供实施例，因而本发明并不限于该实施例。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，核苷酸序列被记载为从5’向3’方向。

[0144] 实施例

[0145] 实施例1：质粒的构建

[0146] 1-a)肌醇单磷酸酶表达盒

[0147] 在LB培养基中(2ml)在37℃振荡培养大肠杆菌株W3110(NBRC 12713)。培养终止后，由培养液回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA用于模板，利用下述引物进行PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名，Takara-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，克隆suhB基因的编码区域(序列编号3)。

[0148] [化4]

[0149] 正向：a t g c a t c c g a t g c t g a a c(序列编号5)

[0150] 反向：t t a a c g c t t c a g a g c g t c g(序列编号6)

[0151] 所得到的suhB编码区域可转录地插入到下述序列的启动子的下游。

[0152] [化5]

[0153] 启动子：g t c g t t t t t c t g c t t a g g a t t t t g t t a t t t a a a t t a a g c c t g t a a t g c c t t g c t t c c a t t g c g g a t a a a t c c t a c t t t t t t a t t g c c t t c a a a t a a a t t t a a g g a g t t c(序列编号7)

[0154] 即，在质粒pNFP-A51(于2012年10月26日以FERM BP-11515保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心)的多克隆位点插入终止子序列和上述启动子序列。

[0155] 在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的suhB编码区域，构建pNFP-A54。将所构建的pNFP-A54利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート(基因工程实验笔记)上田村隆明著)转染到大肠杆菌(Escherichia coli)AKC-016株(于2012年10月26日以FERM BP-11512保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心)中。通过SDS-PAGE确认肌醇单磷酸酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

[0156] 1-b)肌醇-1-磷酸合成酶表达盒

[0157] 由分离出的酒精酵母培养液中回收菌体，使用Nucleo Spin Tissue(产品名、MACHEREY-NAGEL社制造)提取基因组DNA。将所提取的基因组DNA用于模板，利用下述引物进行PCR扩增(PrimeSTAR Max DNA聚合酶(产品名、Takara-Bio制造)反应条件：98℃10sec，55℃5sec，72℃20sec，28循环)，克隆INO1基因的编码区域(序列编号1)。

[0158] [化6]

[0159] 正向：a t g a c a g a a g a t a a t a t t g c t c(序列编号8)[0160] 反向：t t a c a a c a a t c t c t c t t c g(序列编号9)

[0161] 所得到的ino1编码区域可转录地插入到下述序列的启动子的下游。

[0162] [化7]

[0163] 启动子：c t c a a g c c c a a a g g a a g a g t g a g g c g a g t c a g t c g c g t a a t g c t t a g g c a c a g g a t t g a t t t g t c g c a a t g a t t g a c a c g a t t c c g c t t g a c g c t g c g t a a g g t t t t t g t a a t t t t a c a g g c a a c c t t t t a t t c a c t a a c a a a t a g c t g g t g g a a(序列编号10)

[0164] 即，在上述质粒pNFP-A51的多克隆位点插入终止子序列和上述启动子序列。

[0165] 在所导入的启动子序列的下游连接上述克隆的ino1编码区域，构建pNFP-D78。将所构建的pNFP-D78利用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート(基因工程实验笔记)上田村隆明著)转染到大肠杆菌(Escherichia coli)AKC-016株(于2012年10月26日以FERM BP-11512保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心)中。通过SDS-PAGE确认肌醇-1-磷酸合成酶在该大肠杆菌的可溶性级分中的高表达。

[0166] 1-c)用于转化的质粒的构建

[0167] 将pNFP-D78利用SalI消化，进行末端平滑化和5’末端脱磷酸化。将pNFP-A54中的suhB表达盒克隆化，与pNFP-D78连接。得到与pNFP-D78中的INO1表达盒顺方向地连接了suhB表达盒的pNFP-G22。

[0168] 实施例2：肌肉肌醇生产

[0169] 2-a)利用经含有表达盒的质粒转染得到的转化体进行的肌肉肌醇生产[0170] 使用氯化钙法(参照羊土社遺伝子工学実験ノート(基因工程实验笔记)上田村隆明著)将按照实施例1的过程构建的质粒pNFP-G22转染到大肠杆菌(Escherichia coli)AKC-016株(于2012年10月26日以FERM BP-11512保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心)中。将该转化体命名为AKC-016-G22株。

[0171] 另一方面，在对照转化中，利用仅含有INO1表达盒的质粒pNFP-D78进行转染，将所得到的该对照转化体命名为AKC-016-D78株。将所得到的各转化体在含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB微板上于37℃培养一天，形成菌落。将含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基2mL装入15mL容量的试管中，利用白金耳从上述微板上进行菌落的植菌，在37℃以180rpm进行3～5小时的培养，直至OD(600nm)为0.5左右，将其作为主培养所用的前培养液。

[0172] 在250mL容量的罐状培养装置(机种名Bio Jr.8，Biott制造)中加入含有10g/L、15g/L或30g/L的葡萄糖以及100mg/L的氨苄青霉素的合成培养基(下表)或者LB培养基
100mL，添加2mL的前培养液进行主培养(肌肉肌醇生产试验)。培养条件如下：培养温度30℃；培养pH 6.7；碱添加10％(重量/容量)氨水；搅拌1200rpm；通气0.1vvm。

[0173] [表1]

[0174] 合成培养基组成

[0175]

[0176] 使用8N KOH，将pH调整为6.7

[0177] 将上述培养液在4℃进行10,000g×10分钟的离心分离，回收上清，测定培养上清的肌肉肌醇浓度。具体地说，将KS-G(保护柱)、Sugar KS-801和Sugar KS-802(均为商品名，昭和电工株式会社制造)联结进行HPLC(检测器：RI、柱温度：70℃、流速：1mL/min)，从而对培养上清中的肌肉肌醇浓度进行定量。将本发明的转化体(AKC-016-G22株)与对照株(AKC-016-D78株)的比较结果列于表2(合成培养基)和表3(LB培养基)。

[0178] 表2合成培养基的培养上清中生成的肌肉肌醇的浓度(g/L)

[0179]

[0180] 表3LB培养基的培养上清中生成的肌肉肌醇的浓度(g/L)

[0181]

[0182] 2-b)利用在染色体上具有表达盒的转化体进行的肌肉肌醇生产

[0183] 在本实施例中，还进一步制作了在染色体上具有INO1表达盒和suhB表达盒这两者的转化体(大肠杆菌(Escherichia coli)AKC-018株，于2012年10月26日以FERM BP-11514保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心中)。

[0184] 另一方面，对照转化是在染色体上仅插入INO1表达盒而得到的(大肠杆菌(Escherichia coli)AKC-017株，于2012年10月26日以FERM BP-11513保藏在独立行政法人制品评价技术基盘机构专利生物保藏中心中)。

[0185] 将各转化体利用不含有氨苄青霉素的LB培养基进行前培养，并且除了不含有氨苄青霉素且使葡萄糖的添加量为10g/L或30g/L以外，使用与实施例2-a)相同的合成培养基和LB培养基，利用该转化体在与实施例2-a)同样的培养条件下进行肌肉肌醇的生产。接下来利用与实施例2-a)相同的方法对培养上清中的肌肉肌醇浓度进行定量。本发明的转化体(AKC-018株)与对照株(AKC-017株)的比较结果列于表4(合成培养基)和表5(LB培养基)中。

[0186] 表4合成培养基的培养上清中生成的肌肉肌醇的浓度(g/L)

[0187]

[0188] 表5LB培养基的培养上清中生成的肌肉肌醇的浓度(g/L)

[0189]

[0190] 上述实施例2-a)和2-b)的结果显示出，尽管在大肠杆菌宿主(对照株)中确认到了内源性肌醇单磷酸酶活性的存在，但在利用合成生物学方法进行的现有的肌肉肌醇生产中，该活性并不充分。令人吃惊的是，该宿主中的肌醇单磷酸酶活性的亢进使得肌肉肌醇生产率与对照相比提高了1.5～5倍。更令人吃惊的是，在肌醇单磷酸酶活性亢进的微生物中，肌肉肌醇生产量与投料葡萄糖量成正比地增加。这种情况验证了，与现有的技术常识相反地，在利用合成生物学方法进行的肌肉肌醇生产中，肌醇单磷酸酶活性发挥了重要作用。

[0191] 实施例3：新颖的肌肉肌醇衍生物

[0192] 3-a)新颖的肌肉肌醇衍生物的生产

[0193] 本实施例中示出了利用作为由实施例2-a)得到的本发明的转化体的AKC-016-G22株进行的新颖肌肉肌醇衍生物的生产。

[0194] 将含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB培养基100mL装入到500mL容量的试管中，利用白金耳从培养AKC-016-G22株的微板上进行菌落的植菌，在37℃于180rpm进行3～5小时的培养，直至OD(600nm)为0.5左右，将其作为主培养所用的前培养液。

[0195] 在10L容量的罐状培养装置(丸菱生物工程株式会社制造)中加入含有15g/L的葡萄糖以及100mg/L的氨苄青霉素的下述合成培养基(表6)3L，添加60mL的前培养液进行主培养。培养条件如下：培养温度32℃；培养pH 6.0〔下限〕；碱添加28％(重量/容量)氨水；搅拌850rpm；通气1vvm。适当添加作为原料的葡萄糖补料溶液(表7)以使培养液中的葡萄糖浓度为0～5g/L。

[0196] [表6]

[0197] 合成培养基组成

[0198]

[0199] 使用8N KOH，将pH调整为6.7

[0200] [表7]

[0201] 葡萄糖补料溶液

[0202]

[0203] 在培养时间69.5小时后，将上述培养液的一部分在4℃进行10,000g×10分钟离心分离，回收上清。将上清利用将KS-G(保护柱)、Sugar KS-801和Sugar KS-802(均为商品名，昭和电工株式会社制造)联结的HPLC(移动相：水、柱温度：70℃、流速：1mL/min、检测器：RI)进行分析，结果肌肉肌醇浓度为102g/L。

[0204] 另一方面，本发明的新颖肌肉肌醇衍生物(1-4-O-β-D-吡喃葡萄糖肌肉肌醇)通过使用Shodex Asahipak NH2P-50 4E(商品名、昭和电工株式会社制造)的HPLC(移动相：水/乙腈＝25/75、柱温度：40℃、流速：0.8mL/min、检测器：RI)进行分析，保留时间为17.4分钟(需要说明的是，在该分析中，肌肉肌醇的保留时间为13分钟)，在上述上清中以0.3g/L的浓度含有。

[0205] 3-b)新颖的肌肉肌醇衍生物的分离

[0206] 使用大型离心机以8,800rpm对如上所述得到的培养液1000mL进行20分钟离心，之后进一步使用小型离心机以13,000rpm离心5分钟。使用0.45μm的过滤器(MILLIPORE社Omnipore膜型号JHWP09025)，通过减压过滤由所得到的上清中过滤出固体物质。向过滤器过滤后的滤液1000mL中添加活性炭SHIRASAGI A(商品名、日本EnviroChemicals社制造)5g，利用搅拌器搅拌30分钟。使用0.45μm的过滤器，通过减压过滤由该滤液中滤出活性炭。
在活性炭处理后的滤液中添加阳离子交换树脂(Organo社制造Amberlite IR120B H+型)
500mL，利用搅拌器搅拌30分钟。使用0.45μm的过滤器，通过减压过滤由该滤液中滤出阳离子交换树脂。向阳离子交换处理后的滤液中添加阴离子交换树脂(Organo社制造AmberliteIRA96SB OH-型)500mL，利用搅拌器搅拌30分钟。使用0.45μm的过滤器，通过减压过滤从该滤液中滤出阴离子交换树脂。

[0207] 对于阴离子交换处理后的滤液1000mL，在70℃、100mbar条件下蒸发器蒸馏除去水，4倍浓缩成250mL。自然冷却至室温后保存在4℃，使肌肉肌醇析出，之后减压过滤滤出肌肉肌醇。在189mL滤液的组成中，肌肉肌醇为5.83％、本发明的肌肉肌醇衍生物为0.131％(均为W/V)。在室温下向该滤液中添加乙醇189mL，进一步使肌肉肌醇析出，之后减压过滤滤出肌肉肌醇。在373mL滤液的组成中，肌肉肌醇为1.41％、本发明的肌肉肌醇衍生物为0.067％。进一步使用蒸发器(70℃、100mbar)由滤液中蒸馏除去乙醇，得到肌肉肌醇为
8.46％、本发明的肌肉肌醇衍生物为0.401％的水溶液62mL。在室温进一步向其中添加乙醇
186mL，使肌肉肌醇析出后，减压过滤滤出肌肉肌醇。在244mL滤液的组成中，肌肉肌醇为
0.33％、本发明的肌肉肌醇衍生物为0.100％。使用蒸发器(70℃、100mbar)，从滤液中蒸馏除去乙醇和水，得到肌肉肌醇为3.30％、本发明的肌肉肌醇衍生物为0.998％的溶液24mL。

[0208] 由于在上述溶液中确认到属于与肌肉肌醇和本发明的肌肉肌醇衍生物不同的物质(结构未鉴定)且难以从两者中分离出的2种以上的杂质的存在，因而对各种精制方法进行了研究，结果酶处理为有效的。即，相对于上述的肌肉肌醇和本发明的肌肉肌醇衍生物的混合液500μL添加150mM Bis-Tris(pH7.0)缓冲液300μL、以及100UN/mLα-葡萄糖苷酶(Sigma-Aldrich社制造，来自嗜热脂肪芽胞杆菌)200μL，使用温浴箱(AS ONE SI-300C)，在反应温度40℃、1,200rpm搅拌下进行22小时反应。反应后，通过HPLC分析确认到上述杂质之一被分解。其后将反应液利用99℃的干浴器(SIBATA制BI-1200)加热5分钟，使酶失活。对反应后的滤液进行离心分离，之后使用0.45μm的过滤器对上清进行过滤。将滤液冷冻干燥后，加入水制成5mL的水溶液。向该滤液500μL中进一步添加150mM Bis-Tris(pH7.0)缓冲液300μL、以及100UN/mLβ-葡萄糖苷酶(Oriental酵母工业株式会社制造，来自杏仁)200μL，使用温浴箱，在反应温度40℃、1,200rpm搅拌下进行0.5小时的短时间反应。反应后，通过HPLC分析确认到另一杂质被分解。其后将反应液利用99℃的干浴器加热5分钟，使酶失活。离心分离后，使用0.45μm的过滤器对上清进行过滤。将滤液冷冻干燥后，加入水制成含有本发明的肌肉肌醇衍生物约0.99％的水溶液(2.5mL)。

[0209] 使用通过上述酶分解精制后的水溶液，设1次采样量为10μL，进行200次的HPLC分取。分取时的HPLC条件如下：

[0210] 柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E、

[0211] 移动相：水/乙腈＝25/75

[0212] 流速：0.8mL/min

[0213] 温度：40℃

[0214] 检测器：RI

[0215] 自动采样器：岛津SIL-20A型总量试样注入式

[0216] 利用蒸发器(70℃、100mbar)从HPLC分取后的样品中蒸馏除去乙腈，进一步还通过冷冻干燥蒸馏除去水，得到本发明肌肉肌醇衍生物的干燥固体物质(产率：19mg)。

[0217] 3-c)新颖的肌肉肌醇衍生物的结构确定

[0218] 通过下述NMR分析对实施例3-b)中分取的化合物进行结构确定。

[0219] 装置：Avance 600(Bruker Biospin社制造)

[0220] 探针：低温探针(13C高灵敏度)

[0221] 测定温度：18℃(为了防止试样劣化以及在1H-NMR时使水信号移动，全部为291K(18℃))

[0222] 溶剂：D2O(ALDRICH社制造)

[0223] 内部标准：TSP

[0224] 1H观测频率：600.13MHz

[0225] 13C观测频率：150.92MHz

[0226] 测定结果和峰的归属如下。需要说明的是，表中，峰编号的“GH-1”表示葡萄糖残基的1位氢。另外，“IH-1”表示肌肉肌醇残基的1位氢。其它也是同样的。

[0227] [化8]

[0228]

[0229] [表8]

[0230] 表8：1H-NMR

[0231]

[0232] [表9]

[0233] 表9：13C-NMR

[0234]峰编号 δC(ppm)
GC-1 105.9
GC-2 76.4
GC-3 78.4
GC-4 72.4
GC-5 78.9
GC-6 63.6
IC-1 73.8
IC-2 74.7
IC-3 72.6
IC-4 84.7
IC-5 76.9
IC-6 75.1

[0235] 另外，峰的归属通过COSY、CH-COSY、HMBC、二维J分解NMR确认。

[0236] 3-d)新颖肌肉肌醇衍生物的酶分解

[0237] 将实施例3-b)中分取的化合物利用属于曲霉属霉来源的β-葡糖苷酶的纤维二糖酶(SIGMA社)进行分解。具体地说，将该化合物以6mg/ml的浓度溶解在400μL的150mM Bis-Tris缓冲液(pH＝7.0)中。向该溶液中加入25U/mL的纤维二糖酶100μL，在40℃培养直至22小时(1200rpm、震荡培养箱M·BR022、TAITEC社)，使其反应。在反应第0小时、第3小时、第22小时对反应液进行采样，利用HPLC(柱：Shodex Asahipak NH2P-50 4E(商品名)、移动相：水/乙腈＝25/75、流速：0.8mL/min、柱温度：40℃、检测器：RI)确认反应状况。

[0238] 根据图6所示的结果，在从反应开始的第3小时，本发明的肌肉肌醇衍生物大部分发生分解，生成相应量的葡萄糖与肌肉肌醇。此外，在反应开始22小时后，本发明的肌肉肌醇衍生物完全分解。由此判断出，本发明的肌肉肌醇衍生物容易被β-葡糖苷酶分解。并且，由该酶实验也可确认到本发明肌肉肌醇衍生物的结构确定的的正确性。

[0239] 工业实用性

[0240] 本发明可用于肌肉肌醇及其衍生物的工业发酵生产。

[0241]